Universidad Autónoma Metropolitana- I

T t

U

L

J~~~~~~~~~ DB

UN

ADITIVO ALIMANTICION A PAR~IR

DE

SORGO (SoTghum b i c o l o r ( & e $ moench)

FdiWiiNTADO CON

AL

HONGO Rhizorms oliaosporus

J

Nabor

P.

Alvarez Kiranda.

Neftalf E. Escalona Alba.

Universidad Autónoma Metropolitana- I

Depart amento) de Bio t e cnolog

fa

.

J I n g . Bioquímica I n d u s t r i a l .

4 s e s o r e s :

M.

en C . Eduardo

E.

González

H.

R.

en C. Oscar Monroy.

H.

F

?.

.

~

OBTdNCION DS

UN

A D I T I V O ALIT?dNYICIO A PAHTIR

D&

SONGO (Sorghum bicolor

(2.

). moench)

PERWNTADO CON isL EONGO Rhizopus oligocoorus.

INFOBEIS FINAL,

Nabor

P.

h l v a r e z lid.

(No.

de c t a .

76312999).

Neftalí E.

f i s c a l o m A.

(No.

de cta.

77327750).

____.," ....

9

7

,

L

.

a

k

c

- i -

R E S U M E N .

Sorghum b i c o l o r

(La)

moench, .parcialbente desta- nizado, s e u t i l i z ó ) como sustrato básico de una fermenta- c i ó n s ó l i d a con Rhizouus o&igosporus ATCC 22959, con

eT f i n de obtener un producto con mayor contenido, de pro- t e í n a que e i grano o r i g i n a l .

E1 trabajo experimentar comprende esencialmente t r e s

partes, que en una forma m u y breve se exponen a continua-

ción:

l'). A n á l i s i s de l a Composición Química d e l

Sorgo.

Inicialmente, f u e necesario l'levar a cabo pruebas f i s i c o - qu&micas para c u a n t i f i c a r l'os principales componentes del'

sorgo que s e r í a empieado en i a investigación.

Los resultados obtenidos en l a s determinaciones de las sustancias de mayor relevancia para i a fermentación, fueron: 78.87 $, para almidón;

9.91

%,

para proteína 9p

2.342

$ de taninos.

2 ) . Destanización dell Sorgo. La destanización par- c i a r d e l grano ae l l e v ó a cabo apl'icando tratamientos térmico-alcalinos, con soluciones de NaOH'aT

5,

10 y 1 5 $;

50 C de temperatura, 10 minutos de extracción y a g i t a c i ó n controlada.

c

-

ii

-

T

L

1

La

máxima destanización s e obtubo con alcriii a l 3.5

56,

logrando e x t r a e r e l 90.77 $ de Xos taninos t o t a l e s . L i e n t r a s que en

Xos o t r o s dos casos se e x t r a j e r o n 85.75%

y 75.58 $, respectivamente.

3).

Fermentación. Para

Tos procesos

de fermentación se u t i i i z d como'sustrato, muestras de sorgo tratado a l a s t r e s d i f e r e n t e s concentraciones; incl'uyendo además una

de sorgo s i n tratamiento.

Los

mejores resultados fueron obtenidos en e l Lote A d e l segundo proceso de fermentación, con l o s medios de

sorgo sometido a tratamiento con NaOH a l 5

%

y sorgo s i n

c

-

iii

-

T

En nuestro país ae han realizado muy pocas inves- t i g a c i o n e s biotecnológicas donee e l sorgo s e a u t i l i z a d o como s u s t r a t o básico de a l g h t i p o de fermentación.

Los

e s t u d i o s que s e han publicado son esencialmente sobre mejoramiento g e n é t i c o de s e m i l l a s , con el: o b j e t o de d i s -

minuir e i contenido de laninos, a c e l e r a r s u produccián e incrementar Ea cantidad de proteína. An e s t o s traba-

j o s s e han obtenido f r u c t í f e r o s resultados, pero han surgido nuevos problemas, como

i a

p e r d i d a de r e s i s t e n c i a

a i ataque de los pájaros y a aigunas enfermedades causa-

das por microorganismos ( l , 2 , 3 ) .

En algunos países de Africa e s t e c e r e a l e s u t i l i z a - do para obtener bebidas alcohóllicas, de gran aceptación popular, como e s e l caso de l a cerveza d e l BantÚ, a l

sur

de Africa. Se preparan también aEgunos alimentos t r a d i - cional'es ae consumo infantiz, entre los que destaca e l Ogi de Sorgo, en Nigeria

í4,5).

Ambos productos s e ob-

tienen p o r fermentación sumergida con microorganismos E á c t i c o s , principalmente.

La

proteína de e s t o s alimentos

e s de baja calidad y practicanente tampoco

varia

en can-

0.

-

i v

-

f

L 4

c

t

L

Otros paises han desarrozlado v a r i a s técnicas con e l f i n de mejorar l a calidad de d i e t a s preparadas a ba- se de sorgo. dntre l a s más importantes s e encuentran: l a f o r t i f i c a c i ó n de aminoáciüos, adicionando concentra-

dos proteicos; l a germinación de l a s e m i l l a y l a fermen- t a c i ó n sumergida d e l grano (6,7,8,9).

i

Actualmente, l a l i t e r a t u r a sólo reporta un t r a b a j a

cuya f i n a l i d a d f u e mejorar c a l i d a d y contenido de protei- na en sorgo, mediante un proceso de fermentación s ó l i d a

con dicho cereal: Hesseltine

- -

e t a l (1967)

(lo),

u t i l i h a - ron s e m i l l a comercial de grado No. I de sorgo blanco y lo'ferme6taron con el' hongo

R.

oligosporus NRRi27IO.

El' producto obtenido, a l igual' que otros preparados con d i f e r e n t e c e r e a l , fue rebanado, metido en agua de s a l y f r i t o en a c e i t e v e g e t a i , con e l o b j e t o de v a l o r a r e l crecimiento d e l hongo, a831 como e l sabor, o l o r y co- l o r .

c

- v -

CONTENIDO

il

iii

C O N T ~ N I D O V

CUADROS

Y

PIGUtL4S

v i i i

1-1. Objetivo

...

3

CAPITULO 11:. BMVS S T U D I O DdL SORGO 4

Cul'tivo

...

4

...

Producción y Usos 4

Composición d e l Grano

...

5

Taninos

5

Taninos en Sorgo

...

6,

interacciones Tanino-Proteína

e

Almidón

...

TO

P r o t e í n a

...

12

...

...

CAPITULO 111:: PdRiúdNTACIONdS TIWDICIONiiLdS

Y4

IIId. Generalidades

...

1'4

111.2. P r i n c i p a l e s Alimentos Fermentaoos

...

14

111.3. Algunos Microorganismos U t i l i z a d o s

....

15

111.3.1. Breve Descripción d e l Hongo

,.

-

v i

-

7

111.4. Tempeh

...

2T

-

111.4.1. Definición 21

111.4.2. Propiedades

...

22

\I

...

I

CAPITULO I V : ANALISIS DA

LA

COMEOSICION

QUIE',ICA

DAL

SORGO 23

P

i IV.1. I V . 2 .

I V . 3 .

IV

.3

.Y.

IV.3.2. IV.4

I V . 5 .

IV.5.1. I V .5 - 2 .

S e l e c c i ó n y Pretratamiento de l a s e m i l l a 23 Extracción de Taninos

...

24 Determinación de Taninos

...

26 Método de l a V a i n i l l i n a (hW-HCl)

...

26

Ldtodol d e l Complejo A z u l de Prusia

...

29 Determinación de Almidón

...

32 Determinación de Proteína

...

36

Método de Biuret

...

36

Ftlétodo de Kjel.dah1

...

4 0

CAPITULO V : FARK.U?TACION

43

V . 1 . v.2.

v.3.

v.4.

v.5.

V.6.

v.7.

V.8.

...

Preparación d e i S u s t r a t o

4 3

Obtención d e l 1nÓcul.o

43

Primer Proceso de Fermentación

...

44

Humedad d e l Kedio, 45

Segundo Proceso de Fermentación

...

4 6

Prueba de Rebanado 47

Secado d e l Alimento

...

47

Fermentación Sumergida 48

...

...

-

v i i

-

L

.

CAPITULO V I : RXSULTADOS

Y

COXCLEIONES

VI.1.

V I .2.

VI.3.

VI

.4. V I . 5 .

V I -6. VI.6.1. VI.6.2. VI.6.3.

VI.7.

S e l e c c i ó n y _{Pretratamiento}

...

Aplicación de l o s tratamientos

Térmico-alcalinos

...

...

Contenido de Taninos

...

C u a n t i f i c a c i b n de P r o t e í n a

...

D e t e m i n a c i ó n de AXmidÓn

...

Procesos de Fermentación

...

Primer Proceso de Fermentación

...

Segundo Proceso de Fermentación

. . .

.

. .

.

Fermentación Sumergida

...

CmclusiÓn General

...

...

.

...

SUGEWNC IAS

B I BLI OGFZAPIA

.*

,.

-

v i i i

-

u 1’ 2 3 4 5

6

7

8

9

ro

11 1’2 1’3

CUADROS

Y

PIGUHirS

P r i n c i p a l e s Alimentos Producidos por Fermentación de Soya y Algunos Cereales

...

Extracción de Taninos

...

Cuadro Resumen d e l Contenido de Taninos en las

d i f e r e n t e s muestras de sorgo analimadas

...

Contenido de Taninos, medidos como^

Penoles t o t a l e s

...

Cuadro Comparativo‘ de l o s valores obtenidos

p o r l o s dos métodos

...

Porciento de Proteína determinada por e l método de R j e l d h a l , en micelio y diferentes muestras de sorgo

...

Contenido de Almidón

en

l a s diferentes mues- tras de sorgo analivadas

...

Evaluación visual: d e l producto obtenido en

e l

Primer Proceso de Pernsntación. Lote A

...

Cuadro comparativo d e l contenido de proteína en e l s u s t r a t o o r i g i n a l y en e l producto...,

16

57

58

62

63

68

71

34

76

BvalbaciÓn Visual’ d e l Producto obtenido en e l

Primer Proceso de Fermentación. Lote

B

...

77

Lote

A

...

79

Contenido de Eroteina d e l Lote A d e l 20. Proceso.. 80 Cuadro comparativo del contenido de proteína en

ros

productos de ambos procesos y en‘ s u s t r a t o

,

CAPIT'LJLO I.

INTRODUCCION

Actualmente uno de l o s p r i n c i 2 a l e s problemas de E$- x i c o y de muchos países d e l mundo e s l a excesiva e insa- t i s f echa demanda de aliment 3 9 , causada por l a i n s u f i c i e n -

t e producción a g r í c o l a y l a eleva(?a tasa de crecimiento de sus poblaciones.

Ante e s t a situación, en nuestro país, se investigan diversas soluciones FOSibleS. Por una parte, se encuen- t r a l a obtención de proteína a base de algunos microor- ganismos t a l e s como bacterias, Ievaduras, honzos filamen-

tosos y algas, empleando para SU crecimiento sustratos

de escaso v a l o r b i o l ó g i c o , t a l e s como almidones, residuos c e l u l ó s i c o s y algunos derivados d e l petróleo, a s í como desechos tanto de l a inciustria a l i m e n t i c i a corno de l a

'a-

groindus t r i a .

P o r o t r o lado, i a t e c n o l o g í a agropecuaria r e a l i z a constantes mejoramientos g e n é t i c o s con e i f i n de aceie- r a r y e l e v a r i a c a l i d a d y cantidad de l a producción a g r í c o l a y ganadera.

ET

maíz, e l sorgoi y e l trigo,

son

TOS c e r e a l e s re-

presentativos de l a a g r i c u l t u r a mexicana. E l c u l t i v o , d e l sorgo,comparado con e l de o t r o s cereales, e s r e l a t i v a - mente nuevo y constituye l a fuente de un gran número de

c

i

Un nuevo estudio de e s t e c e r e a l , con un enfoque d i - f e r e n t e a l o s realizn.dos a n t e r i o m e n t e en T?éxico, Consis- t e en e f e c t u a r una fsrnentación s ó l i d a , u t i l i z a n d o como sustrato básico sorgo, y e l hongo filamentoso

&.

-

oli-

Lospoius.

El s9rgo empleado en l a fermentación, Sori;F.ulr

&-

c o l o r

(5.)

aoench, es una variedad representativa, entre l a s miis cultivadas en nuestro p a i s ; se c a r a c t e r i z a por

t e n e r a l t a concentración de taninos y por su uso básico como f o r r a j e . Se espera que e l producto de e s t e proceso fermentativo pueda s e r u t i l i z a c o como a d i t i v o en alimen-

t o s balanceados, consumidos principalnente por ganado de engorda.

Las fermentaciones s ó l i d a s de e s t e t i p o ofrecen granües ventajas sobre _{2 . a ~} l í q u i d a s o sumergidas y l a s semisólidas. Las ventajas encontradas son l a s siguientes:

31 eouipo requerido en fermentaciones s ó l i d a s normalinen- t e e s peque3o) y poco s o f i s t i c a d o , con un g a s t o mínimo de energía para mantener la a i r e a c i ó n y temperatura reque-

r i d a s en e I proceso. No se requiere e f e c t u a l procesos de separación, ya que l a blonasa d e l microorganismo es com- pletamente inocua y constituye parte e s e n c i a l d e l prodcc- t o f i n a l .

L

-

3-

1

Y dos procesos de separación d e l producto p r i n c i p a l y sub-

productos, además s e debe i n c l u i r e l tratamiento de de-

sechos orgánicos para e v i t a r contaminación biológica.

Consecuentemente, l o s productos obtenidos por e s t e t i r o

de fermentaciones tendrán un costo

más

a l t o , aunque SUB

rendimientos sean mayoren que l o s alcanzados por v í a f e r -

mentación sólida.

&a tecnología para fermentaciones sólidas s e encuen- tra muy poco desarrollada. Consideramos que una f a s e si- guiente de e s t a investigación deberá t e n e r corno o b j e t i v o

e l

d e s a r r o l l o de una tecnoiogia s e n c i l l a y de bajo c o s t o ,

de manera t a l , que pueda

ser

t r a n s f e r i d a a l medio

rural.

c e r c a de los p r i n c i p a l e s centros de c u l t i v o de sorgo.

1.X. Objetivo.

Obtener mediante una fermentación s ó l i d a , un a d i t i -

vo a l i m e n t i c i o , usando como materia prima sorgo b i c o l o r ,

(Sorghum b i c o l o r

(L.)

-

moench), y e l hongo Bhizopus oli,qos-

=,

con e l f i n de incrementar e l contenido y c a l i d a d

de proteha, en r e l a c i ó n a

la

d e l sorgo o r i g i n a l ,

E

C U I ?

‘LO

11.

BFf3VE ESTUDI3

DZL

SOZGO.

1I.l’. Cultivo.

ET

sorgo es un c e r e a l o r i g i n a r i o de A f r i c a (11). c d t i v o se ha extendido rapidamente a muchos países,’ hasta ocupar en l’a actual’idad ei quinto fugar en i a producción

m d d i a l de c e r e a l e s c12), y e i segundo) a n i v e l nacional(l3).

Este notable incremento s e debe a su f á c i l adaptación en 10s d‘iferentes medios a g r í c o l a s , que e s 10, que caracte- r i z a a e s t e cereal’. Crece en c o n d i c i m e s extremas de tempe- ratura, humedad, a l t i t u d y composicioxes e d á f i c a s d e l sue-

To.

Además presenta gran r e s i s t e n c i a a sequías prolongadas

y a l ataque de pájaros, a s í como a algunas enfermedades propias de l’os cereales. Debido a l a precocidad de su ci- c l o ) de vida, en condiciones favorables, e s posible obtener doe cosechas por año

c14).

Su

11.2. Producción y USOS.

ET Banco de México en su informe correspondiente a l a década

1970-80, reporta que en el: c i c l o ’ a n t e r i o r se c u i t i -

varon

l‘,579,000

Ha, ocupando> el’ segundo) rugar en área de siembra; con una producción t o t a l de

4,812 Toneladas

y un rendimiento de 3 TON/Ha

(13).

.

mana, con un v a l o r nutri,tivo s u p e r i o r a l d e l maíz.

h x i s t e un gran nÚme,ro de variedades h í b r i d a s de sor-

go. Su composición química v a r í a de acuerdo a.Ta e s p e c i e

variedad a l a que pertenezca. Cabe s e ñ a l a r aue los a g r i -

c u l t o r e s generalmente s e l e c c i o n a n las variedades de semi-

xla para siembra, en l a s d i f e r e n t e s zonas d e l país, de- acuerdo a l a s c a r a c t e r í s t i c a s arronómicas dex híbrido y

nunca por su val'or n u t r i t i v o ! (15).

Entre las variedades

más

cultivadas en Fnéxico s e en- cuentra l a de Sorghum b i c o l o r

(4.)

moench, clasificada co-

mo de a l t p > contenido, de t a n i n o s ,

ros

c u a l e s causan proble-

mas de d i g e s t i b i l i d a d cuando s e usa e s t e cereal: como! base en i-a aximentación de animales no:rumientes

CIA).

11.3. Composición del' Grano de Sorgo.

11.3

.I. Taninos

.

E l estudio d e l contenido de taninos en e l grano de sorgo! ha adqujlrido gran i n t e r é s . desde que s e encontró. que l a presencia de é s t o s en al'gunas variedades, reduce considerablemente s u v a I o r b i o l ó g i c o , cuando. s e alimenta con e l l a s a animales monogástricos y a humanos (16).

a). Definición.

Los taninos s e definen generaxmente como compuestos p o l o f e n ó l i c o s , h i d r o s o l u b l e s , con

un

peso moXecular e n t r e

500 y 3 O00 q$/gmolj presentan Tas reacciones clásicas de'

fenoLes. Tienen como c a r a c t e r í s t i c a e s e n c i a l ia capacidad

0.

-6-

C

1

W

combinan también con algunos o t r o s poliméros como celulo-

sa

y pectina (17).

La

i n h i b i c i ó n de l a 8-glucosidasa (18) y algunas enzimas d i g e s t i v a s como l a t r i p s i n a , l a ac-arnuasa y l a l i p a s a

(lg),.

se debe a l a combinación d e l tanino con l a f r a c c i ó n p r o t e i c o de l a misma. La astringencia percibida

en e l paladar cuando se i n g i e r e taninos,

es caueada por

la p r e c i p i t a c i ó n de l a s proteínas y g l i c o p r o t e h a s de l a s a l i v a , l o que reduce su propiedad lubricante

(141,

(15).

ii.3.2. Taninos en Sorgo.

50s taninos que s e encuentran en

el’

grano de sorgo,

son principalmente d e l t i p o de

los condensados. Se ioca-

Iiizen en e i p e r i c a r p i o y están asociados con l a pigmenta- c i ó n de l a t e s t a 116).

Los

taninos condensados son

Tos

más comunes en e l r e i n o vegetal. Son mezclas de productos de condensación de moléculas t i p o flaván, combinadas en dimeros, trimeros

o

polimeros. Los flavonoides

más

importantes que l o s f o r - man son

los

fiaván-3-oies

o

catequinas y los fiaván-3-4-

d i o l e s

o

leucoantocianidinas.

A

pesar de s e r economica- mente muy importantes, han s i d o poco estudiados debido a

-7-

I LOS únicos compuestos que pueüen s e r separados sa-

tisfactoriamente son

ros

fiavanes monoméricos y algunos dimeros, pero es muy d i f i c i l oDtenerlos puros debido a l a h a b i l i d a d que tienen de formar puentes de hidrógeno con

otras moléculas ( 2 0 ) .

Las fórmulas estructurales de l a s catequinas y Xas Ducoantocianidinas, son:

Catequinas:

OH

A f cerequina R=R*'=H

Catequina R=OH; R%H

Galocatequina R=R*=OH

Leucoantocianidinas: i

R

1

b s

Leucopelargonidina R=R*,=H

Leucocianidina R=OH; R*=H

Le ucodelf i n i dina R=R *'=OH

(22)

i3n realidad l a s leucoantocianidinas se encuentran tan extendidas en e l reino vegetal, que son l a s responsa- b l e s de l a s reacciones atribuidas a

ros

taninos (23).

,

,*

L

-9-

'

11.3.3. InteracciÓn con l a s Proteínas.

Se ha sugerido que l a formación de l o s complejos ta-

nino-proteína, se i i e v a a cabo, por t r e s t i p o s de interac- ciones químicas (24), que se describen a continuación:

a ) . Formación de puentes de hidrógeno entre e 1 grupo o x h i d r i l o (-OH), de l o s f e n o l e s que constituyen l a estruc- tura de las Teucoantocianidinas, y los grupos receptores

de l a s proteínas

(-NH2,

-COOHI u otros poliméros.

b). iSnlaces i ó n i c o s entre

Tos grupos aniónicos

de 10s

taninos ( f e n o l e s ionizados o' grupos carboxiloe

1

y grupos c a t i ó n i c o s de l o s aminoácidos de l a s proteínas, como el: grupo amino (-NH2) é p s i i o n de i a i i s i n a .

c).

Bnlaces covalentea formados por l a unión entre quinonas, l a s oue pueden e s t a r formando parte de l a estruc- tura d e l tanino o pueden s e r producidas POT l a oxidación, y algunos grupos r e a c t i v o s de i a proteína, u o t r o poli&-

r o .

Este enlace es de p a r t i c u l a r importancia, ya que im-

L

-10-

.

L

bi

‘

11.3.4.

Almidón.

E l almidón e s uno de 1,os carbohidratos

más

ampliamen- t e d i s t r i b u i d o s e?l l a naturaleza. Se forma a partir de C02

y

H20,

en l a s h o j a s y p a r t e s verdes de l a s p l a n t a s , por

medio de l a c l o r o f i l a y l a l u z s o l a r .

E l almidón e s un homopolisacárido, ya que sus monome-

ros

son de un s ó l o t i p o . Iguar que

i a

c e l u l o s a , e i almidón

e s un glucano que s e encuentra en e l r e i n o v e g e t a l , s i n embargo t i e n e grandes d i f e r e n c i a s en sus propiedades f h i -

cas y quimicas. hlientras que l a c e l u l o s a t i e n e i a función

de s e r v i r como base e s t r u c t u r a l de las p l a n t a s , e l almidón s e considera como fuente de e n e r g í a de reserva. Se almace- na en r a í c e s , tubércul’os f r u t a s y s e m i l l a s en forma de grá-

nulos i n s o l u b l e s , los cuzles e s t á n debidamente ordenados

para impedir i a d i f r a c c i 6 n de Rayos

x

(25).

a). i?ktructura d e l liimidbn.

E1 producto comerciar l’lamado almidón e s generalmente

una mezcla de p o i i s a c á r i d o s . Los p r i n c i p a l e s componentes son l a amilosa y l a amilopectina.

Los

almidones comunes

t i e n e n de un 75-80

%

de amilopectina y de un 20-25 $

amilosa. Los almidones de c e r e a l e s de t i p o ceroso, como ma- í z , a r r o z y sorgo, contienen casi unicamente amiiopectina

con una pequeña f r a c c i ó n de amilosa

(Y%

o menos) (26).

de

l

La amilosa e s t á c o n s t i t u i d a de grandes cadenas l i n e a - r e s de D-Glucosa, l a s cuales e s t á n unidas por e n l a c e s

a ( 1 - 4 ) . Bstas cadenas s e encuentran dispersas y s u peso

molecular v a r i a de 1x103 a 1x10 5 gr/gm>i. ds poco soiu-

..

-11-

b l e en agua, pero’ forma nic21as hidratadas l a s cuales dan un c o l o r azÚl con I o d o . ñn t a l e s micelas l a cadena d e l po-

I i s a c á r i d o tome forma h e l i c o i d a l _(27).

La amilopectina e s t á altamente rdmificada. La longui- tud promedio, de l a s ramificaciones v a r í a de 24 a 30 r e s i - duos de glucosa., Se encuentran unidas en enlaces a: (1-4),

pero en 10s puntos de r a m i f i c a c i ó n los enlaces son cc(1-6).

La amilopectina da soluciones c o l o i d a l e s o , m i c e l a r e s l a s cuales dan un c o l o r r o j o - v i o l e t a con Iodo. Su peso molecu- Tar puede s e r tan a x t o comQ 1 0 8 g/gmUl.

Cuando e l almidón se h i d r o l i z a con ácidos, se obtiene unicaniente D-Glucosa como producto de I a h i d r ó l i s i s t o t a l . La composición der a.lmidÓn d i f i e r e ampliamente depen- diendo de l a fuente de don¿!e provenga, t a l e s como maíz, sorgo, papas, etc., (26).

b). Almidón de Sorgo.

E l almidón de sorgo se c a r a c t e r i z a por su composición

d i f e r e n t e a l a de o t r o s cereales. Contiene de 20 a 30

%

de amilosa y de 70 a 80 $ de amilopectina en sorgo cornÚn, mien-

tras aue e l sorgo de t i 2 0 ceres0 contiene 1 $ de amilosa y 99 ‘$ de amilopectina (28).

La d i s t r i b u c i h d e l almidón en e l grano, obtenida por d i s e c c i ó n manual d e l sorgo (291, es l a siguiente:

83 $ en e l endospermo. 1 3 ’$ en e l gérmen. 34.6 $ en l a t e s t a .

-12-

.

1.

Los gdnui!oe de aEmid6n &ex endosperm del eosgo’

m m

l’igeramente d e grandee que

ios

der alhLd6nide meh. =den aproximadamente entzis 1IQ y 25

p

bd,

de diámetro reepee-

tivamente,,

on

cambio> Tom gránuToe der gerlicsspiio, a d

muoh0

pequeños ( 3 0 ) .

LOS t i p o s de proteína que se encuentran en e 1 grano

de sorgo son:

Axbuminas T.3

-

1.7

s6

Globulinas 2.0

-

9.3 $ Prolaminas 32.6- 58.8

%

( K a f i r i n a )

Gliltel’inas 19.0

-

37.4

%

(39)

Como s e observa, l a k a f i r i n a es

l a proteína represen- t a t i v a de e s t e c e r e a l , y a l igual’ que l a s prolaminas se _sa- i ’ u b i l i z a en etanoli a l 70 u 80 $. Son insolubles en agua al’cohoi e t í l i c o absoluto.

y

a ) . Composición de ].a i r o t e í n a d e l Sorgo.

La proteína de sorgo, como

i a de otros cereales, t i e - ne como p r i n c i p a l e s aminodcidos ximitantes i i s i n a y treo- nina, en primero y segundo l u g a r respectivamente. Eetioni- na, t r i p t o f ano, arginina y g l i c i n a , también han sido seaa- Xados cono aminoácidos Timitantes (40).

-

s a K a f i r i n a e s t á constituida por una a l t a proporción de ácido giutámico (iiutamina) y aminoácidos no porares co- mo leucina e isoleucina, p r o l i n a y alanina

(41).

i

FRBMBNTACION& TRBDICIONALSS

111.1. Generalidades.

En algunos países de o r i e n t e , principalmente aquellos que s e encuentran a l suroeste de Asia, l'os alimentos

más

n u t r i t i v o s y económicos s e preparan comunmente p o r f e r -

mentación s ó l i d a 01 semisóiiüa de soya y/.) algunos cerea-

l e s con hongos fiiamentosos

(43).

Tales productos tienen

una importante contribución en l a d i e t a de l a gente, como fuente básica de proteína, calorías y algunas vitaminas

( 4 4 ) .

I11 -2. Principales Xlimentos Fermentados.

R 1 f r i j o l ' de soya es l'a fuente 0 1 s u s t r a t o p r i n c i p a l

en

l a preparación de una amplia variedad de alimentos f e r - mentados. Entre 10s más importantes s s encuentran, princk-

palmente, l o s cuatro siguientes: Piso,, Shoyu, Tempeh y To- fu. E l miso y e l shoyu se caracterizan p o s

su

f u e r t e sa- bor, por

l o que

se usan como condimentos

o

agentes sabo-

r i z a n t e s , más que como'alimentos nutritivos. E l t o f u

con-

t i e n e mayor cantidad de protefna y grasa, por l o que con- tribuye sustancialmente en l a nutrición de l o s consumido? r e s

(43).

E l tempeh, e s e l producto

más

c o m h y estudiado;

constituye l a base de nuestra investigación y por t a l ra- zón, sus propiedades se describirán ampliamente en e l pun-

t o 4 .

I

.

U 111.3. Algunos Uicroorganismos Utilizados.

,

Generalmente l a literatura sobre microbiologia de a l i - mentos y fermentaciones, micamente menciona e l u s o de es- p e c i e s de bacterias Acido-Eácticas, algunos A s p e r g i l l u s y

levaduras, para l a obtención de alimentos fennentaaos, y

no hace r e f e r e n c i a a l u s o de hongos filamentosos, d e l

or-

den de Tos mucorales, t a n extensamente empleados en muchos países A s i á t i c o s desde hace c i e n t o s de años (45). Algunos géneros t a l e s como Rhizopus, Xucor y Actinomucor, s e ca- r a c t e r i z a n por s u crecimiento extremadamente rápido. Son capaces de formar grandes colonias sobre e l s u s t r a t o a par-

tir de una s o l a espora; producen gran cantidad de enzimas

y hasta donde s e sabe, d i o se han reportado una o dos m i -

cotoxinas de algunos miembros d e l orden de l o s Kucorales

(46)

Existe una gran c a n t i d a d de especies de hongos que han s i d o u t i l i z a d o s en las fermentaciones t r a d i c i o n a l e s e n e l o r i e n t e ;

s i n

embargo, casi todas e l l a s pertenecen a l o s géneros ya mencionados anteriwmente.

0

En

l a

f i g u r a

No.

X,

se mencionan algunas de las espe- c i e s principales para

l a

obtención de tenpeh, miao, Shoyu y tofu.

Para l a elaboración de tempeh se usan además, las s i - guientes especies de Rhizopus:

-

R.

s t o l o n i f e r

-

R.

orysae

-

R.

arrhizus

.,

_"

3111.

do:!

]PO.

A l i

-

Ter-

Tc'

(SO.

"'i?

-

-1

6-

i:x:paies alimentos producidos por fermentación de soya y

122s consumidores y estado f í s i c o d e l producto (46).

dareales; d i f e r e n t e s especies de microorganismos u t i i i z a -

ñicroorganismo Sustrato Apariencia P r i n c i p a l e s usado en l a b.dSiC0 d e l producto. países con-

I Fermentación

-

-

sumidores.

-

R.

ol'iposporus soya s ó l i d o

Ac. elegans soya g e l

K c o r sp

As. oryzae arroz, pastoso

Sc.

r o u x i i soya Y o t r o s c e r e a l e s

-

As. oryzae soya Y l í q u i d o Lactobacillus sp t r i g o

Saccharomyces sp Hansenula sp

Indonesia

China y Formosa

Japón, China y o t r o s luga-

res de Oriente

-1'7-

111.3.1. Breve Descripción d e l Hongo

E =

oliRosPoruS-

Uno de los hongos fiiamentosos más ampliamente usa- dos en l a preparación t r a d i c i o n a l de tempeh en paises

o-

r i e n t a l e s y actualmente en Norte América, e s Rhizopus oligosporus, con l a c l a s i f i c a c i ó n

NBBL

2710; a i s l a d o p r i - meramente en e l Regional Research Center d e l Cepario de Peoria, ILLinois, y ahora también disponible como AYCC

22959

(471.

a). c l a s i f i c a c i ó n .

La base para l a c l a s i f i c a c i ó n e i d e n t i f i c a c i ó n de

los hongos ea l a morfología de l a s unidades filamentosas

o

h i f a s y de su conjunto, a s í como de l a estructura re- productora

(451.

Según Alexopoulus e t a l , l a c l a s i f i c a c i ó n de e s t e hongo s e r í a

(46)

( 4 8 ) :

Super-reino: Eucarionta División: Wastigomycota

Subdivisión: Diplomastigomycotina

Clase : Zigomycetes

Orden: Eucorale 8

Familia: Kucoraceas

Gknero: BhiZODUS Oli.&?OSROrUS

I

-18-

O t r a forma importante de c l a s i f i c a r a

a.

oligosporus e s l a establecida por K ü l l e r e t a l

(451,

( 4 9 ) .

Reino: Vegetal

Divis i 4 n 2 Fungi

Subdivisión: iQunycotha

Superciase : Phycomycetes (clase Clase: Zigomycetes (subclase) Orden: Muc o r a l e s

Pamil’ia: JEucoraceas

Género: Wizopus oligosporus.

+

+

+

La d i f e r e n c i a que e x i s t e con l a c l a s i f i c a c i ó n dada por

o.tros autores, e s e l cambio de e s t o s términos.

b). C a r a c t e r í s t i c a s Porfológicas.

-

-

R.

oligosporus, presenta h i f a s no, septadas, polinucleadas.

-

Posee estorones y rizoides poco desarrollados que gene-

ralmente s e oscurecen al’ envejecer.

-

Presenta estructuras de r e s i s t e n c i a llamadas zigosporas, después de una reproducción sexual.

L

-13-

g i ó f o r o , mediante e s c i s i ó n d e l plasma en porciones.

-

Los esporangióforos son cortos y s e originan en nódu-

l o s , en l o s que también s e forman los r i z o i d e s .

-

Los esporangios son grandes y generalmente ne&ro".

-

Columela hemiesférica y a p ó f i s i s (base d e l esporangio) en forma de copa.

-

m i c e l i o abundante y algodonoso; puede continuar s u c r e - cimiento hasta l l e g a r a l l e n a r l a v a s i j a que l o contiene.

-

Carece de esporangiolosr

-

Abundantes clamidosporas.

-

Las esporangiosporas carecen de paredes gruesas y son de tamaño y medida i r r e g u l a r .

-

En medio natural' vive como s a p r ó f i t o .

c ) . Aspectos Bioquimicos y F i s i o l ó g i c o s .

-

E s t e hongo s e c a r a c t e r i z a por t e n e r desarrollado un s b -

tema enzimático altamente i i p o i i t i c o y p r o t e o i í t i c o .

-

La a c t i v i d a d de s u sistema a m i l o l i t i c o es m u y baja y

algunas veces casi nula, dependiendo d e l s u s t r a t o por degradar.

-

Además de u t i l i z a r l i p i d o s como fuente de carbono, pue- de c r e c e r degradando azúcares pentosas como ia x i l o s a ;

hexosas, como l a glucosa y l a g a l a c t o s a ; disacáridos come l a t r e a l o s a y l a c e l o b i o s a , y p o l i s a c á r i d o s como

e l

almidón s o l u b l e .

,.

-20-

-

Como fuente de nitrogeno, además de proteína, puede in- y aminoáci- corporar sales de anonio, como L N H ~ ) ~

so4,

dos como asparagina (C

H O

N

), para c u b r i r sus reque-

rimientos proteicos.

4 8 3 2

-

Cuando se cul'tiva en medio s ó l i d o Ctubos inclinados o'

p l a t o p e t r i ) , presenta crecimiento superf i c i a i , desa- rrollando gran cantidad de h i f a s estolón; penetra a l medio a travez de rizoides.

-

S u máxima esporulación I a alcanza d e s p d s de

7

días, incubado a 2OoC de temperatura,

en

medio

PDA.

-

bn medio l í q u i d o , dependiendo de l a a g i t a c i ó n , c r e c e formando pequeñas e s f e r a s conocidas como "Pellets".

-

Por

sus bajos requerimientos de oxígeno, s e clasifica como microaeroffiico.

-

Por l a temperatura óptima de crecimiento, s e

l e

c o n s i b -

ra

mesófiio.

L

-21-

,

111.4. Tempeh (pronunciado correctamente: Tern-pay)

IiI .4.1. Def i n i c i b n .

El’

tempeh es un al’imento fermentado,, de traaicionál. consumo en Indonesia. Comiste basicamente de soya f r a g - mentada

u

o t r a s leguminosas y c e r e a l e s ( o ) por combinación

de é s t o s ) fermentados con

R.

oligosporus.

Los fragmentos

de l a soya y/o r o s cereales, constituyen e l sustrato de

l a fermentación, se hayan completamente unidos por un denso y blanco m i c e l i o de aspecto algodonoso durante l a fermentación. Con

e l

secado e l producto toma una l i g e r a c o l o r a c i ó n café y

su

forma

es

m u y s i m i l a r a l a de una pa- lanqueta de cacahuate (dulce de consumo popular en nues- t r o país). Su sabor es m u y aceptable y t i e n e un agradable

y c a r a c t e r i s t i c o oilor a levadura

u,

hongo (47).

IiI

4 . 2 . Propiedades.

E l contenido de proteína en e l tempeh de soya

es

a-

r r i b a d e l 4 6 $, en base seca,

6.19.5

6

en peso h6medo

(47). Su excelente d i g e s t i b i l i d a d , demostrada por Hacitier

- -

e t a i (r964) (53) y s u a z t o val‘or n u t r i t i v o

l a

constitu- ye en un buen s u s t i t u t o de Ila carne en l a d i e t a de huma-

nos.

Se ha observado que el’ tempeh obtenido con c u l t i v a

-22-

contaminación

con

l a b a c t e r i a K l e b s i e l l a pneumoniae, l a c u a l e s responsable del incremento en e l contenido de as-

t a vitamina, ya que e s capaz &e s i n t e t i z a r l a durante e x proceso de fermentación

( 4 4 )

( 4 7 ) .

También s e ha encontrado que las personas que consu-

men tempeh con regularidad en s u d i e t a , d i f i c i l m e n t e pa-

decen anemia perniciosa ( 5 4 1 , causada por d e f i c i e n c i a s de

vitamina B y presentan mayor r e s i s t e n c i a a algunas

in-

f e c c i o n e s bacterianas

(55).

CAPITULO I V .

ANALISIS Di3

LA

COK?2OGICION Q U B I C A DEL SORGO.

1 V . i . S e i e c c i ó n y Pretratamiento, de l a Semilla.

Para f i n e s de nuestra investigación, f u e neceeario u t i l i z a r s e m i l l a de sorgo sin t r a t a r con fungicidas n i in-

e e c t i c i d a s ,

u

o t r a c l a s e de agentes químicos de e s t e t i p o , para

su

preservación.

Generalmente cuando

se

Ievanta l a cosecha de granos,

éstos

se hayan infestados por plagas de insectos, a s í como por algunos microorganismos que constituyen l a mi-

c r o f l o r a natural o nativa, que f á c i i h e n t e s e desarrollan durante su almacenamiento. P o r e s t a razón fue necesario d e s a r r o l l a r una técnica que

nos

permitiera conservar en buen estado l a s e m i l l a de sorgo, durante l a i n v a s t i g a c i b , s i n emplear agentea químicos

como s e hace comunmente.

i V . 1 . i . Procedimientoi

E1

eorgo. obtenido en

el

Edo. de Guanajuato, correa- pondiente

a

l a cosecha de Septiembre

(19811,

se d i v i d i ó

en l o t e s de

500 g r y s e tamiz¿

en

mallas

No.8

y

No.

10,

con e l proposito de obtener granos de tamaño homogdneo,,

a s í corno, para separar semillas contaminantes, residuos de eorgo quebrado y basura en general.

de 250 g r y se puso

en vasos

de precipitados de 1 I t , pa-

ra

l a v a r l o t r e s vecee consecutivas con 400 m l de agua Terminada l a c r i b a se subdividid e 1 eorgo en I o t e s

-24-

d e s t i l a d a a temperatura ambiente y a g i t a c i ó n magnética durante 5 minutos. Se desechó e l agua de lavado y e l exce-

so de humedad se q u i t & . con papel absorbente. Zn seguida

se metió a secado durante 24 horas

a

50 C, en

una e s t u f a

"Precision" GCA Co. Yodelo>

l%,,

con c o r r i e n t e de a i r e .

Transcurrido este tiempo s e envasó en f r a s c o s de vidrio, completamente cerrados, de 500 gr, poniéndolos en conge- l a c i ó n durante 24 horas. Concluido este tiempo se almace-

naron dichos f r a s c o s

a

temperatura ambiente.

O

Durante e l d e s a r r o l l o de e s t e procedimiento s e d e j ó un f r a s c o t e s t i g o que contenía i a misma cantidad de

sor-

go que los demás, pero envasado con granos unicamente ta-

mizados, con e l o b j e t i v o de observar su deterioro, a s í como e l rápido ataque de plagas, durante e l transcurso de l a investigación.

1v.2. Extracción de Taninos.

Empleando soluciones de NaOIi, KOH y Na CO

,

y combi-

naado l a s variables: tiempo,, temperatura y concentración, se ensayaron aigunos métodos OJ tratamientos con e l

fin de

extraer

l a mayor cantidad de taninos s i n dañar l a s d i f e -

rentes

partes de l a semilla. Algunos estudios a l respec- to, r e a l i z a d o s

por Bllessin

C.W.

e t

a l , concluyen que

un

tratamiento con NaOH a l 20$ a 16OoP

i71.11°C),

en un ran-

go de

4

a

8 minutos,, s e remueve unicamente

e l

pericarpio,

quedando i n t a c t o s e l germen y e l endospermo (56).

N8OH

o

KOH a l 0.276 (0.05V) a 3OoC y 24 horas,

o incremen-

2 3

.

O

tandoi l a temperatura a 100 C,. en 20 minutos, s e l o g r a ex- t r a e r de un 75 a 85 $ de l o s taninos t o t a l e s , Tocalizados principalnente

en

el:

pericarpio. Bajo condiciones simila-

res, Na

CO se remueve un 77

46;

mientras que remojando

con agua destilada, unicamente s e extrae un ₃₀ $ (57). Considerando e s t o s resultados y con e l f i n de e v i t a r e l mínimo daño en l a semilla, se a p l i c ó un tratamiento

térmi-

co-alcalino menos drástico, d e s c r i t o a continuación.

2 3

IV.2.l’. Procedimiento.

IniciaiiEente se

fijaron

l a temperatura y e l tiempo,

O

de extracción a 50 C y 1’0 minutos respectivamente, mane-

jando cono v a r i a b l e s tres d i f e r e n t e s concentraciones de NaOH: 5, 1 0 y 1 5

$.

Preparadas e s t a s soluciones,

se

adi- cionaron 25 ml a t r e s matraces erlenmeger de 125 m l , ma-

ne jando cada maestra por duplicado y etiquetando debida- mente todos los matraces. A continuación s e colocaron d i -

chos matraces en un a g i t a d o r g i r a t o r i o con baño de agua

a

temperatura constante, G i r a t o r y water bath shaker, New Brunwick s c i e n t i f i c co. model 0-74. Cuando l a s soluciones

en

el’

i n t e r i o r de l o s matraces alcanzaron

los 50

C s e a- gregaron

5

g r de sorgo n cada matraz y bajo estas condl- ciones, s e agitó durante 10.minutos. Transcurrido e s t e

tiempo,. se separó rapidamente e l ’ e x t r a c t o de l a semilla O

se adicionaron 25 Q1‘ be agua destilada a cada matraz,

para n e u t r a l i z a r con una s o l u c i ó n de ácido l á c t i c o i

N,

usando

un

potencibmetro, pH-meter

E 520 Vetrohm Herisau.

,. , .

-26-

a g i t a c i ó n durante 5 minutos y se midió o t r a v e z e l pH,

como había algunas variaciones, se reajustó a 7. Cada

muestra s e pasó por una malla No. 20, para separar e l a- gua de l a semilla, s i n tener pérdidas considerables; e l exceso de hmedad se q u i t ó con papel absorbente. Después, s e sometió a secado i a semilla, en las mismae condiciones

d e l punto

IV.l.

Transcurridas Ins 24 horas de secado se

pesaron nuevamente l a s 6 muestras, con e l f i n de c a l c u l a r

e l

porciento de materia seca perdida con los tratamien-

t o s y se pulverizaron dichas muestras;

e l

harina se alma- cenó

en pequeños frascos de v i d r i o , para c o m e m a r l a

dis- ponible y en buen estadoy para l a s determinaciones poste- r i o r e s .

I V . 3 .

Determinación de faninos.

Eo8

metodos reportados para l a c u a n t i f l c a c i ó n colo- rirnétrica de taninos en sorgo, han s i d o modificados y e- valuados por v a r i o s autores en d i f e r e n t e s ocasiones, de- bido a que l a composición de l a s estructuras p o l i f e n ó l i - cas de estos compuestos es poco conocida a h , a s í como a l a interferencia de algunos plgmentos que se hayan asocia- dos con l o s taninos condensados.

IV.3.l.

M6todo de l a V a i n i l l i n a (W-HCl).

En esta i n v e s t i g a c G n e i método seleccionado para l a

determinacldn de taninos es e l establecido por Burns

-

e t

-27-

/

Booney

(1972) ( 5 9 ) y Price-Butler

(1977)

(60). Se r e v i s ó

además, l a Última evaluación reportada por Barp F.C.

a l

(1981)

(61).

Este método se basa quimicamente, en l a reacción de La v a i n i l l i n a con e l a n i l l o

"A"

de las moléculas de l a s catequinas g leucoantocianidinas para dar un complejo de c o l o r a c i ó n r o j a , cuya tonalidad depende de l a concentra- c i ó n de e s t o s polimeros.

a ) Procedimientot.

Se pesacon p o r dupl'icado 5 muestras de 500 mg de ña-

rina de

sorgo, de l a s cuales 3 fueron de sorgo.

con trata-

miento térmico-alcalino, (5,.

IO

JT: 1'5

%

de NaOH),

muestras de harina de sorgo sin tratamiento. A I mismo dos

tiempa,. s e colocaron en el' a g i t a d o r g i r a t o r i o los matra-

ces erlenmeyer de I25 m l , l o s cuales c o n t e n h a 25 mT de

RCI: a l 1% en metanol, cuando, l a solución aTcanzÓ los 40QC,

se agregaron

los 500

mg de harina de cada muestra, a l o s r e s p e c t i v o s matraces previamente etiquetados. se a g i t ó

au-

rante una hora

.

Los tapones de hule. usados para

Tos

ma- t r a c e s , s e cubrieron con papel garafilm,. para e v i t a r que

fueran

atacados por e l HCT y se leberaran _grupos s u l f h i - d r i l o j d e l hüke,,

los cuales a f e c t a n

l a absorbancia de

las

muestras

(14).

Después de i a a g i t a c i ó n , se centrifugd e r e x t r a c t o

a 3500 rpñi durante TO minutos.

Del'

sobrenadante se toma-

ron

2 a l i c u o t a s de 1 ml, de l a s cuales una f u e u t i l i z a d a

-2%

.

Para Xa determinación se agregaron 5 mi de l a mezcla reac- ción: v a i n i l i i n a a i 4

$

d i s u e l t a en metanoi y HC1 a l 8 $ en metanoi, mezclados en proporción.T:i; e s t a mezcla se preparó a l instante de s e r usada, pues por oxidación s e a l t e r a

su

c o l o r de blanco a amarillento.

B1

blanco de cada muestra se preparó agregando 1 m i de e x t r a c t o a 5 mi de o t r a mezcla semejante a l a de reac- c i ó n pero ?a v a i n i l l i n a fue s u s t i t u i d a por

HC1

(2.5 m l de HC1 a l 4

5

en metanol

+

2.5 ml de HC1 a l

8

s6

en metanol),

88 üecir,

5

m l de

una solución de

HC1 en metanol a l 6

5.

A p a r t i r d e l instante en que se adicionaron l a s mezclas

de reacción, con i n t e r v a l o s de medio minuto e n t r e tubo y tubo, se cronometraron 20 minutos para toner l a e l e c t u r a s de absorbancia e n un espectrofot&netro Bausch and Lomb, Spectronic 20, puesto a funcionar una hora antes. Ajustan-

do a cero, momentos antes de s e r usado, con 6 m l d e l reac-

t i v o MV-HCl a una l o n g u i t u d de onda de 525

nm.

Por

o t r a parte, el sedimento obtenido> en los tubos

después de l a centrifugación, s e resuspendiói con oitros 20 m l de HC1 a l 1’

$

en metanol, agitando vigoroeamente en

un

Vortex-Genie, y se t r a n s f i r i ó a los matraces de 125 m i

para e f e c t u a r una segunda extracción, incrementando e i

tiempo, a doe horas Pasado e s t e tiempo, se hizo! l a deter-

minación de l a misma manera que l a primera

vez.

Con

e l sedimento> se e f e c t u ó ~ u a s Última e x t r a c c i ó n durante

3

ho-

-29-

b). Curva Estandar.

?

Debido) a que no, f u e posible a d q u i r i r l a D-catequina, i a curva patrón se preparó empieando.taninos naturales

obtenidos de Acacia (Donados por I n t e r c o

s.

A,)

con

un grado de pureza d e l

71.7

$, procediendo, de l a siguiente manera:

139.47 mg de taninos fueron pesados y disueltos en una solución de HC1 a l 1% en metanol, aforando,a 50 m l .

Con e l f i n de separar l a materia insoluble, se filtró a v a c í o u t i l i z a n d o una capa doble de papel Watman Nb.

5.

A

p a r t i r de e s t a solución s t o c k se prepararon

i o

diluciones, variando l a concentración de 0.02 a 2 _mg/ml!. En seguida

se

tomaron a i i c u o t a s de i m l de cada diluci.6n y se trans- f i r i e r o n a tubos de ensaye que contenían

5

m l de l a mez- c l a r e a c t i v o ETV-HCl. Transcurridos 20 minutos se l e y e r o n l a s absorbancias de l a s 1 0 muestras.

iía preparación de l a curva patrón se

hizo,

junto) con

l a de

las primeras extracciones de l a s muestras problema,

con e l

f i n

de t e n e r un Zote de Xecturas.

IV.3.2. Método del: Complejoj

Azul

de Prusia.

Price

y Butler

(1977),

(60) desarrollaron

un

método

cuantitativo

para determinar f e n o l e s t o t a l e s en

e l

grano

de sorgo, 20s cuales son capaces de r e d u c i r

e l

cl’orurs i 6 r r i c o

a

cloruro f e r r o s o y

éste

reacciona con e l f e r r i - cianuro Be potasio dando e l complejo soauble f e r r i c i a n u r o j i 6 , r r i c o de p o t a s i a , cónociao.como h u i de Pruaia.

-

-30-

f e r r i c i a n u r o de potasioxes amarilla, pero

en

presencia de pequeñísimas cantidades die los reductores f e n ó l i c o s , una

parte d e l f e r r i c i a n u r o , reacciona con e l ión f e r r o s o ya reducido por l o s fenoles, para producir e l pigmento a z u l que e s d i l u i d o en e l r e s t o d e l f e r r i c i a n u r o en solución, apareciendo una coloraci6n verde, que cambia a turquesa y a a z u l

en

presencia de mayores concentraciones de feno- les.

a)!. Erocedimiento.

La extracción de los taninos condensados

fue hecha

e n tuboe de centrifuga con 6 nrl' de HC1 a2 l% en metano1

y muestras de 60 mg de harina de sorgo, a l o s d i f e r e n t e s

tratamientos y s i n t r a t a r , pesados en portaobjetos.

Los 8

tubos que contenían e l harina y e l solvente fueron tapa- dos con papel parafilm y s e agitaron durante un minuto en un a g i t a d o r vortex-genie. Inmediatamente después

ae

cen- trifugó a ₃₅₀₀ rpm durante 1 0 minutos.

EI sobrenadante

se

diluyó.

en 50

m l de agua destilada, contenida en matra- cea erlenmeyer de 125 m l y e l aedimento se suspendió con 6 ml de agua destilada, agitando duxmiiie un minuto.

En

seguida se centrifugó., adicionando

e l

sobrenadante a Tos matraces respectivo€?, y

se

d e j ó reposar durante 30 minu-

tos, con e i propósito de que Be eliminara

ex

a i r e aisuel-

to, en e i metanox durante i a extracción.

Transcurrido e s t e tiempo, se agregaron 3 m l de l a so+

X!uciÓn de cloruro f d r r i c o 0.1 iU d i e u e l t o en HC1 0.1N g

3

c

-31-

.

e l

tiempo. de adición; a los 10 minutos

se

l e y ó l a absor-

bancia a 720 nm, ajwtandm el' espectrofotómetro, Varian- Techtron rodelo.

634,

a c e r o con una d i l u c i ó n preparada de

i,cgaal forma, pero omitiendo e l e x t r a c t o de harina de sor- eco *

b). Curva Patrón.

De l a misma manera que en e l método de EV-HCl, l a

curva

estandar se construyó emplean do^ taninos condensadcm

naturales, en i-ar de ácido tanino como sugieren algunos autores, por considerar que a i

ser

é s t e un tanino s i n t e -

tico

e

h i d r o l i s a b l e , es menos representativo.

Se preparó una soluci&n s t o c k con

139.47

mg de tani-

nos d i s u e l t o s en

HC1 a l

1$ e n metanal,. aforando a

IO0

m l d

Se filtró, dicha solución y a p a r t i r de é s t a se prepararon l a s d i f e r e n t e s d i i m i o n e s , variando i a concentración de

EO

a 1'50

y9/"1.

Posteriormente, se s i g u i ó e l procedimien-

t o

d e s c r i t o en e l primer i n c i s o , procurando l e e r l a s ab- sorbancias, tanto de l a curva patrón como de las muestras,

en

un

sólo

l o t e .

h e d i a t a m e n t e después de terminar e i l o t e de lectu-

ras, l a s f o t o c e l d a s fueron lavadas perfectamente con

una

c

-32-

,

I IY.4. Determimación de Almidón. \ I

La cantidad de almidón presente en e l grano de

sor-

go. u t i l i z a d o , se determinó por e i método de Fairbairn,

(621 e l cual se basa teoricamente en l a h i d r ó l i s i s t o t a l d e l almidón con e l r e a c t i v o de antrona (obtenido con an- trona pura d i s u e l t a en ácido> s u l f ú r i c o concentrado).

Es-

t a mezcla r e a c t i v o h i d r o l i s a dichos porímero hasta su uni- dad más simDie que e s i a giucoea, y e s t a forma un queia- t o c o l o r i d o con l a antrona. Dependiendo) de l a concentra- ci6n de glucosa i a coioracihn v a r í a desde un tono verde

Timón

transparente hasta a z u l oscuro.

En

e l primer paso ente técnica, e s l a extracción de

1’0s carbohidratos t o t a l e s contenidos e n l a s muestras de

harina de

sorgo,

En seguida, a l almidón se separa de

a d -

care8 sojLubles como glucosa,. fructuosa y sucrosa (16),

prhcipaihente,. empleando para e s t e f i n una eoiución e t a n o i a i

S@$.

Posteriormente, s e procede a d i s o l v e r e 1 almidón de l a f r a c c i ó n s ó l i d a obtenida después de l a ex- t r a c c i ó n e t a n ó i i c a , adicionando. una s o ~ u c i ó n de ácido1 p e r c l ó r i c o a l 52%. que es un excelente s o l u b i l i z a n t e de dicho p o l i s a c á r i d o , (63). 21’ almidón a s í 8olLibilizado s e

a i s i a por i a formación de un querato co;lorido (armidón- yodo) que se l o g r a al‘ a d i c i o n a r una solución yodo-yoduro de potasior E1 complejo a s í formado,, e s desintegrado en

almidón y Iodo. Una v e z l i b e r a d o e l ’ almidón

se

determina co~orimetricamente con

er

r e a c t i v o ae antrona.

-33-

a )

.

Procedimiento.

Preparación de l a s muestras. Se pesan 500 m~ de se-

m i l l a de sorgo

sin t r a t a r

y s e muelen hasta obtener

una

f i n a harina que pase por marla

No.

40. Se toman 2 mues- t r a s de TOO mg, y 6

más

de harina de sorgo sometido a l o a

3 d i f e r e n t e s tratamientos térmico-aicaiinos.

Bxtracci6n de Carbohidratos. Pesadas l a s

8

muestras,

se t r a n s f i e r e n a tubos cónicos de c e n t r i f u g a de 50 m l , hu- medeciendo e l harina con

3

gotas de e t a n o i a i 80

96.

Se agregan 5 m l de agua d e s t i l a d a y s e a g i t a vigorosamente

en un a g i t a d o r Vortex-Genie, 2 minutos.

En seguida

l o s

tu- bos s e sumergen durante 2 minutos

en

baño de agua calien-

t e , e n t r e 60 y 65 OC. Transcurrido e s t e tiempo, se sacan

y s e l e s agrega 25

mr

de e t a n o l a l 80

$

g nuevamente se

a g i t a n

5

minutos,

a

a l t a velocidad. P o s t e r i o m e n t e ,

los

tubos se ponen o t r a v e z

en e l

baño p o r dos minutos y sea-

gitan. Ea mezcla s e e n f r i a a temperatura ambiente y 88

c e n t r i f u g a 1 0 minutos a 3500 rpm.

Los

sobrenaaantes 8e de- sechan y a l o s sedimentos empacados

en

ToB tubos, se

les

rypricrr

ex mismo tratamiento, de extracción

3

veces más.

SoXubilizaciÓn d e l AlBiiidÓn. Terminada l a e x t r a c c i ó n de

Toe carbohidratos, se adicionan 5

mP de agua d e s t i l a d a a l & . i d o contenido en

los tubos

y se a g i t a fuertemente has-

t a

homogenizar l a mezcla;

en

seguida l o s tubos se meten

en

baño de agua h i r v i e n t e durante 15 minutos. Se e n f r í a n

-34-

percl6ri.c

temperalaid ambiente, se sacan dichos tubos y se a g i t a n 3 veces en lapsos de 5 minutos. Después de e s t a a g i t a c i ó n s e l e s adiciona 20 m l de agua destilada, s e a g i t a n y s e c e n t r i f u g a 15 minutos a 3,500 rpm.

E1 sobrenadante obte-

nido se t r a n s f i e r e a un matraz aforado y el‘ sedimento1 s e

resuspende con 6.5 m l de á c i d o percPÓrico; s e agregan 1’0 m l de agua destilada, s e homogeniza y s e centrifuga

como

en e l caso a n t e r i o r . E l sobrenadante se t r a n s f i e r e a l ma- t r a z y e l sedimento se desecha. Se a f o r a con agua desti- Yada y e s t e e x t r a c t o s e f i l t r a en un embudo con f i l t r o de v i d r i o o en un buchner con f i l t r o de lana de v i d r i o .

Formación d e l Quelato Almid6n-yodo. Se toma una a l í c u o t a de 1’0 r n l y

se

t r a n s f i e r e a un tubo. de centrifuga, a d i c i o - nando 5 m1’ de NaCl a l 20% y 5 ml. de yodo-yoduro de pota- sio, s e a g i t a en Vortex

3

minutos y

se

deja reposar 20. En seguida, se c e n t r i f u g a 1’0 minutos a 3,500 rpm; s e de- secha el’ sobrenadante, separándolo cuidadosamente para e v i t a r pérdidas d e l sbiido, e x cual’se l a v a 2 veces con 1 0 ml de cl’oruro) de sodio en etanol‘, agitando) 4 minutos

en

v o r t e x a a l t a velocidad y centrifugando 1 0 minutos a 3,500 rpm. En cada lavado1 se desecha el’ sobrenadante.

a l 52%. Se ponen 2 minutos en baño agitado a

A l s ó l i d o j o b t e n i d o en cada tubo s e l e agrega 4 ml’ de