VALORACIONS DEL METABOLISME GLUCÍDIC

7.1 TEST ORAL DE TOLERÀNCIA A LA GLUCOSA

Aquest test es va realitzar a rates mascles Goto-Kakizaki a dia 0, 15 i 28 de tractament amb EPA i LINO. Per a dur-lo a terme, es van administrar als animals 3 g/kg pc de glucosa intragàstricament. Es van anar recol·lectant mostres de sang de la cua cada 30 min durant un període de 3 hores. D’aquestes mostres n’obteníem la concentració de glucosa (mg/dl) mitjançant l’aparell ACCU-CHEK (Roche), on s’hi col·locaven unes tires de plàstic a les que hi havíem posat una gota de sang.

7.2 NIVELLS DE GLICOGEN EN MÚSCUL

La determinació de glicogen en múscul es va realitzar a partir dels músculs

gastrocnemius de rates Goto-Kakizaki tractades durant 28 dies amb EPA i LINO. Aquesta

tècnica es basa en la capacitat de les bases fortes de solubilitzar les proteïnes cel·lulars, alliberant així el glicogen sense gairebé alterar-lo. El glicogen es precipita amb etanol i s’hidrolitza en medi àcid. D’aquesta forma s’allibera la glucosa, que posteriorment es va valorar espectrofotomètricament.

De manera més detallada, es van utilitzar 200 mg de teixit que vàrem col·locar en tubs de vidre que contenien 1 ml de KOH al 30%. Els vàrem incubar a 100ºC durant 20 min en agitació i els vàrem deixar refredar. A continuació es van afegir 2 ml d’etanol fred, es varen tapar amb parafilm i es van deixar a -20ºC tota la nit. Posteriorment es van centrifugar a 400 g a 4ºC durant 15 min i vàrem eliminar el sobrenedant. Vàrem redissoldre el precipitat amb 1 ml d’aigua destil·lada i 2 ml d’etanol i es va tornar a deixar tota la nit a -20ºC.

L’endemà es va centrifugar 15 min a 400 g, es va obtenir el sobrenedant, s’hi va afegir 1 ml d’ H2SO4 i es va incubar durant 2-3 hores a 100ºC amb agitació constant. Després vàrem

neutralitzar el contingut amb KOH al 30% i es va enrasar amb aigua destil·lada fins a 2 ml. Arribat aquest punt, es va procedir a la valoració de la glucosa mitjançant el kit Glucose PAP CP (ABX Pentra) basat en la incubació de les mostres amb un reactiu i en la posterior determinació de la concentració de glucosa mitjançant un lector de plaques d’ELISA a 500 nm. Els resultats van ser expressats com mg de glucosa /g de múscul.

7.3 CAPTACIÓ DE 2-DESOXI-[

_{C]GLUCOSA EN C2C12}

La 2-desoxiglucosa (2-DOG) és un anàleg de la glucosa que és captat per les cèl·lules pel mateix sistema de transportadors, i que presenta la característica de que, a diferència de la glucosa, no pot ser metabolitzada. Això permet fer una estimació indirecta de la taxa de captació de glucosa. Per estudiar la captació de 2-DOG en cèl·lules C2C12, es va realitzar un experiment establint diferents grups: control i cèl·lules tractades a la dosi de 500 μM d’EPA i de LINO. Un cop ja havíem sembrat i diferenciat les cèl·lules en plaques de 6 pous, vam realitzar l’experiment a dia 7 de diferenciació. Es van rentar dues vegades amb PBS i es van afegir 3 ml de tampó Krebs-Henseleit (NaCl 150 mM, KCl 6.17 mM, H2KPO4

1.54 mM, MgSO4 1.58 mM, CaCl2 0.5 mM) a pH 7.4 suplementat amb piruvat 2 mM, HEPES

20 mM, 2-desoxiglucosa 25 mM i 0.1µCi/ml de 2-desoxi-[14_{C]glucosa (activitat específica 56}

mCi/mmol, Amerhsam, UK); en el cas del grup tractat, el medi també contenia EPA o LINO. Es van incubar les cèl·lules 3 hores a 37ºC. Posteriorment es van rentar els pous dues vegades amb el tampó Krebs-Henseleit i es van incubar durant 1 hora més a 37ºC amb 1 ml d’ NaOH 0.1N -Tritó 0.1%. Es va realitzar una valoració de proteïnes pel mètode de BCA, i es va valorar la radioactivitat continguda en 250 µl del lisat cel·lular en un comptador d’escintil·lació líquid (Packard 2100TR). Els resultats es van expressar com mmols de 2- DOG per mg de proteïna.

7.4 CAPTACIÓ DE 2-DESOXI-[

C]GLUCOSA EN MÚSCULS EDL AÏLLATS

Per determinar la captació de 2-DOG en músculs aïllats, es van extreure els músculs EDL de rates anestesiades amb Imalgene®-Rompún® (3:1). Els músculs es van manipular amb les consideracions abans esmentades. Un cop extrets, es van incubar en vials de vidre durant 30 min a 35ºC (en un bany termostatitzat) sota una atmosfera d’O2/CO2 (19:1), en 3

ml de tampó Krebs-Henseleit complementat amb piruvat (2 mM), HEPES (20 mM) i aminoàcids de cadena ramificada (leucina 17 mM, isoleucina 10 mM, valina 20 mM), a pH 7.4, prèviament gasejat amb carbogen durant 20 min. Passat aquest temps, es van transferir els músculs a vials nous amb 2 ml de medi d’incubació fresc, el qual portava, en el cas dels grups tractats, 2 mM d’EPA i de LINO. Després de 30 min d’incubació, es van posar els

aquest temps es va procedir a realitzar un últim canvi de medi, compost en aquest cas per tampó Krebs-Henseleit complementat amb manitol 1 mM, D-[3_{H]manitol (activitat específica}

20 Ci/mmol, Amerhsam, UK), 2-desoxiglucosa 0.1 mM i 2-desoxi-D-[14_{C]glucosa (activitat}

específica 56 mCi/mmol, Amerhsam, UK). El manitol serveix com a mesura indirecta de la quantitat de 2-DOG que, en lloc de ser absorbida, es queda a l’espai intersticial. Amb aquest medi radioactiu, es van incubar els músculs durant 30 min més, temps després del qual es van recollir els músculs, es van netejar amb medi d’incubació per eliminar les restes de traçador adherit i no incorporat, i van ser congelats en nitrogen líquid. Els medis es van utilitzar per determinar la radioactivitat present.

Per determinar la quantitat de 2-DOG captada pel múscul, es van posar els EDL en tubs Pyrex amb 250 μl de Protosol® (Du Pont) amb el qual es van incubar a 50ºC durant hores fins la seva completa digestió. Un cop el teixit va estar totalment digerit, es van afegir 250 μl de toluè i 300 μl d’H2O2 al 30%, amb els quals es va incubar durant 10 min a la

mateixa temperatura. Posteriorment es va neutralitzar amb 150 μl d’àcid acètic al 25% i es va realitzar el recompte de la radioactivitat amb 10 ml de líquid d’escintil·lació, realitzant una doble determinació tant pel 3_{H com pel} 14_{C en un comptador d’escintil·lació líquid (Packard}

2100TR). Els resultats es van expressar com nmols de 2-DOG / g múscul.