Validación de una metodología para determinar rebaudiósido a por cromatografía líquida de alta resolución hplc de la planta de stevia rebaudiana bertoni

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA. ría. Qu. ím. ica. ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA. nie. “VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA PARA DETERMINAR Rebaudiósido A. In ge. POR CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC DE LA PLANTA DE STEVIA REBAUDIANA BERTONI”. de. TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:. INGENIERO QUÍMICO. Bach. KAREN SINDY PORTALES QUEZADA. bli ot ec a. AUTORES:. Bach. MILAGRITOS JESÚS SÁNCHEZ RODRÍGUEZ. Bi. ASESOR:. Dr. NOÉ COSTILLA SÁNCHEZ. TRUJILLO – PERÚ 2012. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. MIEMBROS DEL JURADO. ím. ica. Aprobado por:. -------------------------------------------. Qu. Dr. José Rivero Méndez. In ge. nie. ría. PRESIDENTE DEL JURADO. Bi. bli ot ec a. de. ----------------------------------------Ms. Walter Moreno Eustaquio SECRETARIO. ----------------------------------------Dr. Noé Costilla Sánchez ASESOR i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. DEDICATORIA LA PRESENTE TESIS LA DEDICO CON TODO MI AMOR Y CARIÑO: A DIOS por haberme dado la vida,. ica. por llegar a este punto y haberme dado salud y fuerzas para lograr mis objetivos,. además. por. su. infinita. ím. bondad y amor. A mis padres por darme una carrera para mi. Qu. futuro y por creer en mí. Ami madre LUISA por sus consejos, su apoyo, su confianza, por hacerme una persona de bien y. A. mi. ría. sobre todo por su amor. padre:. PEDRO,. por. enseñarme. a. nie. perseverar, por los recursos brindados y sobre todo por su amor.. In ge. A mi abuelita EULALIA, por cuidarme, por brindarme su apoyo y por consentirme.. A mis hermanas: TATIANA y BEATRIZ. de. por su apoyo constante y estar ahí en. bli ot ec a. todos los buenos y malos momentos A ROBERTO por enseñarme a perseverar Por enseñarme a ver la vida de una manera alegre y no dejarme caer en los momentos más difíciles.. A mis amigos KAREN, LUIS y PERCY por estos cincos años de carrera universitaria y de. Bi. conocernos y en los cuales hemos compartido tantas cosas. Gracias por ser mis amigos. A JUANCITO por sus implecables fotocopias.. MILY. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. Dedicatoria. buen sendero de la vida, así como ser mi refugio y. Qu. ím. mi fuerza ante los problemas y obstáculos presentes.. ica. A Dios, muchas gracias por guiarme en el. ría. A mis Padres, Higinio y Janeth, por apoyarme. nie. durante los cinco años, quienes con su apoyo y amor constante son el mejor ejemplo de vida.. Graciosos que compartimos.. de. In ge. A mi Hermana Lisset por los momentos. bli ot ec a. Al amor de mi vida que gracias a su apoyo y amor incondicional pude soportar algunos malos momentos en esta etapa de mi vida.. Bi. Te amo Clark.. KAREN iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los. autores. del. presente. trabajo. queremos. dar. nuestro. UN T. AGRADECIMIENTO. más. sincero. agradecimiento a todas las personas que ayudaron a realizar este proyecto. Un. ica. agradecimiento a nuestro asesor el Dr. NOÉ COSTILLA SÁNCHEZ, por su guía, su constante ayuda, dedicación, paciencia en corregir los borradores, por. ría. Qu. terminar con éxito el presente trabajo de investigación.. ím. brindarnos la facilidad para el uso de equipos del laboratorio y por su apoyo para. Agradecemos por sus valiosas aportaciones durante la elaboración del mismo a la. nie. Q.F. Inés Castro Dionisio por ayudarnos con la realización de diversos ensayos en. In ge. el equipo de HPLC y los análisis requeridos para este trabajo.. de. Agradecemos a los profesores y amigos que de una u otra manera contribuyeron. Bi. bli ot ec a. en la elaboración y culminación de este trabajo de investigación.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. ÍNDICE DE CONTENIDO. Página. Miembros del Jurado. i. ii. ica. Dedicatorias Agradecimiento. iv. ím. Índice Abreviaturas y Símbolos. Qu. Presentación Resumen. ría. Abstract. nie. Introducción. ANTECEDENTES. In ge. MARCO TEÓRICO. v. vi vii viii ix x. 1 14 16. RESULTADOS. 23. DISCUSIÓN. de. MATERIALES Y MÉTODOS. 27 32. RECOMENDACIONES. 33. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA. 34. ANEXOS. 37. Bi. bli ot ec a. CONCLUSIONES. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. r. : Coeficiente de correlación. r2. : Coeficiente de determinación. t. : t de Student. S2. : Desviación estándar. C.V.. : Coeficiente de variación. L.D.. : Límite de detección. L.C.. : Límite de cuantificación. L.C.P.. : Límite de confianza promedio. Rs. : Resolución. C. : Constante. tR. :Tiempo de retención. W. : Anchura del pico por tangente. ím. : Parte por millón. Bi. bli ot ec a. de. In ge. nie. ría. Qu. ppm. ica. UN T. ABREVIATURAS Y SIMBOLOS. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. UN T. Señores Miembros del Jurado: Facultad de Ingeniería Química.. ica. Universidad Nacional de Trujillo.. En el cumplimiento de las normas vigentes que rigen el Grado y Título de la. ím. Universidad Nacional de Trujillo, ponemos a su criterio la presente tesis:. Qu. “VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA PARA DETERMINAR Rebaudiosido A POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC EN LA PLANTA DE STEVIA REBAUDIANA BERTONI”, la que estamos presentando. ría. con la finalidad de optar el Título Profesional de Ingeniero Químico.. nie. El presente trabajo se ha desarrollado en el periodo de noviembre 2011 a mayo del 2012, en el laboratorio de métodos instrumentales de la facultad de ingeniería química de la UNT, utilizando estándares de Rebaudiosido A, como material de. In ge. estudio.. Este trabajo es el resultado de la aplicación de nociones adquiridas durante la. de. formación universitaria, poniendo de manifiesto nuestra inquietud investigadora. Señores del jurado esperamos dispensen errores u omisiones en el trabajo. bli ot ec a. sometido a su apreciación académica y aspiramos con el lapso del tiempo poder superar.. Bi. Trujillo, Junio del 2012.. ---------------------------------------. -----------------------------------------. Bach. Karen Sindy Portales Quezada. Bach. Milagritos Jesús Sánchez Rodríguez. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. RESUMEN En este trabajo se presenta la validación de un método analítico para la. cuantificación de Rebaudiósido A. Los parámetros estadísticos empleados. fueron: La linealidad; obteniéndose un coeficiente de correlación r= 0,9999 para. ica. Rebaudiósido A, siendo el valor mínimo permisible de 0.999. En cuanto a los. límites de detección y cuantificación, se obtuvo límites de detección de 3.56ppm. Qu. ím. para Rebaudiósido A; mientras que límites de cuantificación de 11.01 ppm.. Para la repetibilidad del sistema, con un número de seis determinaciones y en concentraciones de 250 ppm, se obtuvo un coeficiente de variación de 0.94%. ría. para Rebaudiósido A, siendo menor al valor máximo aceptable de 2%. Para la Repetibilidad del método, con un número de tres determinaciones y en. nie. concentraciones de 200, 250 y 300ppm, se obtuvo un coeficiente de variación para Rebaudiósido A de 0.40% ,0.87% y 1.20% para concentraciones de 200,. In ge. 250 y 300 ppm respectivamente; por otra parte para la precisión intermedia del método se encontró resultados similares en tres analistas diferentes y en diferentes días, obteniéndose los siguientes resultados: un coeficiente de variación para el Rebaudiósido A para 200, 250 y 300 ppm de 0.51%, 1.31% y. bli ot ec a. de 2%.. de. 1.52% respectivamente, siendo todos estos menores al valor máximo aceptable. El valor del porcentaje de recuperación media fue de 99.01% para Rebaudiósido A, lo cual está dentro de los límites de las especificaciones (98% - 102%) del valor teórico para exactitud. En el método analítico el parámetro de selectividad se expresó en términos del factor de resolución en relación con el pico de elución. Bi. más próxima siendo estos mayores a 1.5.. PALABRAS CLAVE: Validación, Rebaudiósido A, Esteviósido, HPLC.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. UN T. This work presents the validation of an analytical method for quantification of. Rebaudioside A. The statistical parameters that used were: The linearity and it was. obtained a correlation of r= 0,9999 for Rebaudioside A being the minimum. permissible value of 0.999.Regarding the detection and quantification limits, it was. ica. obtained detection limits of 3.56 ppm for Rebaudioside A, while quantification limits. ím. of 11.01.. Qu. For repeatability of the system with a number of six determinations and using concentrations of 250 ppm was obtained a coefficient of variation of 0.94% for repeatability of. the. ría. Rebaudioside A being less than the maximum acceptable value of 2%.For method, with a number of. three. determinations and. at. concentrations of 200, 250 and 300ppm, was obtained a coefficient of variation. nie. for Rebaudioside A of 0.40%, 0.87% and 1.20% for concentrations of 200, 250 and 300 ppm respectively. These values were lower than the maximum acceptable. In ge. value of 2%.. In addition, in the case of the intermediate precision of the method was found. bli ot ec a. de. similar results in three different analysis on different days.. The value of the average recovery rate was of 99.01% Rebaudioside A, which are within specification limits (98% - 102%) of the theoretical value.In the analytical method Selectivity was expressed in terms of resolution factor in relation to the closest peak of elution these being greater than 1.5 and thus demostrating. Bi. the selectivity of the method.. KEY WORDS: Validation, Rebaudioside A, Stevioside, HPLC. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INTRODUCCION. UN T. I.. La Stevia rebaudiana Bertoni es una planta dicotiledónea, de crecimiento. ica. arbustivo y semiperenne que contiene glicósidos diterpénidos tipo ent- kaureno, entre los cuales los más abundantes son el esteviósido (14%) y rebaudiósido A. ím. (12%), mientras que los componentes minoritarios incluyen a rebaudiósido C-F y. Qu. el dulcósido A (1-2%). De esta manera puede verse que el producto industrial extraído de la estevia es en realidad una combinación de varios glucósidos, cuyas. ría. cantidades varían en función a la variedad de estevia, de los climas y de los. nie. terrenos. 1. La razón entre la cantidad de Esteviósido y Rebaudiósido A presente en las. In ge. hojas de Stevia rebaudiana es usualmente de dos, como resultado de este dominio el Esteviósido imparte el sabor amargo que suele caracterizar los. de. extractos crudos. De manera opuesta, los extractos más valiosos son aquellos con mayor contenido en Rebaudiósido A debido a sus características organolépticas y. bli ot ec a. fisicoquímicas como su solubilidad en agua, la cual es mayor que la de los demás esteviolglicósidos, lo que le permite estar presente en una gran variedad de formulaciones.1, 4. Desde hace mucho tiempo, hojas secas de estevia son usadas como. Bi. edulcorantes naturales y tanto el Esteviósido como Rebaudiósido A son aprobados en Australia, Argentina, Brasil, China, India, Israel, Japón, Nueva Zelanda, x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Paraguay, Rusia, Corea del Sur y algunos otros países. Por otro lado en EEUU el. UN T. Rebaudiósido A y otros glicósidos purificado reciben el estatus GRAS (Generally. Recognised as Safe) en el 2008 y el 2009, además son usados como aditivos alimentarios, mientras que recientemente en Europa, la Comisión Permanente de. ica. la Cadena Alimentaria y de Sanidad Animal de la Comisión Europea emitió su voto. ím. favorable para autorizar el uso de la estevia como aromatizante y desde el 2 de. Qu. Diciembre del 2011 está permitido como aditivo alimentario. 1, 4. Para el desarrollo de un nuevo producto es imprescindible la utilización de. ría. un método analítico que permita cuantificar correctamente los principales. nie. componentes del mismo, teniendo en cuenta siempre el aseguramiento de la confiabilidad de los resultados de ese método analítico para lo cual tendrá que ser. In ge. sometido a un proceso de validación. Este término validación, fue propuesto por la Federal Drug Administration (FDA) en 1976. Apareciendo por vez primera en la revisión de las Normas de Correcta Fabricación (Good Manufacturing Practices) al. de. considerar los procesos de esterilización, luego en 1983, la misma FDA establece unas directrices de tipo informativo, más flexibles que una normativa legal, que. bli ot ec a. orientan acerca de la validación de procesos en un sentido más amplio. Considerando la importancia del tema, otras entidades como la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Association of Ofﬁcial Analytical Chemists (AOAC),. y la International Conference of Harmonization (ICH), además de la Farmacopea. Bi. Europea y la USP 23 consignan la ineludible necesidad de la validación de los procesos analíticos.2,3,5. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UN T. Validar es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas, mediante estudios sistemáticos de laboratorio y demostrativos,. con el fin de demostrar que un método de análisis es lo suficientemente fiable y. ica. reproducible para obtener el resultado previsto dentro de intervalos definidos. Este proceso de validación permite el conocimiento de las características de. 6, 7. Qu. y en los resultados obtenidos al aplicarlo.. ím. funcionamiento del método y proporciona un alto grado de confianza en el mismo. ría. Las características de desempeño del método analítico se expresan en función de los siguientes parámetros analíticos: Exactitud, Precisión, Selectividad,. In ge. nie. Linealidad, Intervalo o Rango y finalmente Límite de Detección y Cuantificación. 7, 9. Muchos métodos analíticos han sido aplicados para la separación y cuantificación de los glicósidos diterpénicos de las hojas de Stevia rebaudiana.. de. Mizumaki et al. Cuantificaron los esteviolglicósidos por un método químico seguido de una hidrólisis enzimática, mientras que Sakaguchi y Kan cuantificaron el total. bli ot ec a. de contenido de esteviolglicósidos mediante cromatografía de gases seguida de hidrólisis ácida. La cromatografía de capa fina también ha sido aplicada también para la identificación de los cuatro esteviolglicósidos más abundantes: Esteviósido, Rebaudiósido A, dulcósido A y Rebaudiósido C.12. Bi. Referencias en cuanto al uso de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución. también están disponibles en la literatura, algunos aplican columnas hidrofílicas. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. (OH), otros autores emplean cromatografía de exclusión, así como columnas C18.. UN T. Sin embargo con el afán de diseñar una metodología que permita menos consumo. de tiempo y solvente, así como del uso de un proceso de extracción que minimice. la exposición humana y ambiental a los solventes; se cuenta con sistemas que. ím. ica. usan principalmente columnas de fase normal como la Amino.10, 11, 12,13. Debido a este futuro prometedor sobre el consumo y comercialización de. Qu. estevia, es de suma importancia el desarrollo y validación de una metodología para el control de calidad de las hojas de estevia antes de su procesamiento así. ría. como del control del proceso de extracción y de purificación para la obtención de. Bi. bli ot ec a. de. In ge. nie. los esteviolglicósidos de mayor interés: Rebaudiósido “A” y el Esteviósido.. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. MARCO TEÓRICO. 1.1.1.. QUÍMICA ANALÍTICA17. UN T. 1.1.. La Química Analítica puede definirse como la ciencia que desarrolla y. ica. mejora métodos e instrumentos para obtener información sobre la composición y naturaleza química de la materia. Dentro de la Química. Analítica se incluye el Análisis Químico que es la parte práctica que aplica. ím. los métodos de análisis para resolver problemas relativos a la. Qu. composición y naturaleza química de la materia.. Los ámbitos de aplicación del Análisis Químicos son muy variados, en la. en ier ía. industria destaca el control de calidad de materias primas y productos acabados; en el comercio los laboratorios certificados de análisis aseguran las especificaciones de calidad de las mercancías; en el campo médico los análisis clínicos facilitan el diagnóstico de enfermedades.. In g. Se subdivide en dos áreas principales:. a) ANÁLISIS CUALITATIVO: Tipo de análisis que identifica los componentes existentes. de. en una sustancia.. Tipo de análisis que proporciona las cantidades relativas de dichos componentes.. ot. ec. a. b) ANÁLISIS CUANTITATIVO:. bli. Es interesante realizar una definición de términos ligados al análisis:. Bi.  Muestra: Parte representativa de la materia objeto del análisis.  Analito: Especie química que se analiza..  Técnica: Medio de obtener información sobre el analito.  Método: Conjunto de operaciones y técnicas aplicadas al análisis de una muestra. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Análisis: Estudio de una muestra para determinar sus composición o naturaleza química. MÉTODOS DE ANÁLISIS. UN T. 1.1.1.1..  Métodos clásicos, que se basan en propiedades químicas del. analito. Se incluyen las gravimetrías, las volumetrías y los métodos de. ica. análisis cualitativo clásico..  Métodos de separación. Se incluyen en este grupo los métodos cuya. ím. finalidad es la separación de compuestos para eliminar las interferencias y facilitar las medidas.. Qu.  Métodos instrumentales, basados en propiedades químico-físicas. La clasificación de los métodos instrumentales se realiza en base a la. en ier ía. propiedad que se mide (espectroscópicos, electroanalíticos, Absorción Atómica, térmicos, HPLC, etc.). 1.1.1.2.. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN18. La extracción es la transferencia de un soluto de un disolvente a otro.. In g. Cuando se utiliza un disolvente orgánico el soluto se extrae por un proceso de distribución. de. El coeficiente de reparto o distribución de un soluto, ante su líquido de disolución y su disolvente orgánico es constante y depende de la. a. naturaleza de dicho soluto, así como de la naturaleza de ambos. ec. disolventes y de la temperatura.Los disolventes orgánicos utilizados en extracción deben tener baja solubilidad en agua, alta capacidad de. ot. solvatación hacia la sustancia que se va a extraer y bajo punto de. bli. ebullición para facilitar su eliminación posterior.. Bi. La extracción con disolventes activos (selectiva) se emplea para separar mezclas de compuestos orgánicos en función de la acidez, de la basicidad o de la neutralidad de éstos. También se basa en una reacción ácido-base entre el producto a separar y el disolvente activo adecuado.. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los compuestos iónicos son más solubles en agua que los compuestos Covalentes, y éstos, son más solubles en disolventes orgánicos. La cuantificación se va a dar gracias a la ayuda del equipo de. 1.1.2.. UN T. Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC).. CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN. (HPLC)17. ica. La cromatografía engloba a un conjunto de técnicas de análisis basadas en la separación de componentes de una mezcla y su posterior detección.. ím. Las técnicas cromatografías son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, liquido, o fluido supercrítico). Qu. que arrastra a la muestra con un flujo constante de presión proporcionado. en ier ía. por una bomba, hasta llegar al punto donde es introducida la muestra. Siguiendo el flujo de presión la lleva a una columna donde se encuentra la fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes. In g. atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando.Después de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado, pasan por un detector que genera una. de. señal que puede depender de la concentración y del tipo del compuesto.. a. El papel esencial de las bombas es impulsar a la fase móvil con presión y. ec. flujo constante, el proceso de inyección de la muestra en la actualidad es automática, las columnas que se utilizan normalmente son de acero. ot. inoxidable y los detectores su papel fundamentalmente es de indicar el momento de aparición de los diferentes componentes que constituyen la. Bi. bli. muestra, calificarlo cuantitativamente como cualitativamente. Con objeto de alcanzar un caudal de efluente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre 3 y 10 μm, que, por otra parte, son comunes en. la moderna cromatografía de líquidos, se requieren presiones de algunos 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más. en ier ía. Qu. ím. ica. UN T. sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía.. PLANTA STEVIA REBAUDIANA BERTRONI19. de. 1.1.3.. In g. Figura N°1: Esquema de un equipo de HPLC. Sinónimo: Hierba dulce, la miel de la hoja.. ec. a. Partes utilizadas: hojas.. ot. Para el año de 1887 el naturalista Dr. Moisés Bertoni, conoce de la planta a través de mineros e indios de la región de Caaguazú y Monday de la. bli. República del Paraguay, por la misma época el químico paraguayo Ovidio. Bi. Rebaudi, realiza los primeros estudios del componente dulce de la hoja. En 1904 Bertoni verifica que la planta pertenece al género Stevia con lo cual en 1905 se registra definitivamente como Stevia Rebaudiana Bertoni. Ya en 1908 se realiza el primer cultivo extensivo en la zona de Puerto 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Bertoni-Alto Paraná (Paraguay). La Stevia Rebaudiana Bertoni es la única con propiedades endulzantes gracias a su principio activo, denominado “esteviósido” en 1921 por la Unión Internacional de Química.. UN T. La hoja de la Stevia Rebaudiana Bertoni, en su estado natural, posee gran cantidad de nutrientes, que en orden de concentración son:  Más del 50%: carbohidratos de fácil asimilación.  Más del 1%: lípidos, potasio.. ím.  Entre el 0,3 y el 1%: calcio, magnesio, fósforo.. ica.  Más del 10%: fibras, polipéptidos (proteínas vegetales).. silicio, zinc.. Qu.  Menos del 0,01%: cromo, cobalto, hierro, manganeso, selenio,  Indicios de ácido Ascórbico, aluminio, beta caroteno C, estaño,. en ier ía. riboflavina, vitamina B1.  Varios aceites esenciales.. Entre los glucósidos, se encuentra en mayor proporción el Esteviósido generalmente entre 5 a 10% del peso de la hoja y en menor medida, del orden de 2 a 3% Rebaudiosido A, B, C, D, E, dulcósido A y B, y. In g. steviolbiosido.Está compuesta de varios glucósidos, cuyas cantidades varían en función a las variedades, de los climas y de los terrenos; pero el. de. Esteviósido(fórmula: C38 H60 O18) es el principal y más abundante componente.. a. La Stevia es en su forma natural es 10 a 15 veces más dulce que el. ec. azúcar común de mesa, mientras que los extractos de Stevia tienen una. ot. potencia endulzante de 100 a 300 veces mayor que la del azúcar1 .El. extracto en su forma líquida tiene un poder endulzante aproximadamente. bli. 70 veces mayor que la sacarosa, mientras que los extractos refinados de. Bi. Stevia, llamados esteviósido (polvo blanco conteniendo 85 - 95% de esteviósido) son 200 a 300 veces más dulce que la sacarosa.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.1.3.1.. REBAUDIOSIDO A 20. En 1982, Tanaka aisló cuatro glucósidos dulces adicionales, presentes en. UN T. menor porcentaje, a los cuales denominó Rebaudiósidos A, C, D y E que es un glucósido de steviol derivados de la Stevia Rebaudiana hierba Bertoni.. ec. a. de. In g. en ier ía. Qu. ím. más de glucosa en su composición química.. ica. El Rebaudiósido A se diferencia del Esteviósido por tener una molécula. Bi. bli. ot. Figura N°2:-REBAUDIOSIDO A:-Polvo blanco de propiedad física, dulce de densidad: 1,58 g/cm3, Punto de fusión: 242-244 C, y Punto de ebullición: 1103,5 ° C a 760 mmHg, formula molecular C44H70O23 y Peso molecular de 967.0128. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.1.4.. CALIDAD DEL METODO ANALÍTICO. UN T. Condiciones Óptimas De Operación De La Cromatografía18 Aún los métodos bien establecidos necesitan ser validados por los analistas usando el personal, reactivos y equipos del laboratorio cuyo. ica. método se quiere validar.. La validación puede hacerse analizando un conjunto de muestras que han. ím. sido analizadas por otro método o por otro laboratorio. El analista debe familiarizarse con un método y asegurarse que ha alcanzado el grado. Qu. deseado de recuperación y precisión después de haber analizado un. en ier ía. conjunto de blanco y muestras analíticas sintéticas o fortificadas.. Gráfico.1:-Respuesta en función de la concentración del analito Atributos de. Bi. bli. ot. ec. a. de. In g. los métodos. Fuente:- Fao.org. La validación consiste, en esencia, en confirmar y documentar que los resultados emanados de la aplicación de un método de análisis son confiables.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Evidentemente todo nuevo método analítico debe validarse para demostrar su idoneidad, Se habla entonces de una validación retrospectiva, donde se pueden combinar los nuevos criterios de. UN T. validación con toda la experiencia ya adquirida. En cambio, se conoce. como validación prospectiva a la que se realiza frente a un producto nuevo.. ica. En un ensayo de validación deben considerarse los siguientes. ím. parámetros:  Selectividad.. Qu.  Linealidad.  Rango.  Precisión.. en ier ía.  Exactitud..  Límite de cuantificación y Límite de detección. A. SELECTIVIDAD. In g. La capacidad de un método para determinar el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradación, excipientes u otras sustancias presentes en la muestra, se relaciona con el término. de. selectividad. La selectividad es la capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultánea o separadamente los analito de interés de forma inequívoca, en presencia de otras sustancias químicas que. ec. a. pueden estar presentes en la muestra. Se recomienda el análisis de muestras del analito sometidas a. ot. condiciones de degradación artificial hasta un 20% de degradación, lo. bli. cual constituye un criterio de especial interés cuando se desconoce sus. Bi. productos de degradación. 6, 7,8 La presencia de interferencias puede tener distintos efectos en la. determinación del analito como: Imposibilitar su inequívoca identificación (aparición de falsos positivos). 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Distorsionar la respuesta del analito (afecta normalmente a la pendiente y ordenada en el origen de la recta de calibrado). Este efecto puede delatar la presencia de interferencias desconocidas, aunque. UN T. también puede ser consecuencia de resultados no lineales.. La selectividad de un método analítico se debería determinar antes de. iniciar el estudio de cualquier otro parámetro de validación, dado que. ica. debe conocerse en qué grado la respuesta del método es únicamente relacionadas con él de una u otra forma.. Qu. B. LINEALIDAD. 6, 7, 8. ím. proporcionada por el analito, sin interferencia de otras sustancias. Es la capacidad del método para proporcionar resultados que son. en ier ía. directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un rango establecido. Siempre que sea posible se busca una respuesta de tipo lineal que facilitara su trazado, interpolación e interpretación. La linealidad en procedimiento analítico es su capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea. In g. directamente, o por medio de una transformación matemática bien definida, a la concentración del analito en muestras en un intervalo dado. La linealidad se refiere a la relación entre la concentración ya la medida. de. de valoración. El objetivo es obtener un modelo que describa con precisión la relación de la concentración versus respuestas, ya sea lineal. ec. a. o no.6,8. C. EL RANGO. ot. Se define como el intervalo entre la concentración superior e. bli. inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión,. Bi. exactitud y linealidad del método descrito. El intervalo de un procedimiento analítico es la amplitud entre la concentración inferior y superior de analito en el cual se puede determinar al analito con un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. utilizando el procedimiento adoptado. El intervalo normalmente se expresa en las mismas unidades que los resultados de la prueba obtenidos mediante el procedimiento analítico. El. intervalo del. UN T. procedimiento se valida verificando que el procedimiento analítico. proporciona precisión, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a las muestras que contienen el analito en el intervalo.. ica. D. PRECISIÓN. 5, 6, 7,8. ím. La precisiónexpresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de medidas de tomas múltiples a partir de. Qu. una misma muestra homogénea en las condiciones prescritas. La procedencia de las muestras destinadas al estudio de precisión puede. en ier ía. ser muestras reales o preparadas en el laboratorio.. El objeto del estudio de la precisión es de conocer la variabilidad o el más-menos del método de ensayo. Los factores susceptibles a influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos, tiempo, entre otros.) de aquí la. In g. importancia para la precisión.. La precisión puede ser medida, ya sea por el grado de repetibilidad,. de. precisión inmediata o reproducibilidad del método analítico.5. Repetibilidad. Precisión inmediata. Reproducibilidad. Bi. bli. ot. ec. a. PRECISIÓN. Repetibilidad instrumental. Repetibilidad del método. Fig.2: diagrama de bloques de la medición de la precisión. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. a) Repetibilidad: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos aparatos y reactivos, entre. UN T. otros), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto. La repetibilidad se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación (desviación estándar relativa) de una serie de medidas.. ica. Repetibilidad del sistema instrumental: Este parámetro estudia la variabilidad debida únicamente al instrumento y se determina analizando. ím. repetidamente una misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces. En el caso que se analice el principio activo de una materia prima. en ier ía. concentración nominal.. Qu. o de una especificación farmacéutica se prepara la muestra a la. Repetibilidad del método: El ensayo de repetibilidad del método se efectúa sobre una serie de alícuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparación de la muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y. In g. mismo analista.. b) Precisión inmediata: Estudia la variabilidad del método efectuado una. de. serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, días, entre otros) y en un. a. mismo laboratorio.. ec. c) Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del método bajo condiciones. ot. operativas diferentes y en distintos laboratorios. La reproducibilidad de dicho método de análisis se determina analizando una serie de alícuotas. bli. procedentes de lotes homogéneos en diferentes laboratorios, diferentes. Bi. analistas y utilizando condiciones operativas y ambientales distintas pero siguiendo el procedimiento descrito en el método. 7,8. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. E. EXACTITUD La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad. UN T. entre el valor que es aceptado convencionalmente como el valor. verdadero o un valor referencial y el valor experimental encontrado. No. debe confundirse la exactitud y predicción, la precisión esta relacionadas con la dispersión de una serie de mediciones, pero no da ninguna. ica. indicación de lo cerca que esta del valor verdadero. Se puede tener mediciones muy precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un. ím. método sea exacto se requiere un cierto grado de precisión.2. Qu. F. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y LÍMITE DE DETECCIÓN Dado un método analítico determinado, se entiende por límite de. en ier ía. cuantificación (LQ) de dicho método, la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones experimentales descritas, con una adecuada predicción y exactitud. El límite de cuantificación es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja concentración. In g. en la matriz de una muestra.. El límite de detección (LD) se define como la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar aunque necesariamente. de. cuantificar bajo dichas condiciones experimentales. Es una característica de las pruebas de límite. La cantidad mínima de la muestra que puede. a. detectarse, aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones. ec. experimentales. indicadas.. Las. pruebas. de. límite. simplemente. comprueban que la cantidad del analito se encuentra por encima o por. ot. debajo de un nivel determinado. Se le expresa en porcentaje, partes por. Bi. bli. millón, etc.2,5 El límite de cuantificación es por lo tanto un término cuantitativo. mientras que el límite de detección es solo cualitativo.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.2.. ANTECEDENTES Se. han. realizado. diferentes. investigaciones. sobre. Stevia. UN T. rebaudiana Bertoni desde el año que la descubrieron 1887 hasta la actualidad.. Mencionaremos solo algunas de las más importantes y mejoradas. ica. investigaciones utilizados en nuestro país así como a nivel mundial:. Maringa, realizo. ím. En Brasil Dacome, A. et al. (2005), de la Universidad Estadual de un estudio sobre el equilibrio de los glicósidos. Qu. diterpénidos dulces de un nuevo cultivo de Stevia Rebaudiana Bertoni: aislamiento y distribución cuantitativa por métodos cromátografico, espectroscópicos y electroforéticos; donde describen la identificación del rendimiento (HPLC).1. en ier ía. esteviósido y rebaudiosido A, mediante cromatografía liquida de alto. Kolb y Herrera en “Analysis of Sweet Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana: Improved HPLC Method” desarrollaron. un método que. In g. puede ser aplicado para el control de calidad de Esteviósido y Rebaudiósido A, utilizando extracción etanolica seguida por un análisis isocrático por HPLC equipado con una columna de Amina (250 x 4.6. de. mm) como fase móvil una mezcla Acetonitrilo /agua (80:20, v/v) y. a. longitud de onda de lectura 210 nm.12. ec. UrsulaWoelver en “Improved HPLC method for the evaluation of the major steviolglycosides in leaves of Stevia rebaudiana” desarrollo un. ot. método para la determinación de los principales esteviolglicósidos. bli. basado en la extracción acuosa seguida por una extracción en fase. Bi. sólida (SEP clean up) obteniendo como resultado una buena extracción mediante el uso de una columna de amino y utilizando como fase móvil una mezcla Acetonitrilo /agua (85:15, v/v) y longitud de onda de lectura 210 nm.11. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En nuestro país también se realizó estudios para determinar el nivel de edulcorante (mezclas de Esteviósido) de tres variedades de estevia instaladas en seis localidades de San Ignacio - Chota –. UN T. Cajamarca, donde encontraron que el mayor nivel edulcorante lo presentaba la variedad EIRETE al 10 % de floración, correspondiente a la. localidad de Dos de Mayo – San Ignacio.-2. Realizado por Ganoza, M. y. Bi. bli. ot. ec. a. de. In g. en ier ía. Qu. ím. ica. Rosales, C. (2008).. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODO. MATERIAL:. 2.1.1. Muestras: PRODUCTO. PARAGUAYO. STEVIA. MIX. UN T. 2.1.. (Mezcla. de. ica. esteviolglicósidos). Este producto fue elaborado por el método de Payzant Donald(6, febrero-1998), obteniéndose. ím. así cristales blancos de una mezcla de los principales esteviolglicósidos.. 2.1.2.. en ier ía. depósito de vidrio.. Qu. La muestra fue conservada a temperatura de -4°c en un. Material de laboratorio: . Embudos de filtración fabricada en vidrio PYREX.. . Fiola (Matraz Aforado, Contrastable) CLASE A -. Marca "SCHOTT DURAN®" de 10, 25, 50 y 250 mL Con. In g. una marca de aforo, esmerilado normalizado y tapón plástico.. Matraz. Erlenmeyer,. Cuello. Normal,. de. vidrio. de. . borosilicatoPyrex® con una gran resistencia al ataque químico y al choque térmico.. Bi. bli. ot. ec. a. . Pipetas de Mohr de 1, 2 y 5 mL, BLAUBRAND®,. clase AS, volumen nominal arriba. . Pizeta de plástico.. . Probeta de 100 mL, En vidrio borosilicato clase A,. PYREX según DIN 12680, forma alta. Con base hexagonal y graduación . Vasos De Precipitación De 50, 100y 250 ml, forma. alta, vidrio PYREX . Varillas de vidrio.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Equipos e instrumentos de Laboratorio: . Balanza Analítica Sartorius 2942, de 200g. máx. Sensibilidad 0,0001g.. UN T. 2.1.3.. Cromatógrafo Agilent 1100 series. . Equipo de filtración al vacío SANILAB. . Micropipeta 100-1000 uL Eppendorf. . Micropipeta 20-200 uL Eppendorf. . Sistema de purificación para obtener agua ultra pura:. ica. . Qu. Acetonitrilo grado HPLC, MERCK MILLIPORE. . Metanol grado HPLC, MERCK MILLIPORE. . Agua destilada. . Agua ultra pura. . Rebiana (Rebaudiósido A al 97%). . Esteviósido (Estándar)- WakoCompany. en ier ía. . Otros materiales:. Bi. bli. ot. ec. a. de. 2.1.5.. Reactivos:. In g. 2.1.4.. ím. Modelo: EASY PURE, Marca: BARNSTEAD. . Computadora Pentium IV. . Filtro de jeringa de Celulosa Regenerada Agilent, 25 mm de diámetro y 0,2 µm de poro. . Impresora HP Laser Jet 1200. . Jeringas descartables de 3 mL. . Filtro membrana de Nylon, 47 mm de diámetro y 0,2 um de poro.. . Memoria USB de 1 Gb. . Papel de filtro. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.. MÉTODO. UN T. LUGAR DE EJECUCIÓN El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Métodos. Instrumentales, ambiente situado en la Facultad de Ingeniería Química-. ica. Universidad Nacional de Trujillo.. ím. 2.2.1. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIONE STOCK. Qu. Para la preparación del estándar madre de Rebaudiósido A se disolvió 25 mg de Rebaudiósido A estándar con 25 mL de agua 1mg/ml.. en ier ía. ultrapura en una fiola de 25 mL. Con una concentración de. 2.2.3. DETERMINACIÓN DE LA LINEALIDAD 8,11 Tomar 4 mL de la solución stock de Rebaudiósido A de. In g. 1mg/mL (1000 ppm), en una fiola de 10 mL y llevar a aforo con agua ultrapura, de esta manera se obtiene el estándar de 400. de. ppm. De igual manera tomar 2, 1, 0.5 y 0.25 mL de la soluciones stock descrita anteriormente para formar soluciones. a. de 200, 100, 50 y 25 ppm respectivamente.. ec. De cada solución se tomó 3 mL y se filtró haciendo uso de. Bi. bli. ot. filtros de jeringa de celulosa regenerada de 25 mm de diámetro y 0,2 µm de poro; colocándose en viales ámbar de 1,5 mL.. 2.2.4. DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN 8 Se utilizó el método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se trata de un procedimiento aplicable que proporciona resultados numéricos, y dirigido a evitar el cálculo en ocasiones. UN T. costoso. Para ello el método utiliza la pendiente de una recta de. calibrado realizada a niveles de concentración cercanos a los. limites esperados, pero sustituye el valor real de la señal blanco. ica. por el resultante de la extrapolación de dicha recta.. PRECISION DEL SISTEMA8. Qu. A). ím. 2.2.5. REPETITIBILIDAD. Para determinar la precisión del sistema, se preparó una solución de 250 ppm de la mezcla de los esteviolglicósidos de. en ier ía. estudio para lo cual se tomó 2.5 mL de la solución madre de Rebaudiósido A de 1 mg/mL (1000 ppm) en una fiola de 10 mL para luego aforar y obtener de esta manera una solución de 0.25 mg/mL (250 ppm).. In g. Se tomó 3 mL y se filtró haciendo uso de filtros de jeringa de celulosa regenerada de 25 mm de diámetro y 0,2 µm de poro; colocándose en viales ámbar de 1,5 mL y se le analizo 6 veces. de. seguidas por el HPLC. PRECISION DEL METODO 8. ec. a. B). Bi. bli. ot. Para determinar la precisión del método, se evaluó mediante. nueve determinaciones con. tres niveles de concentración. Se. prepararon muestras de 200 µg/mL, 250 µg/mL y 300 µg/mL de la mezcla de esteviolglicósidos. Para preparar el primer nivel de análisis, en una fiola de 10 mL se adicionó 2 mL de la solución stock de 1 mg/mL (1000 ppm) de Rebaudiosido “A”. Se aforo a un volumen de 10 mL. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Para preparar el segundo nivel de análisis, en una fiola de 10 mL se adicionó 2.5 mL de la solución stock de 1 mg/mL (1000 ppm). UN T. de Rebaudiosido “A”. Se aforo a un volumen de 10 mL.. Para preparar el tercer nivel de análisis, en una fiola de 10 mL se adicionó 3 mL de la solución stock de 1 mg/mL (1000 ppm) de. ica. Rebaudiosido “A”. Se aforo a un volumen de 10 mL.. De cada solución se tomó 3 mL y se filtró haciendo uso de filtros. ím. de jeringa de celulosa regenerada de 25 mm de diámetro y 0,2. PRECISION INTERMEDIA 8. en ier ía. C). Qu. µm de poro; colocándose en viales ámbar de 1,5 mL.. Se realizó el análisis de la muestra en validación en diferentes condiciones: diferentes analistas en 3 diferentes días. Cada analista procedió del mismo modo detallado en la repetibilidad.. La. In g. 2.2.6. DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD 8 exactitud. del. método. se. evaluó. mediante. nueve. de. determinaciones con tres niveles de concentración. Se añadieron cantidades conocidas de los estándares (200 ppm, 250 ppm y 300 ppm) a una muestra proveniente de Paraguay (que contiene. ec. a. ambos esteviolglicósidos) y que fue analizada previamente.. Bi. bli. ot. En primer lugar se pesó 0.0629 g del producto Paraguayo y se lo llevo a un volumen de 25 mL en una fiola del mismo volumen (solución madre). Luego se tomó 1 mL de esta solución y se llevó a aforo con agua ultra pura en una fiola de 10 mL. (Solución Basal) Para preparar el primer nivel de análisis, en una fiola de 10 mL se adicionó 1 mL de la solución madre Paraguaya y se adicionó 2 mL 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de la solución stock de 1 mg/mL (1000 ppm) de Rebaudiosido “A”. Se aforo a un volumen de 10 mL.. UN T. Para preparar el segundo nivel de análisis, en una fiola de 10 mL se adicionó 1 mL de la solución madre Paraguaya y se adicionó. 2.5 mL de la solución stock de 1 mg/mL (1000 ppm) de. ica. Rebaudiósido “A”. Se aforo a un volumen de 10 mL.. Para preparar el tercer nivel de análisis, en una fiola de 10 mL se. ím. adicionó 1 mL de la solución madre Paraguaya y se adicionó 3 mL de la solución stock de 1 mg/mL (1000 ppm) de Rebaudiosido. Qu. “A”. Se aforo a un volumen de 10 mL.. en ier ía. De cada solución (Basal, nivel 1,2 y3) se tomó 3 mL y se filtró haciendo uso de filtros de jeringa de celulosa regenerada de 25 mm de diámetro y 0,2 µm de poro; colocándose en viales ámbar de 1,5 mL.. In g. 2.2.7. RANGO 8,16. Se determinó en base a los resultados obtenidos en la exactitud y. de. linealidad.. a. 2.2.8. SELECTIVIDAD 16. ec. La selectividad del método propuesto se evalúa por la eficacia de capacidad, en las condiciones seleccionadas en comparación entre los componentes estructuralmente relacionados: Rebaudiósido y Esteviósido.. Bi. bli. ot. separación del sistema cromatográfico en términos de factor de. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.9. CONDICIONES DEL EQUIPO DE HPLC 11,12 El equipo a utilizar es un Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución diodos en el rango UV/Vis, bomba cuaternaria y automático.. UN T. (HPLC) marca Agilent modelo 1100 con detector de arreglo de. muestreador. Antes de hacer cada corrido, estabilizar el equipo de HPLC con. Condiciones de operación del cromatógrafo líquido:. ím. (a). ica. fase móvil durante una hora con el flujo de trabajo de 1mL/min.. : acetonitrilo/agua 80:20. Flujo de la fase móvil. : 1mL/min. Volumen de inyección. : 10uL. Tiempo de corrido. : 18.5 min.. Tiempo de lavado. : 2 min.. Longitud de onda. : 210 nm.. In g. en ier ía. Qu. Fase móvil. Columna. :columna amino (NH2) de 250mm por. de. 4,6mm d.i., empacada con LiChrosorbsorbant de 5 µm. Detector. : UV/Vis con detector de arreglo de. a. diodos.. : en la botella A.. Tipo de elución. : Isocrática.. Temperatura columna. : 30°C. Bi. bli. ot. ec. Ubicación de fase móvil. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. 3.1. LINEALIDAD: esta se obtuvo en el rango de concentración de 400, 200, 100, 50, 25 ppm de Rebaudiosido A y los resultados se. UN T. enumeran en el CUADRO 01:. CUADRO 01: Parámetros estadísticos del ensayo de Linealidad para la. Resultado. Coeficiente de correlación (r). 0.9999. (r2) Test estadístico para el “r”. libertad. Coeficiente de variación. Criterios de Aceptación. Mínimo 0,999 Mínimo 0,999 t tabla = 2.1604. t regresión = 258.2739. t regresión >t tabla. 7. 95%. Máximo 5 %. en ier ía. ρ = 0.05; y n – 2 grados de. 0.9998. Qu. Coeficiente de determinación. ím. Parámetros Estudiados. ica. validación de Rebaudiósido “A”.. Prueba de Linealidad de la pendiente. ρ = 0.05; y n – 2 grados de. In g. libertad. t exp = 258.2739. t tabla = 2.1604 t exp>t tabla. Prueba de proporcionalidad del intercepto. de. ρ = 0.05; y n – 2 grados de. t exp = 3.1960. t tabla = 2.1604 t exp<t tabla. libertad. a. Fuente: Elaboración Propia.. ot. ec. 3.2. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN:. Bi. bli. CUADRO 02: Parámetros estadísticos del ensayo deLimite de Detección y Cuantificaciónparala validación de Rebaudiósido A.. Parámetros Estudiados Limite de detección Limite de cuantificación. Resultado LD (K=3). Criterios de Aceptación. = 3.56 ppm. ----. LC (K=10) = 11.01 ppm. ----. Fuente: Elaboración Propia.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.3. PRECISIÓN: Se prepararon muestras de 200 µg/mL, 250 µg/mL y 300 µg/mL de la mezcla de esteviolglicósidos y los resultados se. UN T. enumeran en el CUADRO 03. CUADRO 03: Parámetros estadísticos del ensayo de Precisión para la. Parámetros Estudiados. Resultado. Coeficiente de variación (RSD). ím. PRECISION DEL SISTEMA. Criterios de. ica. validación de Rebaudiósido A.. 0.94 %. Aceptación. Máximo 2%. PRECISION DEL METODO. Qu. 200 ppm = 0.40% 250 ppm = 0.87%. Máximo 2%. en ier ía. 300 ppm = 1.20% PRECISION INTERMEDIA:. Coeficiente de variación (RSD) Analista A (Día 1). In g. Analista B (Día 2). a. de. Analista C (Día 3). ot. ec. Límites de Confianza Promedio. RSD 200 ppm = 0.51 % RSD 250 ppm = 1.31 %. Máximo 2%. RSD 300 ppm = 1.52%. L.C.P.200 ppm= 199.9443 a 200.7053 L.C.P.250 ppm = 252.9201 a 255.0304 L.C.P.300 ppm= 298.0271 a 301.4583. Bi. bli. Fuente: Elaboración Propia.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.4. EXACTITUD: se evaluó mediante nueve determinaciones con tres niveles de concentración. Se añadieron cantidades conocidas de los estándares (200 ppm, 250ppm y 300 ppm) a una muestra. UN T. proveniente de Paraguay y los datos se enumeran a continuación:. CUADRO 04: Parámetros estadísticos del ensayo de Exactitud para la. el 100%. ρ = 0.05; y n – 1 grados de libertad. G experimental (Test de. In g. Cochran). Pendiente y Limites de. de. confianza. 99.01%. en ier ía. Test de recuperación media y. ím. Porcentaje de recuperación (R). Resultado. Qu. Parámetros Estudiados. ica. validación de Rebaudiósido A.. texp = 1.9882. G exp = 0.7896. Criterios de Aceptación. 98% - 102%. t tabla = 2.306 t exp<t tabla. G tabla = 0.8709 G exp<G tabla. Pendiente=0.9935 Límite Inferior = 0.9170. Incluir a 1. Límite superior = 1.0699. Bi. bli. ot. ec. a. Fuente: Elaboración Propia.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.5. RANGO: CUADRO 05: Parámetro de evaluación del Rango para la validación de. UN T. Rebaudiósido A.. Criterios de. Resultado. Aceptación. ica. Parámetros Estudiados. El método funciona. Precisión y Exactitud.. especificacione. s de Linealidad,. ím. evaluación de Linealidad,. 400 ppm que fueron las. concentraciones mínima. Qu. Establecido en base a la. correctamente entre 25 y. Cumplir con las. y máxima trabajadas.. Exactitud.. en ier ía. Fuente: Elaboración Propia.. Precisión y. 3.6. SELECTIVIDAD: La selectividad del método propuesto se evalúa por la eficacia de separación del sistema cromatográfico CUADRO 06: Parámetro estadístico del ensayo de Selectividad para la. In g. validación de Rebaudiósido A. Resultado. Criterios de Aceptación. ec. a. de. Parámetros Estudiados. Rs = 68.19. > 1.5. ot. Factor de Resolución. Bi. bli. Fuente: Elaboración Propia.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. En la evaluación de la linealidad enel Rebaudiósido A, se. UN T. demostró que el método produce resultados que son proporcionales a la. concentración de trabajo del analito para el rango establecido del 25. ppm a 400 ppm (ANEXO 1 Gráfica Nº 1). Al realizar el análisis. estadísticos de los datos recopilados (ANEXO 1 Cuadro Nº 1), se obtuvo. ica. un coeficiente de correlación r = 0,9999 para Rebaudiósido A el cual es mayor al valor mínimo aceptable de 0,999; lo que indica una significativa. ím. correlación lineal entre la concentración y el área de lectura que reporta el analito en el análisis. Pero como la información obtenida mediante el. Qu. cálculo del coeficiente de correlación es limitado y no justifica por sí sola la linealidad, hallamos el coeficiente de determinación (r2), que aporta una mayor significancia estadística ya que expresa la proporción de la. en ier ía. variación total del método, es así que obtuvimos un r2 = 0.9998 para Rebaudiósido A, lo cual indica una probabilidad del 99.9% de que el porcentaje. de. variación. concentración.8, 11. de. respuesta. es. producida. por. la. In g. Así mismo se determinó el coeficiente de variación de los factores de respuesta que fue de 7.95% para Rebaudiósido A, el cual debe ser menor al 5%; siendo esto un indicativo de una posible falta de linealidad,. de. pero para confirmar que dicha regresión es lineal se aplicó un test de regresión (test de Student) para evaluar que existe una pendiente. a. significativamente distinta de cero con una probabilidad de 95% y n–2. ec. grados de libertad, obteniéndose un tregresión de 258.2739 para. ot. Rebaudiósido A cumpliéndose que es mayor al ttabla(2.1604). 5, 8,11 Además hallamos un t experimental del término independiente. bli. realizando el test de verificación de la pendiente, aplicando una prueba t-. Bi. student con una probabilidad de 95% y n–2 grados de libertad obteniéndose un t. tabla =. exp =. 258.2739 para Rebaudiósido A que es mayor al t. 2.1604, lo indicaría que la recta no pasa por el origen de las. coordenadas, comprobando de esta manera que la pendiente (valor de b) son estadísticamente diferentes de cero.. 5, 8,11. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por. otro. lado. hallamos. un. t. experimental. del. término. independiente realizando el test de verificación del intercepto, aplicando una prueba t-student para evaluar las condiciones de proporcionalidad exp=. 3.1960 para Rebaudiósido A que es mayor al t. indicaría que la recta. UN T. con una probabilidad de 95% y n–2 grados de libertad obteniéndose un t tabla =. 2.1604 lo. no pasa por el origen de las coordenadas,. comprobando de esta manera que el término independiente (valor de. ica. es estadísticamente diferente de cero.8, 11. a). ím. Entre los métodos más usados para hallar los límites de detección y cuantificación está el método de relación señal ruido, sin embargo los. Qu. picos que aparecen en los primeros minutos del cromatogramas hacen imposible ver la señal del blanco por lo que se optó por el siguiente método: Método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a. en ier ía. concentración cero. Está dirigido a evitar el cálculo en ocasiones costos en tiempo, de la señal media del blanco y su desviación estándar. Como resultado se obtuvo límites de detección de 3.56 ppm para Rebaudiósido A; mientras que límites de cuantificación de 11.01 ppm (ANEXO 1. In g. Cuadros N° 2). 3,7. El parámetro de precisión, se evaluó en términos de repetibilidad (del método y del sistema) y precisión intermedia, determinándose para. de. cada uno de ellos el coeficiente de variación y posteriormente para repetibilidad los límites de confianza promedio.. a. Para la repetibilidad del sistema (ANEXO 1 Tabla Nº 3), con un. ec. número de seis determinaciones y en concentraciones de 250 ppm, se. ot. obtuvo un coeficiente de variación de 0.94% para Rebaudiósido A, siendo menores al valor máximo aceptable de 2%. Para la repetibilidad. bli. del método (ANEXO 1 Cuadros Nº 4), con un número de tres. Bi. determinaciones y en concentraciones de 200, 250 y 300 ppm , se obtuvo un coeficiente de variación para Rebaudiósido A de. 0.40%,. 0.87% y 1.20% para concentraciones de 200, 250 y 300 ppm respectivamente; siendo dichos valores menores al valor máximo aceptable de 2%, lo que se traduce en resultados estadísticamente 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. similares bajo las mismas condiciones de operación en intervalos cortos de tiempo, y a la vez expresa un elevado grado de concordancia entre los resultados de una serie repetida ensayos sobre la misma muestra, 3, 8, 11. UN T. demostrándose de esta forma que el método es repetible.. Uno de los factores que influyen, con mayor frecuencia, en la repetibilidad es la concentración del analito; debido a que al disminuir la. ica. concentración del analito la desviación estándar de las respuestas aumenta; además, la repetibilidad depende también del proceso de. ím. preparación de las muestra, es decir a mayor manipulación de la 8,11. Qu. muestra mayor probabilidad de que la variabilidad aumente.. Por otra parte para la precisión intermedia del método (ANEXO1. en ier ía. Cuadros Nº 5, 6,7), se encontró resultados similares en tres analistas diferentes y en diferentes días, obteniéndose los siguientes resultados: un coeficiente de variación para el Rebaudiósido A para 200, 250 y 300 ppm de 0.51%, 1.31% y 1.52% respectivamente, siendo todos estos menores al valor máximo aceptable de 2%, lo que demuestra una buena. In g. reproducibilidad. 7,11. Las condiciones operativas y ambientales que pueden influir en el. de. ensayo de reproducibilidad abarcan desde humedad y temperatura ambiental, hasta variación de condiciones instrumentales y reactivas de. a. diferente calidad. 8. ec. Al hallar los límites de confianza promedio se determinó, con una. probabilidad del 95% para Rebaudiósido A que la concentración del. ot. principio activo a 200 ppm se halla entre 199.94 ppm y 200.70 ppm,. bli. para 250 ppm se halla entre 252.92 ppm hasta 255.03 ppm y finalmente. Bi. para 300 ppm los valores se encuentran entre 298.03 ppm a 301.46 ppm. 3,8 De este modo, podemos constatar que el método es repetible y reproducible; es decir, es suficientemente preciso, por lo que. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.