WESTERN BLOT

La tècnica de Western blot s’utilitza per detectar proteïnes utilitzant un anticòs específic. Aquestes

proteïnes han estat sotmeses prèviament a una resolució electroforètica en gels de poliacrilamida amb SDS, i a la transferència a una membrana de niló o nitrocel·lulosa.

3.20.1 ELECTROFORESI DE PROTEÏNES

L’electroforesi de proteïnes en gel d’SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) és una tècnica utilitzada per a la separació de proteïnes en funció del seu pes molecular. Consisteix en la desnaturalització de les proteïnes de la mostra amb SDS, que confereix càrrega negativa al complex. Les proteïnes desnaturalitzades se separen en una matriu de poliacrilamida en ser sotmeses a un camp elèctric. L’electroforesi es va realitzar seguint les indicacions de Laemmli (1970).

Preparació de les mostres

Una vegada obtinguda i quantificada la proteïna dels extractes (apartat 3.22), se’ls afegeix tampó de càrrega de proteïnes i es deixen bullir durant 5-10 minuts. L’ebullició en presència d’SDS i β-mercaptoetanol permet que les proteïnes es desnaturalitzin.

SOLUCIONS:

Tampó de càrrega de proteïnes 4 X Tris HCl pH 6,8 0,25 M

SDS 8 %

Glicerol 40 %

β-mercaptoetanol 20 % Blau de bromofenol 0,04 %

Preparació de gels de poliacrilamida

Per efectuar l’SDS-PAGE s’utilitzen gels que consten de dues parts: gel apilador i gel separador. Aquests es diferencien per la concentració de poliacrilamida i el pH.

El glicerol dóna densitat a les mostres, mentre que el colorant blau permet visualitzar el front durant l’electroforesi. El tampó es prepara 4X i es conserva aliquotat a –20 ºC.

MATERIALS I MÈTODES

80

La part superior formada pel gel apilador conté una proporció d’acrilamida del 4 %, de manera que la mida del porus del tramat és major. La funció d’aquest gel és alinear l’entrada de les proteïnes abans de ser separades. L’alineament de les proteïnes es dóna a la interfase entre el gel separador i apilador degut a la diferència de pH entre ells.

La part inferior del gel està constituïda pel gel separador, amb un percentatge de poliacrilamida major (7- 20 %) que genera un tamany de porus més petit que permet la separació de les proteïnes en funció del tamany molecular. Concentracions elevades de polímer milloren la resolució de mostres de pes molecular baix, mentre que gels separadors de concentració baixa afavoreixen la transferència posterior a membranes. Aquests gels s’han preparat utilitzant vidres i cubetes OWL.

SOLUCIONS:

Gel separador (10% acrilamida, pH 8,8) Acrilamida/bisacrilamida 3,3 mL Tampó B 2,5 mL SDS al 10% 100 μL H2O 4 mL Persulfat amònic al 10%* 75 μL TEMED* 7,5 μL

*El persulfat amònic actua com a polimeritzador de l’acrilamida/bisacrilamida, mentre que el TEMED catalitza la polimerització; no s’han d’afegir, per tant, fins al moment final de la preparació de cadascuna de les solucions que composen les diferents parts del gel.

Tampó A:

Tris HCl 0,5 M pH 6,8 Tampó B:

Tris HCl 1,5 M pH 8,8 Acrilamida/bisacrilamida:

30% acrilamida/Bis solution, 37,5:1 (2,6 %C) (BioRad) Procés electroforètic

Per identificar els pesos moleculars de les proteïnes de les mostres en estudi, es carreguen en un carril marcadors pretenyits de pes molecular conegut, Kaleidoscope Prestained Standards (BioRad). Les mostres, amb igual quantitat de proteïna, es carreguen al gel per desenvolupar l’electroforesi a temperatura ambient. En cas d’utilitzar gels de 0,75 mm de gruix, el procés electroforètic es realitza a 15 mA durant la migració de les proteïnes pel gel apilador i a 20 mA quan entren en el separador. Si el gel és de 1,5 mm de gruix, o bé quan es fan córrer 2 gels simultàniament, la intensitat s’augmenta a 30 i 40 mA, respectivament. Es tracta d’un procés de durada variable, en funció de la concentració del gel separador i de la mida de les proteïnes a estudiar. De manera general, el procés acaba quan el front del colorant blau arriba a la part inferior del gel. Una vegada finalitzada l’electroforesi, es procedeix a la transferència de les proteïnes a la membrana de niló.

SOLUCIONS:

Tampó d’electroforesi Tris HCl pH 8,3 0,025 M Glicina 0,192 M

SDS 0,1 %

Gel apilador (4 % acrilamida, pH 6,8) Acrilamida/bisacrilamida 1,3 mL Tampó A 2,5 mL SDS al 10% 100 μL H2O 6 mL Persulfat amònic al 10%* 75 μL TEMED* 6 μL

MATERIALS I MÈTODES

81

3.20.2 TRANSFERÈNCIA DE PROTEÏNES A MEMBRANA

Les proteïnes són transferides a una membrana de niló (NYTRAN 0,45 μm; Schleicher & Schuell) per electroelució a 60 V durant 2-3 hores a 4ºC, en tampó de transferència.

PROTOCOL:

1. Es descarta el gel apilador. El gel separador es diposita sobre un rectangle de paper Gel blotting paper (Schleicher & Schuell), prèviament humidificat amb tampó de transferència de proteïnes, situat sobre una espongeta sobre la tapa negra de la casset de transferència (BioRad).

2. Sobre el gel es posa la membrana de niló prèviament humidificada on es volen transferir les proteïnes, sobre aquest es diposita un segon rectangle de paper i l’altra espongeta. És important fer rodolar un tub per sobre de la membrana per tal d’eliminar bombolles d’aire (repetir aquest procés en cada pas).

3. Tancar la casset i introduir-la en la cubeta de transferència (BioRad). Aplicar un voltatge de 60 V. Aquest procés té lloc a 4 ºC durant 2 hores. Mantenir el tampó de transferència en agitació mitjançant una vareta magnètica.

4. Un cop efectuada la transferència, les proteïnes del gel poden ser tenyides amb el colorant Coomasie blue per veure si s’ha carregat la mateixa quantitat de proteïna en els diferents pous.

Tampó de transferència de proteïnes Tris HCl 0,025 M Glicina 0,192 mM Metanol 20 %

Es prepara en el moment de la transferència.

Visualització de les mostres de proteïna en gels de poliacrilamida

El procediment de tinció es basa en la fixació del colorant blau de Coomassie a les proteïnes. PROTOCOL:

1. S’incuba el gel en solució de tinció de Coomasie com a mínim 30 minuts a temperatura ambient. 2. Es renta vàries vegades amb la solució de rentat fins eliminar la coloració inespecífica.

3. Els gels són assecats amb una bomba de buit a 70ºC durant 3 hores. SOLUCIONS:

Solució de tinció

Metanol 40 %

Àcid acètic glacial 7 % Blau de Coomassie 0,025 % 3.20.3 BLOQUEIG DE LA MEMBRANA.

El procés de bloqueig es duu a terme per tal de reduir el soroll de fons durant la immunodetecció. El filtre on es troben les proteïnes transferides, es posa en agitació amb 100 mL de solució de bloqueig durant un mínim d’1 hora a temperatura ambient. Aquest tractament permet mantenir les membranes a 4ºC durant 1 setmana abans de la seva utilització per a immunodetecció, si es va renovant periòdicament la solució de bloqueig.

Solució de rentat

Metanol 40 %

MATERIALS I MÈTODES

82

SOLUCIONS: Solució blotto

Llet descremada en pols

(Central Lechera Asturiana) 10 %

PBS 1 X

3.20.4 IMMUNODETECCIÓ

Per efectuar la immunodetecció, hem seguit les pautes descrites per l’Immunstar HPR Chemiluminiscence

kit (Bio-Rad). La tècnica es basa en la incubació successiva de la membrana amb dos anticossos. L’anticòs

primari és una immunoglobulina G (IgG) que reconeix la proteïna d’interès. L’anticòs secundari és un anticòs anti-IgG, que reconeix l’anticòs primari i porta covalentment unit l’enzim peroxidasa. Aquest enzim catalitza l’oxidació del luminol en medi alcalí, originant la formació de quimioluminescència que serà captada en una pel·lícula fotogràfica (Hyperfilm, Amersham).

PROTOCOL:

1. Incubar la membrana amb una dilució adequada de l’anticòs primari en una bossa de plàstic segellada, que mantindrem durant tota la nit a 4 ºC en un agitador orbital. Alternativament, es pot dur a terme la incubació durant 60 minuts a temperatura ambient.

2. Retirar l’anticòs primari (conservar la solució a -20 ºC per reutilitzar-la en experiments posteriors) i efectuar 3 rentats de la membrana, durant 10-15 minuts, amb 100 mL de solució de rentat.

3. Incubar la membrana amb l’anticòs secundari durant 60 minuts en agitació suau i a temperatura ambient.

4. Retirar l’anticòs secundari i efectuar 3 rentats com es descriu en el punt 2.

5. Preparar la solució de detecció: es mesclen a parts iguals la solució potenciadora de luminol i el tampó de peroxidasa i incubar la membrana amb aquesta solució durant 5 minuts

6. S’elimina l’excés de solució, es diposita en una bosseta de plàstic i es posa a contactar amb la pel·lícula fotogràfica durant 2-30 minuts i es revela la pel·lícula.

SOLUCIONS:

Solució per diluir els anticossos Llet descremada en pols 5 %

PBS 1 X

Tween 20 (Sigma)* 0,1 %

* El Tween 20 és un detergent que dificulta les interaccions inespecífiques dels anticossos a la membrana, obtenint així imatges més netes i amb menor nombre de bandes inespecífiques. No obstant, no s’ha utilitzat quan s’han fet servir anticossos heteròlegs.