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El término EAS hace referencia a un grupo heterogéneo de enfermedades caracterizadas por compromiso articular con entesitis tanto del esqueleto axial como periférico, artritis y, con menor frecuencia, manifestaciones extra articulares que comprometen piel, ojos, mucosas, corazón, pulmón etc. Se encuentran fuertemente ligadas a factores genéticos y en algunos pacientes a infecciones por bacterias artritogénicas. Su presentación y curso clínico están influenciados por la raza, el sexo y la edad de inicio de la enfermedad (1).
En este grupo de enfermedades existen diversas formas, según algunas características clínicas y etiológicas, a saber: espondilitis anquilosante EA, artritis reactivas, ARe, artritis psoriásica, APs y las espondiloartropatías indiferenciadas,
EASI. Se ha informado que los pacientes con espondiloartropatías frecuentemente poseen el antígeno de histocompatibilidad HLA-B27, y la proporción de la relación es diferente según las diversas formas de la enfermedad. En la EA, 95% de los pacientes lo poseen, en las ARe, 70% a 80%, en la APs, 50%, y en las formas indiferenciadas, 0% a 10%, por lo cual el HLA-B27 se considera que es un factor de riesgo genético para padecer EAS (1-3). Se sabe que la prevalencia de la EA es diferente según el grupo racial y se relaciona estrechamente con la frecuencia de expresión del HLA-B27 en dicha población; por ejemplo, su prevalencia en África es de 0,01% (4), en China de 0,11% y en la raza blanca de Inglaterra y Estados Unidos es de 0,5% a 1,0% (5).
En el Servicio de Reumatología del Hospital Militar Central de Bogotá, D.C., Colombia, se caracterizó un grupo de pacientes con EAS, en el cual 48% presentó diagnóstico de ARe (60% con HLA-B27), 32,5% tenía la forma indiferenciada (39% con HLA-B27), 11% correspondió a EA (88% con HLA-B27) y 8,2% presentaba APs (6).
La presencia del genotipo HLA-B27 se considera un criterio diagnóstico de espondiloartropatía axial y su determinación es la única prueba de laboratorio
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disponible (7). Sin embargo, un considerable porcentaje de sujetos normales es positivo para este marcador; por ejemplo, en personas caucásicas la frecuencia de expresión del HLA-B27 es de 6% a 8%, lo cual demuestra que su determinación tiene una alta sensibilidad pero una baja especificidad (8). Por lo tanto, se impone la necesidad de investigar biomarcadores adicionales.
El estudio de biomarcadores –definidos como moléculas que reflejan un proceso biológico o patológico específico– en las enfermedades reumáticas, incluyendo las EAS (9), ha surgido como un área importante y necesaria dentro de la investigación básica y clínica. Se necesitan principalmente dos tipos de biomarcadores para estudiar las EAS, uno que mida la probabilidad de saber si un paciente en particular sufre la enfermedad, y el otro que indique si ésta tiene un alto o un bajo grado de actividad.
Un reto en las EAS ha sido encontrar un tejido que refleje el estado de la enfermedad para evaluarlo de manera más sistemática, lo cual no es fácil pues la enfermedad afecta principalmente los tejidos de la entesis, sitio de difícil acceso dado que es el punto de inserción al hueso de los tendones, la cápsula articular, el ligamento y las fascias musculares. En muchos estudios se analiza el tejido más cercano a la entesis; también se han tomado muestras de membrana sinovial de casos de EAS o EA y se han comparado con las de enfermos con osteoartrosis y artritis reumatoidea. De esta manera, se ha identificado un grupo de proteínas asociadas al metabolismo oxidativo, como la peroxirredoxina 4 y la superóxido dismutasa, entre otras, y se han encontrado mayores niveles en la artritis reumatoidea y menores en las EAS y en la osteoartrosis (10).
En los pacientes con EAS, la VSG y la PCR son las pruebas más usadas para determinar biomarcadores en muestras de sangre. Sin embargo, los valores de estas dos pruebas son reflejo de varias condiciones inflamatorias que son inespecíficas. A pesar de que en algunos estudios se han identificado pequeños
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grupos de proteínas capaces de diferenciar diferentes estadios de la enfermedad, no brindan más información que la VSG y la PCR (11).
En muchos trabajos de investigación se ha usado la cuantificación de diversas citocinas como potenciales biomarcadores, para comparar pacientes con artritis reumatoidea, EAS y Artritis Psoríatica. Por ejemplo, se ha encontrado aumento de IL-1, TNF-alfa, IL-12p40 e IL-13 en los pacientes con artritis reumatoidea (12). En un estudio reportado por Thomas et al. (13), se encontró que los niveles de IL-1Beta, IL-4, IL-15, IL-17, IFN- gamma, TNF-alfa, IL12p40 e IL-6 eran significativamente mayores en los pacientes con EA con respecto a los voluntarios sanos.
Con base en estos antecedentes con el fin de acercarnos al estudio de los biomarcadores en las EAS, en la fase inicial de este trabajo se llevó a cabo un estudio transversal analizando el suero y el líquido sinovial de un grupo de pacientes con diagnóstico de EAS del Servicio de Reumatología del Hospital Militar Central; se analizaron simultáneamente muestras de voluntarios sanos no relacionados. El grupo de estudio estuvo conformado por 73 pacientes: 42 con EA, 19 con EASI y 12 con ARe. De los pacientes con EAS, 21,4% eran mujeres y 78,5% presentaban el HLA-B27. El promedio de edad fue de 25,9±9,9 años, con un promedio de duración de la enfermedad de 62,4±70,4 meses.
Se cuantificaron los niveles de 22 citocinas, tanto en el suero como en el líquido sinovial, mediante el método Beadlyte® Multiplex-ELISA-Luminex (Upstate, cat. 48-011), que permite analizar en forma simultánea las citocinas IL-1alfa, IL- 1Beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, GM-CSF, IFN-gamma, TNF-alfa, eotaxina, MCP-1, RANTES, M1P-1alfa e IP-10.
Los resultados se analizaron y se compararon agrupando a los pacientes de acuerdo con el diagnóstico, de la siguiente forma:
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-análisis del suero de cada grupo de pacientes con diagnóstico de EA, EASI o ARe, en comparación con el grupo de controles sanos y por subtipos entre ellas. -comparación de los valores de las citocinas del líquido sinovial y del suero de los pacientes con diagnóstico de ARe y EASI.
El 26,3% de los pacientes con EASI eran mujeres, el promedio de edad fue de 28,4±10,6 años, y tenían un promedio de duración de la enfermedad de 25,1±32,6 meses. En 31,5% se confirmó la presencia del HLA-B27 y 47,4% manifestó sufrir dolor lumbar.
En el grupo de pacientes con ARe, 25% eran mujeres, el promedio de edad fue de 27±9,4 años, y tenían un promedio de duración de la enfermedad de 15 meses (DE=28,3 meses). El 25% poseía el HLA-B27 y 25% presentaba dolor lumbar (Tabla 3.1). El 50% del grupo control de 35 voluntarios estuvo constituido por mujeres con promedio de edad de 28,7±8,2 años.
De las 22 citocinas analizadas y comparadas entre el grupo de EA (n=42) y el grupo control (n=35), usando la prueba U de Mann- Whitney con corrección de Bonferroni, se encontró una diferencia significativa sólo para la IL-6 (p=0,0022). La concentración promedio para el grupo de EA fue de 61±46,7 pg/ml y para el grupo control de 0,5±3,0 pg/ml (Tabla 3.2).
Los pacientes con EASI y ARe se reunieron en un solo grupo para efectuar el análisis y se compararon con el grupo control. En este caso, los valores de la IL- 1alfa fueron significativamente mayores en los enfermos que en los controles (318,6±105,5 pg/ml contra 24,9 pg/ml). Sucedió lo mismo con los niveles de IL-6 (1.026,3±234,5 pg/ml contra 0,5 pg/ml) y con los niveles de IP-10 (7.345,8±1.579 pg/ml contra 198,5 pg/ml). En todos los casos, el valor de p fue menor de 0,001 (Tabla 3.3). La tercera comparación se hizo entre el grupo mixto de pacientes con EASI y con ARe frente a los pacientes con EA; las citocinas IL-1alfa y la IP- 10se
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encontraron aumentadas significativamente en los pacientes del grupo mixto (p=0,00001) (Tabla 3.4).
Además, al comparar los niveles de citocinas entre las muestras de líquido sinovial y el suero del grupo mixto de pacientes EASI (n=19) y ARe (n=12) , se encontraron concentraciones significativamente altas de IL-1alfa (p=0,0001), IL-6 (p=0,0002) e IP-10 (p<0,0083) en el líquido sinovial (Tabla 3.5). Los niveles de citocinas en los casos de EA no fueron diferentes al compararlos entre los que presentaban inflamación articular (n=9) y los que no la presentaron (n=33).
Esta primera tamización nos permitió hacer una preselección de los mediadores, posibles biomarcadores que fueran más interesantes de estudiar, tanto en suero como en líquido sinovial.
Con estos datos y con el fin de continuar la búsqueda de marcadores, se inició la participación en un estudio multicéntrico, en el cual se evaluaron las modificaciones de los valores de estas citocinas en un grupo de 47 pacientes con EA, que habían recibido tres pulsos de anti-TNF-alfa (infliximab). Los antecedentes en estudios clínicos controlados indican que los síntomas clínicos mejoran en la mayoría de los pacientes; sin embargo, no todos los pacientes responden significativamente al tratamiento con anti-TNF-alfa, lo cual puede estar relacionado con el polimorfismo del gen de esta citocina, entre otras variables.
Hasta ahora, el método de referencia para la evaluación de la respuesta al tratamiento está basado en criterios clínicos, autoevaluaciones de los propios pacientes y como resultados de exámenes de laboratorio las únicas mediciones incluidas son generalmente la VSG y la PCR; por lo tanto, se consideró que si se podían detectar de manera temprana los pacientes que respondían a la terapia con anti-TNF-alfa, esto permitiría racionalizar de una manera más adecuada el tratamiento.
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Los resultados demostraron que después de dos semanas de la primera infusión, al analizar de manera combinada el resultado de la VSG, la PCR y el recuento de plaquetas, se podían diferenciar los pacientes que respondían de los que no lo hacían. Además de las 22 citocinas analizadas simultáneamente, la IL- 1alfa sérica disminuyó significativamente (p<0,001) en los respondedores y estos valores más bajos se correlacionaron con la mejoría clínica evaluada con la escala de Assessment of Spondyloarthritis International Society (ASAS)-40 en la sexta semana de tratamiento, otras citocinas a pesar de que sus niveles disminuyeron no correlacionaron con la evaluación clínica (Figuras 3.1, 3.2 y 3.3). Por consiguiente, se podía considerar a la IL-1alfa como un biomarcador de respuesta y seguimiento del tratamiento con anti-TNF-alfa y, además, proponer que esta citocina es generada en el compartimento sinovial en donde se observó una mayor concentración en el líquido sinovial de los pacientes con EASI comparados con su respectivo suero y en los niveles de pacientes con EA comparados con controles sanos (Figura 3.4) ; estos resultados fueron descritos previamente en algunos modelos in vitro de artritis reumatoidea, en los que se afirma que su expresión puede estar regulada por el TNF-alfa local pero no han sido reportados previamente en EAS(14,15).
Este hallazgo es sustentado por los estudios previos, en los que se avanzó en la generación de los agentes anti-TNF-alfa. Los investigadores llegaron a la conclusión de que no era razonable la idea de trabajar sobre varias citocinas proinflamatorias, por su reconocida redundancia, y era más indicado buscar que, al neutralizar una, fuera posible controlar las demás (14).
En los estudios in vitro realizados por Brennan et al. (15) se midió el efecto inhibitorio de los anticuerpos anti-TNF-alfa y anti-linfotoxina sobre la producción de IL-1alfa a partir de las células sinoviales de los pacientes con artritis reumatoidea y osteoartrosis. La producción de IL-1 se reducía significativamente con el
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tratamiento con anti-TNF-alfa y no con la anti-linfotoxina en los pacientes con artritis reumatoidea. En la osteoartrosis los resultados fueron diferentes: la reducción de los niveles de IL-1 alfa no fue significativa, se concluyó entonces, que en la artritis reumatoidea el TNF-alfa puede ser el principal inductor de IL-1 (14).
Otra aproximación a estos resultados se generó en un modelo in vitro en el que se cultivaron linfocitos T y macrófagos derivados de tejido sinovial y se obtuvo espontáneamente producción de mediadores solubles, como citocinas, enzimas de degradación y prostaglandinas; la cinética demostró una producción más prolongada de IL-1 medida directamente mediante ARNm y la proteína (16,17).
Los primeros trabajos en los que se reportó que el TNF-alfa estaba implicado en la producción anormal de otras citocinas proinflamatorias en la artritis reumatoidea, fueron reportados por el grupo de Feldmann en los años 80 (18). Se evidenció que los anticuerpos anti-TNF-alfa podían regular la expresión de otras citocinas que participan en la patogénesis de la artritis reumatoidea, y así comenzaron los primeros ensayos sobre la estrategia de bloquear el TNF-alfa para inducir la disminución de otros mediadores que incluían la IL-1, el GM-CSF y la IL- 6, así como algunas quimiocinas (15,18).
Estos trabajos pioneros produjeron una gran actividad en los estudios de otras enfermedades degenerativas y orientaron a los investigadores a buscar biomarcadores serológicos de respuesta al tratamiento con anti-TNF-alfa. Los estudios futuros deberían dirigirse a evaluar biomarcadores en conjunto con parámetros clínicos individuales.
Dada la dificultad de encontrar marcadores que se relacionen con la evaluación clínica y el resultado inicial sobre las concentraciones de IL-1alfa en el líquido sinovial, se propuso evaluar parámetros clínicos más específicos, como el
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dolor lumbar, simultáneamente con los niveles de citocinas en los pacientes con EA. El dolor lumbar inflamatorio se considera uno de los principales síntomas de la EA; se presenta en edades tempranas, con un inicio insidioso, asociado con rigidez matinal, empeora con la quietud (durante la noche) y no cede al realizar ejercicios, mientras que el dolor lumbar mecánico está asociado a otras causas; sin embargo, únicamente en 5% de los casos de dolor lumbar crónico se diagnostica EA (19,20).
Existen varios reportes en los que se identifican biomarcadores en EA a partir de sangre periférica. No obstante, las comparaciones se han hecho con sujetos sanos y no con grupos de pacientes con dolor lumbar mecánico, el cual es realmente el cuadro clínico diferencial.
El objetivo de esta parte del trabajo fue, entonces, identificar los potenciales biomarcadores derivados de sangre periférica para diferenciar entre pacientes con EA y dolor lumbar mecánico.
Se midieron mediante ELISA los siguientes marcadores inflamatorios en el líquido sinovial y en el suero de 22 pacientes con EAS y 13 con artritis reumatoidea: IL-1alfa, IL-6, IL-8, IL-17, IL-23, MCP-1, MIP-1alfa, MIP-1Beta, TNF- alfa, IFN-alfa, IFN-Beta, MMP-3 y BMP-7. Se encontraron mayores concentraciones de IL-6, IL-8, MMP-3 y MCP-1 en el líquido sinovial, con respecto a los correspondientes sueros (Figura 3.5).
Posteriormente, se analizaron y se compararon las muestras de 50 pacientes con EA y de 27 individuos con dolor lumbar mecánico; se observaron diferencias en las concentraciones de MCP-1(Figura 3.6 y 3.7), por lo que éste se podría proponer como un biomarcador que permite diferenciar entre el dolor lumbar inflamatorio de la EA y el dolor lumbar mecánico, con una sensibilidad de 96% y una especificidad de 83,3%.(Figura 3.8)
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La proteína quimioatractante del macrófago (MCP-1/CCL2) es secretada por células endoteliales, células de músculo liso y macrófagos (21), participa en el reclutamiento de monocitos y es inducida principalmente por citocinas y productos oxidados. Su receptor (CCR-2) se expresa en grandes cantidades en monocitos de sangre periférica, macrófagos y linfocitos T, y es el único receptor funcional para MCP-1 sobre células hematopoyéticas (22). Aunque se cree que el MCP-1 y el CCR-2 son importantes en el tránsito de leucocitos y en la acumulación de monocitos sobre las paredes arteriales, existe poca información sobre los mecanismos que involucran su señalización intracelular y sobre los fenómenos que regulan su expresión (23).
En la artritis reumatoidea, el receptor CCR-2 está altamente expresado en monocitos de líquido sinovial y también en el tejido sinovial, y se considera como un potencial blanco de tratamiento. Los cultivos de fibroblastos provenientes del tejido sinovial de los casos de artritis reumatoidea, estimulados con MCP-1, ligando soluble de CD40, TGF-Beta, IL-1Beta, IL-18, IL-15 y lipolisacáridos, aumentaron significativamente la expresión de CCR-2, medida por inmunohistoquímica, RT-PCR y Western blot. Además, el MCP-1 indujo proliferación de los fibroblastos (24). Dado que la expresión de CCR-2 es regulada por citocinas, se sugiere que este receptor puede ser muy importante como mediador de señales de inflamación en los procesos de degeneración osteoarticular.
Existe poca información sobre el estudio de MCP-1 en células mononucleares de sangre periférica, de líquido sinovial o de biopsias de tejido sinovial, en pacientes con EAS. El único análisis de expresión por la tecnología de microarreglos realizado por Gu et al. (25), se compararon 1.176 transcritos obtenidos de células de sangre periférica y de líquido sinovial de pacientes con EAS o artritis reumatoidea. El repertorio de citocinas y quimiocinas expresado por
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los pacientes a partir del líquido sinovial fue similar: MCP-1, IL-8, IL-1Beta, IFN- gamma y TNF-alfa. Sin embargo, la transcripción de MCP-1 estuvo significativamente aumentada sólo en las células provenientes de los pacientes con EAS corroborando la importancia del linaje monocito/macrófago en estas entidades (25).
La relación entre el dolor lumbar inflamatorio y las altas concentraciones de la proteína MCP-1 en el suero es aún incierta. Hasta donde sabemos, éste es el primer reporte en el que se investigan niveles de biomarcadores séricos en pacientes con alteraciones relacionadas con el dolor lumbar asociado a artritis.
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PERSPECTIVAS
El realizar estudios multicéntricos para determinar el valor real de la molécula MCP-1 como posible candidato biomarcador para diferenciar el dolor lumbar
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