EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS SOBRE LA
DENSIDAD DE LOS MICROORGANISMOS EDÁFICOS EN SUELOS DEL EJE CAFETERO EN LAS CUENCAS DEL LOS RÍOS
LA VIEJA Y EL OTÚN
Andrés Felipe Vela Rojas
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C.
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS SOBRE LA
DENSIDAD DE LOS MICROORGANISMOS EDÁFICOS EN SUELOS DEL EJE CAFETERO EN LAS CUENCAS DEL LOS RÍOS
LA VIEJA Y EL OTÚN
Andrés Felipe Vela Rojas
APROBADO:
--- Fabio Roldán, PhD Director del trabajo de grado
--- --- Amanda Varela, PhD Angela Umaññaa,,BBiiooll..MMPPhhiill Jurado Decana Académica
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No. 13 de Julio de 1946:
Agradecimientos
Al Centro de Investigación en Biodiversidad y Recursos Genéticos (CIEBREG) y a la Pontificia Universidad Javeriana por el apoyo logístico y económico para el desarrollo de la investigación
Al Doctor Fabio Roldán por su paciencia y su colaboración.
A Mónica Berdugo por su colaboración
A Fernando Torres por su colaboración
A Nelcy Latorre por ser más que una compañera de trabajo, un ejemplo, un abrazo, un beso, un anhelo y todo lo que una persona busca para su vida
A mi familia y en especial a mis padres por ser el motor de mis acciones.
A la persona más importante de mi vida, mi hija Simona por ser el cielo más hermoso que Dios puso en mi camino
A toda la gente que acompaño este proceso en el laboratorio, por una risa, un consejo un algo que construye una mejor persona cada día.
TABLA DE CONTENIDO
Pág
RESUMEN ... 15
ABSTRACT ... 16
1. INTRODUCCIÓN ... 17
2. MARCO TEÓRICO ... 18
2.1. El suelo ... 18
2.2. Técnicas directas e indirectas para conteo microbiano ... 19
2.2.1. Técnicas de conteo... 21
2.2.2. Conteo directo por microscopia de epifluorescencia ... 23
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ... 31
3.1. Formulación del problema. ... 31
3.2. Justificación ... 32
4. OBJETIVOS ... 33
4.1. Objetivo general. ... 33
4.2. Objetivos específicos. ... 33
5. MATERIALES Y MÉTODOS ... 34
5.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo utilizando DAPI:... 34
5.1.1. Cultivo de E. coli o control de procedimiento: ... 34
5.1.2. Estandarización de la tinción utilizando suelo: ... 34
5.1.3. Descripción del protocolo de tinción: ... 35
suelo………....35
5.1.4.2. Evaluación de la concentración de DAPI para la tinción………..35
5.1.4.3. Esquema de conteo………35
5.1.5. Tratamientos y análisis visual de los filtros para la estandarización del protocolo de tinción ... 40
5.1.6. Control de calidad del conteo: ... 40
5.1.7. Análisis estadístico para la estandarización... 40
5.2. Estimación de la densidad microbiana en suelos de la ecorregión cafetera utilizando DAPI ... 41
5.2.1. Muestreo ... 41
5.2.2 Unidades de muestreo ... 41
5.2.3. Eventos de muestreo: ... 43
5.2.4. Parámetros fisicoquímicos:... 43
5.3. Análisis estadístico para evaluar el efecto del sistema productivo sobre los conteos de microorganismos totales. ... 44
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN... 45
6.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo con DAPI: ... 45
6.1.1. Control de procedimiento con E. coli para el conteo directo con DAPI ... 45
6.1.2. Evaluación de los tratamientos utilizando E. coli como control de procedimiento .... 46
6.2. Evaluación de los tratamientos seleccionados para la estandarización utilizando muestras de suelo ... 48
6.3.1. Comparación de los conteos de microorganismos edáficos totales de las fincas
seleccionadas para cada cobertura. ... 51
6.3.2. Comparación de los conteos de microorganismos edáficos totales de las fincas seleccionadas para cada sistema productivo ... 68
6.3.3. Efecto en los conteos del evento de muestreo ... 72
6.3.4. Efecto en los conteos del evento de muestreo entre ventanas ... 76
7. CONCLUSIONES ... 79
8. RECOMENDACIONES ... 80
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 81
LISTA DE TABLAS
Pág
Tabla 1. Parámetros de comparación entre los conteos directos e indirectos. ... 20
Tabla 2. Ventajas y desventajas del conteo en placa y número más probable. ... 22
Tabla 3: Comparación de los métodos para el conteo en placa y directo por epifluorescencia .... 23
Tabla 4: Comparación de los distintos colorantes usados en conteos directos por epifluorescencia ... 26
Tabla 5. Tratamientos evaluados para la estandarización del conteo con DAPI utilizando un cultivo de E. coli y las muestras de suelo. ... 40
Tabla 6. Sistemas productivos, coberturas y fincas seleccionadas en la cuenca del río La Vieja y El Otún. ... 43
Tabla 7. Descripción general de la cuenca del río La Vieja. ... 42
Tabla 8. Descripción general de la cuenca del río El Otún. ... 44
Tabla 9. Recuentos en placa y absorbancia de E. coli en el tiempo ... 45
Tabla 10. Conteos obtenidos durante la estandarización del proceso de tinción utilizando E. coli. ... 47
Tabla 11. Conteos obtenidos de los distintos tratamientos evaluados durante el proceso de estandarización utilizando una muestra de suelo ... 49
Tabla 12: Conteos de los microorganismos edáficos obtenidos durante el estudio en la CEAN.. 52
Tabla 13. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas de las fincas seleccionadas para cada cobertura en la cuenca de río La Vieja ... 54
LISTA DE FIGURAS
Pág Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo utilizado para el conteo con DAPI (Casamayor, 2006). ... 35 Figura 2. Células coloreadas con DAPI en una muestra de suelo. ... 37 Figura 3. Diagrama de flujo del protocolo de tinción y las modificaciones evaluadas. A, B y C hacen referencia a los pasos evaluados para la estandarización del conteo con DAPI. ... 38 Figura 4. Comparación de los esquemas de conteo de la técnica para una mayor precisión por Kirchman y colaboradores (1982), 1) dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado de la dilución. ... 39 Figura 5. Curva de calibración (absorbancia vs. recuento en placa) del cultivo de E. coli. Se
presenta el promedio de dos valores. ... 46 Figura 6. Conteos de microorganismos totales en los cafetales de la cuenca del río La Vieja. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ... 53 Figura 7. Conteos de microorganismos totales en los bosques de la cuenca del río La vieja. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ... 55 Figura 8. Conteo de microorganismos totales en los pastizales de la cuenca del río la Vieja. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ... 56 Figura 9. Conteos de microorganismos totales en los guaduales de la cuenca del río La Vieja. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ... 57 Figura 10. Diferencias de las coberturas de la cuenca del río La Vieja entre muestreos. Se
Figura 11. Conteos de microorganismos totales en los guaduales de la cuenca del río El Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ... 62 Figura 12. Conteos de microorganismos totales en los cultivos de cebolla de la cuenca del río El Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ... 63 Figura 13. Conteos de microorganismos totales en los bosques de la cuenca del río El Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ... 64 Figura 14. Conteos de microorganismos totales en los forestales de la cuenca del río El Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ... 65 Figura 15. Diferencias de las coberturas de la cuenca del río El Otún entre muestreos. Se
LISTA DE ANEXOS
Pág
Anexo A. Preparación de DAPI para el conteo directo ... 92
Anexo B. Cálculos de factor de corrección para conteos realizados en Microscopio de epifluorescencia Nikon Eclipse 5.0i ... 93
Anexo C. Curva de calibración para el cultivo de Escherichia coli ATCC 25922 ... 94
Anexo D. Tabla de datos de la estandarización ... 95
Anexo E. Distribución de los tratamientos para la estandarización con de E. coli. ... 96
Anexo F. Distribución de los tratamientos, ANOVA y comparación de medias utilizando Tukey-Kramer para la estandarización con la muestra de suelo ... 97
Anexo G. t-student para los conteos entre las concentraciones de DAPI para la estandarización en las muestras de suelo... 98
Anexo H. t-student para los conteos entre los esquemas de conteo para la estandarización en las muestras de suelo. ... 99
Anexo I. t-student para los conteos entre los pretratamientos para la estandarización con muestras de suelo. ... 100
Anexo J. Datos del primer evento de muestreo ... 101
Anexo K. Datos del segundo evento de muestreo ... 103
Anexo L. Efecto de la cobertura sobre los conteos ... 105
Anexo M. Diferencias entre muestreos por coberturas ... 113
Anexo N. Efecto del sistema productivo sobre los conteos ... 117
RESUMEN
El objetivo del presente estudio fue estimar la densidad microbiana en suelos de diferentes sistemas productivos del Eje Cafetero Colombiano por microscopía de epiflurescencia. Por lo cual se estandarizó la técnica y se evaluó el efecto de los sistemas productivos sobre los conteos empleando DAPI. Para estandarizar la técnica se evaluaron tres variables: el uso de dos pretratamientos, la evaluación de dos concentraciones de DAPI y dos esquemas de conteo. Posteriormente en dos épocas de muestreo de diferentes características climáticas, se tomaron en cada una 48 muestras compuestas de suelo. Se analizaron variables fisicoquímicas como pH, porcentaje de humedad, temperatura del suelo y altura de la hojarasca y del cultivo.
Se determinó que dos lavados sucesivos en NaCl (0,85% p/v) a 13000 rpm por 5 minutos a una concentración de 5 µg/ml de DAPI por 20 min y el uso de dos filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución generó los conteos mas altos, la CV mas pequeña y la calidad del filtro mayor de todos los tratamientos evaluados.
Al analizar los datos en el sistema productivo se observó que presenta alta heterogeneidad, por lo cual fue necesario analizar los datos por coberturas. La cobertura forestal presentó los mayores conteos. Adicionalmente los cafetales sin sombrío, los guaduales y el cultivo de cebolla mostraron ser las coberturas más variables mientras que los bosques y los pastizales fueron las coberturas menos variables. Finalmente se observaron mayores conteos en el segundo evento de muestreo.
ABSTRACT
The purpose of the present study was to consider the soils microbial density of the different productive systems from the Colombian coffee zone by epifluorescence microscopy. For this reason this technique was standardized and the effect of the productive systems was evaluated on the counts by using DAPI. To standardize the technique three variables were evaluated: the use of two pre-treatments, two DAPI’s concentrations, and two count schemes. Sampling was conducted at two different seasons (June and September) from 16 farms within 6 different productive systems. Three random composite samples were collected from each farm for a 96 total samples. Physiochemical variables like pH, humidity, soil temperature and height of the litter fall and cultivation were analyzed.
It was determined that the successive washings with NaCl (0.85% w/v) to 13,000 rpm by 5 minutes, staining with 5 µg/ml of DAPI by 20min and the use of two filters: one from the selected dilution, and the second from the duplicate to the same dilution generated the highest counts, the highest precision and in general the best quality of all the evaluated treatments.
The productive systems showed a high heterogeneity level indicating that the effect has to be monitored at the covers level. The forest cover displayed greater microbial counts. Additionally, the coffee plantations without shady, the bamboo an onion cultivations were the most variable covers despite the fact that the forests and pastures were the less variable covers. Finally bigger counts in the second event of sampling were observed.
Keywords: DAPI, productive systems, counts, density, soil.
. .
1. INTRODUCCIÓN
El suelo es la matriz heterogénea y variable que soporta el mantenimiento de organismos de nivel macro y microscópico. Los microorganismos son unidades biológicas, autónomas, de amplia versatilidad metabólica capaces de utilizar compuestos, sintetizar biomasa y generar sustancias útiles para otros organismos que necesitan sustratos en forma disponible y asimilable, y cumplen funciones primordiales en la fijación de nitrógeno, la degradación de compuestos contaminantes y el ciclaje de nutrientes y materia orgánica. Los microorganismos en el suelo se encuentran definidos en fusión de la densidad. La densidad o abundancia total es definido como el total de microorganismos por unidad de hábitat. Esta densidad conjugada con la riqueza y la abundancia relativa ayudan a definir la diversidad de un ambiente. Para determinar la densidad microbiana se pueden utilizar métodos de conteos directos e indirectos.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. El suelo
El suelo es el material suelto de la superficie que suministra soporte físico y nutricional para el crecimiento de plantas, animales y organismos (Eweis y Ergas, 1999). Geológicamente, “el suelo se forma a partir de rocas mediante un proceso complejo en el que intervienen fuerzas físicas, químicas y biológicas, que primero reducen la roca a regolíto (fragmento de roca) y después a suelo. Los principales factores que participan en la formación y que afectan directamente la composición del suelo son: el material original, el clima, la topografía, la actividad biológica y el tiempo” (Atlas y Bartha, 2001). A nivel general, el suelo está compuesto por minerales, aire, agua, materia orgánica y organismos vivos (Eweis y Ergas, 1999). Los materiales minerales constituyen un 50% del volumen total del suelo y son los encargados de la regulación de los procesos biogeoquímicos, siendo sustratos iniciales, aceptores de electrones o catalizadores para reacciones bioquímicas en microorganismos (Eweis y Ergas, 1999, Maier et al., 2001). Por otro
lado, el aire y el agua constituyen del 25 al 50% del volumen total del suelo actuando como reguladores del tamaño de los poros, aumentando la disponibilidad de aceptores de electrones y reguladores de reacciones de oxido-reducción, entre otros (Eweis y Ergas, 1999).
El suelo generalmente es pobre en nutrientes y fuentes de energía (Nannipieri et al., 2003); su
materia orgánica está constituida por residuos vegetales o animales, microorganismos y productos generados del metabolismo orgánico (Eweis y Ergas, 1999; Maier et al., 2001). La
porción húmica es una mezcla heterogénea compuesta de productos provenientes de los procesos bioquímicos de los residuos orgánicos (Atlas y Bartha, 2001).
Microbiológicamente, el suelo es reconocido como uno de los sitios que presenta interacciones biológicas más dinámicas en la naturaleza, contiene bacterias, hongos, algas y protozoarios que intervienen en el ciclaje de nutrientes, y preservar la salud y la estructura del suelo. De igual forma, estos organismos pueden aumentar la fertilidad, convirtiendo los sustratos en formas asimilables o disponibles que contribuyen al sostenimiento del crecimiento vegetal (Alexander, 1987; Kennedy, 1999).
microambientes difieren como consecuencia del clima, materiales geológicos, topografía, comunidades microbianas y el efecto del tiempo generando diferencias ambientales a pequeña escala espacial afectando las comunidades microbianas (Meeting, 1993; Hartel, 2005).
En la distribución y diversidad microbiana del suelo influyen las características extrínsecas relacionadas a las precipitaciones, el viento, la composición del suelo, humedad, pH, temperatura, los organismos superiores como plantas o animales y las prácticas agrícolas (Toro, 2004). Las características intrínsecas hacen referencia a los mecanismos de persistencia y resistencia microbianas (esporas y cápsulas), el tamaño, la tasa de mortalidad y las cualidades bioquímicas de los microorganismos (Coyne, 2000).
Las comunidades microbianas edáficas cumplen funciones fundamentales en el ciclaje de nutrientes, descomposición de materia orgánica, efectos en la estructura y características fisicoquímicas del suelo como humedad, pH y alcalinidad (Nannipieri et al., 2003; Singh et al.,
2006).
Diferentes estudios como Torsvik y colaboradores (1990) desarrollado en suelo de un forestal en Noruega, utilizando microscopia de epifluorescencia con naranja de acridina, reportó 1.5 x 1010 bacterias por cada gramo de peso seco. Torsvik y Øvreås (2002) reportan 4.2 x 10 11 células por gramo de peso seco con DAPI y Schmidt (2006), reporta una densidad de microorganismos totales en 1 x 1010 organismos por gramo de suelo.
2.2. Técnicas directas e indirectas para conteo microbiano
Para entender las relaciones entre las poblaciones microbianas de un ecosistema, es necesario poseer información del número, la actividad y desarrollo de los organismos en su hábitat (Atlas y Bartha, 2001). Por esta razón, es necesario diseñar y desarrollar métodos que indiquen la densidad y presencia o ausencia de organismos en una muestra. En estudios microbiológicos, es importante reconocer cual es el objetivo principal para realizar el conteo microbiano, el tipo de matriz, la composición y las posibles relaciones microbianas en la muestra manejando biomasa y la actividad microbiana como datos independientes (Yu et al., 1995; Atlas y Bartha, 2001), por
Se pueden considerar dos tipos de conteo de los microorganismos en distintos ecosistemas: directo o indirecto. El conteo directo es una observación directa del microorganismo (Maier et al., 2001) en el cual se reconocen por separado cada una de los individuos de una comunidad
existente en una muestra (Atlas y Bartha, 2001; Maier et al., 2001; Khan y Yadav, 2004; Wolffs et al., 2005). Por otro lado, el conteo indirecto se define como la evidencia presuntiva de
microorganismos por medio de la búsqueda de productos metabólicos en ensayos cultivables (Maier et al., 2001), evaluando la oxido-reducción de los metabolitos primarios o secundarios
utilizando reactivos que evidencian la presencia del microorganismo en la muestra.
El conteo directo es ampliamente usado en estudios que necesitan datos en cortos periodos de tiempo, mientras que el conteo indirecto es usado para realizar análisis relacionados con la actividad metabólica de los microorganismos, en ensayos que necesitan medios selectivos o específicos para microorganismos (Tabla 1).
[image:20.612.147.491.518.647.2]Existen organismos que debido a su sensibilidad, exigencia y metabolismo particular, necesitan elementos, microelementos y condiciones de cultivo específicas para ser cultivados y así ser manipulados en laboratorio. Los microorganismos que son poco exigentes o que necesitan condiciones de cultivo similares a las que se le ofrecen en el laboratorio, son los considerados cultivables, mientras los que tienen un mayor nivel de exigencia, se consideran no cultivables por las dificultades de mantenerlos en condiciones de laboratorio.
Tabla 1. Parámetros de comparación entre los conteos directos e indirectos. Conteo Directo Conteo Indirecto Tiempo Corto Considerable incubación por
Sensibilidad Mayor Menor
Precisión Mayor Menor
Alcance Viables, no viables y
viables no cultivables Solo viables. Valores del
conteo Mayores Menores
2.2.1. Técnicas de conteo
Entre las técnicas mas utilizadas para cuantificar biomasa se han clasificado en tres grupos: 1) El numero de bacterias cultivables determinado por un conteo en placa (CP) o por número mas probable (NMP), 2) uso de marcadores específicos de moléculas biológicas por microscopia de epifluorescencia y 3) métodos microautoradiograficos (Yu et al., 1995). Inicialmente, se utilizaba
el CP y NMP como métodos para estimar el número de microorganismos de una muestra sin discriminar su origen. Sin embargo, estas técnicas no tienen en cuenta los microorganismos no cultivables ni los que tienen un crecimiento lento, los tiempos de lectura se encuentran estandarizados dependiendo del grupo de microorganismos que se desea contar y son sensibles a las condiciones de cultivo como la temperatura y la composición del medio (Boulos et al., 1999)
(Tabla 2).
El uso de marcadores específicos de moléculas biológicas por microscopia, por ejemplo competidores de los electrones en la cadena respiratoria, que al reducirse generan una fluorescencia ó algún fenómeno físico como la sedimentación facilitando la enumeración de microorganismos. El conteo directo por epifluorescencia genera un conteo más alto de microorganismos con respecto al CP y NMP, debido a que se tienen en cuenta los organismos viables no cultivables, viables cultivables y no viables, independientemente si los viables son aerobios o anaerobios, psicrófilos, mesófilos o termófilos (Roslev y King, 1993, Yu et al., 1995,
Bhupathiraju et al., 1998, Boulos et al., 1999, Créach et al., 2003)(Tabla 3).
El método microautoradiográfico consiste en ligar un radioisótopo a la membrana celular del microorganismo que se activa y se evidencia al tomar una placa radiográfica (Yu et al., 1995). El
uso de esta técnica depende del manejo de equipos específicos de alto valor económico lo que dificulta su utilización.
.
Tabla 2. Ventajas y desventajas del conteo en placa y número más probable. Técnica Característica
Conteo en placa
Ventajas
Practicidad • Fácil y práctica Costos • Bajos costos
Conteo •a 300 UFC. Rango de conteo 30
• Uso de diluciones
Desventajas
• Modificación del protocolo según el objetivo de trabajo
• Tendencia al error
operativo y
sistemático
• Tiempo de
incubación
dependiente del microorganismo
• Potencial de selectividad biológica. •Selectividad nutricional. NMP Ventajas
Practicidad • Fácil Costos • Bajos costos
Conteo • Basados estimación en estadística.
Desventajas
• Modificación del protocolo según el objetivo de trabajo.
• Tendencia al error
operativo y
sistemático.
• Tiempos de
incubación dependen de la técnica y del microorganismo.
• Poca precisión.
Tabla 3: Comparación de los métodos para el conteo en placa y directo por epifluorescencia
Conteo en Placa Conteo directo por epifluorescencia Referencias Tiempo de incubación microorganismoDepende del a 1-12 horas Schallenberg 1989. et al.,
Microorganismos no
cultivables No los cuenta Los cuenta Lepeuple
et al.,
2004. Variabilidad del conteo Variable No variable Rodríguez 1992. et al.,
Manipulación de
muestra Alta Baja
Noble y Ashton 1991. Uso de equipos
específicos No necesita Necesita Toxicidad a
microorganismos Nula Considerable
Capacidad de recuperar
microorganismos viables Alta Nula
Anaerobios cultivables Los cuentab Los cuenta a Depende de la velocidad de duplicación del microorganismo que se desea.
b Por conteo en placa se pueden contar anaerobios cultivables al aumentar los costos por equipos específicos
2.2.2. Conteo directo por microscopia de epifluorescencia
viables o no viables dependiendo del tipo de fluorocromo, generando una ventaja competitiva frente al CP (Maki y Remsem 1981; Kepner y Pratt 1994; Yu et al. 1995; Minor et al., 2003).
El naranja de acridina o 3,6-bis (dimetilamino) clorhidrato de acrídina, es uno de los fluorocromos más usados para el conteo directo por epifluorescencia (Kepner y Pratt, 1994). El naranja de acridina se intercala fuertemente a la doble hélice del DNA por el grupo fosfato de los ácidos nucleicos (Kepner y Pratt 1994, Rapposch et al. 2000). Sin embargo, por la interacción
DNA-Naranja de Acrídina se visualiza todo el DNA presente en la muestra, siendo imposible distinguir entre los organismos metabolitamente inactivos, células viables y el material genético ajeno al objetivo del ensayo (Tabla 4)(McFeters et al.1991; Kepner y Pratt 1994; Yu et al. 1995).
Tras la aparición del conteo directo como herramienta útil y de fácil aplicación, la gran mayoría de los estudios empleaban el naranja de acridina como la mejor elección. Uno de las primeras aproximaciones del uso de naranja de acridina en el conteo por epifluorescencia la realizó Gwynfryn (1974) el cual aplico la técnica en aguas. Sin embargo, un estudio desarrollado por Francisco y colaboradores (1975) estandarizó el proceso de conteo directo con naranja de acridina en aguas. Otros estudios como Daley y Hobbie (1975) realizaron conteos de bacterias del cuerpo de agua de un estuario y un lago, Ramsay (1978) realizó conteos de bacterias en totales en aguas para compararlo con la actividad heterotrófica, Grivan y colaboradores (2003) evaluaron el efecto del tipo de suelo en la composición, las comunidades microbianas cultivables y totales en suelos de uso agrícola, entre otros.
Sin embargo, el desarrollo del DAPI presentó un avance importante en las técnicas de conteo directo siendo muy superior al naranja de acridina debido al amplio especto de uso, mayor especificidad y sensibilidad, no sobreestimación, no variación de los conteos y la coloración a diferentes pH y porque el DAPI no reacciona con RNA (Porter y Feig, 1980; Kepner y Pratt, 1994; Yu et al., 1995). El DAPI es un tinte fluorescente que pertenece al grupo de los colorantes
encuentra la porción nuclear rica en secuencias de A-T (Adenina - Timina), requiriendo mínimo tres pares AT consecutivos para obtener una interacción fuerte (Kepner y Pratt, 1994) (Tabla 4).
Sin embargo DAPI colorea todo el DNA presente en la muestra sin discriminar si es bacteriano o no y si es viable o no (Kepner y Pratt, 1994, Weinbauer et al., 1998). Algunos interferentes que
no tienen DNA desarrollan una coloración amarilla y otros como la clorofila una coloración roja a 400 nm (Kirchman et al., 1982, Kuwae y Hosokawa,1999).
El uso de DAPI en muestras de suelo, presenta algunos problemas relacionados con su metodología. Un problema fundamental, es la presencia de coloides que pueden generar autofluorescencia o unión no específica con el fluorocromo, presentándose enmascaramiento de la unidad fluorescente y generando interferentes por perdida de capacidad de observación en los campos de lectura (Maier et al., 2001, Schallenberg et al., 1989). A nivel práctico se entiende que
a diluciones altas, disminuye la interferencia coloidal, pero también decrece el número de microorganismos lo que resulta en un conteo estadísticamente no representativo. Sin embargo, en muestras de suelo, la concentración de microorganismos es suficientemente alta para realizar diluciones seriadas hasta 10-5 o 10-6 revistiendo de menor importancia la interferencia coloidal (Maier et al., 2001; Torsvik y Øvreås, 2002; Schmidt, 2006).
La interferencia coloidal se puede minimizar con una filtración eliminando las partículas de tamaño superior a 20 µm (Maier et al., 2001). Además de lo anterior, se pueden realizar lavados
Tabla 4: Comparación de los distintos colorantes usados en conteos directos por epifluorescencia
Tipo muestra Limitaciones Ventajas Referencias
NARANJA DE ACRIDINA
• Aguas tratadas
• Aguas residual
• Lodos activados
• Suelos
• Alimentos
• Uso clínico
• Sedimentos
•Varía la coloración dependiendo del pH
•Colorea RNA/DNA
•No discrimina entre viables y no viables
•Autofluorescencia por detritos
•Reconoce todo el DNA
•Genera falsos positivos dependiendo del estado
fisiológico del microorganismo
•Se reconoce la célula aparte de la fluorescencia por la forma y el tamaño
•Prueba rápida
• Duffy y Sheridan, 1998 • Girvan et al., 2003
• Hoff et al.,1995 •Kepner y Pratt, 1994
•McCarthy and Senne, 1980
•Mc Feters et al.,1991 •Rapposch et al.,2000 •Yu et al.,1995
DAPI
• Aguas tratadas
• Aguas residuales
• Lodos activados
• Suelos
• Alimentos
• Inmunología
• Sedimentos
•Fluorescencia de fondo
•Poca definición dependiendo de la muestra
•No se puede almacenar la muestra coloreada por mucho tiempo
•Autofluorescencia del suelo
•Manchado de todo el DNA de la muestra
•Uso de sistema de extracción celular en muestras sólidas o semisólidas
•Se reconoce el
microorganismos aparte de la fluorescencia por la forma y el tamaño
•Conteo de células totales
•Creach et al., 2003 •Diederichs et al.,2003 •Duffy y Sheridan, 1998
•Kuwae y Hosokawa,1999
•Porter y Feig, 1980
•Quéric et al.,2004 •Schallenberg et al.,1989 •Smith y McFeters,1997
•Yu et al.,1995
PRIMULINA
• Aguas costeras
• Aguas subterráneas
• Uso clínico
•Uso de filtros de excitación y lectura por aparte.
•Reacción con detritos.
•No interfiere con la lectura de fluorescencia de la clorofila
•Minimiza enmascaramiento de clorofila
•Caron, 1979
Continuación tabla 4: Comparación de los distintos colorantes usados en conteos directos por epifluorescencia
Sales de tetrazoleo Tipo muestra Limitaciones Ventajas Referencias
INT
• Aguas tratadas.
• Aguas residuales
• Lodos activados
• Suelos.
• Uso clínico.
•INT-formazan es insoluble.
•Dificultad al leer INT-formazan en células pequeñas.
•Baja taza de reducción.
•Soluble en aceite de inmersión.
•Baja sensibilidad.
•Alto espectro de reducción.
•Conteos de viables no cultivables.
•Depósitos de INT reducido internos.
Bitton y Koopman, 1982 Duffy y Sheridan, 1998 Harvey y Young, 1980 Hatzinger etal., 2003
Maki, etal., 1981
Rodríguez etal., 1992
Roslev y King, 1993 Smith y McFeters, 1997
XTT
• Suelos
• Lodos activados
•Utiliza isótopos radioactivos (opcional del fabricante)
•Muestra un potencial de retención en la célula del colorante reducido
•Alta citotoxicidad
•Alta tasa de retención bacteriana
•Necesita el transportador de electrones
•Fácil reducción química
•Algunas especies reducen el XTT
Hatzinger etal., 2003
Kuhn etal., 2003
Mc Feters etal., 1991
Roslev y King, 1993 Shimamura etal., 2003
Smith y McFeters, 1997
CTC
• Alimentos
• Suelos
• Lodos
• Aguas contaminadas
• Aguas tratadas
• Patología
•Es inhibido por transportadores de electrones.
•Disminuye el conteo con inhibidores de la cadena respiratoria.
•Es necesario aumentar la tasa metabólica para tener conteos altos.
•Conteo de viables y no viables.
•No deja coloración de fondo.
•Se observa CTC reducido en pequeñas concentraciones.
•Boulos et al., 1999 •Creach et al., 2003
•Duffy y Sheridan et al., 1998
•Hatzinger et al., 2003
•Jugnia, L. et al., 2000
•Lepeuple et al., 2004
De acuerdo con Schallenberg y colaboradores (1989), la aplicación de concentraciones erróneas de DAPI en muestras de suelo, causan una subestimación del conteo bacteriano. En diferentes estudios han utilizado concentraciones de 0.01, 0.5, 5.0 y 10.0
µg/ml de DAPI para el conteo bacteriano obteniendo buenos resultados (Yu et al., 1995;
Schallenberg et al., 1989). Sin embargo, Schallenberg y colaboradores (1989) afirman
que la concentración óptima para el conteo directo por epifluorescencia con DAPI para muestras ambientales, es de 5 µg/ml en muestras que tengan un contenido de agua de 50 al 99%.
El DAPI ha sido ampliamente utilizado. Un estudio realizados por Coleman (1980) reportó el uso del DAPI para la detección de bacterias en aguas. Porter y Feig (1980) identificaron y contaron microflora acuática con DAPI. Kirchman y colaboradores (1982) realizaron un estudio enfocado en al análisis estadístico del método de conteo directo para la enumeración bacteriana con DAPI. Hymel y Plante (1998) realizaron el conteo bacteriano en suelos arenosos, fangos y otras matrices evaluando cualitativa y cuantitativamente la tinción. Banks y colaboradores (2003), determinaron como afecta la absorción y transporte bacteriano en columnas de suelos saturados. Diederichs y colaboradores (2003) realizaron un estudio utilizando hibridación in situ fluorescente
(FISH) para determinar la microflora bacteriana que alimenta ciliados determinando la población total con DAPI, Caraccioloa y colaboradores (2005) aplicaron FISH en suelos y en acuíferos respectivamente aplicando DAPI para determinar los microorganismos totales en la muestra.
Otro fluorocromo utilizado para conteos microbianos es la Primulina, un colorante que se desarrolló para la diferenciación de microorganismos heterótrofos y fotótrofos en columnas de agua (Caron 1983; McKenzie et al. 1992). Esta técnica se desarrollo
máxima de 425 nm no interfería con la clorofila y se podían leer en la misma preparación (Caron 1983) (Tabla 4).
Por otro lado, las sales de tetrazoleo son ampliamente utilizadas en los ensayos biológicos, incluyendo localización y medición de la actividad de las oxidoreductasas, la detección de radicales superóxido, pruebas de viabilidad y crecimiento bacteriano (Bernas y Dobrucki 2000). Las sales de tetrazoleo sirven como fuertes aceptores de electrones que al tener contacto con el sistema transportador (STE) se oxidan, generando una molécula fluorescente a una longitud de onda particular (McCluskey et al. 2005;
Roslev y King 1993).
Una de las sales de tetrazolium más utilizadas es el (2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5 Fenil Clorhidrato de Tetrazolio (INT) que se emplea para la cuantificación del potencial de respiración, generando una precipitación o una reacción calorimétrica que determina la producción de INT reducido o como se le llama comúnmente, INT-formazán (Harvey y Young, 1980; Maki et al., 1981; Bitton y Koopman, 1982) (Tabla 4).
Harvey y Young (1980) enumeraron bacterias en un pantano salado por medio de INT. Maki y Remsen (1981) realizaron la comparación del INT con el cultivo en placa para determinar el metabolismo bacteriano en aguas. Trevors y colaboradores (1983) utilizaron INT para determinar un efecto tóxico de sustancias ambientales en algas. Dufour y Colon (1992) aplicaron una metodología con INT y DAPI para realizar conteos de microorganismos viables y totales en ambientes acuáticos. Mosherr y colaboradores (2003) utilizaron INT para demostrar la actividad de la deshidrogenasa en sedimentos contaminados con hidrocarburos aromáticos policíclicos.
Otra sal de tetrazolium, 2.3-Bis (2-Metoxi-4-Nitro-5-Sulfofenil) -5- [(fenil-amino) Carbonil] -2H-Hidróxido de Tetrazolio (XTT), es un potente indicador de viabilidad en células tanto procariotas como eucariotas (Ahmed et al., 2004; Kuhn et al., 2003). El
de rápida reducción, fácil visualización y preparación frente a otros colorantes como el INT (Kuhn et al., 2003; Vallejo et al., 2006).
Paull y colaboradores (1988) fueron los primeros en sintetizar el XTT. Roslev y King (1993) utilizaron el XTT como indicador de viabilidad bacteriana en cultivos de
Methylosinus trichosporium, Pseudomonas putida, Escherichia coli y Bacillus subtillis.
Guyard y colaboradores (1999) enumeraron y caracterizaron bacterias un nacimiento de agua. Bensaid y colaboradores (2000) usaron XTT para la estimación de la actividad biológica en lodos activados. Vallejo y colaboradores (2006) compararon XTT con INT utilizando NMP para estimar la densidad de microorganismo degradadores de hidrocarburos.
El 5-ciano-2,3-ditolil cloruro de Tetrazolio (CTC), es una sal de tetrazolium que se reduce en CTC-formazan el cual es acumulado intracelularmente, generando una alta fluorescencia (Roslev y King, 1993; Yu et al., 1995; Smith y McFeters, 1997;
Bhupathiraju et al., 1999; Sieracki et al., 1999) (Tabla 4). El CTC a diferencia de INT,
en forma reducida no produce fluorescencia de fondo, a pesar de ser insoluble. Por lo anterior, el conteo directo con CTC es notablemente superior al conteo con INT (Rodríguez et al., 1992; Yu et al., 1995).
Rodríguez y colaboradores (1992) utilizaron por primera vez el CTC para determinar el número de bacterias activas en muestras de agua. Sieracki y colaboradores (1999) utilizaron citometría de flujo con CTC para evaluar el bacterioplanton marino activo. Bhupathiraju y colaboradores (1999) evaluaron la actividad metabólica de bacterias anaeróbicas. Proctor y Souza (2000) determinaron la cantidad de células activas especificas al CTC en sedimentos de río, costa y esturarios. Créach y colaboradores (2002) determinaron el uso y las limitaciones del CTC en la estimación de las bacterias activas con E. coli. Lepeuple y colaboradores (2004) compararon el uso del CTC, el
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1. Formulación del problema
En Colombia se han desarrollado un limitado número de investigaciones sobre diversidad microbiana edáfica debido a la complejidad nutricional, condiciones de cultivo y la dificultad de la recuperación de los microorganismos no cultivables. El Centro de Investigaciones y Estudios en Biodiversidad y Recursos Geneticos (CIEBREG) está enfocado a la valoración y monitoreo de la diversidad en paisajes naturales asociados a sistemas productivos a todos los niveles tróficos en el complejo ecorregional de los andes del norte (CEAN). Reconociendo la real importancia de los microorganismos en los procesos ambientales y servicios ecosistémicos, en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA), se estudia la diversidad microbiana edáfica. Para desarrollar este estudio, es necesario determinar la abundancia total de microorganismos edáficos, que es el objetivo general de este trabajo de grado. Adicionalmente, en USBA no se contaba con un protocolo estandarizado para el conteo de microorganismos totales en suelos.
3.2. Justificación
Una de las regiones más densamente pobladas y sobreexplotada de Colombia es el CEAN. Según algunos trabajos realizados por las Corporaciones Autónomas Regionales, la densidad poblacional es de 378 h/km2, con un 39.4% de la población nacional en 0.26% del territorio colombiano (CRQ et al., 2005). Sin embargo, a pesar
de esta problemática, se ha logrado mantener algunos focos ecológicos inexplorados o poco intervenidos entre suelos dedicados al uso agrícola en la cuenca del río La Vieja y El Otún. Estos territorios han sido sujeto de algunos estudios e investigaciones en pro de su conservación biológica, la preservación y/o la forestación (CRQ et al., 2005).
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general.
Evaluar el efecto de los sistemas productivos sobre la densidad de microorganismos edáficos en suelos del eje cafetero en las cuencas de los ríos La Vieja y El Otún.
4.2. Objetivos específicos.
• Estandarizar el conteo de microorganismos por epifluorescencia utilizando DAPI.
• Estimar la densidad microbiana en los sistemas productivos predominantes en la ecorregión cafetera.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
El conteo directo de los microorganismos del suelo se realizó utilizando microscopio de epifluorescencia con 4'-6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI). Inicialmente, se realizó la estandarización de la técnica para conteo de microorganismos en el laboratorio de USBA con un cultivo de E. coli a una concentración conocida y con una muestra de
suelo. Para la estandarización del protocolo de tinción se modificaron algunos de los pasos reportados en la literatura para disminuir la variabilidad y la presencia de interferentes e incrementar la exactitud. Con base con los resultados obtenidos durante la estandarización, se estableció el protocolo de tinción para realizar los conteos durante la fase de campo del estudio.
5.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo utilizando DAPI:
5.1.1. Cultivo de E. coli o control de procedimiento: con el fin de obtener una solución con una concentración conocida de bacterias, se realizaron curvas de crecimiento por absorbancia y UFC en el tiempo, y se estableció una curva de calibración de Unidades Formadores de colonia (UFC)/ml vs. absorbancia (600 nm).
Para la realización de estas curvas, se empleó un cultivo de E. coli ATCC 25922
(PUJ-M-Bio-USBA-107), al cual se le realizaron dos preinóculos consecutivos en caldo nutritivo (Pronadisa, 1216) a 1/5 del volumen del recipiente a 25ºC por 24 h a 160 rpm. Del segundo preinóculo, se hizo un cultivo en caldo nutritivo a 25ºC a 160 rpm, del cual se tomaron muestras para realizar recuentos en agar nutritivo (Dibico, 1022-E) y mediciones de absorbancia en el tiempo para poder obtener la línea mejor ajuste. La curva de calibración se utilizó para conocer una abundancia específica a una absorbancia definida y utilizar esa concentración para la estandarización del conteo con DAPI.
5.1.3. Descripción del protocolo de tinción: Se utilizó el protocolo usado por Casamayor (2006) en el Centro de estudios avanzados de Blanes (CEAB), el cual está basado en el protocolo propuesto por Porter y Feig (1980), para la identificación y conteo de microbiota acuática utilizando DAPI, y en el estudio realizado por Kirchman y colaboradores (1982) en un estudio enfocado en al análisis estadístico del método de conteo directo para la enumeración bacteriana con DAPI (Figura 1).
Extracción de microorganismos
Filtración
Tinción
Acondicionamiento del filtro
Conteo
[image:35.612.245.414.230.580.2]5.1.3.1. Extracción de microorganismos: El paso inicial para el conteo directo es la extracción de los microorganismos presentes en el suelo. La estandarización de la extracción fue realizada por Latorre (2007) donde 10 g de suelo fueron colocados en 90 ml de solución salina al 0,85% p/v (grado reactivo; J.T.Baker). La mezcla fue homogenizada en un agitador orbital (I2100; New Science) a 160 rpm por 15 min y se dejó sedimentar por 5 min. Se realizaron diluciones seriadas del sobrenadante en base 10 hasta 10-6 en solución salina (0.85% p/v) previamente filtrada (GSWP04700; millipore) y esterilizada a 121oC, 15 lb de presión por 15 min.
5.1.3.2. Filtración: se colocó 1 ml de la dilución seleccionada en 9 ml de solución salina (0.85% p/v). La muestra fue mezclada por vortex y filtrada utilizando un filtro de 0,22
µm de policarbonato negro de 25 mm de diámetro (GTBP02500, Millipore) con ayuda de una bomba de vació a 25 psi (ROA-P164-AA:GAST). Finalmente el filtro se dejó secar por 20 min a temperatura ambiente antes de la tinción.
5.1.3.3. Tinción: se agregaron 100 µl de DAPI (D9542; Sigma) sobre toda la superficie
del filtro de manera homogénea con una micropipeta (la concentración y el tiempo de contacto se evaluaron en 5.1.4.2). Posteriormente, el filtro se lavó con agua MilliQ por 1 min y se enjuagó en etanol (70% v/v) por 2 s, para finalmente dejarse secar a temperatura ambiente en oscuridad por 20 min.
5.1.3.5. Conteo: Se consideró como células los óvalos, círculos y puntos definidos que mostraron una coloración azul fluorescente durante la observación. En caso de observarse un número de células por rejilla de lectura menor a 30, se leyeron 50 campos aleatorios por filtro y en caso de presentarse un número mayor de cel/campo, se leyó 20 campos aleatorios por filtro (Casamayor, 2006) (Figura 2).
Figura 2. Células coloreadas con DAPI en una muestra de suelo.
5.1.4. Modificaciones al protocolo de tinción: El incremento de la variabilidad en los conteos de microorganismos es favorecida por: la interferencia de la matriz de suelo (Schallenberg et al., 1989, Maier et al., 2001), la concentración del colorante y tiempo
el número de campos de lectura (Kirchman et al., 1982). Por esa razón en el presente
estudio se evaluaron como variables: a) el efecto de un pretratamiento realizando un prefiltrado (Maier et al., 2001) y un lavado de células, b) uso de la concentración
adecuada de DAPI, 5 µg/ml por 20 min (Schallenberg et al., 1989) y 10 µg/ml por 40
[image:38.612.135.513.243.539.2]min (Yu et al., 1995) y c) dos esquemas de conteo que se explicarán en 5.1.5.3.
(Figura 3).
Extracción de microorganismo
Filtración
Tinción
Acondicionamiento del filtro
Conteo
Figura 3. Diagrama de flujo del protocolo de tinción y las modificaciones evaluadas. A, B y C hacen referencia a los pasos evaluados para la estandarización del conteo con DAPI.
2 1 10 µg/ml x 40 min
5 µg/ml x 20 min Lavado Prefiltrado
B
Prefiltrado y lavado de células como
Esquemas de conteo A
5.1.4.1. Evaluación de un pretratamiento para eliminar interferencia de la matriz de suelo: Se evaluaron dos pretratamientos para reducir la interferencia causada por la fluorescencia de la matriz en las muestras (Figura 3):
1. Un prefiltrado de la dilución del extracto de células utilizando un filtro de fibra de vidrio de 42 mm de diámetro (2.0-8.0 µm) (AP2502500; Millipore) (Maier et al., 2001).
2. Dos lavados sucesivos de la dilución del extracto de células utilizando solución salina (0.85% p/v) por centrifugación a 13,000 rpm por 5 min. 5.1.4.2. Evaluación de la concentración de DAPI para la tinción: Se evaluaron dos concentraciones de DAPI a 5 µg/ml por 20 min (Schallenberg et al., 1989) y 10 µg/ml
por 40 min (Yu et al., 1995) para determinar la concentración óptima del colorante en
muestras de suelo.
5.1.4.3. Esquema de conteo: Se evaluaron dos esquemas de conteo para aumentar la precisión y evitar la variabilidad en cada muestra. El primer esquema consistió en obtener dos filtros de la dilución seleccionada de cada muestra, mientras que el segundo, consistió en obtener 2 filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo de un duplicado a la misma dilución (Figura 4).
Figura 4. Comparación de los esquemas de conteo de la técnica para una mayor precisión por Kirchman y colaboradores (1982), 1) dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado de la dilución.
20 ó 50 campos de lectura 2
5.1.5. Tratamientos y análisis visual de los filtros para la estandarización del protocolo de tinción: Inicialmente se utilizó el cultivo de E. coli de concentración
conocida para seleccionar los tratamientos que presentaran los mayores conteos y una muestra de suelo para seleccionar el mejor tratamiento con base en los recuentos y en el análisis visual. Cada tratamiento correspondió al conjunto de modificaciones que fueron evaluadas (Tabla 5). Para el análisis visual de los filtros se observó la disminución de los interferentes de lectura, la eliminación de la fluorescencia de fondo, la fluorescencia de las células y del borde, la nitidez del filtro y la distribución homogénea de las células en el filtro.
5.1.6. Control de calidad del conteo: Como control de calidad durante el proceso de tinción, se utilizaron 3 parámetros: la distribución homogénea de las células en el filtro de lectura, la baja fluorescencia de fondo y la definición de la tinción del borde del microorganismo. Estas características se aplicaron estrictamente a cada filtro de lectura y en caso de cumplirse, los filtros se desechaban y se repetía el proceso.
Tabla 5. Tratamientos evaluados para la estandarización del conteo con DAPI utilizando un cultivo de E. coli y las muestras de suelo.
Tratamiento Pretratamiento [DAPI] µg/ml Esquema Conteoa
1 Prefiltrado 5 1
2 Prefiltrado 5 2
3 Lavado 5 1
4 Lavado 5 2
5 Prefiltrado 10 1
6 Prefiltrado 10 2
7 Lavado 10 1
8 Lavado 10 2
a 1) Dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos filtros, uno de la
dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución.
utilizando el porcentaje del coeficiente de variación (% CV) y la exactitud comparando la concentración del control (cultivo de E. coli) con el valor obtenido durante el conteo.
Para las muestras de suelo se observaron diferencias entre los tratamientos con la prueba de Tukey-kramer (p<0.05) para escoger el que tenga los mayores conteos.
5.2. Estimación de la densidad microbiana en suelos de la ecorregión cafetera utilizando DAPI
5.2.1. Muestreo: En cada una de las coberturas seleccionadas (Tabla 6), se ubicaron aleatoriamente tres cuadrantes (2.5m x 2.5m) representativos, a por lo menos 30 m del borde, para evitar el efecto borde. Se tomó una muestra en cada vértice y del centro de los cuadrantes con un barreno de 15 cm de largo por 5 cm de diámetro en la cabeza de toma de muestras. Se obtuvo una muestra compuesta por cuadrante después de mezclar vigorosamente en un plástico de alta densidad las muestras obtenidas de todos los puntos del cuadrante. De esta mezcla, se tomaron 2 kg de suelo en una bolsa de cierre hermético la cual fue refrigerada (4-6 ºC) durante su transporte hasta el laboratorio de USBA y su posterior análisis.
5.2.2 Unidades de muestreo
5.2.2.1. Ventana La Vieja
La cuenca hidrográfica del río La Vieja sostiene una intensa actividad agropecuaria y una alta densidad poblacional, convirtiéndose en una zona importante para la preservación de los ecosistemas de la ecorregión cafetera. La cuenca está ubicada entre los departamentos de Quindío, Risaralda y Valle del Cauca con una área de ~2,925 km2. Geográficamente la cuenca está ubicada entre 4° 04´ y 4° 49´ de latitud norte y 75° 24´ y 75° 57´ de longitud oeste (CRQ et al., 2005). La cuenca del río La Vieja presenta una
gran heterogeneidad ambiental evidenciada en sus diferencias climáticas y topográficas (Tabla 7) (Díaz et al., 1996).
5.2.2.2. Ventana El Otún
La cuenca hidrográfica del río El Otún esta ubicada el departamento de Risaralda, con un área de ~67 km2, nace en el nevado de Santa Isabel y desemboca en el río Cauca. Se han encontrado bosques premontanos de alta humedad con vegetación arbórea, pastizales naturales y mejorados, y cultivos mixtos (cebolla y aromáticas) (Beltrán et al.,
[image:42.612.171.482.485.654.2]1988) (Tabla 8).
Tabla 7. Descripción general de la cuenca del río La Vieja.
Característica Descripción
clima Medio húmedo transaccional a medio seco
disposición Superficial o moderadamente profundo
composición Texturas finas o moderadamente finas
pH Moderadamente ácido
erosión Moderada a severa
Tabla 6. Sistemas productivos, coberturas y fincas seleccionadas en la cuenca del río La Vieja y El Otún.
Ventana Sistema productivo Cobertura Finca
La Vieja
Ganadería de carne
Bosque La Ilusión
Pastizal La Ramada
Guadual La Ramada
Cultivos mixtos
Guadual La Comarca
Cafetal sin sombrío El Bolsillo
Cafetal sin sombrío La Alegría
Ganadería de leche Bosque Bremen
Pastizal Villa Ximena
El Otún
Cultivos mixtos
Cebolla Macarena
Bosque Santa Helena
Cebolla Bella Vista
Guadual Mandalay
Guadual La Playa
Cultivos forestales Forestales Playa Rica
Forestales Lisbrán
Áreas protegidas Bosque La Pastora
5.2.3. Eventos de muestreo: el primer muestreo se realizó del 10 al 24 de junio de 2006 y el muestreo segundo del 14 al 21 de octubre de 2006.
5.2.4. Parámetros fisicoquímicos: se evaluó la temperatura, pH y humedad del suelo. La temperatura in situ se tomó con un termómetro de campo a 20 cm de profundidad, el
[image:43.612.133.523.114.480.2]Tabla 8. Descripción general de la cuenca del río El Otún.
Característica
Descripción
clima Medio húmedo y frío
disposición Drenados, profundos y moderadamente profundos
composición Texturas finas con alto contenido orgánico, y suelos pobres en fósforo y de poca fertilidad
pH De moderadamente ácido a extremadamente ácido.
erosión Susceptibles a procesos de erosión
Se tienen dos descripciones IVe y VIIesc2 según el IGAC para la cuenca del río La Vieja.
Fuente: Beltrán et, al. 1988.
5.3. Análisis estadístico para evaluar el efecto del sistema productivo sobre los conteos de microorganismos totales. Para evaluar el efecto del sistema productivo sobre los conteos, se utilizó una t-studen (p<0.05 o p<0.02) ó un análisis de varianza (ANOVA) (p<0.05 o p<0.02) y una prueba de Tukey-Kramer (p<0.05) según el caso.
.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo con DAPI:
6.1.1. Control de procedimiento con E. coli para el conteo directo con DAPI
Para obtener la curva de crecimiento con recuentos mayores a 1 x 1010 UFC/ml fue necesario llevar la absorbancia a rangos mayores a 1 unidad de absorbancia (UA). Para realizar la curva de las absorbancias en el tiempo, se empleó una dilución 1/40 y los valores fueron correlacionados con los recuentos para obtener la curva de calibración de absorbancia vs. recuento en placa (Figura 5) (Tabla 9).
Utilizando la ecuación de la línea de mejor ajuste
abs ml
ufc ml ufc abs
abs X
[image:45.612.174.460.447.607.2]Y =9×10−12 / × −1 +0,1909 se estableció que un cultivo a una dilución 1/40 con una absorbancia de 0.460 tendría un recuento de 1.2 x 1012.
Tabla 9. Recuentos en placa y absorbancia de E. coli en el tiempo
Tiempo (min) Recuento Abs*
0 4,45E+09 0,101
30 4,1E+09 0,138
50 4,35E+09 0,163
70 5,35E+09 0,173
90 6,5E+09 0,204
110 1,35E+10 0,307
130 2,85E+10 0,451
150 4,55E+10 0,6125
170 6,3E+10 0,792
190 8,1E+10 0,9145
6.1.2. Evaluación de los tratamientos utilizando E. coli como control de procedimiento
Durante la evaluación de los diferentes tratamientos para la estandarización de la tinción se utilizó un cultivo de E. coli a una concentración de 1.2 x 1012 UFC/ml. Se
escogieron los 4 tratamientos que tuvieron los conteos mayores, independiente de su precisión, y buscando el metodo que favoreciera la mayor recuperacion de microorganismos. De esta forma, los tratamientos 1, 3, 7 y 8 (anexos D y E) mostraron los mayores conteos indicando que la combinación de un lavado como pretratamiento y el uso de un esquema de conteo de dos filtros de la misma dilución presentaban los mayores conteos. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
1E+10 2E+10 3E+10 4E+10 5E+10 6E+10 7E+10 8E+10 9E+10
Conteo en placa (UFC/ml)
[image:46.612.122.533.312.514.2]A b so rb an ci a (6 00 n m )
Figura 5. Curva de calibración (absorbancia vs. recuento en placa) del cultivo de E. coli. Se presenta el promedio de dos valores.
En todos los tratamientos se observó que los conteos obtenidos con DAPI fueron mayores a los recuentos en placa de la curva de calibración (Tabla 10). Los principales factores que pudieron afectar los recuentos en placa pueden ser atribuidos a los errores durante la toma y homogenización de volúmenes con micropipetas y rastrillos, y de igual forma a factores fisiológicos como la concentración de nutrientes (fuente de C y
abs ml ufc ml ufc abs abs X
N) y condiciones de incubación como temperatura y concentración de oxígeno (McCaing et al., 2001; Merck, 2005).
Se observó que de los tratamientos seleccionados que presentaron mayores recuentos tenían en primer esquema de conteo (dos filtros de la misma dilución seleccionada), presentó la mayor precisión expresada como el porcentaje del coeficiente de variación (%CV) (Tabla 10). El alto recuento y la alta precisión de este esquema de conteo, permite seleccionarle como método a utilizar durante el estudio.
Tabla 10. Conteos obtenidos durante la estandarización del proceso de tinción utilizando E. coli.
Tratamientos Pretratamiento [DAPI]aµµµµg/ml Esquema conteob Cel/ml %CVc
1 Prefiltrado 5 1 3,45 x 1012 10,75
2 Prefiltrado 5 2 1,85 x 1012 6,37
3 Lavado 5 1 1,89 x 1012 11,90
4 Lavado 5 2 1,50 x 1012 22,22
5 Prefiltrado 10 1 1,64 x 1012 8,12
6 Prefiltrado 10 2 1,72 x 1012 14,45
7 Lavado 10 1 6,05 x 1012 17,24
8 Lavado 10 2 3,61 x 1012 66,73
a El tiempo de reacción para la concentración de 5 µg/ml de DAPI corresponde a 20 min y
para la concentración de 10 µg/ml es de 40 min.
b Esquemas de conteo, 1) Dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos
filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución.
c %CV = coeficiente de variación = (ds/media)
Se presenta el promedio de dos valores obtenidos.
directo, afirma que el uso de DAPI a concentraciones diferentes a 5 µg/ml genera la subestimación en los conteos. Si se tiene en cuenta que los conteos para ese tratamiento fueron altos, se pudo presentar este efecto en alguno de los filtros de las submuestras.
Con base en los resultados obtenidos del recuento con DAPI en el control de procedimiento en el presente estudio se seleccionó: 1) el prefiltrado a una concentración de 5 µg/ml por 20 minutos con el primer esquema de conteo, 2) el lavado a una concentración de 5 µg/ml por 20 minutos con el primer esquema de conteo, 3) el lavado a una concentración 10 µg/ml por 40 minutos con el primer esquema de conteo y 4) el lavado a una concentración de 10 µg/ml por 40 minutos con el segundo esquema de conteo porque presentan los mayores conteos en primera instancia y %CV menor como segunda medida.
6.2. Evaluación de los tratamientos seleccionados para la estandarización utilizando muestras de suelo
Con base en los resultados obtenidos con el control de procedimiento con E. coli de
concentración conocida, se analizaron las muestras de suelo con los tratamientos con mayores conteos.
No se observaron diferencias significativas con los diferentes tratamientos en los conteos de las muestras de suelo (ANOVA; p < 0.05; n=16). Sin embargo, se presentaron conteos mayores cuando se realizó un lavado como pretratamiento a una concentración de 5 µg/ml por 20 min y realizando un esquema de conteo de dos filtros de la misma dilución (Tabla 11).
El orden de los tratamientos que presentaron mayores recuentos en la muestra de suelo fue inverso al orden de los tratamientos que presentaron mayores recuentos con el cultivo de concentración conocida de E. coli. Los mayores conteos con E. coli se
en el tratamiento 3. Las modificaciones realizadas a estos dos tratamientos sólo difieren en la concentración de DAPI a la cual se hace la tinción, esto demuestra que la concentración varía de acuerdo a las diferentes matrices (suelo, lodos, aguas, etc). Resultados similares fueron obtenidos por Schallenberg y colaboradores (1989) quienes afirman que la concentración óptima para muestras de sedimentos es de 5 µg/ml por 20 min de DAPI y el uso de otras concentraciones puede producir la subestimación del conteo de células totales.
Tabla 11. Conteos obtenidos de los distintos tratamientos evaluados durante el proceso de estandarización utilizando una muestra de suelo
Tratamiento Pretratamiento [DAPI]a µµµµg/ml E. conteob Conteo % CVc
1 Prefiltrado 5 1
7,94 x 1011
36.02 8,05 x 1011
5,42 x 1011 3,39 x 1011
3 Lavado 5 1
5,75 x 1011
24.74 9,71 x 1011
6,11 x 1011
7,41 x 1011
7 Lavado 10 1
2,86 x 1011
47.44 7,02 x 1011
2,59 x 1011 5,15 x 1011
8 Lavado 10 2
7,20 x 1011
18.81 7,02 x 1011
5,09 x 1011 5,15 x 1011
a El tiempo de reacción para la concentración de 5 µg/ml de DAPI corresponde a 20 min y
para la concentración de 10 µg/ml es de 40 min.
b Esquemas de conteo, 1) Dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos
filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución.
c %CV = coeficiente de variación = (ds/media)
mayor al celular, la fluorescencia de fondo generada por la matriz del suelo y la fluorescencia de los residuos del DAPI. El prefiltro tiene un tamaño de poro variable de 2.0 a 8.0 µm permitiendo el paso de coloides que se pueden ver en la mayoría de los campos del microscopio; además, tiene una gran capacidad absorbente de líquidos lo que podría suponer una pérdida en la concentración celular de la muestra filtrada. Por otro lado, la fluorescencia de fondo de la matriz de la muestra se eliminó con los lavados porque las partículas permanecieron en el sobrenadante y eran descartadas en el proceso. Un estudio realizado por Bakken (1985) basado en la separación y purificación de bacterias del suelo, afirma que las partículas del suelo y material orgánico no celular luego de un proceso de centrifugación se encuentran en el sobrenadante y que el proceso es óptimo como pretratamiento en microscopía de fluorescencia, comprobando lo realizado en este estudio. Finalmente, la fluorescencia de fondo debida al uso del DAPI se eliminó eficientemente por medio de un enjuague con una solución de etanol al 70% (Casamayor, 2006).
en el que se observó definición de la fluorescencia, y disminución de interferentes y fluorescencia de fondo no fue el mejor.
Finalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el cultivo de E. coli de
concentración conocida y las muestras de suelo, se seleccionó el uso del lavado a una concentración de DAPI de 5 µg/ml por 20 min y el primer esquema de conteo que utiliza dos filtros de lectura de la misma dilución para realizar el análisis. Esta selección se basó en los mayores recuentos, la observación al microscopio y la precisión (%CV).
6.3. Conteo de microorganismos de suelo de la ecorregión cafetera utilizando DAPI Se procesaron un total de 96 muestras de suelo utilizando el protocolo seleccionado Casamayor (2006) y estandarizado con las siguientes modificaciones: un pretratamiento correspondiente a dos lavados sucesivos en solución salina (0.85% p/v) a 13,000 rpm por 5 min, tinción utilizando una concentración de 5 µg/ml por 20 min de DAPI y un esquema de conteo correspondiente a dos filtros de dilución seleccionada, de cada una de las muestras (Tabla 12) (Anexo J y K).
Se utilizaron los conteos para evaluar si las dos fincas seleccionadas por cobertura presentaban recuentos significativamente iguales. Después se analizó el efecto de las distintas coberturas, sistemas productivos, ventanas y eventos de muestreo sobre los conteos de los microorganismos edáficos.
6.3.1. Comparación de los conteos de microorganismos edáficos totales de las fincas seleccionadas para cada cobertura.
