La posibilidad de expresar genes heterólogos con elevada eficacia tras la entrega de un gen desnudo fue descrita por primera vez a mediados de los años 90 [22, 23]. En el año 1999, Zhang et al. [24] y Liu et al. [25] introdujeron el procedimiento de transferencia génica hidrodinámica. El procedimiento consistía en la inyección a gran velocidad de un volumen grande (2 ml en 5-7 segundos) de solución salina conteniendo un gen de interés, a través de la vena de la cola en ratón (peso medio 20 g). La posibilidad de una transferencia génica eficiente mediante la entrega de ADN desnudo despertó un gran interés puesto que permitía expresar una proteína heteróloga utilizando un procedimiento más seguro que la terapia génica viral. Distintos grupos de investigación dedicaron sus esfuerzos a mejorar la técnica para que fuera lo más segura, eficiente y reproducible posible [26].
En la siguiente figura se muestra lo que ocurre a nivel de la circulación sinusoidal en el hepatocito antes y después de inyectar, en sentido retrógrado, una solución salina conteniendo un plásmido. La inyección de la solución génica a través de la cola alcanza el hígado en sentido retrógrado y provoca un aumento en
la presión dentro del vaso. Esto crea una distensión en la pared que permite la separación momentánea de las células endoteliales. Cuando esto ocurre, el ADN tiene facilitada su salida del vaso sanguíneo a través de los poros sinusoidales y los espacios intercelulares y alcanza el espacio de Disse. De ahí se entrega al hepatocito, en cuyo proceso, la formación masiva de vesículas endocíticas debe desempeñar un papel relevante. Este ADN debe alcanzar el núcleo del hepatocito para que su información genética pueda ser decodificada. Cuando este proceso ocurre de manera eficiente, el ADN se transcribe a ARN y éste se traduce a proteína para su liberación a la sangre (si se trata de una proteína de secreción).
Figura 4. Representación esquemática del procedimiento de transferencia génica
hidrodinámica hepática en ratón. A la izquierda se muestra el sistema vascular
hepático, indicando el sentido del flujo sanguíneo. A la derecha de la imagen se puede observar la organización del sinusoide en condiciones normales (superior) y lo que ocurre tras la inyección retrógrada de una solución génica (inferior). Cuando se inyecta por la vena de la cola (sentido retrógrado) una solución conteniendo un plásmido, aumenta la presión en el interior del vaso, lo que crea una distensión del mismo y la separación de las células endoteliales. Esto permite la entrada del constructo al espacio de Disse (dilatado) y al hepatocito mediante la formación masiva de vesículas endocíticas.
Utilizando este procedimiento, nuestro grupo consiguió alcanzar unos niveles de expresión plasmática terapéuticos para la proteína de la alfa-1-antitripsina humana en ratón durante periodos de tiempo superiores a 6 meses [27]. En la actualidad, se están realizando experimentos de terapia génica para el tratamiento de distintas patologías en ratón con este mismo procedimiento [28- 30]. La posibilidad de alcanzar concentraciones terapéuticas
mantenidas de una proteína heteróloga tras la perfusión hidrodinámica de un gen humano en ratón, impulsó a centrar los esfuerzos en desarrollar y adaptar el procedimiento en animales de mayor tamaño con la intención de trasladarlo a la clínica, ya que los cambios hemodinámicos inducidos por la inyección hidrodinámica son incompatibles con su uso en humanos. Las condiciones de perfusión que conseguían alcanzar los mejores resultados en ratón representan doblar la volemia del animal en un periodo de tiempo muy breve. El procedimiento debe ser necesariamente adaptado puesto que las condiciones hidrodinámicas empleadas en el ratón no podrían ser toleradas por animales de mayor tamaño. Las modificaciones del modelo iban generalmente encaminadas a disminuir la presión hidrodinámica sistémica. Esto se llevaba a cabo dirigiendo la transferencia génica a un único órgano diana. Se realizaron estudios en modelos animales de rata [31, 32] y conejo [33] sin conseguir obtener resultados que fueran siquiera similares a los obtenidos en ratón. Los esfuerzos más recientes se han dirigido a desarrollar modelos de perfusión hidrodinámica hepática en cerdos por tener una mayor proximidad anatómica con los humanos [34]. En el cerdo se diseñaron estrategias de transferencia mínimamente invasivas mediante la realización de cateterismos hepáticos [35, 36] que, aunque fueron seguras, no mostraron una eficiencia remarcable. Algunos autores apuntaban la posibilidad de que se necesitara una mayor presión intravascular hepática, por lo que se estudiaron distintas estrategias como bloquear el retorno venoso o inyectar la solución en condiciones hemodinámicas más exigentes. En ningún
caso se consiguieron niveles de expresión de una proteína heteróloga cercanos a los terapéuticos. Tras los diferentes trabajos realizados por varios grupos en todo el mundo, no se había conseguido alcanzar ningún resultado alentador [37-41]. No obstante, dado el enorme interés que presenta el procedimiento para ser trasladado a la clínica, es necesario realizar un estudio molecular minucioso de la eficiencia del procedimiento que confirme o refute esta posibilidad. Este análisis permitiría identificar la etapa del proceso de decodificación genética que podía estar limitando la eficacia final. Este trabajo de tesis tiene como objetivo confirmar o refutar el interés traslacional del procedimiento de transferencia génica hidrodinámica mediante el análisis molecular detallado de la entrega, transcripción y traducción del gen, así como su posterior exportación al torrente sanguíneo tanto en modelos animales in vivo como en modelos de tejido humanos ex
vivo. Mediante la adaptación eficiente y segura del procedimiento
de transferencia génica utilizado en ratón, se pretende encontrar las mejores condiciones de eficacia y seguridad en la transferencia génica hepática en cerdos in vivo y en segmentos hepáticos humanos ex vivo. Esta metodología permitirá comparar de manera cuantitativa la eficiencia de diferentes procedimientos para transferir un gen al hígado. Para ello se evalúan algunas alternativas que pueden mejorar la eficiencia del procedimiento, como el cierre vascular parcial o total del órgano, y también la eficiencia del procedimiento alcanzada cuando se transfiere el gen a segmentos hepáticos humanos ex vivo.