El virus Vaccinia y la quinasa B1 del virus Vaccinia

El virus Vaccinia tiene un gran genoma de 200 kb que se replica en el citoplasma y es miembro del género Orthopoxvirus de la familia Poxviridae (Moss y Shisler, 2001). Esta familia también incluye Variola virus (VAR), Cowpox virus (CPV), Monkeypox virus (MPV), Ectromelia virus (ECT)…

En los últimos 30 años el uso del virus Vaccinia se extendió mas allá de su papel en la vacunación de la viruela, convirtiéndose en una útil herramienta de investigación como vector para expresión de genes exógenos en células diana y un medio de estudio de la respuesta inmune de los mamíferos a la infección viral. También se está explorando su potencial en la terapia contra el cáncer, principalmente de tres formas: como vector para la expresión de genes terapéuticos de forma específica en los tumores; como vector de expresión de antígenos tumorales y/o moléculas estimuladoras del sistema inmune con el fin de desarrollar vacunas contra el cáncer; y, finalmente, como virus oncolítico, específico para células altamente replicativas.

Hay tres formas de partículas infecciosas de Vaccinia: las IMV (intracellular mature virus), las CEV (cell-associated enveloped virus) y las EEV (extracellular enveloped virus). Las IMV son partículas de aproximadamente 300x240x120 nm de tamaño, con una protección de lipoproteínas que rodean una estructura central compleja. En esta estructura central se encuentran el genoma y

enzimas de “capping”, metilación y poliadenilación de ARN y un factor de transcripción. Estas proteínas son empaquetadas en el virus para permitir la síntesis de proteínas virales tempranas tras la entrada en las células (Moss y Shisler, 2001). Las CEV y las EEV son IMV con un capa lipídica (principalmente fosfolípidos y colesterol) y una menor densidad que las IMV (Smith et al., 2002). Los principales componentes del virus son proteínas (90% del peso seco), lípidos (5%) y ADN (3.2%). En la figura 1.13 se puede observar una representación esquemática del mismo.

Figura 1.13. Estructura del virus Vaccinia. (A) Imagen de microscopía

electrónica de una sección fina de Vaccinia, en la cual se puede observar el núcleo (C), los cuerpos laterales (L) y la capa lipídica externa (E). (B) Representación esquemática del virus Vaccinia. (Moss, 1996)

El hecho de que se produzcan distintos tipos de partículas virales en el ciclo de replicación de Vaccinia representa una ventaja evolutiva, puesto que es una estrategia que le permite al virus aprovecharse de la biología de la célula y evadir la respuesta inmune del hospedador y la apoptosis. Por todo esto, la interacción de una proteína temprana con señales hospedadoras puede ser un importante componente de las estrategias para conseguir la supervivencia viral.

Entre las proteínas virales tempranas se encuentra B1R, una serin-treonin quinasa de aproximadamente 300 aminoácidos y 34 kDa, que usa ATP como dador

de grupos fosfato y necesita cationes divalentes (Mg2+ o Mn2+) para su actividad (Figura 1.14).

Figura 1.14. Representación de la estructura de B1R. B1R posee un dominio de

unión al ADN en su terminal amino, mientras que el dominio quinasa corresponde casi a la totalidad de la proteína. En este se puede señalar el sitio activo y el sitio de reconocimiento de sustrato.

Esta quinasa está presente en viriones y es requerida para la síntesis de DNA viral, como se demuestra con los dos fenotipos de dos mutantes sensibles a la temperatura que expresan una proteína B1R sin actividad quinasa (Banham et al., 1993; Lin et al., 1992). De todos modos, B1R debe de estar involucrada en otros procesos virales ya que, en condiciones permisivas (ciclo de vida normal a una temperaatura permisiva de 32ºC), mutantes de B1R muestran un 60% de la replicación de DNA viral pero solo un 15 % de producción viral (Banham y Smith, 1992). También, es imposible generar un virus deficiente en ORF (“open reading frame”) de Vaccinia, lo que demuestra que es un gen esencial incluso sin actividad quinasa (Banham y Smith, 1992), probablemente por su capacidad para modular otras proteínas mediante una interacción directa.

Hasta el momento, la identificación de sustratos de B1R, tanto virales como celulares, es muy limitada; entre sus proteínas virales sustrato se encuentra H5R (Beaud et al., 1995), y entre los sustratos celulares están proteínas ribosomales (Banham et al., 1993; Beaud et al., 1994), BAF (Nichols et al, 2006), y p53, que es hiperfosforilado, provocando una downregulation de las señales

apoptóticas (Santos et al., 2004), que podría contribuir a la supervivencia de células infectadas, por una interferencia transitoria con la respuesta celular al estrés y permitiendo de esta manera seguir el curso de la progresión de la infección.

El posible papel de B1R en la prevención temprana de la apoptosis depende de 2 mecanismos diferentes: la fosforilación de factores de transcripción como p53 y c-Jun y la activación de la ruta de señalización JNK por interacción con JIP1 (Santos et al., 2004). La prevención podría explicarse porque un mutante del virus Vaccinia sin actividad quinasa B1R tiene una reducción significativa en la producción viral y porque no es posible aislar un virus deficiente en B1R (Banham y Smith, 1992) ya que estos virus probablemente inducen la apoptosis de células infectadas antes de que ocurra la producción viral (Santos et al., 2006).

En resumen, la quinasa B1R del virus vaccinia, presente durante la infección temprana, es capaz de modular la respuesta celular a c-Jun por dos mecanismos diferentes, fosforilación directa en residuos nuevos y modulación de complejos JIP1-MAPK. Por lo tanto, la activación de la transcripción de c-Jun se consigue por dos rutas de señalización cooperantes. Se sabe que la activación de JNK evita la apoptosis (Shaulian y Karin, 2001). B1R es capaz de activar JNK y estabilizar la transcripción activada por p53 (Huang et al., 2003), contribuyendo así a la supervivencia de la célula infectada el tiempo suficiente para permitir la terminación de su ciclo lítico (Santos et al., 2006).