4. CEPAS ATENUADAS DEL VIRUS VACCINIA
4.2 Virus Atenuado de la cepa Copenhagen: NYVAC
NYVAC es una cepa altamente atenuada derivada de la cepa Copenhagen (VACV-COP) de la que fueron eliminados por ingeniería genética 18 genes no esenciales entre los que se encuentran: genes implicados en virulencia, patogenicidad y genes que interaccionan con la célula huésped
(
Tartaglia y cols.,
1992b)
, dando como resultado un virus con una reducida capacidad de replicación en un amplio rango de células de mamífero entre las que se incluyen las de origen humano (Figura 6).Figura 6: Organización genómica de la cepa NYVAC. En la parte superior de la figura se
muestra la molécula lineal de ADN bicatenario. En la parte inferior se muestra en rojo las 18 deleciones que se introdujeron para su generación.
A B región central conservada región terminal izquierda región terminal derecha C N M K F E PO I G L J H D aprox. 15Kb
Genes eliminados o fraccionados Genes intactos
Entre los genes delecionados se encuentra el gen J2R que codifica la timidina quinasa (TK). La inactivación o deleción completa de este gen no afecta al crecimiento del virus, sin embargo, mutantes del virus vaccinia en el gen TK han mostrado un fenotipo atenuado en ratones inoculados por ruta intracerebral o intraperitoneal
(
Buller,
1985; Buller y cols.
,
1985)
. Lo mismo ocurre con la inactivación del gen I4L, que codifica la subunidad grande de la enzima ribonucleótido reductasa implicada en el metabolismo de nucleótidos(
Child y cols.,
1990)
, y con la inactivación del gen de la hemaglutinina (A56R), que produce una neurovirulencia reducida en conejos inoculados por ruta intracraneal(
Shida y cols.,
1987)
. Los genes B13R/B14R tienen homología con los inhibidores de la serina proteasa I e inhiben la respuesta inflamatoria del hospedador. El gen ATI (A26L), cuya función es la protección de los viriones del virus cowpox durante la diseminación entre animales(
Bergoin y cols.,
1971)
, también fue delecionado. Finalmente, se han descrito diversas deleciones espontáneas cerca del extremo izquierdo del genoma del virus vaccinia. Se demostró que la cepa WR con una deleción de 10 kb mostraba un fenotipo atenuado después de la inoculación intracraneal(
Buller y cols.,
1991; Buller y cols.,
1985; Moss y cols.,
1981)
. Más tarde se demostró que esta deleción incluía 17 ORFs potenciales, entre los que se incluyen los genes N1L o C3L, cuya función parece estar implicada en la evasión de los mecanismos de defensa del hospedador. El extremo izquierdo también incluye dos ORFs identificados como genes de ámbito del hospedador, K1L(
Gillard y cols.,
1986)
y C7L(
Perkus y cols.,
1990)
. Su ausencia en el genoma de NYVAC está asociada con la reducida capacidad del virus para replicar en un amplio rango de líneas celulares de origen humano, así como en células de conejo o de cerdo (RK-13, PK15)(
Oguiura y cols.,
1993; Tartaglia y cols.,
1992a
)
. Sin embargo, NYVAC es capaz de replicar con la eficiencia de una cepa silvestre en células Vero y en cultivos primarios de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF)(
Tartaglia y cols.,
1994; Tartaglia y cols.,
1992a)
.Hasta la fecha existe muy poca literatura sobre la biología molecular o el comportamiento de este virus en células en cultivo. Sin embargo, son numerosos los ejemplos en los que se utiliza NYVAC como vacuna recombinante, demostrando su eficacia y seguridad en varios modelos animales
(
Tartaglia y cols.,
1994; Tine y cols.,
1996
)
. Así, NYVAC no es capaz de diseminarse en ratones inmunodeprimidos y muestra una reducida capacidad para replicar en una gran variedad de tejidos humanos sin llegar a producir partículas infecciosas(
Tartaglia y cols.,
1992b)
.Por todas estas razones, NYVAC es considerado como un vector seguro y puede usarse en condiciones ACGM de nivel 1 (“Advisory Committee on Genetic
Modifications”), siempre que la naturaleza del inserto no afecte a la seguridad del vector. En este sentido, distintos ensayos clínicos en humanos han demostrado la seguridad de los vectores derivados de esta cepa frente a enfermedades como malaria, SIDA o encefalitis japonesa
(
Benson y cols.,
1998; Franchini y cols.,
2004; Ockenhouse y cols.,
1998; Precopio y cols.
,
2007; Sheppard y cols.,
2007)
.En la siguiente tabla se detallan los genes delecionados en MVA y NYVAC con sus respectivas funciones.
VACV-
COP MVA NYVAC
Función
C22L - C22L Modulador de la respuesta antiviral. Codifica una proteína homóloga al receptor de TNF C21L - C21L Modulador de la respuesta antiviral. Inhibe las rutas clásica y alternativa del sistema del complemento C20L - C20L Codifica una proteína con dominios de anquirina
C18L - C18L Posible gen de rango de hospedador. Codifica una proteína con dominios de anquirina. 003L
C17L
004L C17L
Posible gen de rango de hospedador. Codifica una proteína con dominios de anquirina.
C16L - C16L Función desconocida
C15L - C15L Función desconocida
C12L* 008L - Modulador de la respuesta antiviral. Se une a la IL18 e inhibe IL18 inducida por IFN-gamma 014L
015L C9L
016L
C9L Posible gen de rango de hospedador. Codifica una proteína con dominios de anquirina. C7L 018L C7L Rango de hospedador (hr). Necesario para la replicación del virus en células humanas
C6L 019L C6L Función desconocida
C5L - C5L Función desconocida
C4L - C4L Función desconocida
C3L - C3L Modulador de la respuesta antiviral. Inhibe la ruta clásica del sistema del complemento C2L - C2L Modulador de la respuesta antiviral. De la familia de las proteínas tipo Kelch. Implicado en respuesta inflamatoria C1L - C1L Función desconocida
N1L 020L N1L Modulador de la respuesta antiviral. Interviene en la señalización de NFkB N2L 021L N2L Codifica una proteína que tiene como diana la alpha-amianitina
M1L - M1L Codifica para una proteína con dominios de anquirina
M2L - M2L Función desconocida
K1L 022L K1L Rango de hospedador (hr). Necesario para la replicación del virus en células de conejo. Es capaz de complementar a C7L en células humanas
K6L 027L K6L Función desconocida. Posible fosfolipasa
033L
VACV-
COP MVA NYVAC
Función
F11L 041L F11L Serin/threonin quinasa. Implicado en el control de la eleongación de la transcripción 059L
O1L
060L O1L Función desconocida
I4L 065L I4L Interviene en metabolismo de ácidos nucleicos. Subunidad grande de la ribonucleotido reductasa J2R 086R J2R Timidina quinasa. Implicado en virulencia
A26L* 137L A26L Proteína tipo A que forma cuerpos de inclusión. Diseminación del virus de animal a animal 150R
A39R
151R A39R
Modulador de la respuesta antiviral. De la familia de las semaforinas
A52R - A52R Modulador de la respuesta antiviral. Homologo a TLR. Tiene como diana a IRAK-2 y TRAF-6 A53R - A53R Modulador de la respuesta antiviral. Homologo al receptor de TNF A55R - A55R Modulador de la respuesta antivira. De la familia de las proteínas tipo Kelch. Implicado en respuesta inflamatoria A56R 165R A56R Hemaglutinina. Proteína de membrana de los EVs. Inhibe fusión
168R B2R
169R B2R Función desconocida
171R B4R
172R B4R Codifica una proteína con dominios de anquirina
B8R 176R* B8R Modulador de la respuesta antiviral. Se une e inhibe al IFN-α/β de varias especies. * En MVA no es funcional
B13R 181R B13R
B14R 182R B14R
Modulador de la respuesta antiviral. Inhibe la apoptosis mediada por TNF y FasL
B16R* 184R - Modulador de la respuesta antiviral. Codifica una proteína homóloga al receptor de IL-1β B20R - B20R Codifica para una proteína con dominios de anquirina
B21R - B21R Homólogo a C15L 190R B23R 191R B23R Homólogo a C17L B24R - B24R Homólogo a C18L B26R - B26R Homólogo a C20L B27R - B27R Homólogo a C21L B28R - B28R Homólogo a C22L
Tabla II: Función de los genes delecionados en las cepas MVA y NYVAC. En rojo se
muestran los genes ausentes o parcialmente delecionados dentro del genoma de capa cepa viral y en verde los genes intactos. VACV-COP: cepa Copenhagen del virus vaccinia; El asterisco indica que el gen se encuentra inactivo o ausente en la cepa parental.