J N O M B R E
:
SOFIA DAYAN ASKENAZI.MATRICULA
:
80229223.
JCARRERA
:
INGENIERIA DEALIMENTOS.
JDIVISION
:
C B SFECHA DE I N I C I B
:
1 8
JULIO1983
/FECHA
DE
TERMUNACION:
I8
ENERO
1984
c/
HORAS
POR SEMANA IPR33MEDIO
DE25
HORAS
POR SEMANA./TUTOR
:
ING. GRACIANO CASARUBIAS,J e f e
del
depto.
d a
alimentos.
4 I T U L O ; AISLAMIENTO
BIE
CEPAS PRODUCTORAS DE VITAMINAB12.
TELEFONO
:
395-52-73
Y
395-52-19.
OBJETNO I
La
vitaminaB
es un conpuesto iniispenaable en l a dietahumana,
12
y por dato su gran importancia.
La
obtención de l a vitamina se puede lograr por procesos extractivos.de &ado de res o en su defecto de rin6n de res, a partir de aguas negras,
r e s u l t a d o ser estos dos precesos, my caros y de manor rendimiento que
un tercer proceso) e l fermntativo.
En &xico, se importa l a vitamine a pafses 8om1 Jagn, Eatadoe
Unidos,
Francia y otros,
por
l o quesi
se consiguiera encontrar alguna bacteriasobreproductora de esta vitamina, y lograrama cubrir l a d e w d a nacional
en un proyecto rentable, e l pais no depederfa ya de esta impoktacibn.
En nuestro pafs. existe una gran producci6n de suero de leche, taaibiga
se dispone de recuraos materiales y humpnos que requerirfa
el
desarrollo d eun proyecto fermantntivo para
la
producción de esta vitamina, puesto que e lsustrato de l a bacteria qhe produce l a vitamina. puede u t i l i s a r lactosa
corn fuente de carbono, e l suero de leche, que es desperdiciado en gran
cantidad, p u d e
ser
utiiisado. para éste f i n .(4)
Lis
bacterias utilieadas para l a producción dela
vitamina, son princi-palmente: pseuiomonas denitrificana y Ropionibacterium shernmnii
(4).
El
objrtivo de este trabajo es e l aislamiento de estas cepas pro-ductoras de vitamina
Biz.
sabiendo o conociendo e lmedie
de cultivoen que (Istas se desarrollan y tienen dptim producci6n de l a vitamina.
encontrando una cepa sobreproductora. ya que l o s redimlentma abtenl-
dos hasta ahera. en M6xic0, son pequeños. per l o tanto e l proyecto de
su
Por otro lado, se revisará informcidn que existe en ar-
tfculos sobre l a obtención de esta vitamina por d i o de bac-
terias, o m a por d i o de fermntación.
Es
importanteobservar
l a i.sievancia que tiene esta vitaminaen l a dieta d e l ho&re, y
por
ésto e l interes de 6U produ-cción por
medios
que sean rentables, como #e mnciona anterior-mente.
,-
I
c
I
It?I'RODiJCCION I
La
vitamina Bi2 es idispermable enla
dieta hunrna. ya quesu
auaenciaprovoca l a a n e d perniciosa, cambios neureibgicos y mntales, afecta a i
metabolism de
las
grasas. prevova des6denes en membranas, mucosas yotros
disturbies.Qufmicamnte, l a vitamina tiene dos componentes caracterfsticas I
-. a )
gl
mayori Un aiatema de anillos de corina (anilies tipo pirrol),dese dos de e l l o s directamnte y no por un meteno. CoordinPnio l e s
4
6tem
8d e l sistema anular ( 6ttomos de nitrkene) de
la
corina, existe un dtomr de-
cobalte.
b ) Un ribonuclebtklo~ e l
5.6
dimtilbeneimldazol, impsrtante ensu
s f k
tesis, que funciona c o w factor escencial en eldesplreamielrto 1.2 de un
&tom ale carbono de una mrl6cula de suatrate a
la
siguiente, acempaiiado deun desplazamiente
inverso
de algún o t r e grupo (2,i)l hidPOfile. amine. ai-quilo o carboxile. (F5gura
l )
mta
vitamina es de gran b p r t a n c i a en l a dieta d e l hombre, ya que éste ne es c a p e de sintetizarlr, y a l ne incluirse en su alimntaci6n,COW ya se mn~i0n5. puede causar graves danos a i organismo,
pues
l a vi-tamina también
funciona
COM ooenzima en reacciones e n e i d t i c a s , es escera-cia1 en l a appduraaidn y d e s a r r i l l e noriaal de los eritrocitos.
En sus caracterfsticas I f s i c a s , a temperatura ambiente,
la
vitamina esrelativatmate estable, ya que en periodos de 2 lii.8 o a veces
ads.
neexiste pérdida de actividad.
En
soluci6n acuosa se estabiliaa en unPñ
10
4.5
a5.
La
V i t 4 d . MBu
se puede obtener por proceses extractive8 de hígadoo rM6n de
res,
a partir de aguas negras o.por
un proceso ads barato queserfa e l fermentative, es decir a partir de microorganismbs.
I
I.
.I
4I.g~n.o animles
ia
pueden obtener porasdio
de su f l o r a intesti-nal,
pero
noel
hoapbre,éste
loa obtiene por medio de su alimentauidn. y10s aiieientos que
la
contienen son:la
lecho y sua derivados, enla
yema de huevo, verduras y hortalizas vedes,algas,
harinas
comla
depescade, carnero y res.
Si
l a vitamins es obtonidapor
d i o de microorganisms, observaaus quel a s concentraciones en
las
que se puede obtener, pueden ser amig variadas,pues
e l redimiente depede d e l microorganisma
u t i l i z a r ,el
medio de cul-tivo en e l que crece, condiciones de PH, .ereaci&n, tenpratura, luz, etc.
us
microorganismos en 10s que seha pr0b.d.
que poducen mayorcantidad de
la
vitamins
son; Propienibacterium ahermanii,
Repionlbac-kriyrp
fmvdeaohi,
Propionibcteriuramnelli,
PaeUdomnas denitrificansy bacterias metanegénicas
.
IPS condiciones de fermentación depeden de l a bacteria P utilíear,
pero en tdd los casos
se
requiereia
adición de c i b r t r e l o m n t u oseonda-los, 0.m e l
ion
cobalto, en conaentracioms de entre 5nylOOnos c a s o ~ e l
5.6
d h t i l b e n z i ~ a z ~ l en concentraciones entre 10 y 30%/it,
qie incrementala
prducci6nde
ia
vitaminaB
~
que~
,
es una c o b i a -mi^,
la
cianecebalamina.en a-
Para e l case específice de Ro~ionibacterium shernunii
,
que e--riasntaimnte fue con
la
bacteria que se trabajó. en cuanto a requeri-mentos de d i o de cultivo se
refiere,
se pude u t i l i z a r l a lactosa comad i o de cultivo para
la
fuente de carbono, pudiedo crecer en un d i o abase de suero de leche, subprducto de l a
idwtria
lechera, que 0010 esu t i i i z ~ i o en
un
16,
i o ¿e& Be desperdicia,por
i o que es una buenaopción
p a
utilizar. %tan bacterias gen gram positivas. bacilos. ca-talasa positiva, no forman esporas. aerovios facultativos. 6n
el
queso-
r
tidanies de
&ido
popibnico y algo de vitaairsB12.
m t i d i o s 8.b- e l d i o de cultivo matraron que, para
la
h c t e -ria
l a adiciln de d q u e l . sale0 de s d i o y calcio, producenun
docremnteen l a p r d u c c i l n de vitamin9
B
12'para
la
fermntacibn p o p i l n i c a .la
fuente de carbono podríaser
glu-cosa 0 lactosa.
Bn l a
etapa
anaeróbica d e l proceso fermntati80, eo en d o d e se formanl e s anillos de pirral, y a l no agregarse cobalto, esta biosfntesis de
vi-
tamina,
se
desvía.En
aerobiosis es d o d e se llevaa
cabola
dntesos d e l5.6
dimtilbsii~imilasol. corn Puente de ni$dgene se requiere e l ionamnto.
gl romiimiento requerido o esperPde, deber8 ser ne menor de
25
a35
mg/it, a c t u a h n t e , en d x i c o , en las investigaciones b c k s , no se
re-
basa les
15
ngllt,
l a causa es que l a bacteria no esuna
oobrepraduc-t o m de
la
vitanirs. y l e s estudios acerca de r e q u e r b n t e s y d i o decultivo son muy pocos, de l o s traba jes de investigaciln de c o d i c i e -
nee Jptimas para
la
bacteria. parala
prducciln de vitaminaBi2,
pocos sehan reaiizado con l a s cepas que existen en d x i c a ,
por
i o que sere-
quiere de estidios mis profudoo, mayores experimentes par. encontrar
a l a bacteria 6abreprductera y a i d i o de cultivo.
así
como codicie-neo lptimas de preducci6n.
Podems observar que e l medio de cultivo a utilizarse es escenciai
para l a producción de l a vitamina, por ejemplo l a adición de cobalto, en
sus diferentes
formas.
es my importante para que l a bacteria puedaproducir l a vitamina. En e l caso de RhodOWeudOnmaS sphaeroides
,
-ba un d i e de cultivo basado en propienato-acetate, obser-
vadase también l o s efectos d e l ion cebalto y/.
EO3.
en cediclonesde ocrcuridad y aer&icas. e l extracto de levadura se agrega corn
fuente de nitrbgeno. A l agregar esto en e l m d i o de cuLtivo, e l pro-
pionate y acetate,se comienzan a acumlar l a s moléculas de v i t a d m
012 dentro de
la
bacteria.La
aerobiosis y oscuridad. favorecentam-
bién a l a formación intracelular de
la
vitamina. (9)otra bacteria: RhedepseuBoPum gelatinosa, bacteria fotosin-
tJtica, fue tratada en un d i o de cultivo basado en alratdén. y a
diferencia de su crecimiento tfpico. que se realiza en presencia de
luz y aerobiosis, aquf cre suprimid l a luz, de j á d o l a en condicio-
nes
de oscuridad, agregdndesele también extracto de levadura, cobalto.a una teniparature de
38
C. e l PH se ajustó a siete.Le
cantidad. devitamina
Biz
obtenida fue de 33mg de vitaminaBiz/
g de célula.(io)
O
P.dems
observar
quelas
bacterias fotosintéticas, son ricas enla
prducci/n de vitamina812,
se observá de nuevo a l a bacteriaRhdopseudemna sphieroile
.
pues
se realiza en oscuridad y aerobiosis, per un lade, y per otro,en cedicienes de lu6 y anaerobias. .4e u t i l i z ó glutamate, e l ion
cobalto que produce
la
cebalamina. Pe observa que, l l e g a d e a unlfmite. en bacterias fotosintéticas, a mayor cantidad de cobalto,
myor prducci/n de i n vitamina. (1)
I
g
Los
reüultaios
que se obtienen, nos dicen que en condicionesanaeróbicae-
y
con luz, se encuentra l a mnyer producción de i svita-
I r L _ r P L I-.
mina.
LB
cepa que se u t i l i z ó fue=. suhereides8253
,
Ellode cultivo basado en mnlato-glutamate. aunque se obtuvieron
resul-
tados altos con otras bacterias, variando e l medie de cultivo, e l
más a l t a fue éste. (1)
.Se
ha
propuesto, quela
prduccibn dela
vitamina porla
bac-teria
E.
sphaeroides, puedeser
un coiactor escencial en e l meta-belismo d e l &ida. propi6nico. (11)
Observado los resultados; en presencia de
luz
se prducemayor
cantidad de l a vitamina que en l a oscuridad. apoyado a diferentes
resultados encontrados en otras revisiones ya mencionadas, que
girman que en codiciones de luz, l a vitamina se obtiene en mayer
c a n t i d d . ( l l )
Se
rmieatra. que en codiciones aerobias, u t i l i z a d ola
mismacepa, con luz. pero p n i e d o codicioras de oxfgeno limitadas, se
presenta
un
excelente d i o para l a prducci6n de l a vitamina (11).En
un medie de c u l t i v i , basado en cáscara de naranja y marda-rina, que son deshechf~ de i d w t r i a s , probado e experímntardo
con varias bacterias, se obtienen resultados de producción de VitAUIiiui
Biz d s
altos con l a s cepas; Prouienlbacteriuai shermaniidole Rh.doweuslombnas spbieroides
,
e l d i o de cultivo va varian-do en cantidedes y algunos compuestos, segdn las necesidades de
la
bacteria. (2),
8%ui&n-A l realizar
el
experimento enUNFI.
observ6una
prodicci6nmuy
pobre
dela
vitamina,la
bacteria que ae u t i l i z ó fue Propioni-bacterium shermnii, e l valor que sed encontrá fue de
3.6
rag decianocobaiamina/ l i t r o .
L.
que aquí sucedía principalmente y queI
I
,
..
..
afectó a l crecimiento de
ia
bacterla. ypor
l o tante a l aprdu-
cciÓj de l a vitamina, fue que e l PH se disparaba formande un
&lo
demasiado 6cFdo para que l a bacteria l o pudiera soportar.
a
d i o
de cultivo contada cobalto,
suero
deleche
(lactosa como fuentede carbono),
suero
de leche, extracto de levadura, es un meal10 decultivo en e l que
la
bacteria @fa desarroiiarse y producir l avitamina, se traba
j6
cen varias 8uatahcias buffer, parapcder
controlar e l problema d e l PH, pero
ne
funcionó, por10
tanto e lredimiento de l a vitamina fue my pequeno.
REVIFION
BIBLICGRAFICA
8c
.I
i
Fasaki y colaboradores
(99,
encuentran que en un medio de cul-tivo basado en propionato-acetato. observado los efectos d e l ion
cobalto y/o E O 3 , para l a utilización d e l propionato y l a utiliza-
ción o biosfntesis de l a vitamina
B12,
en conlicioma de oscuri-dad y aergbicas. Obtuvieron corn resultado, que a l agregar e l co-
balto y extracto de levadura a l medio b a s a l d e propionato.
exis-
t$a una acumulación de l a vitamina pmr l a bacteria, l a cepa
uti-
lizada,
=
sphaeroidesF
.
A l mezclar e l acetato y propionatoen e l medio. los dos dcidos se utilizaban simultaneamnte, acu-
mulado también intraceluiarmnte l a vitamina.
U
acumulaci6nde l a vitamina alcanzó
un
dxim
de67
mcg de vitaaunaB
/
g r decélula seca, pero regularmente l o obtenido fue de
45
a 60 mcg devitamina
B
/
gr de célula seca. se l e agregaba también a l mediobasal
1.8
gr deC
H OOOiila y.2
g r deC%-
COONa'50.
enun
l i t r o de& i o basal. Esta vitamina se encontraba en l a bacteria como own-
zima
cabalanine.Ln
determinacih del a
vitamina se realizó par medios12
12
2 5
microbiOl6giCoS.
.%saki y Nogai, en otro experimnto (10). con bacterias fotosin-
t6tiCaS. en coniiciones anaerobias y con luz,
pero
tambi6n campa-r a d 0 l a s condiciones aerobias y en oscuridad, con un medio de cul-
tivo que contenía extracto de levadura, cobalta y otras sales, a justado
l a temperatura a
38
C
yPH
de7,
extragendo l a vitamina en su formaciano y cuantificandela por
medio
microbiol6gico. se obtuvo un ren-dimient. de
33
mcg de vitamineB
/
gr de célula.O
12
Cauthen y colaboraderes. demuestran que l a s bacterias fotosin-
t&ticas son relotivarmnte ricas en l a producoidn de l a vitamina (1).
Pues pueden llegar a producir hasta lOOmcg de vitamina pese seco
.
.
4.
. I
1.
.
..
c:
r
L
,Se ebservaron
a
estas bacterias tanto en d i o oscuro y aerobio.como en anaerobiesis y luz, en un
medio
de cultivo basado en glu-tamato, cobalto (que produce a l a cobalamina); entre mayor sea l a can-
tidad de cobalto. m$or será l a produccidn de l a vitamina p r la
bacteria, particularmente en cultivos fotosint8ticos.
En
10sresul-
tados observanos que en aerobiosis y escuridad se produjo
la
mitadde l a cantidad de vitamina que en anaerebiosis y con luz. .Se observ6.
que en coniiciones de oxígeno LLmitdas, con luz y a!~aerQbioSiS, 6s
un excelente &ado para l a prducción de
la
vitamina.&I otro estudi Nagai y .%saki
(11).
llegan a priducir hasta74
nicg de vitaminaB
1
g r de célula, per d i o de l a bacteria_Reo= sphaeroides. que puede p r d u c i r l a vitamina en conliciones de os-curidad y aerobiesis. d a d o corn rendimiento
3
mcg de vitaminaB
/
g r de cglula, y se suguiere que l a vitamina es un cofactor escencial
en e l metabolism d e l ácido propibnieo. Aquí, se cambian la5 conli-
ciones a luz y anaerobiosis, concentración de oxígeno, crecimiento
de l a cglula y producción de vitamina B12.1* que obtenemos es que
la
bacteria crece tante en aerobiosis como en anaerebiosis. pera en condi-
ciones de luz, produce
mayor
cantidad dela
vitamina, de1.4 a 1.8
veeesids
en luz que en oscuridad.12
12
m g a i y Sasaki. comntan (6). que l a bacteria Rp.-o~&g~&&¿eo crece
perfectamente bien en
un
malie de cultivi basado en propiomto-acetato. en codiciones oerobias y de oscuridad, existiendo cobal-
to en e l medie y extracto de levadurr.
L.
que se ebserv6 fue que seprod* igual cantidad de Vitamina en condiciones de luz en aero-
biosis y anaerobiosis.
Bscamiila iiurtadc M r f a de Lourdes (2). prepara un medio basado
i
L.
de
la
i d u a t r i a de enlatados. se tratanias
ciscaras en un autoclavecon e n z h s o con ilcldos. para M r o l i z ~ ~ polisaciridos. se centrifuga
y 10 sobrenadadnta se diluye con
zúcares ( glucosa),
se
agregan sales y f a c t h s de crecimiente, do-p e d i e d o e l micreor~anisno a utilizar.
ia
V i ~ se ~ cuantifi- Mca por p d t d 0 8 microbiol6gicas.
En
l e sresultados
observames que l abacteria con
mayor
producciin dela
vitamina es Propionibacteriumahermanii, aiguibdoie R h o d o ~ s e U i o a ~ ~ sphasroides.
a y a deionicada para reducir a-
r.
rr
L
L
PARTE B-NTAL : . L
,.
-. ,_....
-.. r ._ I FEn
lon Laboratorios Nacionales de iomsnto &xiustrial, realicde l siguiente experimento. para 1s. obtenci6n de VitamiM 812’
Medio
de cultivo para l a prduccibn de vitaminaB12
ISuero
de lecheIatracto de levadura.
Cloruro de cobalto.
ACUO de cítrica.
.hliato de fierro.
.se preparó e l d i 0 de cultive, con e l extracto ¿e l e v d u r a y
otro con caldo de cocimiento de
maíz,
que oon dos fuentes de nitrbgeno diferentes, para observar
si
existía alguna diferencia en s iutilización. para
la
prduccibn ¿eia
vitamina.1)
un
d i e de agar en d o d o se encontrabala
bacteria Ropio-Ilibacteriun SherMtIii
,
W in.oul*un
nihtBWc d# 5OOmi.se ponen igualniente 3mtraces. ut-0 extracto de levadura y oros
3
con caldo de cocimiento demaíz.
.Se a j u s t a e lPH
a 7.0-7.5, l a temperatura de incubación es de30
o C.O
Sa
esteriliza
en un autoclave, antes de inocular a 121 C 20 min.Durante l a s promeras 72 hrs., se colocan los matraces en una
agitadora, con baÍio de agua y en
anaerobiosis.
en l a s s e g d a s 72 hrs.,se leo suministra
un
f l u j o de a i r e , c r e a d o así. codiciones ae-rebias.
f o r ~ c i 6 n de espuma se controló adiCiOMdOh antiesgumin-
Birtracción de
la
cebalamina:.
i
r'
para extraer
la
cebahmiiu de l a s células baCt%ri.iutI se pro-sigue de
la
siguionte mnerfa:Se
prepara una soluci6n de KCN a15%.
y se l e adicionan2ml
de&ata solución par cada
250
micregramis de cibalamiiu, de aquí, sesemcite a calor l a m s t r a (100'C
por 30 min.).
enbaño
de vapor.k f . e l cianuro convierte
a t d a l a c o b a ~ m i i u en cianocobaiamini que esIds
reahtente a la temperatura.Preparaci6n d e l i d c u l o para
la
v a l o r a c i h de la vitamina:.Se u t i l i z a un mioroorganismb
sensible
ala
p a e n c i a de la vita-mina,en éste cam, e l microorganism de prueba
fue
iactobaciiiwleichmmii
.
Se realiza aen un cultii. de24-48
hrs
de dad y aeinicula con &:te un tubo con 10 mi de d i o a c t o Microimculum Broth
e d r i l , se incuba de
16 a
24
hrs, a35.37.C.
de aquf, se lavan l a scélulas
3
veces, con d i o de prueba diluído y e s t é r i l , centrifu-gad. a
2000
rpmdurante 10 minutos y se r e s w p e d e n en 100ml
ded i o de prueba diiuldo y
estCril
( ~ c t oB~~
hasaymium).
Este
cultivofue
u t i i i e d o para inocular l o s tuboa con muestra..
y para realizar
la
curva tipc.-
0
SO esterilizaron a
121
c
por
5
min., se enf'rú y se inocula cadatubo con
una
gota d e l cultivo que contiene a1 microorganiami sen-s i b l e a l a presencia de
la
vitaBIIyL, se inoculo con pipetapaatern,
la
prueba se realizapu.
cuadruplioado.Para e l c.do de l a s muestra8 problema, se realisan d i l u c i c
5
ne8 de
1
entre 2x10,
y un m i l i l i t r o de cadauna
de satas dilu-ciones
sele
agreg6 a1 tubo de prueba corresp.diente. e l proceso serealiza de igual manera que l a cuma
tih.
0
Ya inoculados, 00 incuban de
16
a
24
hrs, a35-37
C.ya pasado e l
periodo
de ineubación, se agregan5
ml de agua des-t i l u l a , y se lee en e l eapectrofotóaatro a
546
nm,
a j u s t a d ola
trana-mitancia a l
lo@$,
con e l tubo que no contiene cianocobalamina.Los tubos y materiales utilizados para realizar l a prieba se me-
0
tioron previanmnte a
uh
horns a 30Qi C.& d o utilizado es
una
combinación d o l ~trohscker y ~ i n zy por l a Ii.0.A.C.
(4).
'i%cnicas para e l aislaaiontm de
la
cepa:Para
la
aegunia etapa realieada. e l aislaaLtento dela
cepa sobre-productora de
la
vitamina, ae u t i l i z ó e l mism d i o de cultivo. ylas inismas codiciones, so agregaban 200 91 d e l medio y 20 g r de
la
muestra do donde se
iba
a a i s l a rla
bacteria ( queso parmiano, d ib l e crema, panela, ado&, gruysre y leohe no pasterizada,
pues
a l dse pude encontrar l a bacteria bucada).
Ya incubados
14
hra, se traiuiferhn 10 ml de cada d i o a90 91
d e l a d i o de cultivo a base de suero de leche e s d r i l . y se espe-
r8ban
otras
14
&s. ~ ~ s p u é s sesembraba
de a d a d i o . en una caja..
. .
~.
. ~.
...
I
L
**te de
PHi
u t i l i d un reguiador de f o s f a t w :
14.3
gr de éste en un l i t r ode agua destil&ia, se toniron 100
ml
de 6sta solución y se transfi-rieron a un l i t r o de agua destila¿.. Se utiliearon despu6s dife-
rentes concentraciones d e l buffer: 1,
1.5.
2,
2.5,
3
y4.
btodología para e l reconocinientode l a cepa I
Ya que
en
e l agar #e encentrahn la#diferentes
colonias. se observa-ba cada colonia a1 micrescopio, notamio
si
eran gram positivas,se h a c b 1.
prueba
de catalasa notadosi
era pociitiva; se observeba l a f6Z.mP9 etc.
Y
a1 observar Bu9 características,si
eran las deA l correr l a
prueba
de vitamina con Sa cepa utilizada co-a
i
mo muestra, y r e a l i z a d o previamente l a curva tipo, se
40
observarque l a producción de l a vitamina fue de
3.6
ng/l de cianecobalamina._.
. ..
., .
-.
_...,
l o que es un rendimiento
muy
pobre, conparado con l a literatura, conlos experimentos realizados
por
Sasakipor
ejemplo(69,
( 9 ) ,
que aunquese realizó l a prueba con otra bacteria, se obtuvieron redimientos.
hasta diez veces d m altem. Escamilla (2), que u t i l i z a l a misma cepa,
y su redimiente es mayor. i o que sucedfa aquf, es que era otro ti-
po de medio de cultivo y ne surgieron variaciones en e l PH que pu-
dieran afectar.
A s í , que observando los msult~dos obteni*os, y conparbrdoios cen
les de la literatura podemos concluir que esta bacteria no es sobre-
productera, asf que se ~ M en a i s l a t l a de algún otro d i e y c.- Ó
rrer l a prueba.
La
etapa d e l aislamiento se realfe6 t a l como dice en e ld-
t d o , y en un principio, ya a l sembrarlas
en
placa de agar, se net6que sole aparecían colonias de levaduras y de lactebacilos, asf que se
pensó
que p d f aser
que e l PH bajera durantela
etapa de incuba-ción. a i
&ir
e l PH éstefue
de3.7,
asf que pederns entender que so.i o se encontraran lactobacilos y levaduras, remistentea a
PH
bajo.Lo
que se hizo a l observarel
problemafue
util6uar unregulador
defosfatos, a l volver a incubar. e l PH volvio a bajar a 3.8,
por
l o quese
agregó más reguledor.
pero
i o más que se pudo hacer era nodejar
bajar e l PH a mnoa de
5.4.
l o cual parala
bacteria que me quie-re a i s l a r IU es conveniente.
,
L
#-
Bn
tuid los casos solo se pudieron ebsemor los mismos alicro-organicrnos
.
De+spds se pena6 en sembrar directaaisnte Propionibacterium
s ~ u u w i ~ en
la
placa de agar y observar s i podfa crecer f á c i l -Pgnte en esto d i o . i o que sucedfó
fue
que crecid muy lentamen-t e en l a placa. .%,prob6 en agar lfquido y
su
crecimiento fuesatisiactorio
en
este& i o ,
por l o quese
tom/ como buene opciónpara
resembrar en esta etapa.En
cuanto a l probb& que se presenta cch e l PHI sepensó
quiz6 reducir
el
t i e m de incubaci6n y asf e l PH no alcamsrfaa bajar tanto, se probó de esta manera, p e ~ tampoco
dio
res&t a o .
Otra ppci6n fue l a de
ir
controlando e l PH durante l a ferisn- tación. ariruliedo amonio y c u i d d i o de no contaminar a1 abrir losmatraces para realizar esta eperacibn.
Por otro
iado.
en ios artfculos revisados notams que seha-
cen gran cantidad de estudios para lograr encontrar un d i o de
cultivo 6 p t h para
la
prducci6n de l a vitaeina, asf corn las con-diciones para lograrlo.
Los
artículos hablan de bacterias foto8int6ticas prductorasde l a vitamina, casi todos aisncionan l a imp.rtancia de l a utiliza-
ción d e l ien cobalto, para
la
fernaci6n de 1. vitamina y su m a $ wredimiente. También se mencionan conficiones de luz y aMerobiOsi8
y a l centrario. comparando l o s niveles de produccián de vitamina,
encontrando que en el primsro existe mayor rendimiento.
D e s d s de M a 6sto. podems concluir que, en e l caso d e l
experimsnto realizado en LAWT, se necesitan haoer may~res estu-
dios sobre l a s necesidades de
la
bacteria m a la 6ptilsp p r d u -cción de l a vitamina. como i o sen; e l
d i e
de cultivo, ceniicio-ne8 de aereación, PUS lub. agitación, etc.. Y en
el
casedel
aisla-
miento, se popuse anteriormente un d t o d o para e l ccntrel
del
PH,y resedmar e l agar
líquido,
para queIn
bacteria
crema ndsfácil-
I
c
BIBLINRdFLa I
1 ) Cauthen E. sally,
J.R.
Pattison, L ascelles June(1967).
Vitamina12
i n
photosynthetic bacteria and mthionine synthesis by Rhodoweu-domonasXapheroides. Biochemstry Journal 102.
774.
2) Bacamilla W t a d o . m r í a de iourdes.(1979). Screening of microor-
ganisms producing vitamin
B12
i n mediaof
mandarin-orange peel.Report research.Universidad Autónoma Metropolitana de I a t a p l a p .
3)
JeS& G.Gil
(1979).
Producción de vitamina FlI2 por fermsntacióna partir de suero de leche.. (Tesis profesional-EWC).
4)
Luna
Guido h r c o l i c i n i o(1981).
Estialio sobre l a producción de vitamina B12por
vfa fermentative a partir desuero
de leche.(Tesis
profesioaal-Em).5)
Lehninger AlbertL.
1980.
Bioqdiica. Segurda edicibn. Biiciones Omega.P k i M S I
39-35'?.
1
I
6) Nagai 9. e .%saki
K.
Vitamin B ard chloropwll productions by a12
photosynthetic bacteriam growing on propionate media. Production of Chemicals. 1
Faculty of Engenering e KirosMma University. Kiroshims, Japan.
i
8)
Rarkin-Elmer Manual. 1973. Iísthod of M i t i o m .9)
Sasaki K.,PUtsunoriH.,
NaEai S.(1978). Growth on propionate-acetateJournal of Fermentation Technology. Vol.
56,
No. i t 200...
10) % s a k i
K,
Nagai 3.(1979).
The opt- PH and tempereture f o r the a e r bbic growth of Rhodopseudonionas .@atinosa. and Vitamin Biz and ubiquinone
formation on a starch msdium. Journal
of
rermintation Technology, Vol.57,
11) .%saki K.. Nagai
P.
(1979).
Growth, vitamin Bl2 and phop0 pigmsntf o r m t i o m of .Sgrouinr on propionate msdia
d e r dark Biotechnology.
7.
201-220.e,
t
\
12) Strohecker
R.
aniM.
H.Bine.
1966.
Vitamin Assay Tested Mothods.J u s t i f i c a c i ó n y naturaleza d e l 7-oyecto:
L3
vitamina B12 *qG p u d e obtener por p r o c e r o s e x t r a c t i v o s r H i @ d o de riE6nde res o a p a r t i r de aquas negra?, estos procesos r e s u l t a n rauy caros $ de menor r e n d i v i e n t o comp-irsdos con iin proceso fermentstivo.
En México, e x i s t e gran producrT.ón de suero de leche, también disponemos de
los
recursos materisles y humanos que r e q u e r i r í a e l d e s a r r o l l o de un pro-y e o t o fermentativo para l a producci6n de ésta vitamina, y pued-to que l a bac- t e r i e que produce ésta m i s m a , n e c c s i t s como s u s t r a t o suero de leche, a l obte-
ner
d x i t o en e s t e experimento, sir podría c u b r i r l a demanda nacional de vi- taminaB
,
y no depender de l a 1mportsci6a de ésts.12
Introducoidnt
Los
prooesos fermentativos son m-dios psra obtener productos importantes pera e1 hombre: farmaoéuticos, energéticos, de consumo animal y humano.1
Por
o t r a par*e, se u t i l i z a n subproductos i m i u s t r i a l e s , deshechos agríco-las y domésticos como materia prima para fermentar, por l o t a n t o se eliminan contaminantes.
Algunos animales pueden obtener e s t a vitamina de su f l o r a i n t e s t i n a l o de l a d i e t a de oarne, para ea hombre. es indispensable que é s t a venga i n c l u í d o en
su
d i e t a , como por ejemplo: en l a leoha y sus derivsdoa, en l a yema de h e -I
1
YO,
en
verduras y h o r t a l i s a s verdes, algae, harina de pescado, oarnero, res, etc.& ausencia de esta vitamina
en
l a d i e t a d e l hombre, produce anemia pernicio-Ea, t r a s t o r n o s nerviosas: cambios n e l r o l ó g i c o s y mentales, disfunoiones endócri-
Antecedentes :
En
: 9 2 5 ,
Wipple y Robbins, descubren q u e e: h í ñ a n o de Y ? -eet?.blece a..
los
pacientes rue sufren de anemia perniciose y sospecht o r que es e l qiie dá e s t e e f e c t o . En 1948,:Ftickers :r colsi-c--.iorn? y Smith
a i s l a n c r i s t a l e s de esta. vitamina, en e l mismo ario C , ? s t l e ? J c e C I J O ?dei+$s
e x i s t e una m o p r o t e i n s de b a i o pes, moledular en e l j u p n -fst-l!io ?. l a que llama f a c t o r i n t r í n s e c o . que q n d a a la d i g e s t i ó n de est? XrltzTin:.
7l.Q E.r+::*o u n
fx-
'.
..
t a l o g r a f f a de rayos
X.
En
1955,
Dohskin y colaboradores, descubren su estruct, !Hasta
1973,
K r i e g e r y k u g h , l a s i n t e t i z a n quimicsmenti ? o r medio de unI
proceso que oonsti. de
70
pasos y e s muy,costoso.1
Los
primeros ~ > r o c e s o s fermentativos i n d u s t r i a l e slos
1levc.n ,=. cabo por me-I
d i o de estos microorganismos: Bacillus,'memtherium y Strntamyces olixacenes.
A b
a d , no s e tnnian a l t o s rendimientgs. '~
Fub esta l a aparicidn de l a s &euiIo
I n !
onas d e n i t r i f i c a n s y de' c i e r t z s especies d e l g6nero de l a 3 propionobacterias cdando s e obtuvieron rwfores rendimientos.hi oondioiones de fermentación dependen d e l microorCLnismo ?. u t i l i z a r .
la
vitaminaB
I
I
!
consta de dos componentes c a r a a t e r í s t ? c o s : P I mayor que es
un
sistema de a n i l l o s de Gorrina (an 110s t i p o pirrol).DPntro de estos a n i l l o s hayun
átomo de c o b a l t o y el menor que e s un r i b o n u c l e 6 t i ~ i c ( 5 , b dimetilbenzi-12
i
I
midazol). Por l o que l e llaman oianodobalamina.
Ahera se sabe que es necesaria
para
reacciones enein$Ticas como coenzimm:in- t e r v i e n e n enel
desplazamiento de un Btomo de hidrógeno i e s d e un átomo de carbo-no
de una mol6cula de s u s t r a t o a l s i m i e n t e , acompañado n e \in despalezsmientoinverso
de algún o t r o grupo ( h i d r o x i l o , amíno, a l q u i l o o csrboxilo).I
I
Se
ha
v i s t o que e s t a vitamina es e s c e n c i a l también para l a maduración normal Iy d e s a r r o l l o de e r i t r o c i t o s .
-
Objetivo:
~
I
I
I
Eaoontrar l a 8 condiciones 6ptimae de producci6n de v i t ? . r i n s B por medio
12
I
Hebodología:i
Se preparó un medio de c u l t i v o a base de suerc ae l e c : : e , o x t - z c t o lsvndri- ra, c l o r u r o fie cobalto, s u l f i t o d r f i e r r o h i d r z t i d o y k : i C o -ítricn.Este es un medio s e l e c t i v o prim Propioniba.cterium e . r r - n < i
.
La.;;
condicionesde c u l t i v o serán: a ) Ajustar e l
PH
a 7.0b) Una temper3tu.z-a de 30 O C en un baso con a g i t a c i ó n o s o i l z t o r i a
! c) Una etapa sna.erobia de 72 horas y o t r a aerobia de 77 horas.
Todo e s t o fue! seleccionado a p a r t i r de l a t e s i s que r e menciona en l a b i b l i o -
g r a f i a
(i).
Pars
comprobar que l o obtenido es vitamina B se c u e n t ? con unos microorga-12
nismos que
la
requieren como f a c t o r de crecimiento, y e s t o s son: L a c t o b a c i l l u sleiohnvrnii
.
I
+alero
-
Q-c.
-
-
N
B i b l i o g r a f í a :
(1) Marco L i c i n i o Luns ;u;?o,
1981,
Estudio sobre l a prc..ucci¿n devitamina B p o r v:c f e r n e n t s t i v a a P a r t i r de suero de leche 12
( T i s i s profesbonal- I P l i ENCB)
(2) Acosta
L.
José L.
y GnrcíaA.C.,
1979,
Estudio de f a c t i b i l i d a d econ6-mica y diseno de una plsnta
para
producir vitaninaB
por fermentaci6n12 ( T é s i s profesional- ENC3)
(3)
