LUGAR DE EJECUCIÓN
C) PRECISION INTERMEDIA
3.6. SELECTIVIDAD: La selectividad del método propuesto se evalúa
por la eficacia de separación del sistema cromatográfico
CUADRO 06: Parámetro estadístico del ensayo de Selectividad para la
validación de Rebaudiósido A
Parámetros Estudiados Resultado Criterios de
Aceptación
Factor de Resolución Rs = 68.19 > 1.5
Fuente: Elaboración Propia.
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IV.
DISCUSIÓN
En la evaluación de la linealidad enel Rebaudiósido A, se
demostró que el método produce resultados que son proporcionales a la concentración de trabajo del analito para el rango establecido del 25 ppm a 400 ppm (ANEXO 1 Gráfica Nº 1). Al realizar el análisis estadísticos de los datos recopilados (ANEXO 1 Cuadro Nº 1), se obtuvo un coeficiente de correlación r = 0,9999 para Rebaudiósido A el cual es mayor al valor mínimo aceptable de 0,999; lo que indica una significativa correlación lineal entre la concentración y el área de lectura que reporta el analito en el análisis. Pero como la información obtenida mediante el cálculo del coeficiente de correlación es limitado y no justifica por sí sola
la linealidad, hallamos el coeficiente de determinación (r2), que aporta
una mayor significancia estadística ya que expresa la proporción de la
variación total del método, es así que obtuvimos un r2 = 0.9998 para
Rebaudiósido A, lo cual indica una probabilidad del 99.9% de que el porcentaje de variación de respuesta es producida por la
concentración.8, 11
Así mismo se determinó el coeficiente de variación de los factores de respuesta que fue de 7.95% para Rebaudiósido A, el cual debe ser menor al 5%; siendo esto un indicativo de una posible falta de linealidad, pero para confirmar que dicha regresión es lineal se aplicó un test de regresión (test de Student) para evaluar que existe una pendiente
significativamente distinta de cero con una probabilidad de 95% y n–2
grados de libertad, obteniéndose un tregresión de 258.2739 para
Rebaudiósido A cumpliéndose que es mayor al ttabla(2.1604). 5, 8,11
Además hallamos un t experimental del término independiente realizando el test de verificación de la pendiente, aplicando una prueba t-
student con una probabilidad de 95% y n–2 grados de libertad
obteniéndose un t exp = 258.2739 para Rebaudiósido A que es mayor al t
tabla = 2.1604, lo indicaría que la recta no pasa por el origen de las
coordenadas, comprobando de esta manera que la pendiente (valor de
b) son estadísticamente diferentes de cero. 5, 8,11
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Por otro lado hallamos un t experimental del término independiente realizando el test de verificación del intercepto, aplicando una prueba t-student para evaluar las condiciones de proporcionalidad
con una probabilidad de 95% y n–2 grados de libertad obteniéndose un t
exp= 3.1960 para Rebaudiósido A que es mayor al t tabla = 2.1604 lo
indicaría que la recta no pasa por el origen de las coordenadas,
comprobando de esta manera que el término independiente (valor de a)
es estadísticamente diferente de cero.8, 11
Entre los métodos más usados para hallar los límites de detección y cuantificación está el método de relación señal ruido, sin embargo los picos que aparecen en los primeros minutos del cromatogramas hacen imposible ver la señal del blanco por lo que se optó por el siguiente método: Método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero. Está dirigido a evitar el cálculo en ocasiones costos en tiempo, de la señal media del blanco y su desviación estándar. Como resultado se obtuvo límites de detección de 3.56 ppm para Rebaudiósido A; mientras que límites de cuantificación de 11.01 ppm (ANEXO 1
Cuadros N° 2). 3,7
El parámetro de precisión, se evaluó en términos de repetibilidad
(del método y del sistema) y precisión intermedia, determinándose para cada uno de ellos el coeficiente de variación y posteriormente para repetibilidad los límites de confianza promedio.
Para la repetibilidad del sistema (ANEXO 1 Tabla Nº 3), con un número de seis determinaciones y en concentraciones de 250 ppm, se obtuvo un coeficiente de variación de 0.94% para Rebaudiósido A, siendo menores al valor máximo aceptable de 2%. Para la repetibilidad del método (ANEXO 1 Cuadros Nº 4), con un número de tres determinaciones y en concentraciones de 200, 250 y 300 ppm , se obtuvo un coeficiente de variación para Rebaudiósido A de 0.40%, 0.87% y 1.20% para concentraciones de 200, 250 y 300 ppm respectivamente; siendo dichos valores menores al valor máximo
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similares bajo las mismas condiciones de operación en intervalos cortos de tiempo, y a la vez expresa un elevado grado de concordancia entre los resultados de una serie repetida ensayos sobre la misma muestra,
demostrándose de esta forma que el método es repetible. 3, 8, 11
Uno de los factores que influyen, con mayor frecuencia, en la repetibilidad es la concentración del analito; debido a que al disminuir la concentración del analito la desviación estándar de las respuestas aumenta; además, la repetibilidad depende también del proceso de preparación de las muestra, es decir a mayor manipulación de la
muestra mayor probabilidad de que la variabilidad aumente. 8,11
Por otra parte para la precisión intermedia del método (ANEXO1 Cuadros Nº 5, 6,7), se encontró resultados similares en tres analistas diferentes y en diferentes días, obteniéndose los siguientes resultados: un coeficiente de variación para el Rebaudiósido A para 200, 250 y 300 ppm de 0.51%, 1.31% y 1.52% respectivamente, siendo todos estos menores al valor máximo aceptable de 2%, lo que demuestra una buena
reproducibilidad. 7,11
Las condiciones operativas y ambientales que pueden influir en el ensayo de reproducibilidad abarcan desde humedad y temperatura ambiental, hasta variación de condiciones instrumentales y reactivas de
diferente calidad. 8
Al hallar los límites de confianza promedio se determinó, con una probabilidad del 95% para Rebaudiósido A que la concentración del principio activo a 200 ppm se halla entre 199.94 ppm y 200.70 ppm, para 250 ppm se halla entre 252.92 ppm hasta 255.03 ppm y finalmente para 300 ppm los valores se encuentran entre 298.03 ppm a 301.46
ppm. 3,8
De este modo, podemos constatar que el método es repetible y reproducible; es decir, es suficientemente preciso, por lo que
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norepercutieron apreciablemente los errores aleatorios en la
determinación.3,8
La variabilidad de los resultados puede deberse a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Los factores susceptibles a influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados como al analista, el equipo, los reactivos, el tiempo,
etc., es por ello la importancia de este ensayo. 3,8
En cuanto a la exactitud, cuya finalidad es comprobar que el
método tiene la capacidad de revelar dentro de un límite aceptable la cantidad de sustancia de interés, que esté presente en la muestra (ANEXO1 Cuadros Nº 8), el valor del porcentaje de recuperación media fue de 99.01% para Rebaudiósido A, los cuales están dentro de los límites de las especificaciones (98% - 102%) del valor teórico. Señalando así la recuperación como satisfactoria. Se debe tener en cuenta que la recuperación esperada depende de la matriz de la muestra, del procedimiento de la preparación de la muestra y de la
concentración del analito en la misma. 8
Para demostrar que no hay diferencia significativa entre la recuperación media y el 100% se aplicó un test estadístico (test de
Student) donde se cumple que texp<t tabla (1.99<2.3) para una probabilidad
de 95% y n – 1 grados de libertad, corroborándose de esta forma que el
método es exacto para Rebaudiósido A, es decir el método proporciona resultados próximos entre el valor teórico y el experimental encontrado.
Así mismo para evaluar si el factor concentración influye en los
resultados, se utilizó el test de G Cochran, encontrándose un valor Gexp
de 0.79 para Rebaudiósido menor al G tabla: 0.87, para una probabilidad del 95%, de tres grupos de concentraciones y tres repeticiones, lo que significa que las varianzas de las tres concentraciones utilizadas son equivalentes; o dicho de otra manera que el factor concentración no
influye en la variabilidad de los resultados.3,8,11
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La selectividad del método propuesto se evalúa por la eficacia de separación del sistema cromatográfico en las condiciones seleccionadas en comparación con dos componentes estructuralmente relacionados con Rebaudiósido A y Esteviósido.
La separación fue satisfactoria ya que el factor de resolución calculado de Rebaudiósido A y el pico más cercano (Esteviósido) fue de
68.19 el cual es mayor a 1.5. 8,16
Con respecto al rango como cumple con la evaluación de la
linealidad y exactitud, el método funciona correctamente entre 25 y 400 ppm que fueron las concentraciones máxima y mínima trabajadas. Por todo lo antes mencionado se comprobó, la validez del método analítico
dentro del rango estudiado. 8
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V.
CONCLUSIONES
1. Para hallar la señal-ruido se utilizó el Método basado en la
extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero.Debido a que se encontró interferencias de unos picos al inicio de los cromatogramas.
2. El método por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para
la cuantificación de Rebaudiósido “A” en la planta de Stevia rebaudiana
Bertoni cumple con los parámetros de calidad estudiada: la linealidad
presenta un r2 de 0.9998, el límites de detección y cuantificaciónse
obtuvo menor al 2% (0.94%),la exactitud nos dio un 99.01% siendo su límite de aceptación 98%-102%, la precisión es menor al 2%, el rango funciona correctamente entre 25 y 400ppm debido a que cumple con los criterios de exactitud y linealidad y la selectividadse tomó en cuenta a la separación de su elemento más cercano en este caso Esteviósido que fue de 68.19 el cual es mayor a 1.5. Siendo esta aceptable.
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VI. RECOMENDACIONES
1. Mantener actualizada la información sobre las versiones futuras de las
normas de validación, para así poder introducir los correspondientes cambios en los trabajos a realizar, aceptando que los requerimientos son más exigentes día a día y estas normas con el paso del tiempo se perfeccionan aún más.
2. Para hacer estos análisis tenemos que tener una gran confiabilidad con
los analistas ya que la mayoría de los errores en estos análisis son errores humanos o del analista, otro error más común seria de los materiales o equipos que no están calibrados.
3. Tener cuidado con las interferencias en el análisis como los que ocurrió
en los primeros minutos del cromatograma, interfiriendo en los análisis de señal-ruido.
4. Se recomienda utilizar equipos calibrados como son las Fiolas y las
Micropipetas que son los utensilios más importantes que se utiliza en estos estudios.
5. Utilizar agua ultra pura de buena calidad y siempre filtrar las sustancias
que van a pasar por la columna y el equipo de HPLC por estas muy sensibles.
6. Lavar bien la columna de Amino cada vez que se va hacer pruebas
diferentes.
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