Tungstato: una molécula moduladora de la toxicidad de FK506.

La última parte de nuestro trabajo se centró en el estudio del mecanismo de acción de una pequeña molécula moduladora de los efectos de FK506, el tungstato. Esta sal inorgánica, usada como agente antidiabético, fue capaz de rescatar el defecto de crecimiento que provoca FK506 en levadura. Este rescate es independiente de la interacción del inmunosupresor con su diana terapéutica conocida, calcineurina. Tungstato potenció la activación de la ruta

GCN inducida por FK506 y exacerbó el fenotipo de sensibilidad osmótica

inducido por el inmunosupresor. Además, se demostró que tungstato es capaz de modular la activación de Hog1p y la expresión génica Hog1p-dependiente, aunque sin causar un fenotipo observable. El hecho de que la inducción de la ruta GCN por tungstato sólo se produzca en presencia de otro inductor sugiere la modulación de un regulador de la ruta. Tungstato fue capaz de inhibir in vitro a la fosfatasa Glc7p, regulador negativo de la ruta GCN, y a su ortólogo mamífero PP1. Además, un mutante con baja actividad Glc7p mimetizó la resistencia a FK506 que produce tungstato y los datos de interacción genética con el mutante gcn2-507 son consistentes con una inhibición in vivo de la fosfatasa. Por otro lado, tungstato produce en la levadura fenotipos relacionados con la homeostasis iónica. En este efecto de tungstato podrían estar implicadas tanto Glc7p como la fosfatasa Ppz1p, a la que tungstato inhibe

in vitro, como la propia ruta GCN, cuya activación constitutiva demostró tener

efectos en la regulación iónica celular.

3.1 Efecto de tungstato sobre la toxicidad de FK506 en levadura.

Tungstato rescató la toxicidad de FK506 en levadura. Como la causa principal del defecto de crecimiento inducido por el inmunosupresor es el ayuno de triptófano, cabría pensar que tungstato está solucionando de algún modo este problema. Posibles explicaciones de este rescate son: 1) que tungstato estuviera evitando el evento responsable del ayuno; 2) que éste se estuviera paliando al aumentar la entrada de nutrientes en la célula y 3) que tungstato

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mejore la respuesta celular al ayuno. El ayuno producido por FK506 dispara la ruta GCN, responsable de la inducción de la biosíntesis de aminoácidos. Tungstato potenció la activación de esta ruta, mejorando de este modo la respuesta celular al ayuno. Por tanto, las dos primeras opciones pueden descartarse, al menos como causa principal, porque en ninguna de ellas se produciría una sobreactivación de la ruta de control general de nutrientes. Además, un mutante con una alta capacidad de incorporación de aminoácidos, como el ∆ppz1,2 (Yenush, Mulet et al. 2002), siguió respondiendo a la inducción de la ruta por parte de FK506 y su sobreactivación por tungstato (Figura 35). La sobreactivación de la ruta GCN es consistente con el hecho de que tungstato exacerbó la osmosensibilidad de la levadura en presencia de FK506. Ya hemos visto que esta osmosensibilidad dependiente de FK506 se debe en parte a la activación de la ruta GCN en presencia del estrés osmótico. Tungstato no fue capaz de activar la ruta GCN en ausencia de FK506. Este comportamiento sugiere la actuación de la sal sobre un regulador de la ruta. Efectivamente, tungstato inhibió a la fosfatasa Glc7p in vitro y un mutante con baja actividad de esta fosfatasa se mostró resistente a los efectos de FK506. Glc7p es una fosfatasa que regula negativamente a la ruta GCN defosforilando el factor eIF2α. El rescate por tungstato del crecimiento en condiciones de ayuno del mutante gcn2-507 (con baja actividad Gcn2p) y no del ∆gcn2 sugieren además que esta inhibición de Glc7p también está ocurriendo in vivo. Por otro lado, tungstato no aumentó la osmosensibilidad en presencia de FK506 del mutante ∆gcn4, ya de por sí parcialmente resistente a este efecto. Se refuerza así la hipótesis, discutida en apartados anteriores, de la participación de genes regulados por Gcn4p en la toxicidad de la ruta GCN sobre la respuesta a estrés osmótico.

Tungstato exacerbó la sensibilidad osmótica inducida por FK506. Esto se puede explicar por el efecto negativo que sobre la ruta HOG tiene la activación de la ruta GCN y que se discute en apartados anteriores. Sin embargo tungstato también es capaz de modular la cinética de activación de la kinasa Hog1p y su respuesta transcripcional (Figura 29). En esta modulación podrían estar implicadas las fosfatasas reguladoras de Hog1p, Ptp2p y Ptp3p, ya que

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tungstato ha demostrado ser un buen inhibidor de tirosina-fosfatasas (Barford, Flint et al. 1994). Aunque fenotípicamente esta alteración no parece ser determinante a las dosis de tungstato utilizadas, son necesarios más experimentos para establecer su importancia en la ruta de respuesta a estrés osmótico.

La inhibición de una fosfatasa de eIF2α por parte de tungstato parece mediar la sobreactivación de la ruta GCN y por tanto, el rescate del defecto de crecimiento inducido por FK506. De acuerdo con ello, un mutante con baja actividad Glc7p es parcialmente resistente a FK506 (Figura 37) y a la regulación de la activación de la ruta GCN por tungstato (Figura 38). Además, tungstato rescata el crecimiento de un mutante gcn2-507 con baja actividad Gcn2p en presencia de 3AT, lo que es consistente con una inhibición in vivo de

Glc7p (Wek, Cannon et al. 1992). El hecho de que tungstato inhiba in vitro tanto

a Glc7p como a su ortólogo mamífero, la subunidad catalítica de PP1, indica que la inhibición de tungstato es directa sobre la actividad enzimática de la fosfatasa, más que sobre su afinidad por ciertas subunidades reguladoras específicas. Aunque tampoco se puede descartar esta posibilidad ya que se ha descrito la inhibición por tungstato de la interacción entre la fosfatasa Cdc14p y su regulador Net1p (Traverso, Baskerville et al. 2001). Por tanto, la acción de tungstato sobre la célula puede ser tan pleiotrópica como las funciones de la fosfatasa que inhibe. Glc7p ejerce funciones tanto en la regulación de la homeostasis iónica (Williams-Hart, Wu et al. 2002) como en la de la progresión del ciclo celular (Hisamoto, Sugimoto et al. 1994). De este modo se podrían explicar otros efectos del tratamiento con el agente antidiabético. Tungstato provocó: 1) resistencia a LiCl y NaCl y sensibilidad a KCl (Figura 30); 2) aumento de la expresión del gen ENA1, y 3) retraso de la entrada en ciclo tras arresto con factor α (Figuras 34 y 40), aunque este último efecto es independiente de Glc7p (Figura 40). Para explorar el efecto que tungstato pueda tener sobre otras funciones de Glc7p se hacen necesarios más experimentos. Entre estas funciones cabe destacar aquéllas implicadas en el metabolismo de la glucosa, como la represión por catabolito (Tu y Carlson 1994) y la síntesis de glucógeno (Cannon, Pringle et al. 1994). Además, hay que mencionar que tungstato produce en levadura una cinética de crecimiento

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caracterizada por un ligero retraso en el inicio de la fase exponencial y un mayor rendimiento de biomasa (datos no mostrados). Estas observaciones son consistentes con una inhibición de la fermentación y un aumento de la respiración. Hay que recordar que el vanadato, compuesto muy similar al tungstato, inhibe la glicolisis a través de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Benabe, Echegoyen et al. 1987).

Tampoco hay que descartar la propia (sobre)activación de la ruta GCN como responsable de los fenotipos inducidos por tungstato. Una cepa que expresa una versión constitutivamente activa de la kinasa Gcn2p también presenta resistencia a LiCl y sensibilidad a KCl (Figura 41). Además, ya se ha descrito la participación de esta ruta en la respuesta a estrés salino (Goossens, Dever et

al. 2001). En cuanto a su participación en ciclo, recientemente se ha descrito la

implicación de dos ortólogos de Gcn2p en mamíferos, PERK y GCN2, en el arresto de ciclo en respuesta a estrés de retículo (Hamanaka, Bennett et al. 2005).

Por otro lado no se puede descartar la existencia de otras posibles dianas de tungstato mediadoras de todos estos fenotipos, como ya se ha visto para el retraso en la progresión de ciclo celular (Figura 40). Una posibilidad es la de las fosfatasas Ppz1p y Ppz2p, importantes en la regulación de la homeostasis iónica y progresión del ciclo celular (Yenush, Mulet et al. 2002), así como de Ena1p (Ruiz, Yenush et al. 2003). Tungstato inhibió in vitro a Ppz1p (Figura