MATERIALES Y MÉTODOS
5. V600E B-RAF Y TGF REGULAN LA EMT INDEPENDIENTEMENTE DE ILK
Uno de los procesos clave para la adquisición de un fenotipo migratorio es la regulación de los contactos focales. De esta manera, las células pueden conectar las señales extracelulares con el citoesqueleto de actina y controlar la motilidad celular. Por ello, ya que muchas de las proteínas implicadas en la formación de contactos focales se han relacionado con la EMT, en este estudio analizamos la relación entre algunas de ellas, en concreto ILK y FAK, y la inducción de la EMT mediada por V600EB-RAF y TGFβ.
Respecto a ILK, varios estudios han demostrado que las células tumorales poseen altos niveles de expresión y actividad de esta proteína en comparación con células no cancerígenas. Además, a ILK se le ha asignado un papel importante en la EMT. Nuestro estudio demuestra que TGFβ produce un aumento de la expresión de la proteína ILK, el cual se corresponde con un incremento de su ARNm. En este sentido, aunque hasta ahora no se ha descrito esta activación en células derivadas de carcinomas tiroideos, sí se ha demostrado en otros modelos que TGFβ puede aumentar ILK a través de un mecanismo dependiente de Smads y, además, que ILK puede participar en la EMT (51, 53, 345).
Uno de los mecanismos por los que ILK regula la EMT es a través del aumento de Snail1 por un mecanismo dependiente de GSK3-β. En su estado activado, GSK3-β fosforila a Snail1 marcándolo para su posterior ubiquitinación y degradación proteosomal. Asimismo, es importante destacar que ILK puede fosforilar GSK3-β en la serina 9 induciendo su inactivación y, por tanto, aumentando Snail1. Nuestros resultados muestran que en nuestras células tumorales tiroideas GSK3-β está constitutivamente fosforilado en la serina 9 y que, ni el TGFβ o la inhibición de la expresión de ILK afectan a su estado de fosforilación. Además, el silenciamiento de ILK tampoco modifica ni los niveles basales de Snail1 ni el aumento producido por TGFβ, lo que demuestra que la fosforilación de GSK3-β es independiente de ILK y, por consiguiente, también lo es la regulación de Snail1. Como hemos demostrado que Snail1 es el represor transcripcional principal de E-cadherina, en consecuencia, ILK tampoco es necesaria para la regulación de E-cadherina a través de la vía GSK3-β-Snail1 en estas células. Estos resultados se ven apoyados por el hecho de que el papel de ILK sobre la inactivación de GSK3-β varía dependiendo del tipo celular. Por ejemplo, la inhibición de la expresión de ILK no modifica la fosforilación de la serina 9 de GSK3-β en células embrionarias, mientras que en
125 macrófagos y células endoteliales los niveles de p-GSK3-β están muy reducidos (295). Otra posibilidad es que ILK no actúe como una proteína quinasa en estas células. Se ha propuesto que ILK tiene una doble función como proteína quinasa y como proteína adaptadora. Sin embargo, el papel de ILK como quinasa funcional in vivo está en entredicho, ya que ILK tiene un dominio quinasa atípico que carece de algunos residuos necesarios para la actividad transferasa. Además, la resolución de la estructura de su dominio catalítico demostró que ésta es incompatible con el dominio de las proteínas quinasas (346). Por otra parte, aunque se ha demostrado que la eliminación de la expresión de ILK o de su actividad mediante mutagénesis afecta a la fosforilación de GSK3-β, también se ha observado que estas mutaciones afectan a las interacciones proteína-proteína (346). Además, en el modelo murino knock-in que expresa ILK constitutivamente activo, el estado de fosforilación de GSK3-β no se modifica (347). En nuestro estudio la falta de efecto de ILK sobre GSK3-β y Snail1 es paralela a la falta de efecto sobre la migración y la invasión en las células 8505C y BHT101. Sin embargo, aunque en nuestro modelo celular ILK no está implicada en la regulación de la EMT a través de Snail1 y E-cadherina, su aumento por TGFβ podría estar participando en otros procesos relacionados con la progresión tumoral. Recientemente se ha observado que TGFβ produce un aumento de ILK y su asociación con RICTOR (348), lo que puede dar lugar a distintos efectos tumorogénicos mediados por mTORC2. Entre los procesos mediados por ILK podría estar la angiogénesis, ya que la sobreexpresión de ILK se ha asociado con la inducción del factor proangiogénico VEGF (349). Otro de los procesos en los que podría estar implicado ILK es en la represión de marcadores de diferenciación celular. En este sentido, la represión del transportador de yodo y sodio NIS es una de las características principales en cánceres de tiroides poco diferenciados, lo que implica una mayor resistencia al tratamiento. TGFβ reprime NIS en células tumorales tiroideas (290) y se ha observado que la enzima PARP-1 forma parte de un complejo transcripcional encargado de reprimir su expresión (350). Curiosamente, uno de los mecanismos por los que ILK regula la expresión de Snail1 es a través de la unión de PARP-1 con su promotor. Según nuestros resultados, ILK1 no regula la expresión de Snail1, pero puede ser que sí reprima la expresión de NIS a través PARP-1 y, por lo tanto, que TGFβ esté reprimiendo la expresión de NIS a través de ILK. Por ello, aunque son necesarios más estudios, es importante tener en cuenta la importancia de valorar la combinación de fármacos inhibidores de TGFβ junto con los protocolos establecidos de radioterapia en los pacientes con ATC. Por otra parte, en este trabajo demostramos que la inhibición de V600EB-RAF se opone al aumento de la expresión de ILK inducido por TGFβ, revelando un nuevo mecanismo por el que TGFβ regula la expresión de esta proteína. En relación con este aspecto, la combinación de inhibidores de la vía Ras-RAF-MEK-ERK con oligos antisentido de ILK ha mostrado ser una estrategia eficaz para inhibir de forma sinérgica el crecimiento de células de glioblastoma (351), por lo que sería interesante estudiar los efectos de la cooperación entre la vía RAF-MEK- ERK y TGFβ sobre la actividad de ILK, la cual podría ser importante para regular alguna de las funciones de ILK sobre proliferación o diferenciación, a través de activación de ciclina D1 o NF-κB.
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