Variabilidad alélica en genes de acuaporinas

Se probaron los primers que amplificaron para los genes Aquaporin NIP 1-1 y Aquaporin

TIP ya que presentaron al menos 1 SNP en los 8 genotipos seleccionados para la

estandarización en laboratorio, estos tuvieron una buena calidad en su secuencia, lo cual permitió que estos dos genes se analizaran en toda la población. Las secuencias correspondientes a las zonas promotoras no presentaron al menos 1 SNP, por ende, no se tuvieron en cuenta en el análisis. El primer gen Aquaporin NIP 1-1 mapea en el cromosoma II en el locus PGSC0003DMG400028456. En este gen se encontraron 3 SNP (Figura 2-6; Tablas Suplementarias 5 y 6). En el segundo gen Aquaporin TIP el cual mapea en el cromosoma XII y en el locus PGSC0003DMG400026463 se encontraron 8 SNP (Tablas Suplementarias 5 y 6). Sin embargo, no todos tuvieron efecto respecto a la media del fenotipo a pesar de ser significativos. Por lo tanto, en el gen Aquaporin NIP 1-1 se encontró un único SNP (A/G)31364785 mapeado en el cromosoma 2 el cual tuvo efecto en el

CRA en plantas control. Por otro lado, en el gen Aquaporin TIP se encontró el SNP(A/C)507227 el cual influyó en la variable CE y IC en plantas control y el SNP (C/T)50722427

mapeado en el cromosoma 12 en el gen Aquaporin TIP el cual tuvo efecto en el MDA en las plantas bajo estrés por déficit hídrico (Figura 2-6).

Según lo observado en los resultados (Figura 2-6 A; Tabla Suplementaria 5) el SNP que mapea en el cromosoma 2 en el gen Aquaporin NIP I-I en la posición 31364785, explica un 15,15% del CRA en las plantas control. Al haber una sustitución completa de A/A a G/G en esta posición, hay una reducción en el CRA. En promedio de esta variable de un 7,3%; cuando se tiene en esta posición A/A en promedio el CRA es de 80,45%, sin embargo, cuando es G/G disminuye a 74,60% (Figura 2-6A).

En el gen Aquaporin TIP, a partir del análisis de varianza se identificó un SNP que se asoció significativamente (p<0,05) para las variables CE y IC en las plantas control. El SNP A/C que mapea en el cromosoma 12 en la posición 50722727 del genoma explica el 10,9% para CE y 11,75% para IC en las plantas control respectivamente. Esto se evidencia en el

76 Arquitectura genética de la tolerancia al estrés por déficit hídrico en papa diploide

diagrama de cajas (Figura 2-6B) para CE donde se observa que cuando se tiene A/A en esta posición, la conductancia estomática es en promedio de 340,0 mmol m-2_seg-1_{, cuando}

es A/C aumenta a 348,3 mmol m-2_seg-1 _{y cuando hay una sustitución completa C/C es de}

496,17 mmol m-2_seg-1_{. Además, este SNP(A/C)}

50722727 según el ANOVA, explica un 11,75%

del IC (Tabla suplementaria 1). Esto se corrobora en el diagrama de cajas ya que se observa que la sustitución de A/A a A/C genera un incremento en el IC de 0,35% a 0,44% respectivamente (Figura 2-6 C).

Figura 3-6. Diagrama de caja para las variables CRA, CE, IC y MDA para cada SNP encontrado en genes de acuaporinas en papa. X es el valor dependiendo de la variable fenotipada y el eje Y es para los genotipos de cada SNP. A) CRA en plantas control para el SNP (A/G)31364785 mapeado en el cromosoma 2 en el gen Aquaporin NIP 1-1. B) CE en

plantas control para el SNP (A/C)50722727 mapeado en el cromosoma 12 en el gen Aquaporin TIP. C) IC en plantas control para el SNP (A/C)50722727 mapeado en el cromosoma 12 en el

gen Aquaporin TIP. D) MDA en plantas bajo estrés por déficit hídrico para el SNP (C/T)50722427 mapeado en el cromosoma 12 en el gen Aquaporin TIP

El diagrama de cajas para el MDA en plantas en condiciones de estrés por déficit hídrico, indica que un cambio de base en el SNP(C/T)50722427 del gen Aquaporin TIP, influye en la

disminución de este compuesto (Figura 2-6 D). Esto se evidencia cuando en esta posición se encuentra C/C, el resultado promedio de MDA es de 17,1 µmol g-1 _{PF, cuando se}

produce muta a C/T, el promedio es de 14,4 µmol g-1 _{PF y cuando hay una sustitución}

completa a T/T se reduce a 12,1 µmol g-1 _{PF. Según los análisis de varianza, este SNP}

explica el 9,98% de la varianza de MDA (Tabla Suplementaria 6).

Figura 3-7. SNPs asociados significativamente con la tolerancia a déficit hídrico en

Solanum tuberosum Grupo Phureja. En rojo se muestran los marcadores SNP

significativamente asociados en este estudio. En verde se muestran los genes que están dentro de los 100 kb de los SNP asociados, que están involucrados en las variables fisiológicas a partir del fenotipado. Las distancias genéticas se dan en Mbp, según el genoma de referencia actual DM-v4. En azul se encuentran los SNP identificados en genes de acuaporinas que influyen en el fenotipo de CRA, CE, IC y MDA. El negro representa los marcadores que limitan cada cromosoma en el genoma de la papa. Diagrama realizado con el software MapChart.

78 Arquitectura genética de la tolerancia al estrés por déficit hídrico en papa diploide

3.5 Discusión

Identificar SNP a través de dos enfoques de mapeo por asociación como el gen candidato y GWAS para el rasgo de estrés por déficit hídrico, a partir de las variables fisiológicas evaluadas durante este estudio, permitió una mejor comprensión de los factores que intervienen en el control genético de la regulación en este rasgo en papa. En este estudio se encontró que, en las plantas sometidas a estrés, en los cromosomas IV y VI mapearon SNPs asociados con proteínas relacionadas con el CE y reguladores de membrana.

Como primera medida en plantas estresadas por déficit de agua, para mitigar el estrés, inducen el cierre de estomas, lo que causa la acumulación de ácido abscísico (ABA) (Zhu

et al., 2002; Schroeder et al., 2001). En el cromosoma VI se identificó el gen

PGSC0003DMG400027228 que codifica para una proteína con dominio de dedo de zinc. Estos resultados estarían contribuyendo con lo hallado por otros autores, quienes han encontrado que en las membranas celulares se han encontrado proteínas con dominio de dedo de zinc C2H2 que funcionan como activadores de transcripción durante el estrés

abiótico en plantas de Arabidopsis thaliana y en S. tuberosum durante el cierre estomático (Han et al., 2020; Gong et al., 2015). Además, estas proteínas también están involucradas en el movimiento estomático (Hu et al., 2006).

En papa, Gong et al. (2015) realizaron el perfil del transcriptoma bajo condiciones de estrés por sequía y estrés hídrico y reportan que la proteína “BTB/POZ” y “TAZ domain containing

protein 1”. Las proteínas “BTB/POZ-MATH (BPM)”, Ubiquitinas ligasas E3 como la COP1,

“Speckle type POZ” y “F ciclin (F-box)” actúan en la regulación de procesos biológicos como la tolerancia a estrés biótico y abiótico (Mazzucotelli et al., 2006). Los genes que codifican para estas proteínas también fueron identificados en el presente estudio en los cromosomas VI y IX. Las proteínas Ubiquitinas ligasas E3 a pesar de no ser muy estudiadas, se ha reportado su importancia en la regulación de la respuesta de estrés por frío (Dong et al., 2006), además participa en la señalización de hormonas como ABA en la

Identificación de variantes alélicas naturales asociadas con tolerancia a estrés hídrico en papa diploide

79

respuesta a condiciones ambientales, senescencia, anoxia y deficiencia de nutrientes (Mazzucotelli et al., 2006).

Debido a la acumulación de ATP y NADPH por la restricción de difusión de CO2 en la hoja

como consecuencia del cierre estomático, se produce un desequilibrio energético a nivel de cloroplasto causando estrés oxidativo y daño en las membranas (Dahal et al.,2019; Pinheiro y Cháves, 2011; Flexas et al., 2004). Estudiar variables que dilucidan el rasgo de estrés por déficit hídrico como la CE y la peroxidación lipídica a partir de la cuantificación del MDA permitió tener información robusta de los posibles genes relacionados con estas dos variables. A nivel de cloroplastos, se han estudiado complejos de traslocación de proteínas de envoltura externa e interna de sus membranas. En este estudio a partir de la fenotipificación de las variables CE y MDA se encontraron en el cromosoma VI, genes que codifican para proteínas “Outer envelope membrane protein” y “Oxygen-evolving enhancer

protein 1”. Estas proteínas hacen parte de la maquinaria TOC y TIC del cloroplasto la cual

contiene complejos de traslocación de proteínas, que trabajan de acuerdo con las condiciones ambientales y de desarrollo de la planta (Kovács-Bogdán et al., 2010). También se ha reportado, que la producción de estas proteínas disminuye en condiciones de estrés salino (Rakshit et al., 2020).

En este mismo sentido, cabe señalar que, ante condiciones de estrés salino, las plantas optan por responder con el mismo mecanismo que ante déficit hídrico ya que igualmente se produce una limitación de agua, es decir se produce cierre estomático. A partir de la fenotipificación de la CE en plantas bajo estrés se encontraron proteínas extensinas repetidas ricas en leucina de la pared celular (LRX) 3/4/5 que se ha reportado que actúan en la tolerancia por sal en Arabidopsis (Zhao et al., 2018).

A nivel de membrana, también se ha encontrado genes biosintéticos de la pared celular que presentan cambios a partir del estrés ambiental lo que influye en la respuesta de las plantas (Yin et al., 2019). En Arabidopsis se han reportado los genes GATL1, GATL6 y

GATL9 de la familia GT8 como co-reguladores en la síntesis de la pared celular (Yin et al.,

2010). En esta investigación se encontraron dos QTLs (Glyco_MDAIV y Glyco2_MDAIV) en las posiciones chr04: 9520598 y chr04:9520127 respectivamente en un gen que codifica para la proteína “Glycosyltransferaza CAZy Family GT8” mapea en el cromosoma IV

80 Arquitectura genética de la tolerancia al estrés por déficit hídrico en papa diploide

(Figura 2-7). Cada uno de estos QTL mostraron una variación fenotípica del 33% con relación a la variable de MDA, lo cual corrobora la participación de proteínas tipo GT8 en las membranas celulares ante condiciones ambientales adversas.

Por otro lado, en el cromosoma IX se encontró una proteína NBS-LRR lo que hace pensar que tiene cierta relación con la respuesta hipersensible (HR) de la planta ya que proteínas de este tipo como la NRC1 están asociadas con la muerte celular programada (Gabriëls et

al., 2007). Una de las vías de interacción entre los estreses bióticos y abióticos es la

señalización hormonal de la vía del ABA (Atkinson et al., 2011). Además, se ha reportado en tomate que ante la señalización de estrés osmótico ocasionado por sequía puede mejorar la resistencia a Botrytis cinerea (Achuo et al., 2006). En este mismo cromosoma se encontró una “A membrane associated salt inducible protein” que según estudios realizados por Wiese et al. (2004) ante un aumento de estrés osmótico a causa de salinidad se correlacionó directamente con la resistencia a mildeo polvoso; es decir, que el cierre estomático mediado por ABA, puede causar resistencia a enfermedades evitando la entrada de patógenos por medio de los estomas. Sin embargo, esta correlación puede ser tanto positiva como negativa dependiendo del estrés, ya que respuesta HR asociada al gen R con Pseudomonas syringae en Arabidopsis y tabaco, en presencia de estrés a altas temperaturas, causa un efecto benéfico en el desarrollo de inductores virales propiciando el crecimiento de patógenos (Wang et al., 2009).

Por otra parte, respecto a la fenotipificación de las plantas control, se identificaron SNPs en genes que codifican para Purple acid 18 y una fosfoproteína fosfatasa en dos loci, en los cromosomas X y I respectivamente. En papa dulce se han reportado tres isoformas de fosfatasas (PAP), las cuales están relacionadas con el llenado del tubérculo y aumento en el peso seco (Schenk et al., 2001). En especies como Arabidopsis, Stylosanthes spp. y frijol estas fosfatasas ácidas permiten que se aumente el aprovechamiento de dNTP extracelular como fuente de fósforo lo cual se ve reflejado en un mayor peso seco y contenido total de fósforo (Robinson et al., 2012; Liang et al., 2012; Liu et al., 2016). En plantas transgénicas de Stylosanthes spp. se reportó aumento de los niveles de transcripción de genes los Purple acid SgPAP7 y SgPAP1, a partir de la necesidad de fijación de Pi en los brotes y raíces (Liu et al., 2016). En papa, se han identificado QTL en el cromosoma X asociados con brotes de peso fresco, seco, número de tubérculos y peso de tubérculos (Anitakumari et al., 2012).

Identificación de variantes alélicas naturales asociadas con tolerancia a estrés hídrico en papa diploide

81

En este estudio se encontró en el cromosoma I un gen candidato asociado con UDP-

glucosa glicotransferasa. El estudio de la ruta de los glicoalcaloides ha sido de interés para

mejoramiento genético (McCue et al., 2006). En papa, en el desarrollo de los tubérculos, la sacarosa se metaboliza en UDP glucosa y fructuosa sintasa. Esta primera es un donador de sacarosa y conduce a la formación de α-chaconina (Nazarian et al., 2017; McCue et al., 2006; Wald et al., 2003). La α-chaconina es un compuesto de la familia glicoalcaloides que corresponde a metabolitos secundarios en Solanum, que sirven como defensa química contra hongos, nematodos, herbívoros y otras condiciones de estrés y son abundantes en los tubérculos de papa (Eraso et al., 2019).

A partir de los genes candidatos identificados con el fenotipo de PSTen las plantas control, se puede deducir que se asocian con proteínas que permiten mantener un adecuado funcionamiento del aparato fotosintético (Chlrorophyll a-b), un adecuado estado de las membranas celulares (Proteínas estructurales constitutivas de la pared celular) un adecuado estatus hídrico (Prolina sintetasa) y la optimización de la fijación de fósforo, componente principal del ATP. Esto concuerda con lo encontrado en cereales donde se han encontrado QTL correspondientes a genes que codifican para la clorofila y que se han asociado con un mayor rendimiento, eficiencia fotosintética y eficiencia en la transpiración en condiciones de déficit hídrico (Anithakumari et al., 2012; Verma et al.,2004).

Mediante la aproximación del gen candidato y del análisis de genes de acuaporinas, se determinó la varianza fenotípica de los SNPs encontrados con las variables tomadas tanto en plantas bajo estrés por déficit hídrico como en plantas control. Este enfoque permitió determinar que en el gen Aquaporin NIP 1-1 se encontró que el SNP(A/G)31364785 mapeado

en el cromosoma 2 el cual influyó en el CRA y que al haber una sustitución completa G/G se disminuye el porcentaje de esta variable en plantas control. Esto puede indicar que este SNP tiene que ver en la susceptibilidad de la planta ya que el contenido relativo de agua es un indicador del estatus hídrico de la planta. Se ha reportado que cuando el CRA es menor a 75%, se afecta el metabolismo de la planta ya que se minimiza la síntesis de ATP lo que afecta la fotosíntesis (Lawlor & Cornic 2002).

Se ha reportado que las acuaporinas NIP I transportan agua y glicerol ya que la subfamilia de estas proteínas tiene diferentes sustratos para el transporte de acuerdo con la similitud

82 Arquitectura genética de la tolerancia al estrés por déficit hídrico en papa diploide

de secuencia de la región de constricción aromática/arginina (ar/R) (Mitani et al., 2011). El gen Aquaporin NIP 1-1 gen no tuvo una variación significativa con ninguno de los rasgos en las plantas estresadas, lo que hacer suponer que, ante condiciones de estrés por déficit hídrico, los SNPs encontrados en el gen Aquaporin NIP 1-1 no explican el fenotipo relacionado con la respuesta al estrés en condiciones de déficit hídrico.

Las acuaporinas en las plantas en general tienen la función de regular el transporte de agua a nivel transmembrana cuando la planta necesita un ajuste en el flujo de agua o ante condiciones de falta de esta (Luu & Maurel, 2005). En el gen Aquaporin TIP II, SNP (A/C)50722727 mapeado en el cromosoma 12 según el ANOVA se considera que influye con

el aumento de la conductancia estomática en plantas control. Al presentar la sustitución A/C y C/C indica que la planta puede mantener en mayor medida sus estomas abiertos, por ende, podría asociarse con una mayor fotosíntesis y mayor fijación de carbono. Para este mismo SNP, se encontró un aumento en el IC siendo significativo para esta variable y su posible relación con el proceso de partición de materia seca ya que esta variable nos relaciona tanto el R como el peso PST; además al mantener los estomas abiertos, la planta puede seguir produciendo fotoasimilados. El gen Aquaporin TIP seleccionado en este estudio es análogo al gen TIP 2-1 el cual se identificó bajo expresión diferencial en condiciones déficit hídrico en los estolones del genotipo de papa Ningshu 4 (Gong et al., 2015).

El MDA se considera un indicador de estrés ya que es un compuesto orgánico que aumenta cuando hay daños a nivel de membrana por ROS. En este sentido, el SNP (C/T)50722427 mapeado en el cromosoma 12 en el gen Aquaporin TIP, influye en la

disminución de este compuesto indicando un menor daño lipídico y por ende menos afectación del estrés a nivel celular.

De acuerdo con los análisis obtenidos en gen candidato, el SNP (A/C)50722727 de la proteína

Aquaporin TIP ll cambia el aminoácido de aspargina Asn (N) a histidina His (H) en el codón 268 de la proteína. Al realizar un BLAST el porcentaje de identidad varia de un 89,52% a un 89,92% respectivamente. Esto indica que corresponde a la acuaporina de interés y no necesariamente hubo un cambio de la proteína por el aminoácido que se sustituyó a causa del SNP. Cabe señalar, que este SNP fue de especial interés ya que explica un 10,09% y

Identificación de variantes alélicas naturales asociadas con tolerancia a estrés hídrico en papa diploide

83

11,75% la varianza fenotípica de la conductancia estomática y el índice de cosecha en plantas control.

2.6 Conclusiones

Hacer los análisis de asociación empleando los enfoques de gen candidato y el estudio de asociación amplia del genoma permitió identificar regiones genómicas asociadas con el estrés al déficit hídrico.

Los genes candidatos identificados por su asociación con la tolerancia a estrés por déficit hídrico correspondieron en su mayoría a proteínas que actúan como respuesta ante estrés abiótico y biótico debido a que estas proteínas participan en la señalización hormonal del ABA.

Se identificaron genes que codifican para proteínas relacionadas con el daño de membranas y paredes celulares como consecuencia del estrés oxidativo. Estos genes ya habían sido reportados en estudios relacionados con estrés osmótico ocasionado por sal lo cual está relacionado con el rasgo de estrés por déficit hídrico.

Los genes Aquaporin TIP y Aquaporin NIP 1-1 presentaron variantes alélicas que influyeron en el CRA, la CE y el IC en plantas control. En plantas en condiciones de déficit hídrico, influyeron en el contenido de MDA, considerado un indicador de estrés. A pesar de estos hallazgos es necesario la validación de estos genes por medio de la evaluación de la expresión génica.

84 Arquitectura genética de la tolerancia al estrés por déficit hídrico en papa diploide

2.7 Referencias

Achuo, E.A., Prinsen, E., Hofte, M. (2006). Influence of drought, salt stress and abscisic acid on the resistance of tomato to Botrytis cinerea and Oidium neolycopersici, Plant

Pathology, 55:178-186.

Aliche, E. B., Oortwijn, M., Theeuwen, T. P. J. M., Bachem, C. W. B., Visser, R. G. F., & van der Linden, C. G. (2018). Drought response in field grown potatoes and the interactions between canopy growth and yield. Agricultural Water Management, 206(February), 20–30. https://doi.org/10.1016/j.agwat.2018.04.013.

Anithakumari, A. M., Nataraja, K. N., Visser, R. G. F., & van der Linden, C. G. (2012). Genetic dissection of drought tolerance and recovery potential by quantitative trait locus mapping of a diploid potato population. Molecular Breeding, 30(3), 1413–1429. https://doi.org/10.1007/s11032-012-9728-5.

Ariza, W., Moreno-Echeverry, D., Guerrero, C. A., & Moreno, L. P. (2020). Effect of water deficit on some physiological and biochemical responses of the yellow diploid potato (Solanum tuberosum L. Group Phureja). Agronom. Colomb. 38(1).

https://doi.org/10.15446/agron.colomb.v38n1.78982.

Atkinson, N. J., Dew, T. P., Orfila, C., & Urwin, P. E. (2011). Influence of combined biotic and abiotic stress on nutritional quality parameters in tomato (Solanum lycopersicum).

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(17), 9673–9682.

https://doi.org/10.1021/jf202081t

Binod, P.L., Bhim, B.K., Duryodhan, C., Bishnu, P.P., Sung, J.S., On-Sook, H., Yul, R.K., (2015). Growth and yield characters of potato genotypes grown in drought and irrigated conditions of Nepal. Int. J. Appl. Sci. Biotechnol. 3, 513–519. http://dx.doi. org/10.3126/ijasbt.v3i3.13347.

Cabañero, F. & Carvajar, M. (2007). Different cation stresses affect specifically osmotic root hydraulic conductance, involving aquaporins, ATPase and xylem loading of ions in