Efecto sinérgico del aceite esencial de Corymbia citriodora “eucalipto limón” y Fluconazol contra Candida albicans

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. FACULTAD DE MEDICINA. ED. IC. TESIS. IN. A. -U. NT. ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICNA. M. Efecto sinérgico del aceite esencial de Corymbia citriodora “eucalipto limón” y. DE. Fluconazol contra Candida albicans. MEDICO CIRUJANO. CU. LT. AD. PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE:. FA. AUTORA: ASESORES:. Cabanillas Olivares, Joselyn Pamela Dra. Mejía Delgado, Elva Manuela Dr. Chávez Uceda, Tony. TRUJILLO-PERÙ 2019. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. DEDICATORIA. -U. NT. A Dios, por darme la fortaleza para culminar con éxito esta etapa y acompañarme en cada paso que doy con su amor infinito.. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. A mis padres Andrés Cabanillas y Onelia Olivares por todo el amor que me brindan, el sacrificio que realizan para poder alcanzar mis metas y su apoyo en mi formación tanto académica como humana.. FA. CU. LT. A Luis Fernando Del Río por motivarme e impulsarme a cumplir mis objetivos y brindarme su apoyo de manera incondicional.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. AGRADECIMIENTOS. IN. A. -U. NT. A la Facultad de Medicina UNT, alma mater que me acogió durante mi formación profesional y me brindó a través de mis queridos maestros grandes enseñanzas de vida para el cumplimiento de esta noble labor.. AD. DE. M. ED. IC. A mis asesores, Dra. Elva Mejía Delgado y Dr. Tony Chávez Uceda por su gran dedicación, su valioso apoyo científico y consejos que hicieron posible la realización de este trabajo. FA. CU. LT. A mis amigos, Aron Aredo y Deborah Arzani con quienes compartí experiencias inolvidables y pudimos conformar una familia a lo largo de la carrera. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ÍNDICE PÁGINA. i. NT. RESUMEN. -U. ABSTRACT. ii. INTRODUCCIÓN. II.. MATERIAL Y MÉTODO. III.. RESULTADOS. IV.. DISCUSIÓN. V.. CONCLUSIONES. 36. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 37. 1. 5. 27. 32. 45. FA. CU. ANEXOS. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. I.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. RESUMEN Objetivo: Evaluar el efecto sinérgico del aceite esencial de Corymbia citriodora (AECC) y Fluconazol contra Candida albicans. Materiales y métodos: Estudio experimental desarrollado en 3 fases. Primera fase: se evaluó la susceptibilidad de Candida albicans frente al AECC y Fluconazol mediante el método de difusión en agar. Segunda fase: se determinó. NT. la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del AECC contra Candida albicans mediante el. -U. método de macrodilución. Tercera fase: se determinó el efecto de la asociación del AECC y Fluconazol contra Candida albicans mediante los métodos de difusión en discos y “tablero. A. de ajedrez”. Resultados: Primera fase: la susceptibilidad de C. albicans frente al AECC fue. IN. de 13,1mm, 18,5mm, 23,2mm, 42,3mm al 25%, 50%, 75% y 100% respectivamente.. IC. Segunda fase: la CMI del AECC fue de 214,25 mg/mL. Tercera fase: la susceptibilidad de. ED. C. albicans frente a la asociación del AECC al 25%, 50%, 75% y 100% y Fluconazol. M. mediante difusión en discos fue de 24,6 mm, 46,8 mm, 53 mm y 68 mm respectivamente;. DE. mediante el “tablero de ajedrez”, la concentración inhibitoria fraccionaria del AECC y Fluconazol contra Candida albicans fue menor de 0,5 en todas las combinaciones realizadas.. FA. CU. LT. AD. Conclusión: El AECC tiene efecto sinérgico con Fluconazol contra Candida albicans.. Palabras clave: Sinergismo, Corymbia citriodora, fluconazol, Candida albicans. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ABSTRACT Objective: To evaluate the synergistic effect of the essential oil of Corymbia citriodora (AECC) and Fluconazole against Candida albicans. Materials and methods: Experimental study carried out in 3 phases. In the first, the susceptibility of Candida albicans against the. NT. AECC and Fluconazole was evaluated by the Kirby-Bauer agar diffusion method. In the. -U. second, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the AECC against Candida albicans was determined by the macrodilution method. In the third, the effect of the. IN. A. association between AECC and Fluconazole against Candida albicans was determined by. IC. the disk diffusion and the “chess board” methods. Results: First phase: the susceptibility of. ED. C. albicans against the AECC was 13.1mm, 18.5mm, 23.2mm, 42.3mm at 25%, 50%, 75% and 100% respectively. Second Phase: the MIC of the AECC was 214.25 mg/mL. Third. M. phase: the susceptibility of C. albicans against the association of the AECC at 25%, 50%,. DE. 75% and 100% and Fluconazole through diffusion method was 24.6 mm, 46.8 mm, 53 mm and 68 mm respectively; using the “chess board” method, the fractional inhibitory. AD. concentration of AECC and Fluconazole against Candida albicans was less than 0.5 in all. LT. combinations performed. Conclusion: The AECC has a synergistic effect with Fluconazole. FA. CU. against Candida albicans.. Key Words: Synergism, Corymbia citriodora, fluconazole, Candida albicans. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. I.. INTRODUCCIÓN. Las especies de Cándida son patógenos oportunistas considerados como causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo (1,2), lo que sumado a su creciente resistencia farmacológica (3) representaría una grave amenaza para la salud pública (4,5). Su patogenicidad se le atribuye a ciertos factores de virulencia,. NT. como la capacidad de evadir las defensas del huésped, adherencia, formación de. -U. biopelículas (en el tejido del huésped y en dispositivos médicos) y la producción de enzimas hidrolíticas (6,7).. IN. A. Dentro de las distintas especies existentes, se considera que uno de los principales. IC. y más frecuentemente aislados es Candida albicans (8,9); el cual pertenece a la. ED. microbiota humana normal ya que colonizan la cavidad oral, tracto grastrointestinal y urogenital en un 70% a más de la población (10); sin embargo, bajo ciertas. M. condiciones puede causar vaginitis, candidiasis oral, candidiasis cutánea,. DE. candidemia e infecciones sistémicas que pueden ser potencialmente mortales (10,11).. AD. Las infecciones fúngicas han mostrado un incremento significativo en las últimas. LT. dos décadas (12), siendo la candidiasis la enfermedad fúngica más frecuente. CU. alrededor del mundo (13) mientras que la candidemia es una infección que se asocia a una elevada tasa de mortalidad (11,14) y son precisamente las especies de Cándida. FA. los principales agentes causantes al presentarse en el 50-70% de las infecciones fúngicas sistémicas (13). En los países europeos, más de la mitad de los casos de la candidiasis y candidemia son causados por C. albicans (15) mientras que en Estados Unidos Candida spp. se estima como la cuarta causa de candidemia asociado a una tasa de mortalidad que oscila entre el 29% y el 76% (12).. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. En el Perú existen pocos estudios al respecto y los datos epidemiológicos son limitados; sin embargo, en el trabajo realizado por Bustamante et al (16), se afirma que la Candidiasis es una de las infecciones fúngicas más frecuentes en el Perú y estimaron que un total de 581 174 casos de enfermedades graves causadas por hongo ocurren cada año en nuestro país, lo que representa aproximadamente 1,9% de la. NT. población peruana total. Mientras que, sobre la candidemia, se ha reportado una. -U. incidencia de 1,18 casos por cada 1 000 hospitalizaciones en Lima, además de identificarse a C. albicans como la especie más frecuentemente aislada (30,4%) (17). IN. A. lo que concuerda con un trabajo realizado en nueve hospitales, también en la capital,. IC. en el que se reportó que de 153 especies del género Candida aislados que causaron. ED. candidemia, la especie aislada en mayor frecuencia (39,9%) fue C. albicans (18); por otro lado, en un estudio realizado en hospitales de Lima y Callao, se identificó. DE. M. una incidencia de candidemia por centro entre 1 y 2,6 casos por 1000 ingresos (19).. El tratamiento para la Candidiasis comprende cuatro principales clases de fármacos:. AD. los azoles, los polienos, las equinocandinas y de los análogos de pirimidina (20), el. LT. uso de estos medicamentos dependerá del tipo de infección, el sitio anatómico. CU. afectado y la sensibilidad de la especie. Entre estos agentes antifúngicos, los azoles son los fármacos preferidos y los que se utilizan con mayor frecuencia para el. FA. tratamiento de las infecciones por Cándida dentro de los cuales destaca el uso de Fluconazol debido a su eficacia contra la mayoría de especies de Cándida, su alta biodisponibilidad, bajo costo y baja toxicidad (13,20) características por las cuales se sigue utilizando como tratamiento de primera línea en la práctica médica (21,22) además de ser uno de los fármacos recomendados por la Guía de Práctica Clínica. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. para el manejo de Candidiasis realizada por la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas (23). En la actualidad se observa que el uso generalizado de antifúngicos, la prescripción no controlada de estos medicamentos como profilaxis y el aumento de sus dosis terapéuticas ha generado una disminución en su efectividad debido a la aparición de. NT. cepas resistentes (24,25). La resistencia de las especies de C. albicans frente a. -U. fluconazol es cercana al 3%, este porcentaje aumenta hasta en 9,5% en pacientes con VIH (26). En el Perú se ha reportado que la resistencia a fluconazol es de. IN. A. aproximadamente 13%. (19). Esta realidad hace que la terapéutica contra las. IC. infecciones por Cándida sea un reto en el cual es necesario generar nuevas. ED. estrategias para combatirla, como el uso de productos naturales que ayuden a efectivizar los tratamientos actuales, disminuir la toxicidad y la resistencia a los. M. fármacos.. DE. Una de las plantas más empleadas tradicionalmente para el tratamiento de diversas enfermedades es Corymbia citriodora debido a que se le atribuyen propiedades. AD. analgésicas y antiinflamatorias (27,28), actividad antioxidante (29), actividad. LT. antibacterial incluso contra patógenos bacterianos multidrogo resistentes (30,31),. CU. antiviral (32), antifúngica (33–36), entre otras. Esta última propiedad ha venido siendo estudiada y se conoce que el aceite esencial de C. citriodora muestra eficacia. FA. como agente antifúngico (37–39), su actividad antimicótica está relacionada con su. composición química siendo sus principales componentes bioactivos: citronelal,. citronelol e isopulegol (37,40). Dentro de su espectro antimicrobiano destaca su actividad contra Candida albicans (38) siendo ésta superior que en otras especies de Eucalipto (41,42).. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. La combinación de los fitoconstituyentes de C. citriodora con medicamentos como el fluconazol aún no ha sido estudiada; sin embargo, ésta significaría una tentativa estrategia terapéutica para maximizar su efecto antimicótico, disminuir dosis y la creciente resistencia a este fármaco. La falta de información acerca de esta asociación motivó a realizar el presente estudio que tiene como objetivo evaluar el. NT. efecto sinérgico del aceite esencial de Corymbia citriodora “eucalipto limón” y. -U. fluconazol contra Candida albicans; además se pretende motivar a la comunidad científica a realizar más trabajos al respecto que permitan más adelante asegurar el. IN. A. uso de un producto económico y de fácil adquisición como parte del tratamiento. 1.1. ED. IC. adyuvante de las infecciones por C. albicans.. PROBLEMA. M. ¿Cuál es el efecto del aceite esencial de Corymbia citriodora “eucalipto limón” y. HIPÓTESIS. AD. 1.2. DE. Fluconazol contra Candida albicans?. El aceite esencial de Corymbia citriodora “eucalipto limón” y Fluconazol tiene. CU. LT. efecto sinérgico contra Candida albicans.. OBJETIVOS. FA. 1.3. OBJETIVO GENERAL. . Evaluar el efecto sinérgico del aceite esencial de Corymbia citriodora “eucalipto limón” y Fluconazol contra Candida albicans.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. OBJETIVOS ESPECÍFICOS . Determinar la susceptibilidad de Candida albicans frente a distintas concentraciones del aceite esencial de Corymbia citriodora mediante la técnica de Kirby - Bauer.. . Determinar la susceptibilidad de Candida albicans frente a Fluconazol. Determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de. -U. . NT. mediante la técnica de Kirby Bauer.. Corymbia citriodora contra Candida albicans mediante la técnica de. IN. Determinar la susceptibilidad de Candida albicans frente a la asociación del. IC. . A. macrodilución.. difusión en discos.. Determinar la concentración inhibitoria fraccionaria del aceite esencial de. M. . ED. aceite esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol mediante el método de. DE. Corymbia citriodora y Fluconazol contra Candida albicans mediante la. FA. CU. LT. AD. técnica de “tablero de ajedrez”.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. II.. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1 MATERIAL  Material Biológico: Cepa salvaje de Candida albicans obtenida del laboratorio de Microbiología. NT. de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. -U.  Material Botánico:. IN. de la Universidad Nacional de Trujillo.. de. Fluconazol. ED. inyectable. IC.  Material Farmacéutico: Solución. A. Las hojas frescas de Corymbia citriodora fueron obtenidas del jardín botánico. 200mg/100mL,. fabricado. por. M. VITROFARMA S.A, lote n° S180110, con registro sanitario n° EE-00274,. -. Criterios de inclusión. AD. 2.1.1. DE. adquirido en una farmacia de la ciudad de Trujillo.. Placas sembradas con Candida albicans y con las concentraciones. LT. correspondientes del aceite esencial de Corymbia citriodora. CU. 2.1.2. FA. -. Criterios de exclusión. Placas que presenten algún tipo de deterioro o daño en su estructura durante el proceso de incubación.. -. Placas que tras el proceso de incubación evidencien contaminación por otros agentes distintos a Candida albicans.. 2.2 Muestra 2.2.1. Unidad de análisis. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. -. Halos de las repeticiones para cada concentración del aceite esencial de Corymbia citriodora, Fluconazol y la asociación de ambos realizadas en placas Petri. 2.2.2. -. Unidad de muestreo. Colonias formadas en cada una de las repeticiones para cada. NT. concentración del aceite esencial de Corymbia citriodora, Fluconazol. 2.2.3. -U. y la asociación de ambos realizadas en placas Petri. Tamaño muestral. IN. A. El cálculo del número de repeticiones se determinó aplicando la. ED. IC. siguiente fórmula que corresponde a estudios de diseño experimental:. ̅̅̅2 ) ̅1 − 𝑥 (𝑥. 2. 2. DE. M. 𝑛=. (𝑍𝛼⁄2 + 𝑍β ) ² 2 𝑆. Donde:. AD. n = Número de repeticiones necesitados en cada uno de los. LT. tratamientos 𝒁𝜶⁄ = 1,96 para un 𝜶 =0,05. FA. CU. 𝟐. Zβ = 0,84 para un β= 0,20 ̅̅̅1 − ̅̅̅) 𝑥2 valor asumido por no haber estudios similares S= 0,8 (𝑥 Reemplazando en la fórmula tenemos: n = 10 Se realizaron 10 repeticiones para cada tratamiento. 2.3 MÉTODO 2.3.1 Diseño de estudio 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. El presente es un estudio experimental cuyo diseño se realizó en 3 fases: Fase 1: Evaluación la susceptibilidad de Candida albicans frente al Aceite Esencial de Corymbia citriodora (AECC) y Fluconazol. Para ello se realizó el método de difusión en agar de Kirby-Bauer A) Método de disco de difusión: Se utilizaron discos embebidos con. NT. cada concentración del aceite esencial de Corymbia citriodora. -U. (25%, 50%, 75% y 100%) y discos con Fluconazol: hallándose la medida de los halos de inhibición. Se realizaron 10 repeticiones por. IC. IN. A. cada tratamiento.. ED. Fase 2: Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del Aceite Esencial de Corymbia citriodora contra Candida albicans. M. B) Método de macrodilución: Se usó el método de macrodilución,. DE. método cuantitativo para determinar la CMI de un agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento de los microorganismos in. LT. AD. vitro.. CU. Fase 3: Determinación del efecto de la asociación del AECC y Fluconazol. FA. contra Candida albicans. C) Método de discos de difusión: Se evaluaron las zonas de inhibición del crecimiento de Candida albicans generadas por la asociación de los discos embebidos con AECC y Fluconazol, determinando como sinergismo la presencia de una zona de inhibición “puente” cerca de. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. la unión de ambas zonas o el aumento de la inhibición del crecimiento debido a los efectos combinados de ambos.. D) Método de tablero de ajedrez: Se realizaron combinaciones de las diluciones tanto del AECC como de fluconazol, a modo de un tablero. NT. de 4x4, donde cada casilla quedó representada por un tubo de ensayo.. -U. Luego se procedió a incubar los 16 tubos a 37º C durante 48 horas. Pasado este tiempo se determinó la concentración mínima inhibitoria. IN. A. a través de la observación de la turbidez en los tubos y su verificación. ED. espectrofotómetro.. IC. a través de las lecturas del nivel de absorbancia dadas por el. Tipo de Variable. Aceite esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol. Independiente Cuantitativa Continua. Escala. DE. Variable. M. 2.3.2 Operacionalización de variables. Nominal. -Concentraciones del AECC al 25%, 50%, 75% y 100% -. AD. -Discos fluconazol. Nominal. con. Sí. No. -Halos de inhibición nominal formados independientemente.(43) -Halo de inhibición truncado junto de las dos zonas.(43) -Concentración inhibitoria fraccionada CIF > 0,5. (43). Dependiente Cualitativa Dicotómica. Nominal. impregnados. -Aumento del halo de inhibición. (43) -Formación de un puente de inhibición entre las dos zonas de inhibición.(43) -Concentración inhibitoria fraccionada CIF≤ 0,5. (43). LT CU. FA. Efecto sinérgico del aceite esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol contra Candida albicans. Indicador. Categoría. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.3.3 Definición operacional de variables . Aceite esencial de Corymbia citriodora Es el aceite obtenido mediante el método de destilación por arrastre de vapor, que contiene principios activos de la planta, preparado a concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100%.. . NT. Solución de Fluconazol. -U. Fluconazol de presentación inyectable (200mg/100ml). . Efecto antimicótico in vitro contra Candida albicans. IN. A. Capacidad para inhibir el crecimiento o producir la muerte del hongo. IC. en condiciones experimentales . ED. Susceptibilidad: Determina la cantidad de droga que se requiere para matar o inhibir el crecimiento de un microorganismo patógeno. (44). . M. Halo de inhibición. DE. Zona alrededor del disco donde una sustancia antimicótica es capaz. AD. de impedir el crecimiento del hongo al cabo de 48 horas de incubación. Se utilizará como medida los diámetros de estas zonas en. LT. mm, según la escala de Duraffourd.(44). FA. CU. a) Para demostrar la susceptibilidad de las cepas de Candida albicans al aceite esencial de Corymbia citriodora se utilizó la escala de Duraffourd, la cual es usada para determinar cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro, según diámetro de inhibición de crecimiento fúngico.(44)  Nula (-) para un diámetro inferior a 8 mm.  Sensibilidad límite (sensible = +) para un diámetro comprendido entre 8 a 14 mm. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT.  Medio (muy sensible = ++) para un diámetro entre 14 y 20 mm.  Sumamente sensible (+++) para un diámetro superior a 20 mm. . Concentración inhibitoria mínima (CIM): concentración más baja. después. de. incubación. estandarizadas. . bajo. condiciones. -U. microorganismo. NT. del agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un. IN. A. Efecto sinérgico: Cuando el efecto combinado es mayor que la suma. IC. de los efectos individuales.(46) . ED. Método de “Tablero de ajedrez”:. Técnica más utilizada para evaluar las asociación de fármacos.. M. Consiste en la utilización de múltiples diluciones de dos agentes. DE. antimicrobianos que se estén probando. Para esto se hace uso de la Concentración inhibitoria fraccionada (CIF) (46). AD.  Sinergismo: Si se tiene una CIF ≤ 0.5. CU. LT.  No sinergismo: Si se tiene una CIF > 0.5. FA. 2.3.4 Procedimiento 2.3.4.1 Recolección e identificación taxonómica La especie de Corymbia citriodora fue recolectada del jardín botánico de la Universidad Nacional de Trujillo, del distrito de Trujillo, provincia de Trujillo, región La Libertad. Luego fue identificada en el Herbarium Truxillense para su autentificación y verificación taxonómica según el sistema filogenético de la especie. (Anexo N°1). 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.3.4.2 Extracción del aceite esencial La extracción del aceite esencial, se realizó. por el método de. “hidrodestilación”.(38,47) Se seleccionaron las hojas que se encontraban en buenas condiciones y. NT. se desechó aquellas que tenían hongos y estén decoloradas o maltratadas.. -U. (Anexo N°2). Luego las hojas de eucalipto se lavaron con agua de caño y en seguida se. IN. A. desinfectó con hipoclorito de sodio al 0.5%. Posteriormente se realizó. ED. los residuos de hipoclorito.. IC. un enjuague de la planta con suficiente agua destilada estéril para retirar. Se armó el equipo de destilación, sometiendo las muestras a una corriente. M. de vapor de agua sobrecalentada, arrastrando la esencia que. DE. posteriormente por acción del refrigerante, fue condensada. El destilado se separaró tomando en cuenta sus propiedades de inmiscibilidad y. AD. diferencia de densidades entre el agua y el aceite esencial, para lo cual se. LT. utilizó una pera de separación de vidrio, deshidratándose las impurezas. CU. de agua en el aceite esencial con sulfato de sodio anhidro. Finalmente se. FA. filtró, y se guardó los aceites en frascos de vidrio color ámbar (para evitar. la descomposición por la luz) y bajo refrigeración a una temperatura entre 4°C a 8°C, hasta que se realizó el análisis microbiológico. (Anexo N°3). 2.3.4.3 Preparación de las diferentes concentraciones de los aceites esenciales Se prepararon las concentraciones según la siguiente tabla (Anexo N°4):. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Volumen de aceite 2,5 mL. Volumen de Tween 80 7,5 mL. Volumen final 10 mL. Concentración (%) 25. 5,0 mL. 5,0 mL. 10 mL. 50. 7,5 mL. 2,5 mL. 10 mL. 75. 10 mL. -. 10 mL. 100. NT. 2.3.4.4 Preparación de la cepa. -U. Las cepas de Candida albicans se cultivaron en tubos de ensayo con tapa rosca a 25°C por 48 horas en medio Agar Sabouraud dextrosa 2% con el. A. fin de obtener colonias jóvenes.. IN. 2.3.4.5 Preparación del inóculo. IC. Las cepas de Candida albicans fueron diluidas con solución salina hasta. ED. obtener una suspensión semejante a la turbidez del tubo N° 0,5 de. M. MacFarland (suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez).. DE. Luego de preparado el patrón de turbidez se distribuyó en tubos de ensayo (4 a 6 ml por cada tubo, la turbidez corresponde a 1.5 x 108. AD. UFC/mL) que posteriormente fueron incubados a 37° C durante 4 a 6. CU. LT. horas y protegidos de la luz.(48). FA. 2.3.4.6 Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana La susceptibilidad al aceite esencial del C. citriodora se probó mediante los métodos de difusión con discos de Kirby-Bauer y de macrodilución en caldo, siguiendo las recomendaciones del Comité Nacional de Estándares Clínicos de Laboratorio (NCCLS-National Committee for Clinical Laboratory Standards) (43). 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. A. Determinación de la susceptibilidad de Candida albicans frente al aceite esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol a través del método por difusión con discos de Kirby-Bauer 1. Se sembraron las cepas de Candida albicans en placas Petri con agar. NT. Müller Hinton con 2% de glucosa haciendo uso de un hisopo estéril, el cual fue previamente embebido en el tubo del cultivo preparado. El. -U. hisopado se realizó sin dejar superficie libre en el agar, rotando la. A. placa 60° por cada vez y pasándolo por la periferia del agar para. IN. conseguir una siembra uniforme. (Anexo N°5). IC. 2. Se prepararon discos de papel filtro estériles y se sumergieron 10. ED. discos en aceite esencial de Corymbia citriodora por cada una de las. M. concentraciones durante una hora. Se utilizaron discos con Fluconazol como control positivo y discos estériles embebidos en Tween 80 como. DE. control negativo.. AD. 3. Pasada la hora, se colocaron los discos con una aguja estéril sobre los cultivos de Candida albicans. Se colocó 1 disco por placa de agar.. LT. Posteriormente las placas se incubaron a 37°C durante 48 horas.. FA. CU. 4. La lectura de resultados se realizó pasadas las 48 horas. Se medió con una regla milimetrada los halos de inhibición, incluyendo el área del disco de papel filtro, procediéndose de igual manera con los controles (Anexo N°6 y 7). La lectura de los halos de inhibición producidos se medió en milímetros tomando en cuenta la escala de Duraffourd (44).. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. diámetro inferior a 8 mm.. Nula (-). límite diámetro comprendido entre. Sensibilidad. 8 a 14 mm. (sensible = +). NT. Medio (muy sensible = ++) diámetro entre 14 y 20 mm. sensible diámetro superior a 20 mm. -U. Sumamente. IN. A. (+++). ≥19mm. 15-18mm. ≤14mm. DE. M. Fluconazol. Sensible Dosis Dependiente Resistente. ED. Antifúngico Sensible. IC. Halos de inhibición referenciales NCCLS (49). B. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria del AECC. AD. (CMI). LT. Se colocaron en cuatro tubos estériles 0.8 mL de cada una de las. CU. concentraciones de aceite esencial (25%; 50%; 75% y 100%) y se inoculó. FA. 0.2 mL del microorganismo (Candida albicans en concentraciones semejantes al tubo 0.5 de la escala de MacFarland) en cada uno de los tubos correspondientes, además se agregaron dos tubos control, uno con Fluconazol y otro sin tratamiento (Anexo N°8). Se mezcló y uniformizó el contenido de los tubos y se procedió a incubarlos a 37ºC durante 48 horas. Después de este periodo de incubación se observó la presencia de turbidez, el tubo con la menor. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. concentración que no tuvo turbidez se consideró como la CMI. Así mismo, se procedió a realizar lecturas del nivel de absorbancia de cada uno de los tubos en el espectrofotómetro para determinar el nivel de turbidez y corroborar la CMI. Para determinar las cuentas viables se tomó 0.1ml de cada tubo y se. NT. colocaron en placas Petri con agar Sabouraud para luego ser estriado con. -U. el asa de Drigalsky (Anexo N°9). Estas placas estriadas fueron incubadas a temperatura de 37ºC durante 48 horas. Luego de este periodo de. IN. A. incubación se examinaron las placas y se registraron el número de. IC. colonias. La CMI del aceite esencial de Corymbia citriodora quedó. ED. definida como la concentración donde se registró el menor número de colonias observables. (Anexo N°10). M. Se realizó el conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC). DE. empleando la siguiente fórmula: UFC= N/4 x A x D. LT. AD. N= número de colonias; A= Área; D= Dilución. CU. C. Evaluación de la asociación del aceite esencial de Corymbia citriodora. FA. y fluconazol mediante el método de difusión en disco 1. Preparación de los discos Se embebieron los discos estériles (papel filtro de 6 mm de diámetro) con cada concentración del aceite esencial (25%, 50%, 75% y 100%) y se dejaron en reposo durante 1 hora. Por otro lado, se tuvieron los discos de Fluconazol listos para su uso. Todos los discos se mantuvieron en condiciones ideales y a la misma temperatura. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2. Preparación del inóculo Las cepas de Candida albicans fueron diluidas con solución salina hasta obtener una suspensión semejante a la turbidez del tubo N° 0,5 de MacFarland 3. Inoculación en las placas con agar. -U. - Se colocó un hisopo estéril en el inóculo.. NT. Luego de haber ajustado la turbidez de la suspensión del inóculo:. - Se eliminó el exceso del inóculo presionando el hisopo contra la. IN. A. pared del tubo por encima del líquido.. IC. - Se realizó una distribución uniforme al frotar sobre toda la. ED. superficie del agar por tres veces, girando la placa aproximadamente 60º. M. - Se dejó la placa inoculada en reposo durante 15 minutos, antes de. DE. aplicar los discos.. 4. Aplicación de los discos en las placas de agar inoculadas. AD. Con una pinza estéril se colocaron los discos separados por una. LT. distancia mayor o igual a la suma de los radios de los halos de. FA. CU. inhibición obtenidos con Fluconazol y el aceite esencial de Corymbia citriodora (25%, 50%, 75% y 100%) ensayados por separado. Se presionó cada disco para asegurar el contacto completo con la superficie del agar.. 5. Incubación Se colocaron las placas con tapas hacia abajo y se incubaron a 37ºC durante 48h. 6. Lectura de placas. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Se realizó la lectura de las placas con crecimiento uniforme, observándose la interfaz de las zonas de inhibición. (Anexo N° 11) 7. Interpretación de resultados  Sinergismo: zona de inhibición “puente” cerca de la unión de. a los efectos combinados de ambos.. NT. ambas zonas o aumento de inhibición del crecimiento debido. -U.  No sinergismo: Será considerado cuando los dos círculos permanezcan independientes o exista truncamiento en el lugar. IN. A. de unión de ambas zonas de inhibición.. IC. D. Evaluación de la asociación del AECC con Fluconazol mediante el. ED. método de “tablero de ajedrez”. M. El nombre de este método hace referencia a que los tubos que se utilizan forman un tablero (como el del ajedrez) donde hay diluciones tanto del. DE. AECC como de Fluconazol en concentraciones inferiores al CMI de cada. AD. uno de ellos. De esta manera quedan representadas las combinaciones de las diluciones de los ambos antimicrobianos para evaluar el efecto de su. LT. asociación frente a Candida albicans.. CU. La disposición del eje horizontal y vertical se realizó de la siguiente. FA. manera:. -. En el eje horizontal se colocaron las diluciones de fluconazol en las siguientes concentraciones: 0,125; 0,25; 0,50 y 1 veces su CMI. -. En el eje vertical se colocaron las diluciones para el AECC en las siguientes concentraciones: 0,125; 0,25; 0,50 y 1 veces su CMI.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Posteriormente se realizó el método de macrodilución en caldo en la que cada casilla quedó representada por un tubo que contenía un volumen final de 2 ml distribuido de la siguiente manera: -. Se añadieron 0,25 ml de fluconazol, 0,25 ml del AECC, 1 ml del. NT. inóculo (suspensiones del 0.5 de la escala de MacFarland) y 0,5 ml de caldo glucosado. -U. 1) Preparación de las distintas concentraciones del AECC. A. Ya que las concentraciones necesarias del AECC son 0,125;. IN. 0,25; 0,50 y 1 veces su CMI, siendo su CMI la concentración al. IC. 25%, las concentraciones finales necesarias fueron 3,125%,. Preparación del AECC al 3,125%. M. . ED. 6,25%, 12,5% y 25% respectivamente. (Anexo N°12). Se tomó 0,125 mL del AECC al 100% y se mezcló con 3,875 mL. Preparación del AECC al 6,25%. AD. . DE. de Tween80.. Se tomó 0,25 mL del AECC al 100% y se mezcló con 3,75 mL. FA. CU. LT. de Tween80.. . Preparación del AECC al 12,5% Se tomó 0,5 mL del AECC al 100% y se mezcló con 3,5 mL de Tween80.. . Preparación del AECC al 25% Se tomó 1 mL del AECC al 100% y se mezcló con 3 mL de Tween80.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2) Preparación del stock de las distintas concentraciones de Fluconazol Los 0,25 mL de fluconazol que se colocaron en los tubos fueron obtenidos de un stock en el que se ha multiplicado por 8 la concentración ya que al colocarlos en el tubo quedarían diluidos. NT. a la octava parte. (Anexo N°13). -U. La CMI de Fluconazol con la que se trabajó fue de 64 ug por tratarse de una cepa resistente (43).. 0,25 x CMI (64ug). 16 ug. 128 ug. 0,5 x CMI (64ug). 32 ug. 256 ug. 64 ug. 512 ug. IN. Concentración final. M. ED. IC. 0,125 x CMI (64ug). A 8 ug. Stock: Concentración final x8 64 ug. Concentraciones necesarias. Preparación del Stock de 8ug. AD. . DE. 1 x CMI (64ug). LT. Se tomó 0,125 mL de la solución inyectable de Fluconazol (200. . Preparación del Stock de 16ug Se tomó 0,25 mL de la solución inyectable de Fluconazol (200. FA. CU. mg/ 100 mL) y se mezcló con 3,781 mL de solución salina.. mg/ 100 mL) y se mezcló con 3,656 mL de solución salina. . Preparación del Stock de 32ug Se tomó 0,5 mL de la solución inyectable de Fluconazol (200 mg/ 100 mL) y se mezcló con 3,406 mL de solución salina.. . Preparación del Stock de 64ug. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Se tomó 1 mL de la solución inyectable de Fluconazol (200 mg/ 100 mL) y se mezcló con 3,906 mL de solución salina.. 3) Luego se incubaron todos los 16 tubos a 37º C durante 48 horas. Pasado este tiempo se determinó la concentración mínima. NT. inhibitoria a través de la observación de la turbidez en los tubos. -U. y su verificación a través de las lecturas del nivel de absorbancia dadas por el espectrofotómetro. Finalmente se registraron los. IN. A. resultados de la CMI para el aceite esencial y Fluconazol, para. IC. luego calcular la CIF. (Anexo 14 y 15). ED. Interpretación de resultado a través del índice de Concentración. M. Inhibitoria Fraccionario (CIF):. CIF= CIFFCZ+ CIFAECC. AD. DE. Se calculó la CIF de la siguiente manera:. Donde:. CIFFCZ: CMI de Fluconazol en combinación/ CMI de Fluconazol solo.. . CIFAECC: CMI del AECC en combinación/ CMI del AECC solo.. FA. CU. LT. . Para obtener la CMI de solo Fluconazol y solo AECC se realizó el método de macrodilución previamente descrito Se consideraron los resultados de la combinación de ambos compuestos de la siguiente manera (50):. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. CIF ≤ 0.5. Adición. 0.5 < CIF < 1. Indiferencia o sin interacción. 1 < CIF < 4. Antagonismo. CIF ≥ 4. NT. Sinergismo. 2.3.5 Diseño de investigación. -U. A. Determinación de la susceptibilidad de Candida albicans frente al aceite. A. esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol a través del método por. Grupos experimentales. AECC 50%. AECC 75%. AECC 100%. 10 discos. M. G4. C1 Fluconazol. C2 Tween 80. 10 discos. 10 discos. 10 discos. 10 discos. FA. CU. LT. 10 discos. G3. Grupos control. DE. AECC 25%. G2. AD. G1. ED. IC. IN. difusión con discos de Kirby-Bauer. Las placas se incubaron a 37°C por 48 horas. Lectura de los halos de inhibición producidos tomando en cuenta la escala de Duraffourd. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. B. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria del AECC (CMI). Grupos control. Grupos experimentales. AECC 25%. AECC 50%. G3 AECC 75%. C1. G4 AECC 100%. Fluconazol 0,8 mL. C. albicans. C. albicans. 0,2 mL. C. albicans. C. albicans. C. albicans. 1 mL. 0,1 mL. 0,1 mL. 0,1 mL. Se incubaron a 37°C por 48 horas 0,1 mL. 0,1 mL. AD. DE. 0,1 mL. M. Se incubaron a 37°C por 48 horas. ED. IC. IN. A. C. albicans. Sin tratamiento. -U. 0,8 mL. 0,2 mL. C2. NT. G2. G1. Se incubaron a 37°C por 48 horas en placas con agar Sabouraud. FA. CU. LT. Se incubaron a 37°C por 48 horas en placas con agar Sabouraud. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. C. Evaluación de la asociación del aceite esencial de Corymbia citriodora y fluconazol mediante el método de difusión en disco Grupos experimentales. AECC 50%. Fluconazol. AECC 75%. NT. Fluconazol. Fluconazol. AECC 100%. Fluconazol. A. -U. AECC 25%. G4. G3. G2. G1. M. ED. IC. IN. Discos embebidos. DE. Las placas se incubaron a 37°C por 48 horas. No Sinergismo: considerado cuando los dos círculos permanezcan independientes o exista truncamiento en el lugar de unión de ambas zonas de inhibición.. FA. CU. LT. AD. Sinergismo: zona de inhibición “puente” cerca de la unión de ambas zonas o aumento de inhibición del crecimiento debido a los efectos combinados de ambos. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. D. Evaluación de la asociación del AECC con fluconazol mediante el método de “tablero de ajedrez”. 2. 3. 4. 0,5. 5. 6. 7. 8. -U. 1. 9. 10. 11. 12. 0,125. 13. 14. 15. 0,25. 0,5. Tubos de ensayo con las combinaciones de ambos tratamientos. A. 0,25. IN. 1. NT. AECC (CMI). IC. ED. 1. FLUCONAZOL (CMI). AD. DE. M. 0,125. 16. 1 mL 0,25 mL. Inóculo Fluconazol. 0,25 mL. AECC. 0,5 mL. Caldo glucosado. FA. CU. LT. Se incubaron los 16 tubos a 37°C por 48 horas. Se determinó la CMI a través de la turbidez de los tubos y nivel de absorbancia en el espectrofotómetro para luego calcular la CIF. Sinergismo: CIF ≤ 0.5. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.4 ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN Una vez obtenidos los datos se realizaron tablas de frecuencia de una entrada con sus valores absolutos, promedio y desviación estándar.. NT. La comparación de los resultados obtenidos en la investigación se realizó. -U. mediante las siguientes pruebas estadísticas:. - Se aplicó la prueba estadística de ANOVA teniendo en cuenta un nivel de. IN. A. significancia de p < 0,05 para determinar si existe diferencia significativa entre. IC. las medias de los diámetros de halos de los tratamientos y grupos controles.. ED. - Se realizó también la prueba de comparaciones múltiples de Duncan; en la cual. M. se determinó qué tratamiento es el óptimo.. DE. 2.5 ASPECTOS ÉTICOS. El proyecto de investigación fue presentado para consideración, comentario,. AD. consejo y aprobación a los comités designados por la Facultad de Medicina de la. LT. Universidad Nacional de Trujillo. Así mismo, se tomaron en cuenta los principios. CU. de bioseguridad, y se prestó atención adecuada a los factores que pudieran dañar. FA. el medio ambiente (51). 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. III.. RESULTADOS. 1. Determinación de la susceptibilidad de Candida albicans frente a las distintas concentraciones del aceite esencial de Corymbia citriodora y a. -U. NT. Fluconazol mediante la técnica de Kirby-Bauer (Anexos N° 16-19). IN. A. Gráfico N° 1. Medias de las medidas de los halos de inhibición del AECC al. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. 25%, 50%, 75%, 100% y los controles.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2. Determinación de Concentración Mínima Inhibitoria del aceite esencial de Corymbia citriodora contra C. albicans mediante la técnica de macrodilución. NT. Tabla N°1. Concentración Mínima Inhibitoria del aceite esencial de. Turbidez. GRUPOS DE CONTROL. IN. A. GRUPOS EXPERIMENTALES AECC al 50%. AECC al 75%. AECC al 100%. C. albicans con Fluconazol. C. albicans sin tratamiento. 1. -. -. -. -. -. +++. 2. -. -. -. -. +++. 3. -. -. -. -. -. +++. 4. -. -. -. -. -. +++. 5. -. -. -. -. -. +++. 6. -. -. -. -. -. +++. 7. -. -. -. -. -. +++. 8. -. -. -. -. +++. -. -. -. -. -. +++. -. -. -. -. -. +++. AD. ED. DE. M. -. FA. 10. CU. 9. -. IC. AECC al 25%. LT. N° de Tubo. -U. Corymbia citriodora contra Candida albicans según el nivel de Turbidez. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Tabla N°2. Concentración Mínima Inhibitoria del aceite esencial de Corymbia citriodora contra Candida albicans según el Nivel de Absorbancia. -U. NT. en el espectrofotómetro y UFC. AECC al 75%. Turbidez. 0.32. 0.25. 0.11. UFC. 0. 0. C. albicans sin tratamiento. 0.04. 0.095. 0.53. 0. 3578. 108. ED. FA. CU. LT. AD. DE. M. 0. C. albicans con Fluconazol. AECC al 100%. IN. AECC al 50%. IC. AECC al 25%. GRUPOS DE CONTROL. A. GRUPOS EXPERIMENTALES. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 3. Determinación de la susceptibilidad de C. albicans frente a la asociación del aceite esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol mediante el método de difusión en disco (Anexos N° 20-22). -U. NT. Gráfico N°2. Medias de las medidas de los halos inhibición de la asociación entre AECC al 25%, 50%, 75%, 100% y fluconazol. IN IC. 70. ED. 60 50. 68. 53. 46.8. M. 40. DE. 30. 24.6. 10. AD. 20. LT. Diámetro promedio de los Halos de Inhibición (mm). A. 80. AECC 25% y Fluconazol. AECC 50% y Fluconazol. AECC 75% y Fluconazol. AECC 100% y Fluconazol. Grupos de Investigación. FA. CU. 0. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 4. Determinación de la Concentración Inhibitoria Fraccionada de C. albicans frente a la asociación del aceite esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol mediante el método de “tablero de ajedrez” (Anexos. NT. N°23,24). 0.098. 0.385. 0.085. 0.364. 0.067. 0.373. IC. ED. 0.059. 0.483 0.449 0.440 0.438. 0.353. 0.453 0.441. 0.364. 0.436. 0.358. 0.420. 0.327. 0.446. 0.102. 0.308. 0.410. 0.077. 0.300. 0.377. 0.060. 0.274. 0.334. 0.119. 0.244. 0.362. 0.100. 0.224. 0.324. 0.075. 0.218. 0.293. 0.053. 0.179. 0.232. 0.073 0.062. CU. AD. 0.119. DE. 0.350. LT. 0.091. ∑CIF. 0.379. M. 0.100. FA. A. CIFFCZ. IN. CIFAECC. -U. Tabla N° 3. Concentración Inhibitoria fraccionada del AECC y Fluconazol sobre Candida albicans obtenidos mediante el método de “Tablero de ajedrez”. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. IV.. DISCUSIÓN. Mediante los ensayos in vitro para evaluar la susceptibilidad de las cepas de C. albicans frente a las distintas concentraciones del aceite esencial de Corymbia citriodora se encontró que las cepas fueron sensibles a las cuatro concentraciones trabajadas (25%, 50%, 75% y 100%). Se presentó una actividad antimicótica. NT. sumamente sensible en las concentraciones al 75% (642,7 mg/mL) y 100% (857. -U. mg/mL) ya que los halos de inhibición promedio fueron de 23,20 mm y 42,30 mm respectivamente. Resultados que concuerdan con los de Musyimi et al. (42). IN. A. quienes afirman que el aceite esencial de Corymbia citriodora es. IC. extremadamente efectivo al 100% debido a que muestra una completa inhibición. ED. de crecimiento con esta concentración.. Las zonas de inhibición de crecimiento encontradas fueron evidentemente. M. mayores a las encontradas por Luqman et al. (38) quienes trabajaron con cepas. DE. de C. albicans salvajes y cepas mutantes resistentes a fármacos, encontrado que el aceite esencial de Corymbia citriodora posee mayor actividad antifúngica en. AD. este último grupo; sin embargo, la zona de crecimiento inhibitorio para ambos. LT. grupos de cepas no superó los 15 mm.. CU. La actividad antimicótica del AECC se debe a los fitoconstituyentes que posee, se considera que sus principales monoterpenos son citronelal (60-69%),. FA. citronelol (10-12%), isopulegol (4-8%)(37,52). El mecanismo de acción del AECC no se ha estudiado en detalle debido a la presencia de diferentes grupos de constituyentes/compuestos, pero se considera que la acción puede deberse a cualquiera de los siguientes mecanismos: daño o degradación de la pared celular, alteraciones en la membrana citoplasmática, agotamiento de la fuerza motriz de. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. protones, flujo de electrones, fuga de contenido celular, daño a las proteínas de membrana y transporte activo, coagulación del contenido celular (38). Por otro lado, al evaluar la susceptibilidad de las cepas frente a Fluconazol se halló una actividad nula y se determinó un halo de inhibición de 6 mm en todas las repeticiones realizadas por lo que se las consideró como cepas resistentes a. NT. Fluconazol. Existen múltiples mecanismos de resistencia a los azoles en especies. -U. de Candida (53) dentro de los cuales se describen: describen alteraciones de las enzimas relacionadas en la síntesis de ergosterol y la disminución de la. IN. A. concentración de drogas debido al desarrollo de bombas de eflujo activas que. IC. producen una disminución de las concentraciones de fármaco en el sitio de. ED. acción. Estas bombas están codificadas por los genes CDR (confiere resistencia a casi todos los azoles) y MDR (espectro más estrecho específico para. DE. M. fluconazol) (54).. Se determinó que la concentración mínima inhibitoria del AECC fue de 214,25. AD. mg/mL (concentración del AECC al 25%) con un conteo de UFC de cero a partir. LT. de esta concentración. Los resultados obtenidos contrastan con los de otros. CU. autores, siendo este resultado mucho mayor que el encontrado por Barbosa et al.(41) quienes determinaron un CMI de 0,25 mg/mL y lo obtenido por Luqman. FA. et al.(38) cuyos resultados de CMI varían desde 1,25mg/mL a 5mg/mL con cepas resistentes y 2,5 mg/mL a 5 mg/mL con cepas salvajes. La disparidad de resultados puede ser atribuida a la variación de la composición química del aceite esencial, puesto que los aceites esenciales están constituidos por diferentes constituyentes bioquímicos. Estos componentes también pueden variar de acuerdo al tipo de hojas utilizadas para la extracción del aceite, tal como. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. lo afirman Batish et al.(40) quienes encontraron diferencias en la composición de monoterpenos y demás fitoconstituyentes en hojas jóvenes, adultas, senescentes y hojarasca. En el presente estudio se utilizaron los tipos de hojas jóvenes y adultas, que según reporta Batish et al. (40) presentan una mayor cantidad de constituyentes sobre todo de citronelal, citronelol e isopulegol. Así también la. NT. diferencia de resultados podría explicarse por las variaciones regionales en. -U. cuanto a condiciones climáticas, localización geográfica y los tipos de cepas. IN. A. utilizadas.. IC. Al evaluar la asociación del AECC y Fluconazol por el método de difusión en. ED. disco se determinó que el 100% de los cultivos realizados mostraron sinergismo ya que el aumento de los halos de inhibición fue evidente y a medida que se. M. incrementa la concentración del AECC se incrementa también el diámetro del. DE. halo de inhibición de ambos tratamientos sin mostrar antagonismo. Esto evidencia que los efectos antifúngicos de ambos tratamientos se potencian. AD. resultando en una amplia acción sinérgica.. LT. Los resultados obtenidos concuerdan con el análisis realizado de la asociación de. CU. ambos tratamientos mediante el método del “tablero de ajedrez” en el cual se determinó que la concentración inhibitoria fraccionada para cada una de las. FA. combinaciones realizadas se encuentra en un rango menor a 0,5 (0,232-0,483) lo que sugiere de igual modo la presencia de sinergismo. Se demostró también que. el efecto sinérgico de la combinación de AECC y Fluconazol tiene una gran eficacia para revertir la resistencia de C. albicans in vitro puesto que mejora el efecto antifúngico del Fluconazol al reducir su CMI de 64ug (CMI para cepas resistentes) a 8 ug (CMI para cepas sensibles).. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. El sinergismo observado puede explicarse por los monoterpenos propios de la especie trabajada, Xu et al. (55) reportaron que estos inhiben competitivamente la excreción de fluconazol puesto que regulan de forma consistente la expresión de genes de la bomba de eflujo en diferentes cepas de C. albicans al generar una alteración en la expresión de genes CDR involucrados en la resistencia a. NT. fluconazol. Por otro lado, el modo de acción propuesto por el citronelal es una. -U. alteración de la homeostasis de la membrana asociada con una disminución del contenido de ergosterol (56) lo cual también contribuiría al singergismo. IN. A. propuesto y coincide con la propuesta de Batista et al. (57) quienes afirman que. ED. por hongos del género Candida.. IC. el citronelal es un compuesto prometedor para combatir enfermedades causadas. También se plantea que el AECC es biológicamente activo contra los biofilms en. M. formación y maduros de C. albicans al disminuir la actividad metabólica en. DE. ambos biofilms, actuando sobre la morfología y estructura de estos promoviendo la disminución de hifas.(58). AD. El AECC se perfila como una probable fuente de medicamentos antimicóticos. LT. que en combinación sinérgica con medicamentos convencionales como el. CU. Fluconazol puede disminuir las concentraciones de este en un intento por evitar los efectos secundarios y el aumento de la resistencia. El presente estudio in. FA. vitro demuestra sinergismo entre el AECC y Fluconazol, resultado que justifica estudios más extensos en el intento de evaluar el potencial antifúngico del AECC tanto in vitro como in vivo.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. V. . CONCLUSIONES. El aceite esencial de Corymbia citriodora y Fluconazol tiene efecto sinérgico contra Candida albicans.. . La susceptibilidad de Candida albicans frente al AECC fue de 13,1 mm, 18,5 mm, 23,2 mm, 42,3mm al 25%, 50%, 75% y 100% respectivamente. La susceptibilidad de Candida albicans frente al Fluconazol fue de 6mm. -U. . NT. mediante la técnica de Kirby Bauer.. mediante la técnica de Kirby Bauer.. A. La concentración mínima inhibitoria del AECC contra Candida albicans. IN. . La susceptibilidad de Candida albicans frente a la asociación de AECC. ED. . IC. fue de 214,25 mg/mL mediante la técnica de macrodilución.. al 25%, 50%, 75% y 100% y Fluconazol fue de 24,6 mm, 46,8 mm, 53. La concentración inhibitoria fraccionaria del aceite esencial de Corymbia. DE. . M. mm y 68 mm respectivamente mediante el método de difusión en discos.. AD. citriodora y Fluconazol contra Candida albicans fue menor de 0,5 en todas las combinaciones realizadas mediante la técnica de “tablero de. FA. CU. LT. ajedrez”.. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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