Western blot

Para la detección de la expresión a nivel de proteína de diversos marcadores se utiliza el ensayo de Western blot. En nuestro caso hemos utilizado la expresión de la hemooxigenasa-1, como marcador de estrés oxidativo. Para ello el proceso seguido ha sido:

a)Recolección de células

1) Se aspira el sobrenadante de los distintos cultivos tratados y se añaden 3 mL de tripsina 1% y se incuba a 37 ºC durante 20 minutos. Luego se añade 7 mL de solución de inactivación (2% FBS en PBS). Se transfieren las células a tubos de 15 mL. Se cuantifica el número de células por mililitro de cada tubo y se centrifugan a 130 G durante 8 minutos. Se aspira el sobrenadante y se congelan los tubos a -80 ºC.

2) Se prepara el tampón RIPA (Millipore; radio inmunno precipitation assay) añadiendo 1 mL de la solución stock 10x a 9 mL de agua MilliQ y se añade 1 pastilla de inhibidores de proteasas (Roche) y de inhibidores de fosfatasas (Roche) por cada 10 mL de RIPA 1x.

3) Se descongelan los tubos guardados a -80 ºC y se añaden 50 µL de RIPA 1x por cada 1x106 _{células. Luego se sonican las muestras 3 veces durante} 15 segundos en el sonicador Branson Sonfier D250. Por último se centrifugan durante 5 minutos a 13000 rpm y se recoge el sobrenadante con las proteínas descartando los residuos insolubles.

57 b) Cuantificación de las proteínas

Para determinar la cantidad de proteína en cada muestra se usa el Bio-Rad Protein Assay 5X.

1) Para llevar a cabo esta cuantificación, se diluye el stock de Bradford 5x a 1x con agua MilliQ y se añaden a una placa de 96 pocillos 100 µL de Bradford 1x en dos pocillos por cada muestra que se va a cuantificar, ya que se realizan duplicados y se usa la media para los cálculos.

2) Se añade 1 µL de la muestra en el pocillo, se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos y se lee la absorbancia de las muestras en el lector de placas a 595 nm de longitud de onda. Para obtener el blanco se usa el mismo procedimiento reemplazando la muestra por RIPA 1x y se descuenta el valor obtenido de la absorbancia del resto de muestras.

c) Preparación de los geles

1) Primero se monta el soporte para preparar los geles y se comprueba que los soportes estén bien sellados con agua MilliQ. El gel está compuesto por dos partes, el stacking gel (donde están los pocillos) y el resolving gel (donde están los carriles). El stacking está al 4% mientras que el resolving en nuestro caso será del 10%.

2) La composición de cada uno de los geles (volumen final = 10 mL) ha sido para el stacking: 6,1 mL agua MilliQ + 1,3 mL de 30% acridina + 2,5 mL tampón del stacking gel (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8)+ 0,1 mL SDS. Para el resolving: 4,1 mL agua MilliQ + 3,3 mL de 30% acridina + 2,5 mL tampón del resolving gel (Tris-HCl 1,5 M pH 8,8)+ 0,1 mL SDS. Para que el gel polimerice es necesario añadir APS 10% (amonio persulfato; Sigma; 100 µL cada 10 mL de gel) y TEMED (Applichem, 10 µL por cada 10 mL de gel). Hay que añadir estos compuestos justo antes de cargar el soporte.

3) Para iniciar la preparación se añade el resolving hasta la línea inferior verde del soporte (unos 7 mL), después de adicionarle los agentes de polimerización. Se añaden los agentes de polimerización a la preparación del gel stacking, se añade la mezcla hasta el tope del soporte y se inserta el peine con cuidado de no formar burbujas. A continuación se montan los geles en el soporte y se sitúa el en el aparato de transferencia. Luego se llena el aparato hasta el nivel de los peines de los geles, con

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aproximadamente 1 litro de running buffer (TGS 1x: 100 mL TGS 10x + 900 mL H2O).

d) Carga de las muestras

1) Una vez el gel está listo se prepara el tampón de carga para observar el desplazamiento de la banda a través del running gel. Se añaden 100 µL de -mercaptoetanol a 900 µL tampón 5x (tampón de carga;2,5 mL Tris-HCl 1 M pH=6,8, 1 gr de SDS, una gota de bromofenol, 5 mL de glicerol, 1,5 mL H2O destilada). El volumen de muestra a cargar depende de la concentración de proteína total de la muestra (son necesarios un mínimo de 25 µg). Una cuarta parte del volumen de proteína es el volumen de tampón de carga que hay que añadir para obtener una concentración de éste de 1x. 2) Las muestras se mantienen en hielo y cuando están todas listas se

desnaturalizan a 95 ºC durante 5 minutos. Luego se hace un pulso de centrífuga para recuperar la muestra y se realiza un shock térmico en hielo durante 1 minuto. A continuación se cargan las muestras en los pocillos, cargando algunos con el control de pesos moleculares, ladder (Invitrogen). Una vez realizada la carga se deja correr la muestra durante 1-1:30 horas a 120 v.

3) Luego se pone en una bandeja el tampón de transferencia (10 mL TGS 10x + 20 mL isopropanol + 70 ml H2O para cada gel).

4) A continuación se preparan 6 hojas de papel Whatman (VWR), así como un trozo de membrana de nitrocelulosa (VWR) del mismo tamaño. Y se sitúan en la bandeja con tampón de transferencia. A continuación se desmonta el contenedor del gel y se traslada el running gel a la bandeja.

5) Se ponen tres hojas Whatman superpuestas y se añade la membrana encima. A continuación se añade el gel, y se añade tampón de transferencia encima del gel. Finalmente se superponen tres hojas Whatman, y se añade el resto de tampón de transferencia encima, se tapa el aparato de transferencia y se inicia la transferencia a 20 v durante una hora.

e) Hibridación de la membrana con anticuerpos

1) Se retira la membrana de nitrocelulosa y se realiza un lavado de ésta con TTBS (TBS 10x: 200 mM Tris, 5 M NaCl, pH 7,5; TTBS: TBS 1X/ 0,1%

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Tween 20) durante 5 minutos en agitación. Luego se transfiere la membrana a una bandeja con Red Ponceau durante 1 minuto en agitación lo que permitirá observar las bandas de proteínas y cortar la membrana.

2) Luego, se recupera el Red Ponceau, se limpia la membrana con agua indirectamente y se realizan tres lavados de TTBS durante 5 minutos en agitación.

3) Se bloquean las membranas en una bandeja con 5% de leche en polvo en TTBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se incuba la membrana con el anticuerpo primario en un tubo donde se añaden 5 mL de la solución de anticuerpo primario (TTBS + 5% de leche en polvo + el anticuerpo primario (HMOX-1, Abcam), ambos en una dilución de 1:2000) + azida sódica al 0,1%, siendo el stock 1000x, 1 M) y se incuba durante toda la noche girando a 4 ºC (Lab RolleII, Speedy 7).

4) El día siguiente se realizan tres lavados de 5 minutos con TTBS en agitación y se transfiere a otro tubo con 5 mL de la solución con el anticuerpo secundario (Santa Cruz; TTBS + 5% de leche en polvo + anticuerpo secundario con una dilución de 1:2000) y se deja incubar durante 1 hora. Se realizan tres lavados de 5 minutos de la membrana con TTBS en agitación y posteriormente uno más de 5 minutos en TBS 1x.

f) Detección y lectura de bandas

1) Se añade la solución de detección (Pierce ECL Western Blotting Substrate; Millipore; que se prepara mezclando en proporciones iguales cada una de las soluciones, 1x peróxido de hidrógeno y 1x Luminol, 1,5 mL por membrana) a la membrada situada en la bandeja del GeneGnome y se incuba durante 3 minutos, se retira el exceso de líquido con papel. Se realizan las tomas de fotografía acumulando la señal, tomando como tiempo 1 min, 2 min, 5 min, 5 min, 10 min, 10 min, 20 min 20 min 30 min o hasta que la señal se sature.