se han podido identificar los distintos dominios estructurales y funcionales de cada una de ellas, de acuerdo a la caracterización de estas mismas proteínas en otros organismos. En el caso de la proteína MRE11 de trigo, para los tres genomas, se identificaron los cuatro dominios fosfoesterasa que definen la actividad nucleasa de la proteína, localizados en la mitad N-terminal. En el alineamiento llevado a cabo, se puede ver que estos dominios presentan una gran homología entre todas las especies analizadas, incluso tratándose de especies tan alejadas evolutivamente del trigo como la levadura o el hombre. También se ha encontrado un dominio de unión a ADN en la región central de la proteína, donde el grado de homología entre los ortólogos disminuye ligeramente, sobre todo con la humana y la de levadura. A la vista de estos alineamientos se observa que las pocas diferencias encontradas entre las proteínas de trigo normalmente se localizan fuera de los dominios conservados. En cuanto a los dominios de unión a NBS1 y RAD50, se localizarían en las regiones N-terminal y C-terminal, respectivamente, aunque no se han definido exactamente las regiones correspondientes a los mismos, al igual que para un segundo dominio de unión a ADN en C-terminal. La existencia de estos dominios en las secuencias caracterizadas se pone de manifiesto por la gran homología que presentan respecto de otras proteínas previamente caracterizadas y por el hecho de que se han detectado uniones entre ellas, al menos con RAD50, mediante los ensayos de doble híbrido.
En el caso de RAD50 se han definido los dominios ATPasa de tipo ABC (ATP
Binding Cassette) en N-terminal y en C-terminal (Hopfner y col., 2000, 2001, 2002;
Wiltzius y col., 2005); estas regiones a su vez contienen dominios menores como son Walker A y Walker B, así como los dominios P-loop, Q-loop, D-loop y H-loop. También se encuentra el dominio hook con la secuencia conservada CXXC implicada en la coordinación de iones de zinc para la interacción entre dos complejos, de forma que al comparar este dominio en las proteínas de trigo con las otras proteínas de plantas conocidas se ha visto que la secuencia consenso CXXC para este dominio en plantas sería CPCC. A ambos lados de este dominio se encuentran las regiones de la cola, que se plegarán de forma antiparalela para dar lugar a la estructura característica de estas proteínas. En este caso las regiones más conservadas se corresponden con los dominios ATPasa, encontrándose gran homología entre todas las proteínas estudiadas, y observándose que las diferencias encontradas entre las proteínas RAD50 de trigo se
Discusión
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encuentran fuera de estos dominios mencionados, y especialmente fuera de los dominios ATPasa conservados.
En cuanto a NBS1, las proteínas expresadas a partir de los distintos genomas de trigo presentan una alta homología, similar a los casos anteriores; sin embargo, cuando son comparadas con las procedentes de otras especies esta homología es mucho menor, quedando reducida en el caso de humanos y levaduras a pequeñas regiones de unos pocos aminoácidos en los dominios FHA y de unión a MRE11. En trigo se han localizado los dominios FHA y BRCT, ya descritos en otras proteínas como es el caso de la proteína NBS1 humana, aunque el dominio BRCT está ausente en la proteína XRS2 de levaduras (Kobayashi y col., 2004). Al igual que en el resto de genes caracterizados(Desai-Mehta y col., 2001; Paull y Gellert, 1999; Tauchi y col., 2001) hay dos puntos de posible fosforilación por parte de kinasas como pueda ser ATM, motivos SQ en la región central de la proteína, y los dominios de unión a las proteínas MRE11 y ATM en C-terminal. Son estos últimos dominios los que aparecen especialmente conservados, junto con el dominio FHA cuando se comparan con otras proteínas ortólogas, y de hecho el dominio de unión a MRE11 fue empleado por el grupo de Akutsu y col. (2007) para hacer una búsqueda en las bases de datos, a partir del dominio de la proteína de pollo, encontrándose así las primeras proteínas NBS1 en plantas, concretamente en arroz y Arabidopsis thaliana.
Un aspecto añadido a la caracterización molecular de los genes del sistema MRN es el de su localización cromosómica. En principio es importante señalar que la localización de secuencias de ADN de copia única en plantas es un objetivo complicado, entre otras razones por la presencia de la pared celular que dificulta la obtención de preparaciones cromosómicas de buena calidad, siendo frecuente la presencia de citoplasma en las mismas, lo que aumenta el ruido de fondo de señales inespecíficas (Khrustaleva y Kik, 2001). Además el alto grado de compactación del ADN en los cromosomas metafásicos de las especies vegetales, así como el gran tamaño del genoma y el alto contenido en secuencias repetidas en el caso concreto del trigo, dificultan aún más este objetivo (Wang y col., 2006). Por ello hasta la fecha, la gran mayoría de trabajos de
FISH realizados en cereales se han limitado a la localización de secuencias de ADN
repetidas (Cuadrado y col., 2000; Cuadrado y Jouve, 2007a, 2007b; Cuadrado y Schwarzacher, 1998; Heslop-Harrison y col., 1991). No obstante, dada la longitud del gen