La plasticidad en la expresión de un gen es determinante en la adaptabilidad; una de las manifestaciones fundamentales de esta capacidad es la habilidad de las células a usar diferentes fuentes de carbono. Esto es consecuencia de un complejo grupo de sensores y rutas de señalización que lideran la expresión de transportadores y enzimas metabólicas.
En la naturaleza S. cerevisiae tiene la capacidad de adaptarse un amplio rango de fuentes fermentables y no fermentables de carbono (L-azucares, etanol, acetato, glicerol, etc.). La glucosa es la fuente de energía más utilizada en las células; en respuesta a esta fuente de carbono existe una matriz compleja en las rutas de las señales de transducción coordinadas con diversas respuestas metabólicas, como por ejemplo la glucólisis, la disminución de la actividad respiratoria, el incremento de la biogénesis de los ribosomas, además de la regulación en el crecimiento y desarrollo.
El primer paso en el catabolismo exógeno de la fuente de carbono es usualmente el transporte de la molécula a través de la membrana celular; los genes HXT (transportadores de hexosas) son los encargados de la expresión de las proteínas que facilitan la difusión de glucosa, fructosa y otros azucares a través de la membrana (Yin et al., 2003; Flick et al., 2003). Las proteínas HXT pertenecen a la súper familia de facilitadores MFS, se ha encontrado que para S. cerevisiae existen 17 familias potenciales, estas proteínas son capaces de transportar pequeñas cantidades de solutos a través gradientes quimiostáticos, asimismo de equilibrar los sustratos a través de la membrana en ambas direcciones (Nelissen et al., 1997; Saier et al., 2000; Bannam et al., 2004).
La secuencia y los análisis bioquímicas de diversas MFS sugieren que están compuestos de 12 segmentos transmembranales (TMs) de estructura tipo α-hélice, seis hélices están localizadas fuera de la membrana citoplasmática y 6 hélices dentro, formando un canal que facilita el transporte bidireccional del sustrato (Hirai et al., 2002). Las proteínas HXT son similares en su secuencia amino terminal y trabajan independientemente, facilitando los mecanismos de difusión y exhibiendo diferentes afinidades por los diferentes sustratos (glucosa, fructosa, manosa y/o galactosa). La modulación de la afinidad de los transportadores de hexosas HXT por una u otra fuente de carbono y a interacción entre ellos puede contribuir a la habilidad de adaptación a las diferentes concentraciones del azúcar por las células de
levadura (Saloheimo et al., 2007). En S. cerevisiae la expresión de los genes HXT se regula a través del balance de dos rutas opuestas, represión e inducción las cuales son reguladas o inhibidas respectivamente por glucosa. Existen 18 genes que codifican para proteínas transportadoras de hexosas HXT1 a HXT17, GAL2 (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001; Ferrer et al., 2004). En S. cerevisiae hay dos sistemas de transporte, uno constitutivo que es un sistema de baja afinidad (Km 15 a 20 mM) y uno represivo de glucosa que es un sistema de alta afinidad (Km 1 a 2 mM).
En investigaciones realizadas encontraron que una cepa mutada en los genes HXT1 al HXT7 no fue apta para crecer en glucosa, fructosa ni manosa y no presento flujo glucolítico. Con estos estudios determinaron que HXT2, HXT6 y HXT7 son genes que expresan proteínas transportadoras de hexosas de alta afinidad la presencia de cualquiera de estos genes es suficiente para que la cepa mutante crezca en una baja concentración de glucosa (0.1%). Los genes HXT1, HXT3 y HXT4 son genes que codifican para transportadores de baja afinidad, y su presencia es suficiente para que la cepa mutante crezca en altas concentraciones de glucosa (más del 1%). Los genes HXT8 al HXT17 codifican para proteínas que son incapaces de transportar glucosa (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001; Yin et al., 2003).
5.5.1. Regulación transcripcional en S. cerevisiae: señalización por glucosa
La regulación de la concentración de hexosas en las células de levadura, es mediante la expresión de los genes HXT vía señalización desde receptores de baja y alta afinidad de glucosa (Ozcan et al., 1999, 2002; Flick et al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006). El gen SNF3 codifica una proteína situada en la membrana citoplasmática (Snf3p) que censa bajas concentraciones de sustrato, en cuanto a hexosas se refiere, esta activa la inducción de un grupo de transportadores de hexosas de alta afinidad, la deficiencia de la proteína lleva a una pérdida de los transportadores. Snf3p es requerida para la inducción de los genes HXT2, HXT3 Y HXT4 (Flick et al., 2003; Ozcan et al., 1999). El gen RGT2 codifica Rgt2p (proteína censora de altas concentraciones de glucosa) está situado en la membrana citoplasmática, este requerido para la expresión máxima de la inducción del gene HXT1 (Ozcan, 1996, 1999). El alto grado de similitud entre Snf3 y Rgt2 sugiere que ambas proteínas censan glucosa de una forma similar y pueden actuar sobre las mismas proteínas o similares para transmitir la señal de glucosa. Tanto Rgt2p como Snf3p, tienen un 70% de homología entre ellos y un 30%
con otros miembros de la familia HXT. Como se menciono anteriormente, no transportan glucosa pero sirven como sensores extracelulares de glucosa, fructosa y manosa generando una señal intracelular de inducción que no requiere del transporte o metabolismo de la glucosa para la expresión de HXT (Dietvorst et al., 2009). Ambas proteínas, están constituidas por dos diferentes dominios: 12 dominios transportadores transmembranales y un dominio C-terminal la cual se predice esta en el citoplasma; Snf3 tiene dos secuencias de 25 aminoácidos y Rgt2p solo una, aparentemente esta terminación es la responsable en la generación de la señal de la expresión de los genes HXT. Se ha sugerido que el cambio conformacional inducido por la unión de la glucosa al dominio transmembranal, afecta el dominio C-terminal y la forma en cómo interacciona con otros componentes se sugiere que probablemente sirve como un dominio de señalización que interactúa con los componentes cercanos en la ruta de la señal de transducción (Ozcan et al., 1996, 1999; Lafuente et al., 2000).
5.5.2. El represor transcripcional RGT1
El controlador final en la ruta de traducción en la señal de glucosa es RGT1, ruta la cual inicia con el sensado en la superficie de la membrana y termina en el núcleo, regulando la expresión de los transportadores de glucosa. RGT1 pertenece a la familia GAL4 de factores de transcripción, es requerido para la represión transcripcional de HXT1-HXT4 en ausencia de glucosa; este gen codifica para un represor transcripcional, Rgt1p, una proteína que contiene un grupo Zn2Cys6 responsable de la unión al ADN, la cual reconoce varios sitios de
unión a los promotores de los genes HXT ya que un solo sitio de unión no es suficiente para una represión significativa (Ozcan et al., 1999; Kim et al., 2003; Flick et al., 2003). La función de Rgt1p es regulada por una interacción intramolecular entre la región-N terminal y la región media de RGT1, se sugiere que esto inhibe la unión al DNA con el dominio de RGT1 (Dombek et al., 2004). RGT1 sirve también como activador transcripcional y es requerido para la completa expresión del gen HXT1 cuando los niveles de glucosa son altos, aunque la forma en cómo se convierte de represor transcripcional a un activador no es clara aun. Lo cierto es que el nivel de glucosa determina el estado de fosforilación de Rgt1p; esta hipofosforilado en ausencia de glucosa e hiperfosforilado cuando los niveles de glucosa son altos (Lafuente et al., 2000; Kim et al., 2006).
En ausencia de glucosa Rgt1p, en conjunto con Mth1, un regulador negativo en la señalización de glucosa y Std1p una proteína involucrada en el control de la regulación de glucosa, se une a los promotores de los genes HXT y a los correpresores transcripcionales Ssn6 y Tup1, esto estabiliza el dominio represivo en la cromatina e inhibe directamente a la RNA polimerasa reprimiendo la expresión de los genes HXT (Lafuente et al., 2000; Flick et
al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006).
En presencia de glucosa, cuando la señal es generada por Snf3 y Rgt2, es transmitida a Rgt1 a través de Grr1, inhibiendo la represión transcripcional de Rgt1, aunado a la degradación inducida por glucosa de Mth1 y Std1, permitiendo que los genes HXT se expresen (Kim et al 2003, 2006; Ramakirshnan et al., 2006). En la activación por glucosa la PKA (cAMP-proteinquinasa) cataliza la fosforilación de Rgt1 inhibiéndolo, permitiendo la expresión de los genes HXT. La PKA está involucrada en diversos procesos celulares, entre los que se encuentra el crecimiento celular, resistencia al estrés y en el metabolismo en general. Diversos estudios han demostrado que las células de levaduras deficientes en PKA no son capaces de expresar los genes HXT1 y HXT3 en presencia de glucosa (Lafuente et al., 2000; Polish et al., 2005; Kim et al., 2006; Belinchon et al., 2006).
5.5.3. Las proteínas Grr1, Hxk2 y Reg1
La represión en la expresión de los genes HXT en presencia de glucosa requiere de la proteína Grr1p, una proteína que se expresa constitutivamente a muy bajos niveles y pertenece al complejo SCF (Skp1/cullin/F-box) cada una de las cuales poseen diferentes componentes F-box. La naturaleza de la proteína F-box determina la especificidad de la interacción con el complejo de enzimas de ubiquitinación (Ubcs) y su blanco. Grr1 se une a los sustratos en la proteólisis mediante ubiquitinación, esta incluye un motivo carboxilo terminal capaz de interaccionar proteína-proteína, unido así Rgt1 con Grr1 se elimina la interacción con el correpresor dando lugar a una activación transcripcional (Hsiung et al., 2001; Flick et al., 1991, 2003; Vallier et al., 1994). En ausencia de glucosa, Rgt1 está presente en la forma no-ubiquinada y actúa como represor al unirse a Ssn6 y Tup1, proteínas que forman un complejo correpresor que reprime la transcripción de algunos genes interaccionando directamente con las histonas H3 y H4 (Watson et al., 2000; Davie et al., 2003; Zhang et al., 2004; Fagerstrom-Billai et al., 2007).
La levadura S. cerevisiae es capaz de detectar los niveles extracelulares de glucosa y generar señales intracelulares que resultan en respuestas adecuadas a las variaciones en la composición del medio; la mayoría de estas respuestas involucran alteraciones en la expresión de los genes, una parte de estas alteraciones ocurren por los niveles de trascripción del mARN, por la represión o activación en la trascripción de diversos genes implicados en la codificación de enzimas en el metabolismo de carbono; entre estas se encuentra una isoenzima hexoquinasa 2 (Hxk2). Cuando las células de la levadura están creciendo en un medio fermentable compuesto por glucosa, fructuosa o manosa como fuente de carbono, el gen HXK2 codifica la enzima Hxk2p, la cual cataliza la fosforilación de glucosa en el carbón 6 en el citosol. Se encontró que la interrupción del gen HXK2 tuvo un profundo efecto en las transcripciones de genes relacionados con el ciclo TCA (Ciclo de los ácidos tricarboxílicos o de Krebs), al igual que en la tasa de respiración, y en la síntesis de ATP. Al realizar la cinética de producción de etanol con la mutante hxk2-delta presentó una menor producción que la cepa que no tenía interrumpido el gen HXK2. Hxt2p juega un rol específico durante la señalización de glucosa ya que es requerida para la represión de algunos genes por glucosa, es específicamente requerida para una fuerte inducción de HXT1 por altas concentraciones de glucosa y para HXT4 en bajas concentraciones (Belinchon et al., 2006; Westergaard et al., 2007). Hxk2 depende de la cantidad de Mig1 presente en el núcleo, Moreno et al. (2005) analizaron la interacción tanto in vivo como in vitro de Hxk2-Mig1; encontraron que el complejo es necesario para la translocación de Mig1 al núcleo. Dilucidaron que el mayor funcionamiento de Mig1 en inhibir la función de la proteinkinasa Snf1 cuando la bloquea por fosforilación. Mig1 en un factor involucrado en la represión transcripcional de glucosa, que tiene una secuencia especifica de unión al ADN y es regulado por SNF1 (serinproteína/treonin quinasa) y GLC7 fosfatasa (Nehlin et al., 1990; Verma et al., 2005). De la Cera et al. (2002) demostraron que HXK2 Y MED8 están asociados fisiológicamente ya que ambas proteínas Hxk2p y Med8p se encuentras interaccionando juntas en las uniones con los segmentos de DNA que contienen los sitios MED8, concluyeron que Hk2p opera a través del sitio MED8 por interacción con Med8p, en la traducción en la ruta de señalización de glucosa en
Saccharomyces cerevisiae. MED8 es una subunidad mediadora del complejo de la ARN
polimerasa II cuando actúa como represor previene que la polimerasa se una al promotor, cuando actúa como activador se une a la polimerasa e incrementa la afinidad con el promotor o simula la transición de cerrado a abierto complejo promotor-polimerasa (en la burbuja de trascripción en la cual la doble hélice de ADN se une para facilitar el inicio de la trascripción) (Kornberg et al., 2005; Westergaard et al., 2007). Otra proteína que participa en el proceso
inhibidor de los genes represivos es Reg1p, una proteína magnesio dependiente serin-treonina fosfatasa (AMD fosfatasa) contiene una subunidad catalítica de 38 kDa y una subunidad moduladora de 23KDa, tiene actividad fosfatasa. Reg1p interacciona fuertemente con Glc7p, una proteinfosfatasa tipo-1 que participa en diferentes procesos que incluyen represión de glucosa, crecimiento celular y acumulación de glicógeno. Reg1 interacciona a través de Glc7p con el dominio kinasa de Snf1p resultando la desfosforilación e inactivación de Snf1p y de algunos genes involucrados en la represión de glucosa. Esta interacción juega un rol importante en el transporte de Fbp1p (fructosa 1-6 bifosfatasa) como intermediario de importación y degradación de las vesículas a las vacuolas durante la inducción de glucosa (Tung et al., 1992; Cui et al., 2004; Kenneth et al., 2004).