*Unidad de Laboratorios de Ingeniería y Expresión Genéticas, De-partamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universi-dad Autónoma de Nuevo León.
L
A
REACCIÓN
EN
CADENA
DE
LA
POLIMERASA
A
DOS
DÉCADAS
DE
SU
INVENCIÓN
IRAM PABLO RODRÍGUEZ SÁNCHEZ*, HUGO A. BARRERA SALDAÑA*
P
ocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser considerados realmente revoluciona-rios. Sin embargo, cuando ocurren se transforma el modo en que se piensa y trabaja en el laboratorio.Aunque el progreso en las diferentes ramas de la ciencia parece ser lento y su evolución resulta una letanía de «paso a paso», en el caso de la biología molecular ha sucedido lo contrario. Esta disciplina ha sido afortunada con grandes cambios en tiem-pos relativamente cortos.
Una época nutrida de dichos cambios fue la dé-cada de 1970, en la que se produjo un gran núme-ro de descubrimientos, como el de las enzimas de restricción, la clonación de genes en plásmidos y fagos, y las técnicas de hibridación en filtro para ADN y ARN, conocidas como “Southern” y “Northern blot”, respectivamente; así como las invenciones de las técnicas de secuenciación química y enzimática para el ADN.1
Otro salto tecnológico ocurrió en 1983, cuando Kary Mullis (figura 1) desarrolló una nueva técnica que hizo posible la síntesis de grandes cantidades de un fragmento de ADN sin tener que clonarlo: la reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés). Esta técnica es considerada la más revolucionaria del último cuar-to del siglo XX.2 Con ésta se consigue copiar
millo-nes de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de interés representa tan sólo una diez-millonésima parte.3
Pero la PCR no es sólo una técnica exqui-sitamente específica, sino también muy sen-sible, pues en principio para practicarla basta-ría una sola molécula, por ejemplo, del geno-ma hugeno-mano (~6 pico-gramos), aunque habi-tualmente se emplean cantidades excesivas de éste (en el orden de hasta microgramos).
Además, por si es-tos atribues-tos fueran pocos, la técnica es tan robusta que puede usar como substrato para la reacción al ADN, sin
tener que purificarlo de su fuente natural, y es co-mún emplear productos biológicos diversos como tejidos embebidos en parafina, semen recuperado de escenas de violación, lavados bronquiales, exudados de mucosas, raíces de cabellos o cejas, sangre, extendidos citológicos, etc.; muchas veces basta una simple ebullición de la muestra para lisar, liberar y de paso desnaturalizar el ADN, dejándolo listo para la reacción.
¿Qué es la reacción en cadena
de la polimerasa?
La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de éste es específica-mente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su co-piado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperatu-ras de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en cues-tión de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN.3,4
La PCR es una técnica de biología molecular al-tamente específica, rápida, sensible y versátil para detectar cantidades ínfimas de un cierto ADN espe-cífico, posibilitando su fácil identificación y prescin-diendo del uso de radioisótopos, indispensables antes de su invención.
Al principio, su inventor enfrentó dos problemas fundamentales: uno era que en cada ciclo había que añadir la enzima ADN polimerasa, ya que ésta se inactivaba con las temperaturas tan altas deman-dadas para desnaturalizar el ADN y exponer las ba-ses nitrogenadas de sus nucleótidos. Otro inconve-niente era que había que hacerlo manualmente en tres baños mantenidos a las diferentes temperaturas requeridas, pasando rápidamente la muestra de un baño al otro y luego al último, repitiendo esto varias decenas de veces.5
El descubrimiento de una bacteria (Thermus aquaticus) que vive en aguas termales junto a geissers a 75°C, la cual tiene una ADN polimerasa que fun-cionaba bien a altas temperaturas (72°C) e incluso es estable a 94°C, supuso un gran avance, ya que sólo tenía que ser añadida al principio y se
mante-Fig. 2. Termociclador (Mastercycler® gradient thermal cycler).9 A estos aparatos se les atribuye junto con las ADN
polimerasas termoestables el permitir automatizar por com-pleto la PCR.
nía activa durante todo el proceso.6 Esto, junto con
el diseño de los termocicladores o aparatos que consisten en un bloque que puede ser programado para calentarse y enfriarse rápidamente en determi-nados tiempos, condujo a la automatización total del proceso (figura 2).7,8
¿Cómo funciona la PCR?
La reacción consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos: el primero consiste en la ruptura de los puen-tes de hidrógeno del ADN para desnaturalizarlo, para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95ºC, por un minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. En el segundo ocu-rre la hibridación de las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados cebadores o iniciadores (ADN sintético de hebra sencilla), a una temperatura que facilita el apareamiento de las ba-ses nitrogenadas complementarias de ambas claba-ses de ADNs. Esta temperatura depende de la tempera-tura de fusión (Tm) de los iniciadores, la cual puede calcularse mediante una fórmula (ver más adelan-te), pero generalmente oscila entre 50 y 60°C. El tercer paso se efectúa a 72ºC, temperatura a la que la polimerasa extiende la longitud de los cebadores, añadiendo los diferentes nucleótidos libres en el or-den que le va dictando la secuencia de nucleótidos de la cadena que actúa como molde10 (figura3).
¿Con qué ingredientes se practica
la reacción?
Para realizar una PCR se necesita mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia a amplificar, am-bos cebadores que se alinearán a las cadenas sim-ples del ADN, la mezcla de los cuatro desoxirribo-nucleósidos trifosfatados (dNTPs) en cantidades su-ficientes, el tampón de reacción para la polimerasa, agua ultrapura para completar el volumen final de reacción (que normalmente oscila entre 20 y 100 µl), y como ingrediente final crucial para la reac-ción, la enzima ADN polimerasa termoestable.2
Solución amortiguadora
La solución amortiguadora para la reacción se emplea, comúnmente, concentrada diez veces, y por lo general incluye Tris-HCl (pH=8.4 a temperatura ambiente), KCl, gelatina y MgCl2.
Algunos autores recomiendan el uso de adyu-vantes, los cuales en la práctica aumentan la espe-cificidad y fidelidad de la reacción, tales como el dimetilsulfóxido (DMSO) añadido para disminuir la estructura secundaria del ADN,11 detergentes como
el tween 20 o el Tritón X-100, que ayudan a estabi-lizar la enzima, y, finalmente, el polietilenglicol (PEG), el glicerol, la formamida, o la seroalbúmina bovi-na, entre otros; aunque en ningún caso estos últi-mos son imprescindibles.
Magnesio
Tanto el ión magnesio como el manganeso tienen una función crítica en la reacción, requiriéndose a una concentración que oscila regularmente entre 0.5 y 2.5 mM. La concentración de MgCl2 debe optimi-zarse para cada ensayo en particular, ya que puede tener efecto tanto en la especificidad como en el rendimiento de la reacción. En general, concentra-ciones insuficientes de Mg+2 dan lugar a bajo
rendi-miento, mientras que en exceso se obtienen amplifi-caciones inespecíficas.2
Desoxirribonucleósidos
trifosfatados (dNTPs)
Los cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y dGTP; distinguibles por sus bases nitrogenadas) son los la-drillos con los que se construyen las nuevas cadenas de ADN (figura 4).
Fig. 4. Bases nitrogenadas. Estos componentes de los nucleótidos son la clave de la especificidad del apareo de las cadenas del ADN, apareándose siempre una purina con una pirimidina
La variación en su concentración afecta la espe-cificidad y fidelidad de la reacción. Concentracio-nes altas de los mismos hacen disminuir la fidelidad con la que la polimerasa efectúa su trabajo, e inclu-so pueden llegar a inhibir su actividad. También afec-ta a la fidelidad de la reacción el uso de concentra-ciones desbalanceadas de estos cuatro ingredien-tes, siendo las concentraciones usuales, en la ma-yoría de los casos, entre 0.2 a 1 mM.
Los dNTPs pueden captar iones de magnesio por lo que las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma relación, aconse-jándose que la concentración de Mg+2 sea 0.5 a 1
mM superior a la concentración de los dNTPs.
Cebadores o iniciadores
Éstos son el componente más sensible que determi-na el éxito de un ensayo de PCR. Su longitud suele estar entre 18 y 30 nucleótidos, y su contenido en G+C entre 40-75%. La concentración a la que sue-len emplearse en una PCR está en el intervalo de 0.1-0.5 µM. Los iniciadores normalmente se dise-ñan para ser exactamente complementarios al mol-de mol-de ADN.2
Los cebadores ideales deben carecer lo más po-sible de estructuras secundarias, así como de com-plementariedad entre sí. La comcom-plementariedad en el extremo 3' induce a que ambos iniciadores se translapen en dicho extremo y sirvan de templados y a su vez de iniciadores entre sí, para que la polime-rasa los extienda y genere así pequeños amplicones referidos como dímeros de cebadores. Estos dímeros son productos cortos que se amplifican muy eficien-temente, reduciendo la cantidad de cebadores dis-ponibles en la reacción, y provocando un menor rendimiento del amplicón de interés.12
suelen usarse degenerados, y en realidad son una mezcla de cebadores de la misma longitud con cier-tas diferencias de secuencia en posiciones específi-cas, de tal forma que se abarque un intervalo am-plio de posibles secuencias blanco.13
En estos casos se debe procurar que la degene-ración sea mínima en el extremo 3', puesto que en éste, las bases desapareadas se extienden con poca eficiencia. Ambos iniciadores deben tener una tem-peratura de fusión o Tm similar y, por ende, un con-tenido semejante en G+C. La fórmula más utiliza-da para calcular la Tm de un iniciador es: Tm = (2°C) (# de A+T) + (4°C) (# de G+C). 2
La distancia que separa los sitios donde se aparean los cebadores dentro del ADN molde de-termina el tamaño del producto de amplificación. El tamaño ideal depende de la aplicación: los produc-tos largos se amplifican con menor eficiencia, mien-tras que los productos muy cortos pueden confun-dirse con dímeros de los iniciadores y limitan mucho la posibilidad de caracterizarlos posteriormente.
Existen diferentes programas computacionales que ayudan en el diseño de cebadores y calculan sus Tms, estructuras secundarias y posibles interac-ciones entre ellos.14
Los cebadores se sintetizan en el laboratorio mediante un proceso escalonado en el que se van añadiendo nucleótidos libres al extremo de la cade-na en crecimiento. El extremo 3’ del nucleótido ini-ciador de la futura cadena se fija a un soporte sóli-do como una partícula de gel de sílice. Un sintetiza-dor de ADN o «máquina de genes» realiza la síntesis en fase sólida, añadiendo paso a paso cada nucleótido en una serie de etapas (figura 5). Al final de cada ciclo de adición, la cadena en crecimiento
Fig.5. “Máquina de genes”. Actualmente existen máquinas capaces de construir cadenas nucleotídicas de tamaños que hasta hace poco serían inimaginables. Máquinas como la aquí mostrada (Oligo 1000M DNA Synthesizer)16 son las
encargadas de fabricar los oligonucleótidos utilizados du-rante la PCR.
se separa de la mezcla de reacción mediante filtra-ción o centrifugafiltra-ción. A continuafiltra-ción se repite el procedimiento para unir otro nucleótido. Se invier-ten aproximadamente 40 minutos en añadir un nucleótido a la cadena y es posible sintetizar cade-nas con una longitud de hasta 100 nucleótidos.15
Como ya se dijo, estos iniciadores no deben ser complementarios entre sí, para que no se hibriden entre ellos. Y deben flanquear los extremos de la porción de ADN que se desea amplificar, debiendo de formar puentes de hidrógeno con dicho ADN a ambos lados de la región de interés.
Diseño de los cebadores
Para la elección de los iniciadores existe una serie de normas que pueden ayudar, aunque hay que in-dicar también que existen programas de cómputo que facilitan esta tarea (ADNsis, Primer3, Oligo, etc.). Deben evitarse tramos largos de una sola base y que el extremo 3´ tenga una estructura secundaria importante. También se debe procurar en lo posible que las últimas bases del extremo sean G o C, para que le brinden mayor estabilidad al punto de inicio de la etapa de extensión.17
Como ya se dijo, se debe evitar la complemen-tariedad entre la pareja de iniciadores para minimi-zar la posibilidad de que se creen dímeros de cebadores.
Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 nucleótidos, y que éste sea similar para ambos cebadores. La temperatura de hibridación de los cebadores al molde se ajusta para que sea, cuando mucho, 5ºC menor que la temperatura calculada según la fórmula arriba citada.
Enzima
Sólo pueden utilizarse polimerasas que sean capa-ces de actuar a las altas temperaturas empleadas en la reacción. En la actualidad la mayoría de las polimerasas que se suministran comercialmente son versiones recombinantes e incluso mejoradas por ingeniería genética.18
Dos enzimas de uso muy extendido son la ADN polimerasa Taq, proveniente de la bacteria termofílica Thermus aquaticus6y la Vent de la
bac-teria Thermococcus litoralis.19 Sus temperaturas
tem-peraturas, incluso por encima de 92ºC.
De las dos enzimas señaladas, la popularidad alcanzada por la Taq rebasa por mucho y en dife-rentes aspectos a otras polimerasas. Esta enzima es una proteína que consta de una sola cadena polipeptídica con un peso molecular de aproxima-damente 95 kDa, cuenta con actividad de exonu-cleasa 5´→3´.20 Y su fidelidad de replicación
de-pende de la concentración del ión Mg+2 y de los
dNTPs, así como del que exista o no balance en la concentración de estos últimos.
Existen otras enzimas que se usan también apar-te de la Taq y la Vent, en donde se requiere activi-dad correctora para mayor fideliactivi-dad de copiado, como la Pfu, extraída originalmente de Pyrococcus furiosus21 o UlTma, proveniente de Thermotoga
maritima,22o bien, que tienen también en
determi-nadas condiciones actividad de reverso transcriptasa, lo que les permite catalizar tanto una transcripción reversa (conversión de ARN a ADN), como la pro-pia PCR, como es el caso de la enzima de Thermus thermophilus, ya fabricada por ingeniería genética y simplemente conocida como rTth.23,24
ADN
La cantidad de ADN molde puede ser de tan sólo 1 ng en el caso de material genético clonado (en virus o plásmidos), o de un mínimo de 20 ng, cuando se utiliza ADN genómico proveniente de células eucariotas. De hecho, como se ha mencionado arri-ba, el molde puede ser también ARN que sea pre-viamente transformado en ADNc mediante transcrip-ción reversa. Hay muchas formas posibles de pre-parar el molde para PCR.
En general, no es necesario purificar el molde, porque la reacción puede tolerar la presencia de impurezas, pero hay que tener mucho cuidado de eliminar, lo más posible, la presencia de inhibidores de la polimerasa, sobre todo en las muestras clíni-cas. Si el material son suspensiones celulares, pue-de ser suficiente con romper las células por calor.
Pero para la mayoría de las muestras clínicas es necesario realizar un procedimiento de extracción con fenol-cloroformo y posteriormente precipitación de ácidos nucleicos con isopropanol o etanol.
Agua
El agua se usa como solvente del resto de los ingre-dientes y se requiere al menos destilada.
Las etapas de un ciclo de reacción
Tres son los pasos a seguir y a repetir por cada ciclo de la PCR. A éstos comúnmente se les refiere como desnaturalización, alineamiento y extensión. Si de trabajar con ADN genómico se trata, regularmente se agrega una etapa previa de desnaturalización a 94°C, para relajar las posibles estructuras secunda-rias y de otros tipos. Después de concluida ésta, se repiten los diferentes ciclos en los que tanto la tem-peratura como el tiempo serán específicos del pro-ducto a amplificar y del origen del ácido nucleico que servirá, como ya se mencionó, de plantilla o molde a copiar por la polimerasa utilizada.25
Desnaturalización
El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de simple cadena que actúa como molde para la sínte-sis de su nueva cadena complementaria. Mediante un calentamiento a 94°C, el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se separen o desnaturalicen (figura 6).
Fig. 6. Desnaturalización del ADN. Los puentes se rompen dejando al ADN en forma de cadena sencilla, permitiendo así exponer las diferentes bases nitrogenadas para la hibri-dación con los oligonucleótidos cebadores.
Ésta es una etapa crítica, ya que es muy impor-tante que el ADN molde se desnaturalice completa-mente, lo que se consigue a temperaturas de 94ºC, durante por lo menos un minuto. Si la muestra tiene alto contenido de G+C, se recomienda aumentar de preferencia el tiempo.
Fig. 7. Inicio de la reacción de la PCR. Los cebadores com-plementarios que flanquean el sitio a amplificar se enlazan formando puentes de hidrógeno. De esta manera la poli-merasa puede comenzar a extenderlos para copiar ambas hebras molde.
Fig. 8. Progreso de la reacción de la PCR. A la temperatura óptima de la ADN Polimerasa Taq (72°C), la enzima agre-ga los dNTPs a partir del 5 ‘ hacia el extremo 3´.
Fig. 9. Conclusión de la PCR. Teóricamente entre más ci-clos de reacción integren el programa de amplificación, más productos idénticos se generarán. Pero al aumentar los ci-clos también se aumenta proporcionalmente la posibilidad de agregar errores en las nuevas secuencias.
Alineamiento
La enzima, como todas las ADN polimerasas, nece-sita del grupo OH- libre en el extremo 3´ del
inicia-dor ya apareado al sitio blanco de la amplificación, a partir de donde iniciar la síntesis. Este punto cons-tituye el sitio de crecimiento de la cadena comple-mentaria al molde.
Mientras que un cebador (referido como el 5´ o sentido) es complementario a la secuencia del ex-tremo 5´ de la región del ADN molde a amplificar, el otro es al extremo 3´ de la misma, pero en la cadena opuesta (figura 7).
El alineamiento específico de ambos cebadores se produce a una temperatura determinada por com-posición de bases y oscila entre 40 y 72°C. Ambas cadenas originales del ADN sirven simultáneamente como moldes para sintetizar sus respectivas cade-nas complementarias nuevas.
Un aumento de temperatura favorece la especi-ficidad, ya que disminuye las uniones incorrectas de los cebadores con sitios apócrifos del ADN molde.2
Extensión
Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en los sitios donde los iniciadores se aparean, la poli-merasa empieza a copiar la hebra, incorporando desoxirribonucleósidos monofosfatos en dirección 5´→3´ (figura 8). Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que es la que coincide con la máxima actividad de la polimerasa (72°C) para evi-tar alineamientos inespecíficos de los iniciadores.
El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación, debiendo estimar 1 min. para alar-gar 1000 nucleótidos. Es común que al finalizar
to-dos los ciclos se realice un último alargamiento por 5 min. a 72ºC, para asegurarse que todos los pro-ductos de amplificación estén completamente ter-minados y tengan, por ende, exactamente la misma longitud.2
Naturaleza exponencial de los ciclos
Al final del primer ciclo, ambas hebras de una mo-lécula bicatenaria de ADN a las que se les hayan apareado los iniciadores han sido copiadas para generar dos nuevas cadenas bicatenarias (figura 9). Cuando se repite por segunda ocasión el ciclo de tres pasos, las dos moléculas del primer ciclo se copian para producir ahora cuatro moléculas. El tercer ciclo genera ocho moléculas.
En teoría, 20 ciclos producirán aproximadamen-te un millón de copias de la molécula molde de ADN, y 30 ciclos generarán alrededor de mil millones de copias de ésta.
la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera empírica).
Es importante evitar un número alto de ciclos, ya que pueden dar lugar a la amplificación de produc-tos no deseados originados por hibridaciones ines-pecíficas.
Hay que tener en cuenta que la enzima sufre el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación del producto, reflejándose esto en que después de un número determinado de ci-clos la amplificación deja de comportarse de mane-ra exponencial, volviéndose aritmética, y finalmente llega a una fase estacionaria. Afortunadamente, cuando el efecto meseta se presenta, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utili-zación.26,27
Evolución de la técnica
La tecnología de la PCR está experimentando conti-nuas mejoras.28,29 Por ejemplo, y como ya se hizo
referencia arriba, ahora es posible utilizar eficientemente el ARN como substrato, ya que la ADN polimerasa rTth también posee actividad de retro-transcriptasa, y, por ende, convierte el ARN a ADNc, y acto seguido lo amplifica.23
Como se ha mencionado anteriormente, el ADN blanco que se va a amplificar suele tener una longi-tud máxima a las 3000 bases. Pues bien, ya es co-mún emplear la técnica de «PCR larga», capaz de amplificar secuencias de hasta 40,000 bases de lon-gitud, lo cual facilita el desarrollo de proyectos genómicos.30,31
Otro claro ejemplo de la sofisticación de esta reacción es su versión en “tiempo real”, que permite cuantificar con una alta confiabilidad la concentra-ción de hasta múltiples substratos presentes de una reacción, en virtud de que cada cadena copiada genera una señal fluorescente de longitud de onda distinta que es medida al instante por el mismo termociclador de tiempo real.32
Aplicaciones
Las aplicaciones de la PCR son múltiples, abarcando desde la evolución hasta la clínica, pasando por la genética, la biología molecular y la biotecnología; amén de aplicaciones en la agricultura y la ganadería. La PCR es especialmente útil en la detección de enfermedades genéticas tales como la fibrosis quistica,33 la hemofilia clásica34 y las distrofias
mus-culares Duchenne/Becker.35
Esta técnica ha tenido un impacto mayúsculo en la medicina forense, campo en el que se está utili-zando en investigación criminal como parte de la tecnología de la «huella digital» del ADN. Gracias a su aplicación, es posible excluir o incriminar a sos-pechosos utilizando muestras extremadamente pe-queñas de material biológico encontrado en la es-cena del crimen.36
En microbiología, la PCR permite identificar al agente infeccioso independientemente de su respues-ta serológica, lo que represenrespues-ta una gran venrespues-taja en casos donde los anticuerpos aparecen luego de un largo período de infección y a veces en forma impredecible. También en aquellos numerosos ca-sos donde se quiere distinguir si la presencia de an-ticuerpos es señal de infección antigua o activa, como ocurre ante el hallazgo de anticuerpos contra el virus de la hepatitis C, y la necesidad de precisar si el virus está presente o no.37
También es de gran utilidad en el diagnóstico de enfermedades virales neonatales, donde el diagnós-tico serológico de la infección es generalmente en-mascarado por la presencia de anticuerpos mater-nos circulantes.38
Otra de sus aplicaciones es en el estudio del com-plejo mayor de histocompatibilidad que determina los antígenos conocidos como moléculas HLA de clase II, que son las que establecen la compatibili-dad en transplante de órganos.39
La PCR permite estudiar no sólo organismos vi-vos, sino también sus restos fósiles, congelados o momificados. Incluso se puede partir de ADN de especies diferentes, y mediante el empleo de inicia-dores consenso lograr la amplificación de secuen-cias génicas de una especie cuya secuencia del gen de interés es aún desconocida.40
También puede servir para medir la expresión de un determinado gen. Para ello se extrae ARN men-sajero, se le practica una retrotranscripción con la que se obtiene un ADNc, y éste se utiliza como ma-terial de partida para la amplificación. Al partir de ARNm en vez de ADN genómico, se está estimando la expresión de un determinado gen que incluso pude llegar a realizarse de una manera semicuantitativa.41
Diagnóstico de enfermedades
hereditarias
Fig. 10. Mecanismos para el sexado y selección de embrio-nes. Mediante PCR se puede determinar el sexo de un feto e incluso de un embrión incipiente. Modificada de la imagen 6-11 de Watson JD y cols.50
o para ser utilizado como sonda en hibridaciones en filtro tipos “Southern” o “Northern”.
También mediante una simple electroforesis en gel se puede estudiar, a nivel de ADN genómico, la existencia de deleciones e inserciones en un gen determinado.42
Enfermedades cuya base es una mutación pun-tual pueden ser diagnosticadas por PCR, si luego se trata con una enzima de restricción cuyo sitio se ve afectado por dicho cambio puntual en la secuencia nucleotídica.43 Incluso, puede estudiarse a los
des-cendientes del paciente en cuestión que aún no han desarrollado la enfermedad, para ver si han here-dado la mutación responsable (portadores) de la enfermedad.
Aunque controversial por no disponer de cura, ya es posible estudiar también si un determinado gen causante de una enfermedad de la madurez está latente desde la niñez, como en el caso de la corea de Huntington,44 la enfermedad de Alzheimer,45 etc.
Diagnóstico de enfermedades
oncológicas
La PCR permite estudiar alteraciones genéticas en proto-oncogenes y en genes supresores de tumores que están involucrados en el origen de las neopla-sias.46 El seguimiento de los resultados obtenidos
con un tratamiento puede ser monitoreado median-te la demedian-tección por PCR de células malignas; es po-sible llegar a detectar hasta una célula cancerígena en 106 células normales, siendo la sensibilidad
al-canzada más que la de cualquier otra técnica.47 Esto
es ampliamente aplicado en malignidades hemato-poyéticas para la detección de enfermedad mínima residual.48
Diagnóstico prenatal
De una pequeña cantidad de sangre extraída al feto o de una biopsia de tejido placentario (vellosidades coriónicas) es posible obtener ADN sobre el cual se pueden practicar estudios como los arriba descri-tos.
En efecto, desde hace más de una década se ha venido analizando el ADN de embriones incipientes (productos de fertilización in vitro), regularmente en la etapa de mórula, para el sexado de éstos y la selección de aquellos que no porten mutaciones de enfermedades que se sabe frecuentemente en la pareja en cuestión (figura 10).49
Este análisis puede ser de gran valía para el caso de trastornos heredados ligados al cromosoma X, donde en los embriones o fetos del sexo femenino se descarta la enfermedad o en el peor de los casos se confirma la condición de portadora; mientras que en los del sexo masculino se precisa si serán sanos o afectados.51
Actualmente, este tipo de estudios se puede rea-lizar también buscando células o ADN del feto en la sangre periférica de la madre, sin la necesidad de intervenir al feto.52,53
Sin embargo, estas aplicaciones prenatales han resultado polémicas por los posibles riesgos éticos y de discriminación.
Detección de enfermedades infecciosas
Mediante PCR es posible monitorear infecciones bacterianas54 y virales.55 Los procedimientos
conven-cionales de detección se basan en la posibilidad de crecer los microorganismos en cultivo o en detectar su presencia en el paciente mediante anticuerpos. La desventaja de estos métodos es que pueden tar-dar semanas. La PCR detecta directamente los pa-tógenos tradicionalmente difíciles de cultivar, tales como Chlamidia trachomatis,56 Legionella
pneumophila57 y Mycoplasma pneumoniae.58 Así
Fig. 11. Estudios de evolución. Los fósiles encontrados se convierten en fuentes de material genético confiables para realizar estudios evolutivos a manera molecular.70
en la que muchas veces el tratamiento empírico tie-ne que iniciarse antes del diagnóstico definitivo, apoyándose hasta hace poco únicamente en el cua-dro clínico.60
Mediante el PCR es posible amplificar secuen-cias correspondientes al virus o a la bacteria de una manera específica y muy sensible, pudiendo llegar a detectar un microbio entre 106 células infectadas con
agentes infecciosos como el del SIDA,61 hepatitis B,62
tuberculosis,61 herpes,63 brucelosis,64 malaria,65 etc.
Dentro del campo del SIDA se está utilizando para el diagnóstico prenatal, y para cuantificar la carga y la actividad viral mediante la obtención de ADNc y amplificación de secuencias específicas del virus. Esto último se utiliza para dar seguimiento del éxito de los tratamientos.
Estudios de evolución molecular
La PCR ha sido utilizada para generar secuencias de genes a lo largo de la evolución y establecer el grado de relación entre especies y poder construir así árboles filogenéticos.66,67 La homología se mide
comparando cambios nucleotídicos en el mismo gen entre diferentes especies o por comparación de ge-nes mitocondriales que no se recombinan durante la meiosis y tienen un alto porcentaje de puntos de mutación. Incluso se pueden estudiar especies ex-tintas o fósiles (se ha logrado amplificar ADN de
hasta millones de años de antigüedad), extrayendo el ADN de piezas que se encuentren en los museos (figura 11). 68
También se han realizado estudios de evolución entre poblaciones humanas, llegando a la conclu-sión del origen africano de nuestra especie, gracias al estudio del ADN mitocondrial.69
Biotecnología y ciencias agropecuarias
La PCR también ha facilitado la obtención y, de paso, la modificación (vía oligonucleótidos mutagénicos) de secuencias génicas para su integración en vecto-res de expvecto-resión, dándole mayor versatilidad a las técnicas de ingeniería genética que han hecho posi-ble la biotecnología moderna.71Igualmente, es la
base de métodos para diferenciar variedades vege-tales, así como para identificar si un organismo, ya sea animal o vegetal, corresponde a uno genética-mente modificado.72
Pero quizá el mayor impacto en las ciencias agropecuarias se ha dado en el campo diagnósti-co, donde la PCR es la base de innumerables méto-dos de detección de plagas73 y parásitos.74
Finalmente, también se ha visto cómo en años recientes, métodos de PCR para determinar la “huella genética” en humanos, son ahora aplicados con éxito en el ganado.75
Recomendaciones
evitar estos falsos positivos, siempre deben tenerse en cuenta las siguientes normas: deben separarse en el espacio y en el tiempo las etapas de preampli-ficación y amplipreampli-ficación; siempre deben utilizarse testigos negativos, donde en lugar de poner ADN se substituya su volumen por agua. Además, las mues-tras deben ser analizadas -por lo menos- por dupli-cado. Jamás deben almacenarse productos de PCRs con muestras biológicas que servirán de substratos o de reactivos. Igualmente, se recomienda no usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al número de éstos.76
Los anteriores riesgos y limitaciones son el ver-dadero problema que ha impedido que la PCR se haya popularizado aún más, después de todos es-tos años, como la técnica única para muchas prue-bas de diagnóstico. Hoy por hoy existe la alta posi-bilidad de falsos positivos.
Como se puede apreciar, las aplicaciones de esta novedosa técnica parecen no tener límites, pues en esencia el proceso permite, como se ha dicho, en-contrar una aguja en un pajar, al generar un segun-do pajar lleno de copias de dicha aguja.
Resumen
La PCR, técnica inventada por Kary B. Mullis en 1983, emplea un par de oligonucleótidos para de-limitar una región de interés y una polimerasa para extenderlos, utilizando ambas hebras del gen en cuestión como plantilla. Al repetir este ciclo dece-nas de veces, se duplica cada vez el fragmento de ADN en cuestión. Así se logra copiar millones de veces la secuencia de interés, aunque se encuentre entre millones de otras secuencias de ADN. A 20 años de su invención, la PCR se cataloga como la estrella de las herramientas de la biología mole-cular. En la actualidad son innumerables las aplica-ciones de su utilización en múltiples campos de las ciencias biológicas, agropecuarias y de la salud.
Palabras clave: Taq ADN polimerasa, Oligonucleó-tidos cebadores, PCR, Amplicones.
Abstract
The PCR, a technique invented by Kary B. Mullis in 1983, uses a pair of oligonucleotides to flank a gene region of interest and a polymerase to extend them, using both strands of the gene as the template. By repeating this cycle dozens of times, the DNA
frag-ment of interest is duplicated even more. Thus, it re-sults in millions of copies of the specific DNA se-quence, even if it is part of a complex DNA mix. 20 years after its invention, the PCR is catalogued as the star tool of molecular biology. In the present time, its application in biological, farming, and health sci-ences are innumerable.
Keywords:Taq DNA polymerase, Oligonucleotide primers, PCR, Amplicons.
Agradecimientos
La presente revisión se modeló tomando en cuenta un sinnúmero de acertadas opiniones provenientes de amigos y colegas de la ULIEG, así como de los revisores de la misma, con quienes estamos agra-decidos.
Dedicatoria
Los autores desean dedicar este trabajo al profesor Robert M. Chandler Burns, como un homenaje pós-tumo por sus dos décadas de innumerables e invaluables revisiones a los manuscritos de la ULIEG para revistas internacionales.
Referencias
1. Barrera Saldaña HA. Información genética: es-tructura, función y manipulación. Conacyt, Co-lección Ciencia Básica. México. 1992.
2. Barrera Saldaña HA, Ortiz López R, Rojas Martí-nez A Reséndez Pérez D. Reacción en cadena de la polimerasa: Una nueva época dorada en la bio-logía molecular. Ciencia y Desarrollo, (Conacyt) 1993; 18 (108): 50-60.
3. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am. 1990; 262 (4): 56-61, 64-5.
4. Templeton NS. The polymerase chain reaction. History, methods, and applications. Diagn Mol Pathol. 1992; 1 (1): 58-72.
5. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986; 51 (1): 263-73. 6. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi
7. Bertrand O, Delfau MH, Garbarz M, Picat C, Devaux I, Dhermy D, Boivin P, Grandchamp B. An efficient laboratory made apparatus for DNA amplification. J Biochem Biophys Methods. 1989; 18 (3): 227-35.
8. Wittbrodt J, Erhardt W. An inexpensive and versatile computer-controlled PCR machine using a Peltier Element as a thermoelectric heat pump. Trends Genet. 1989; 5 (7): 202-3.
9. http://www.brinkmann.com/pdf/bs-manuals/ mastercycler_gradient.pdf
10. Baumforth KR, Nelson PN, Digby JE, O’Neil JD, Murray PG. Demystified ... the polymerase chain reaction. Mol Pathol. 1999; 52 (1): 1-10. 11. Pomp D, Medrano JF. Organic solvents as
facilitators of polymerase chain reaction. Biotechniques. 1991; 10 (1): 58-9.
12. Brownie J, Shawcross S, Theaker J, Whitcombe D, Ferrie R, Newton C, Little S. The elimination of pri-mer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 1997; 25 (16): 3235-41.
13. Rose TM, Schultz ER, Henikoff JG, Pietrokovski S, McCallum CM, Henikoff S. Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences. Nucleic Acids Res. 1998; 26 (7): 1628-35.
14. Gorelenkov V, Antipov A, Lejnine S, Daraselia N, Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. Biotechniques. 2001; 31 (6): 1326-30.
15. Smith M. Applications of synthetic oligodeoxyribonucleotides to problems in molecu-lar biology. Nucleic Acids Symp Ser. 1980; (7): 387-95.
16. http://www.beckmancoulter.com/Literature/ BioResearch/1793A(T).pdf
17. Henke W, Herdel K, Jung K, Schnorr D, Loening SA. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 1997; 25 (19): 3957-8.
18. Jin C, Liu H, Yang S, Zhang S. Cloning and overexpression of thermostable DNA polymerase gene in Escherichia coli. Chin J Biotechnol. 1995; 11 (3): 185-91.
19. Cariello NF, Swenberg JA, Skopek TR. Fidelity of Thermococcus litoralis DNA polymerase (Vent) in PCR determined by denaturing gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 1991; 19 (15): 4193-8.
20. Longley MJ, Bennett SE, Mosbaugh DW. Characterization of the 5' to 3' exonuclease associated with Thermus aquaticus DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 1990; 18 (24): 7317-22.
21. Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MW, Short JM, Sorge JA, Mathur EJ. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene. 1991; 108 (1): 1-6.
22. Diaz RS, Sabino EC. Accuracy of replication in the polymerase chain reaction. Comparison between Thermotoga maritima DNA polymerase and Thermus aquaticus DNA polymerase. Braz J Med Biol Res. 1998; 31 (10): 1239-42.
23. Myers TW, Gelfand DH. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry. 1991; 30 (31): 7661-6.
24. Juhasz A, Ravi S, O’Connell CD. Sensitivity of tyrosinase mRNA detection by RT-PCR: rTth DNA polymerase vs. MMLV-RT and AmpliTaq polymerase. Biotechniques. 1996; 20 (4): 592-600.
25. Vosberg HP. The polymerase chain reaction: an improved method for the analysis of nucleic acids. Hum Genet. 1989; 83 (1): 1-15.
26. Kainz P. The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochim Biophys Acta. 2000; 1494 (1-2): 23-7.
27. Morrison C, Gannon F. The impact of the PCR plateau phase on quantitative PCR. Biochim Biophys Acta. 1994; 1219 (2): 493-8.
28. Sariola H. Polymerase chain reaction—from fiction to fact and from fact to fiction. Duodecim. 1993; 109 (23-24): 2195-6.
29. Stolovitzky G, Cecchi G. Efficiency of DNA replication in the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93 (23): 12947-52. 30. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R.
Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91 (12): 5695-9.
31. Barnes WM. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91 (6): 2216-20.
32. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993; 11 (9): 1026-30.
33. Rojas Martínez A, Vázquez Alemán RM, Gustincich S, Cantu JM, Barrera Saldaña HA. Genetica mo-lecular de la fibrosis quistica: El alelo •f508 en familias mexicanas. Bol Med Hosp Infant Mx. 1992; 49 (6): 335-341.
Molecular detection or carriers of hemophilia A in Mexican families. Rev Invest Clin. 1996; 48 (2): 125-7.
35. Delgado Luengo W, Pineda Del Villar L, Borjas L, Pons H, Morales A, Martinez Basalo MC, Barrera Saldana HA. Molecular diagnosis of Duchenne/ Becker muscular dystrophy in Venezuelan patients with the polymerase chain reaction Invest Clin. 1994; 35 (4): 195-207.
36. Barrera Saldaña HA, Villalobos Torres MC, Cerda Flores R. Tras el rastro de la huella genética. CiENCiA UANL. 1999; 11; (2): 110-115. 37. Garson JA, Tedder RS, Briggs M, Tuke P,
Glazebrook JA, Trute A, Parker D, Barbara JA, Contreras M, Aloysius S. Detection of hepatitis C viral sequences in blood donations by «nested» polymerase chain reaction and prediction of infectivity. Lancet. 1990; 335 (8703): 1419-22. 38. Guatelli JC, Gingeras TR, Richman DD. Nucleic
acid amplification in vitro: detection of sequences with low copy numbers and application to diag-nosis of human immunodeficiency virus type 1 infection. Clin Microbiol Rev. 1989; 2 (2): 217-26.
39. Hao GQ, Xiao LL. The application of molecular biology techniques in HLA-typing. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2002; 10 (3): 268-72. 40. Ascacio Martínez JA, Barrera Saldaña HA. A dog
growth hormone cDNA codes for a mature protein identical to pig growth hormone. Gene. 1994; 143 (2): 277-80.
41. Schneeberger C, Eder S, Speiser P, Zeillinger R. Competitive reverse transcriptase-PCR: an improved method for determination of c-erbB-2 gene expression. Anticancer Res. 1996; 16 (2): 849-52.
42. Calleja Macias IE, Martinez Garza SG, Gallegos Rivas MC, Ortiz Lopez R, Gomez Guerra L, Barre-ra Saldana HA, Gutierrez Gutierrez AM. Y chromosome micro-deletion identification in infertile males. Ginecol Obstet Mex. 2003, 71 (1): 25-31.
43. Delgado Enciso I, Martínez Garza SG, Rojas Martinez A, Ortiz Lopez R, Bosques Padilla F, Cal-derón Garcidueñas AL, Zárate Gómez M., Barre-ra Saldaña HA. (2001). 677T mutation of the MTHFR gene in adenomas and colorectal cancer in a population sample from the Northeastern Mexico. Preliminary results. Rev Gastroenterol Mex; 66 (1): 32-7.
44. González-González MC, Trujillo MJ, Rodríguez de Alba M, García-Hoyos M, Lorda-Sánchez I, Diaz-Recasens J, Ayuso C, Ramos C. Huntington
disease-unaffected fetus diagnosed from maternal plasma using QF-PCR. Prenat Diagn. 2003; 23 (3): 232-4.
45. Nishiwaki Y, Kamino K, Yoshiiwa A, Nagano K, Takeda M, Tanabe H, Nishimura T, Kobayashi T, Yamamoto H, Nonomura Y, Yoneda H, Sakai T, Imagawa M, Miki T, Ogihara T. Mutational screening of APP gene in patients with early-onset Alzheimer disease utilizing mismatched PCR-RFLP. Clin Genet. 1996; 49 (3): 119-23.
46. Barrera Saldaña H, Martínez Garza S, Ortiz Lopez R. The molecular diagnosis of cancer. Rev Invest Clin. 2003; 55 (2): 128-37.
47. Lyons J. The polymerase chain reaction and cancer diagnostics. Cancer. 1992; 69 (6): 1527-31. 48. Mar Aguilar F, Gómez Almaguer D, Carrizales
Villareal JA, Viader Salvadó JM, Barrera Saldaña HA. Detecting residual bcr-abl transcripts in chronic myeloid leukaemia patients using coupled reverse transcriptase-polymerase chain reaction with rTth DNA polymerase. Clin Lab Haematol. 1998; 20 (4): 221-4.
49. Coutelle C, Williams C, Handyside A, Hardy K, Winston R, Williamson R. Genetic analysis of DNA from single human oocytes: a model for preimplantation diagnosis of cystic fibrosis. BMJ. 1989; 299 (6690): 22-4.
50. Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M. Recombinant DNA. Scientific American Books, W.H. Freeman y Co. New York, 1992, 2° Ed. 51. Lo YM, Patel P, Wainscoat JS, Sampietro M,
Gillmer MD, Fleming KA. Prenatal sex determination by DNA amplification from mater-nal peripheral blood. Lancet. 1989; 2 (8676): 1363-5.
52. Rijnders RJ, Christiaens GC, de Haas M, van der Schoot CE. Fetal DNA in maternal blood. Ned Tijdschr Geneeskd. 2004; 148 (4): 170-4. 53. Morales Machin A, Borjas Fajardo L, Pineda del
Villar L, Prieto Carrasquero M, González S, Gutié-rrez M, Delgado Luengo W, Alvarez F, Barrera-Saldaña H. Prenatal molecular diagnosis of cystic fibrosis. Report of 3 cases. Invest Clin. 1997; 38(3):145-53.
54. Skwark M, Nawrotek P, Czyzewska I. The detection and determination of potential virulence of Salmonella spp. using PCR method. Pol J Vet Sci. 2004; 7 (1): 33-7.
55. Telenti A, Imboden P, Germann D. Competitive polymerase chain reaction using an internal stan-dard: application to the quantitation of viral DNA. J Virol Methods. 1992; 39 (3): 259-68.
Marushko TV, Iehipko HV. Characteristics of modern diagnosis of diseases caused by Chlamydia bacteria. Lik Sprava. 2002; (7): 3-6.
57. Alexiou-Daniel S, Stylianakis A, Papoutsi A, Zorbas I, Papa A, Lambropoulos AF, Antoniadis A. Application of polymerase chain reaction for detection of Legionella pneumophila in serum samples. Clin Microbiol Infect. 1998; 4 (3): 144-148.
58. Bernet C, Garret M, de Barbeyrac B, Bebear C, Bonnet J. Detection of Mycoplasma pneumoniae by using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. 1989; 27 (11): 2492-6.
59. Sritharan V, Barker RH Jr. A simple method for diagnosing M. tuberculosis infection in clinical samples using PCR. Mol Cell Probes. 1991; 5 (5): 385-95.
60. Matsumoto T, Yamaguchi K. Rapid diagnosis of infectious diseases at the site of outpatient clinics Rinsho Byori. 2002; 50 (5): 468-73.
61. Laure F, Courgnaud V, Rouzioux C, Blanche S, Veber F, Burgard M, Jacomet C, Griscelli C, Brechot C. Detection of HIV1 DNA in infants and children by means of the polymerase chain reaction. Lancet. 1988; 2 (8610): 538-41. 62. Kaneko S, Miller RH, Di Bisceglie AM, Feinstone
SM, Hoofnagle JH, Purcell RH. Detection of hepa-titis B virus DNA in serum by polymerase chain reaction. Application for clinical diagnosis. Gastroenterology. 1990; 99 (3): 799-804. 63. Frías C, Matas L, Ferre X, Millán M, Marti S,
Her-nández A, Ausina V. Usefulness of adding multiplex nested-polymerase chain reaction assay of cerebrospinal fluid samples to routine diagnostic testing for herpesvirus encephalitis.Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001; 20 (9): 670-2. 64. Sifuentes Rincón AM, Revol A, Barrera Saldaña HA.
Detection and differentiation of the six Brucella species by polymerase chain reaction. Mol Med. 1997; 3 (11): 734-9.
65. Craig MH, Bredenkamp BL, Williams CH, Rossouw EJ, Kelly VJ, Kleinschmidt I, Martineau A, Henry GF. Field and laboratory comparative evaluation of ten rapid malaria diagnostic tests. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2002; 96 (3): 258-65.
66. Revol de Mendoza A., Esquivel Escobedo D.,
Mar-tínez Dávila I., Barrera Saldaña HA. Expansion and divergence of the GH locus between spider monkey and chimpanzee. Gene. En prensa
67. Revol de Mendoza A, Esquivel Escobedo D, San-tiago Alarcón D, Barrera Saldaña H. Independent duplication of the growth hormone gene in three anthropoidean lineages. JEG. 2001; 2: 151-159. 68. Handt O, Richards M, Trommsdorff M, Kilger C, Simanainen J, Georgiev O, Bauer K, Stone A, Hedges R, Schaffner W, et al. Molecular genetic analyses of the Tyrolean Ice Man. Science. 1994; 264 (5166): 1775-8.
69. De Benedetto G, Nasidze IS, Stenico M, Nigro L, Krings M, Lanzinger M, Vigilant L, Stoneking M, Paabo S, Barbujani G. Mitochondrial DNA sequences in prehistoric human remains from the Alps. Eur J Hum Genet. 2000; 8 (9): 669-77. 70. http://amberforsale.com/Fossil_Amber_Gallery/
Insects.htm
71. Escamilla Treviño LL, Viader Salvadó JM, Barrera Saldana HA, Guerrero Olazarán M. Biosynthesis and secretion of recombinant human growth hormone in Pichia pastoris. Biotechnology letters. 2000; 22 (2): 109-114,
72. Mendoza A, Fernández S, Cruz MA, Reséndez Pérez D, Barrera Saldaña HA. Detection of genetically modified maize food products by the polymerase chain reaction. Journal of Food and drugs Analysis. Enviado.
73. Mendoza A, Salazar C, Alvarado O, Cruz MA, Barrera HA. Molecular differentiation of weak and severe citrus tristeza virus insolates in México. Rev. Fitotec. Méx. 2003; 26 (4): 223-230
74. Rodríguez-Pérez MA, Lilley BG, Domínguez-Vázquez A, Segura-Arenas R, Lizarazo-Ortega C, Mendoza-Herrera A, Reyes-Villanueva F, Unnasch TR. Polymerase chain reaction monitoring of transmission of Onchocerca volvulus in two endemic states in México. Am J Trop Med Hyg. 2004; 70 (1): 38-45.
75. Cunningham EP, Meghen CM. Biological identification systems: genetic markers. Rev Sci Tech. 2001; 20 (2): 491-9.
