EFECTOS TERATOGÉNICOS DEL NITRATO DE PLOMO EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DEL PEZ CEBRA Danio rerio (Hamilton, 1822) A CINCO DOSIS
SUBLETALES.
PRESENTADO POR Carolina Alvarez Garzón
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD CIENCIAS
CARRERA BIOLOGÍA BOGOTÁ D.C
EFECTOS TERATOGÉNICOS DEL NITRATO DE PLOMO EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DEL PEZ CEBRA Danio rerio (Hamilton, 1822) A CINCO DOSIS
SUBLETALES.
PRESENTADO POR Carolina Alvarez Garzón
INGRID SCHULER Decana Académica
EFECTOS TERATOGÉNICOS DEL NITRATO DE PLOMO EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DEL PEZ CEBRA Danio rerio (Hamilton, 1822) A CINCO DOSIS
SUBLETALES.
PRESENTADO POR Carolina Alvarez Garzón
EDILMA GUEVARA ROZO MSc Directora
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Madre Tierra por dejarme existir y pertenecer a este mundo.
Agradezco a mis padres Elsa y Fredy, por enseñarme todo lo que soy, por creer en mis sueños y apoyarme incondicionalmente en la realización de estos. A mis hermanos Andrea y David por su comprensión, compañía y tolerancia durante este proceso.
A mis Abuelas que son la inspiración de mi vida. Gracias por mostrarme que a pesar de todos los tropiezos, siempre debemos levantarnos y seguir adelante.
A Guillermo por su amor, comprensión, tolerancia y presencia durante estos cinco años de vida. Mil gracias por estar ahí, junto a mí, junto al cañón sin desfallecer.
A Edilma Guevara por sus aportes a este trabajo, por tener paciencia conmigo y compartir siempre sus conocimientos.
A Angélica Rodríguez, gracias por su amistad incondicional, por su gran ayuda siempre, por su paciencia y comprensión, gracias por todos los momentos que me hiciste reír a carcajadas y también aquellos que me hiciste llorar.
Gracias a todos aquellos que estuvieron en mi camino durante estos cinco años de vida, los llevo a todos en el corazón y todos me enseñaron grandes cosas.
Finalmente le doy gracias a la vida por permitirme vivir, ser feliz y estar triste, por hacerme zancadillas pero también enseñarme a levantarme, por darme la oportunidad de aprender cada día más sobre cualquier cosa, no solo aquello que te llena de conocimiento académico sino y lo más importante aquello que hace que el alma se sienta mejor.
TABLA DE CONTENIDO
Págs
1. Resumen……… 7
2. Introducción………. 8
3. Planteamiento del Problema y Justificación……… 10
4. Marco Teórico 4.1. Características generales del Plomo………. 11
4.2. Toxicología del plomo……….. 11
4.3. Pez Cebra……… 13
4.4. Pruebas de Toxicidad……… 14
4.5. Teratogenia……… 15
4.6. Malformaciones congénitas………. 15
4.7. Antecedentes………. 16
5. Objetivos 5.1. Objetivo General……… 19
5.2. Objetivos Específicos……… 19
6. Metodología 6.1. Procedimiento en Laboratorio……….. 20
6.2. Diseño experimental………. 20
6.3. Tratamiento estadístico de los datos……… 21
7. Resultados 7.1. Mortalidad……… 22
7.2. Malformaciones………..… 25
8. Discusión……… 36
9. Conclusiones……….. 40
10.Recomendaciones……….. 41
1. RESUMEN
El nitrato de plomo es un contaminante acuático que genera impacto negativo sobre diferentes ecosistemas, afectando el desarrollo de organismos como los peces.
Este estudio se realizó con el fin de evaluar el efecto teratogénico de cinco concentraciones subletales de nitrato de plomo sobre el desarrollo embrionario del Pez Cebra (Danio rerio). Se llevó a cabo un bioensayo exponiendo 360 ovocitos a cinco concentraciones diferentes de nitrato de plomo (3 ppm, 1 ppm, 0.8 ppm, 0.5 ppm, 0.1 ppm) a un tiempo de 144 horas de exposición, se evaluó el porcentaje de mortalidad y la incidencia de malformaciones en cada una de las dosis subletales utilizadas cada 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 horas.
La mortalidad no fue superior al 50% en ninguna de las concentraciones utilizadas, sin embargo se evidenció que la mortalidad depende de las concentraciones. Por otro lado se reportaron ocho malformaciones; cuatro asociadas con el desarrollo de la columna vertebral como cifosis, lordosis, escoliosis y espina bífida con un 59 % de incidencia. Otras como edema pericárdico, hemorragia cefálica, hipertrofia de aletas caudales y vitelo adicional que no fueron muy frecuentes con un 41 % de incidencia. En el caso de las malformaciones se demostró que a mayor concentración y mayor tiempo de exposición, la cantidad de malformaciones presentes era más amplia que al comienzo del experimento.
2. INTROCUCIÓN
Uno de los problemas ambientales más importantes y críticos de la actualidad es la contaminación acuática debido a las actividades industriales antrópicas. Los metales pesados son el tipo de contaminante que más impacto genera ya que su toxicidad, persistencia y capacidad de bio-acumulación afecta la capacidad de supervivencia de los organismos perturbando la dinámica poblacional de las especies y de esta manera la estructura y función ecosistémica [1].
El plomo es un metal inorgánico que genera múltiples efectos adversos en los organismos expuestos a este compuesto; puede afectar su capacidad de aprendizaje y reproducción, retardar su crecimiento y generar numerosas lesiones en su metabolismo. Además tiene la capacidad de almacenarse en los huesos aumentando su concentración en la cadena alimenticia hasta llegar a los humanos [2].
A diferencia de otros metales el plomo es un compuesto sin función fisiológica en lo seres vivos, en cambio genera alta toxicidad en los organismos expuestos a este elemento. Los esfuerzos por reducir los contenidos y emisiones de plomo no han sido suficientes pues sigue siendo un gran contamínate hasta el punto de encontrarse en la dieta humana [2,3]
El Pez Cebra (Danio rerio) es una especie pequeña, de agua dulce que se utiliza como un modelo biológico para realizar bioensayos. La facilidad de su cultivo, su gran desove y el tamaño de sus huevos fertilizados, hacen de esta especie un modelo excelente para estudiar teratogénesis inducida por sustancias toxicas. El desarrollo embrionario del Pez Cebra (Danio rerio) es rápido (72 h desde la fecundación hasta la eclosión a 28 ◦ C), sus huevos son fácilmente visibles debido a la transparencia de su corion y embrión. Además el proceso de su embriogénesis se encuentra ampliamente descrito por etapas [4, 5, 6, 7].
las alteraciones físicas que experimenta dichos organismos ante un contaminante ya sea específico o combinado [9].
La toxicidad o teratógenia de los contaminantes genera alteración en la morfogénesis temprana, lo cual influye en la aparición de malformaciones en estadios tardíos del desarrollo o incluso después de su eclosión. Algunos de estos problemas van a repercutir durante la etapa de alevín con saco vitelino causando mortalidades variables en los organismos [9].
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Problema científico y Justificación
Uno de los metales pesados de uso común dentro de la industria es el plomo, el cual es utilizado en la elaboración de pigmentos, cables de energía y baterías eléctricas, entre otros [9]; las deposiciones de desechos industriales o lixiviados de rellenos sanitarios han aumentado las concentraciones de plomo en el agua en forma de sal inorgánica (Nitrato de PlomoPb (NO3)2) acumulándose rápidamente [2, 10, 11]. Altas concentraciones de nitrato de plomo en el agua ocasionan efectos irreversibles en organismos acuáticos [2, 12], estos pueden ser teratogénicos, afectando sensiblemente la supervivencia de las larvas acuáticas, como los peces [13]. Se realizan pruebas toxicológicas para conocer los efectos de sustancias toxicas a distintos niveles de organización trófica, con el propósito de aportar herramientas para el control de calidad de agua por vertimientos y evaluación de compuestos específicos [8]. Las pruebas in vitro sirven para determinar un estimado cuantitativo y cualitativo del potencial teratogénico permitiendo pronosticar sus efectos in vivo [14]. Estos bioensayos son una fuente importante de información para la evaluación de ecosistemas intervenidos por el hombre lo que permite realizar planes de manejo de aguas, evitando y previendo la extinción de diferentes especies [15].
4. MARCO TEORICO
4.1 Características generales del plomo
El plomo es un metal pesado no esencial y altamente tóxico. Su densidad es de 11,34 g/cm3, es altamente maleable, dúctil y bajo conductor eléctrico. Es constituyente de más de 200 compuestos en la naturaleza pero es relativamente raro encontrarlo en la corteza terrestre (0,016g Pb/Kg), sus emisiones naturales consisten en la degradación de rocas, actividades ígneas y decaimiento radioactivo, sin embargo la emisión antropogénica ha incrementado las concentraciones de plomo generando concentraciones más altas que las naturales, tanto en ambientes sólidos como acuosos [2].
Es un metal muy usado en la industria, en la fabricación de pigmentos, recubrimientos, recipientes, ungüentos, baterías eléctricas e incluso algunos licores. Además presenta aplicaciones en la metalurgia como munición de armas, metal para cojinetes, cobertura de cables, compuestos de calafateo, plomo laminado, soldaduras, vidriado de cerámica y ciertos tipos de cristal [2]. De igual manera, es utilizado en la fabricación de insecticidas, plaguicidas y gasolinas que contienen aditivos de plomo [17], aunque estos han disminuido ante la prohibición de su uso [18].
El nitrato de plomo Pb (NO3)2 es una sustancia cubica, cristalina e incolora, con una densidad de 4.53 g/cm3. Este compuesto se produce disolviendo plomo, monóxido o carbonato de plomo en ácido nítrico [19]. Es uno de los pocos compuestos del plomo que es soluble [11] y su uso principal, desde la edad media, ha sido la producción de pigmentos. Debido a que es un compuesto altamente soluble en el agua, puede contaminarla fácilmente, ya que los desechos de aguas negras de las industrias mencionadas anteriormente llegan directamente a cuerpos de agua.
4.2 Toxicología del plomo
y nerviosos afectando funciones cerebrales relacionadas con el aprendizaje, la supervivencia y el comportamiento; además de la reproducción [2].
La susceptibilidad por toxicidad por plomo se encuentra principalmente en individuos jóvenes, donde puede afectar el desarrollo del sistema nervioso central [20], sin embargo existen diferencias en el proceso toxicológico por múltiples factores como la edad, sexo, condiciones ambientales y fisiológicas [2]; en términos generales es la dieta el aspecto más relevante para el incremento hasta niveles tóxicos de este compuesto.
Se han identificado múltiples efectos adversos en varios órganos y sistemas incluyendo el hematopoyético, renal, cardiovascular, reproductivo e inmunitario, se conoce que el plomo puede generar encefalopatías en gatos y perros expuestos a elevadas dosis, también afecta los huesos y se ha demostrado que es cancerígeno en ratas y ratones tratados con nitrato de plomo [21]. Es agente causal de anomalías congénitas en embriones debido a que es capaz de atravesar la barrera placentaria y afectar directamente al embrión. Se demostró que este compuesto puede transferirse de madre a hijo por medio de la leche mediante el trabajo con ratas en periodos de lactancia [22].
Los efectos teratogénicos del plomo se asocian a malformaciones de la columna vertebral y medula espinal, estas alteraciones fueron descritas en hamsters después de la exposición a este compuesto. Además se ha demostrado gameto-toxicidad y efectos reproductivos en las crías de varias especies, estos efectos se evidencian en el cambio de tamaño (enanismo o gigantismo), peso y supervivencia de las crías [22].
4.3 Pez Cebra (Danio rerio)
El Pez Cebra (Danio rerio) habita naturalmente los ríos del norte de India, Paquistán y Nepal. Actualmente es un pez ornamental encontrándose difundido por todo el mundo con fines industriales. Esta especie pertenece a la familia Cyprinidae. Los adultos de este pez son aproximadamente de 3-5 cm de largo, de modo que se pueden manejar fácilmente en grandes cantidades en el laboratorio [24]. El desarrollo embrionario de este pez es similar al de otros vertebrados, incluidos las humanos, [7,16, 25, 26, 27]. Este desarrollo embrionario es muy rápido, en las primeras 24 horas después de la fertilización la mayoría de los órganos están desarrollados y en menos de 96 horas eclosiona y reabsorben el vitelo. La madurez sexual se alcanza hacia el tercer mes de vida. Una sola hembra puede poner hasta 200 huevos por semana [24].
Las características anteriormente mencionadas han popularizado el uso de esta especie como modelo biológico, siendo empleado en estudios de desarrollo, farmacológicos y toxicológicos. Estas pruebas pueden ser realizadas en un formato miniaturizado, que reduce las cantidades de productos químicos para desplegar y el volumen de residuos potencialmente peligrosos [16]. Por otro lado el pequeño tamaño de los huevos y embriones permite la operación de las pruebas de detección de alto rendimiento, por lo tanto se genera una base de datos de muchas muestras repetidas para la evaluación estadística y la validación de los resultados [28].
4.4 Pruebas de Toxicidad
Los ensayos biológicos o pruebas de toxicidad son herramientas para estimar el efecto de agentes físicos y químicos sobre organismos bajo condiciones experimentales específicas y controladas. Estos efectos pueden ser tanto de inhibición como de magnificación, evaluados por la reacción de los organismos tales como muerte, crecimiento, proliferación, multiplicación, cambios morfológicos, fisiológicos o histológicos [29].
La toxicidad se define entonces como la capacidad de una sustancia para ejercer un efecto nocivo sobre los organismos o la biocenosis dependiendo de las propiedades químicas del compuesto su concentración, tiempo de exposición, frecuencia de exposición y su relación con el ciclo de vida del organismo [29].
En este caso se debe definir concretamente algunos conceptos aplicables al trabajo que se va a desarrollar:
CE50/CI50: concentración efectiva o de inhibición media. Concentración del material
en agua, suelo o sedimento que se estima afecta al 50% de los organismos de ensayo. La CE50 y sus límites de confianza (95%) son usualmente derivados de análisis estadístico [29].
CL50: concentración letal media, concentración del material en agua, suelo o
sedimento que se estima letal para el 50% de los organismos de ensayo. La CL50 y sus límites de confianza (95%) son usualmente derivados de análisis estadístico [29].
4.5 Teratogenia
Teratogenia viene del griego “terato” que significa monstro, hace referencia a los efectos
negativos producidos durante el desarrollo embrionario y su etiología. Se puede evidenciar como malformaciones, las cuales son producidas cuando se expone el organismo a diferentes concentraciones de agentes tóxicos ya sean físicos (rayos X) o químicos (metales pesados) durante su embriogénesis [30].
4.6 Malformaciones congénitas
Las malformaciones congénitas hacen referencia a aquellas características que se adquieren durante el desarrollo embrionario y por ende se presentan en el momento de la eclosión [31].
En este estudio se reportan malformaciones implicadas en el desarrollo de la espina dorsal, estas suelen presentarse como desviaciones en la columna vertebral debido a daños parciales en el esclerotoma generando una curva en la columna vertebral. Estas malformaciones pueden ser en diferentes sentidos y se puede evaluar según el grado de curvatura.
La escoliosis es la curvatura lateral de la espina dorsal usualmente en forma de una S o una C, estas pueden llegar a ser muy severas afectando la movilidad (Figura 8) [32]. La cifosis es la curvatura excesiva de la columna torácica hacia la parte ventral del cuerpo. En diversos grados puede afectar la movilidad de los embriones (Figura 9) [32]. La lordosis es la curvatura excesiva de la columna en la región lumbar hacia la parte dorsal del cuerpo. En diversos grados puede afectar la movilidad de los embriones (Figura 9) [32].
Por otro lado se encontró edema pericárdico, este se presenta como una acumulación de líquido en el espacio intersticial del pericardio aumentado su tamaño y alterando la contracción cardiaca lo cual puede causar la muerte del embrión (Figura 11) [34].
Se evidenció hemorragia cefálica, esta tiene lugar cuando existe una ruptura de un vaso sanguíneo encefálico debido a un pico de hipertensión o a un aneurisma congénito, al derramarse la sangre sobre los tejidos cerebrales se genera apoptosis, en algunos casos se puede generar derramamiento en la cúpula óptica del embrión (Figura 8 y 12) [34].
La hipertrofia en la aleta caudal, se presenta cuando existe algún tipo de desorden o anomalía en los tejidos de esta estructura. Se evidencia como un desorden de tejidos aumentando la proporción del tamaño de la aleta caudal (Figura 13) [5].
4.7 Antecedentes
Existen varios trabajos sobre toxicidad en embriones de Pez Cebra (Danio rerio) que sustentan la teratogenicidad tanto de metales pesados como de herbicidas, plaguicidas o diversos medicamentos. Para la evaluación de dichos experimentos diferentes autores utilizan la prueba estandarizada FET con embriones de este pez.
Samson & Shenker (2000) exponen embriones de pez cebra en diferentes estadios a dos concentraciones de cloruro de metilmercurio hasta las 32 horas después de la fertilización; concluyen que los efectos teratógenos de este compuesto son dos: primero, daños tisulares a nivel medio del pliegue de la aleta caudal y segundo, flexión en la parte posterior de la región de la cola; por otro lado describen el periodo de las 18 a las 20 horas después de la fertilización como el más crítico de exposición a este compuesto, el cual corresponde al tiempo de formación de las dos estructuras más afectadas [5].
utilizó cadmio y los efectos predominantes observados fueron la mortalidad, edema y alteraciones de la columna como cifosis vertebral, escoliosis, y lordosis [35].
Según Chan & Cheng (2003) el cadmio produce apoptosis durante el desarrollo embrionario, lo que genera después de un tiempo diversas malformaciones congénitas; estos autores exponen embriones de pez cebra a una concentración de cadmio (100µM) durante el periodo de tiempo desde las 5 horas hasta las 28 horas después de fertilización [36].
Existen también estudios sobre el efecto adverso de otras sustancias como el etanol el cual causa degeneración en el sistema nervioso central lo que conlleva a defectos en el sistema cardiovascular, en las estructuras faciales y en las aletas, como conclusión se determina que el efecto depende de las concentraciones y el tiempo de exposición del compuesto [37].
Según Cook y col. (2005) el pesticida Malatión reduce las tasas de sobrevivencia y retarda el desarrollo embrionario del pez; concuerda con la hipótesis de la correlación dependiente entre las malformaciones, las dosis y el tiempo de exposición a la sustancia [38].
Para Tsay y col. (2007) el bioensayo con benzoato de sodio arrojó resultados deletéreos para los embriones de Pez Cebra (Danio rerio) que fueron expuestos a concentraciones desde 0 ppm hasta 2000 ppm, encontrando malformaciones en pronefros, defectos en la glándula de incubación y edema en el saco pericárdico [39].
Estudios en otras especies de desarrollo acuático demuestran la toxicidad de plomo y sus efectos teratogénicos. Burden y col. (1995) evidencian que existe un mayor grado de afectación en estadios tempranos del desarrollo del pez Oncorhynchus mykiss al exponerlo a 4 concentraciones diferentes de plomo disuelto en agua [40].
5. OBJETIVOS
5.1 General
Determinar los efectos teratogénicos durante el desarrollo embrionario del Pez Cebra (Danio rerio) causados por la exposición a 3 ppm, 1 ppm, 0.8 ppm, 0.5 ppm y 0,1 ppm de nitrato de plomo en un tiempo de 144 horas.
5.2 Específicos
Especificar el porcentaje de mortalidad en cada una de las concentraciones utilizadas.
Describir las malformaciones morfológicas macroscópicas presentes en los embriones del Pez Cebra (Danio rerio) expuestas a cinco concentraciones subletales de nitrato de plomo.
6. METODOLOGÍA
6.1Procedimiento en laboratorio
5.2 Diseño Experimental
El n-muestreal fue establecido por literatura, teniendo en cuenta el estudio realizado por Selderslaghs y col. (2009), en el cual la muestra era de 20 huevos por tratamiento, en este estudio se trabajó con el mismo número de embriones por replica. Se realizaron seis tratamientos con las siguientes concentraciones: 0,1 ppm, 0,5 ppm, 0,8 ppm, 1 ppm y 3 ppm y el control.
Producto a Obtener Actividades Implicadas
Proposito Metodológico a Desarrollar
Evaluación de Fertilidad de los Huevos de Danio rerio
Huevos fertilizados puestos en las diferetnes conentraciones.
Cada concentracion tuvo 3 replicas y en cada replica
huvo 20 huevos
Se evaluó hasta las 144 horas de expocicion (0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120
y 144)
Embriones Muertos fueron removidos, se reporto en
tablas de mortalidad, concentracion, tiempo de
exposición
Tomar una submuestra y fijar en formol buferizado Realizó dercripción
macroscopica del embrion teniendo en cuenta caracteristicas normales
Se realizaron fotografias de los embriones malformados 360 Huevos fertilizados.
5 Concentraciones de Nitrato de plomo. (0.1 ppm, 0.5 ppm, 0.8 ppm, 1 ppm y
Los embriones de cada concentración fueron evaluados hasta las 144 horas de exposición, en intervalos de 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 horas; aquellos embriones muertos fueron removidos y reportados en una tabla de mortalidad por concentración y los vivos se evaluaron macroscópicamente para evidenciar las malformaciones [7].
6.3 Tratamiento estadístico de los datos
7. RESULTADOS
7.1Mortalidad
Al establecer el porcentaje de mortalidad de los embriones de Pez Cebra (Danio rerio) en cada uno de los tratamientos, fue necesario introducir la variable de muerte por agente fúngico, el cual se presentó desde el inicio del experimento y su comportamiento vario según los tratamientos (Tabla 1; Figura 1).
Tabla 1. Porcentaje de mortalidad acumulada de embriones de Pez Cebra (Danio rerio) en 5 tratamientos de dosis subletales de nitrato de plomo. (Muertos) Muertos por plomo. (Muertos H) Muertos por hongo. (% Mortalidad), Porcentaje de mortalidad por plomo. (% Mortalidad H), Porcentaje de mortalidad por hongo.
TRATAMEIEMTO VIVOS MUERTOS MUERTOS H % MORTALIDAD % MORTALIDAD H
0,1 ppm 41 5 14 8 23
0,5 ppm 43 11 6 18 10
0,8 ppm 45 11 4 18 7
1 ppm 42 14 4 23 7
3 ppm 49 5 6 8 10
PORCENTAJE DE MORTALIDAD DE EMBRIONES DE PEZ CEBRA (Danio rerio) EXPUESTOS A 5
[image:22.612.75.541.354.717.2]Los embriones expuestos a la concentración de 0,1 ppm de Pb (NO3)2 mostraron síntomas de toxicidad, y de baja mortalidad 8 % por este compuesto (Tabla 1), sin embargo se presentó un 23 % de mortalidad por el agente fúngico (Tabla 1). Las primeras horas de exposición fueron determinantes en la mortalidad por el agente fúngico, pero no fueron representativas para la exposición al nitrato de plomo (Figura 1).
En tanto que la concentración de 0,5 ppm presentó 18 % de mortalidad por nitrato de plomo (Tabla 1), evidenciándose desde las primeras horas de exposición y estabilizándose a las 72 horas. El 10% de la población presentó mortalidad por agente fúngico (Tabla 1), lo cual indica que para esta concentración la mortalidad por nitrato de plomo fue más representativa que en el anterior tratamiento (Figura 1).
Los embriones que se encontraban en la concentración de 0.8 ppm presentaron un 18% de mortalidad por nitrato de plomo (Tabla 1), estos alcanzaron el periodo de eclosión hasta las 72 horas. El porcentaje de mortalidad por el agente fúngico fue menos representativo que en la concentración anterior con un 7% (Tabla 1) del total de la población (Figura 1).
Los embriones de Pez Cebra (Danio rerio) expuestos a 1 ppm presentaron un porcentaje de mortalidad por nitrato de plomo del 23% (Tabla 1); por otro lado el porcentaje de mortalidad por el agente fúngico fue de 7% (Tabla 1) lo anterior mostró mismo porcentaje del tratamiento anterior, indicando que a medida que la concentración de nitrato de plomo aumenta, disminuye la mortalidad por este agente (Figura 1).
Por último los embriones expuestos a 3 ppm presentaron un porcentaje de mortalidad por nitrato de plomo del 8% (Tabla 1), porcentaje similar al presentado por el agente fúngico 10% (Tabla 1), esto indica que para esta concentración la mortalidad no fue un factor representativo en ninguno de los dos casos (Figura 1).
mayor porcentaje de mortalidad por agente fúngico, mientras que a mayores concentraciones de nitrato de plomo existe menor porcentaje de mortalidad por agente fúngico (Figura 1).
El análisis de mortalidad se estableció utilizando una prueba de Ji Cuadrado (ᵡ2) comparando los individuos vivos y muertos en cada uno de los tratamientos. Se obtuvo un ᵡ2= 23,69 (Ji cuadrado
calculado), que comparado con el ᵡ2 de tablas con 5 grados de libertad y un α de 0.05 (ᵡ2 =11,07)
determina que el Ji cuadrado calculado es mayor al de las tablas lo cual indica que se acepta la hipótesis alterna, es decir, que la mortalidad es dependiente de la concentración de nitrato de plomo (Tabla 2.)
[image:24.612.136.473.336.685.2]7.2 Malformaciones
La mayoría de las malformaciones presentes en los 5 tratamientos de nitrato de plomo fueron evidentes a partir de la eclosión de los embriones de Pez Cebra (Danio rerio) entre las 48 y 72 horas de exposición al plomo, no obstante una vez se fijaron los embriones y se removió el corión se identificaron otras malformaciones.
Debido a que las 5 concentraciones utilizadas en este estudio son dosis subletales en todas ellas se presentó algún tipo de malformación (Tabla 3).
Tabla 3. Malformaciones en embriones de Pez Cebra (Danio rerio) según las cinco dosis subletales de nitrato de plomo.
MALFORMACIONES PRESENTES EN EMBRIONES DE PEZ CEBRA (Danio rerio)
EXPUESTOS A CINCO DOSIS SULETALES DE PLOMO Grupos de 60 peses
MALFORMACIÓN 0,1
ppm 0,5 ppm 0,8 ppm 1 ppm 3 ppm TOTAL MALFORMACIONES Deshidratación del Corión 0 3 0 0 0 3
Vitelo Adicional 1 0 0 0 0 1
Columna Bífida 1 0 0 0 0 1
Cifosis 6 22 26 32 39 125
Escoliosis 4 5 3 6 10 28
Lordosis 2 3 2 1 7 15
Hipertrofia Aletas 5 2 1 0 2 10
Hemorragia Cefálica 0 2 18 5 28 53
Edema Pericárdico 2 5 15 5 22 49
Total 21 42 65 49 108 285
% 35% 70% 100% 82% 100% 79%
[image:25.612.72.534.340.588.2]presentaron desde la hora 12 de exposición del tratamiento coincidiendo con los primeros estadios del desarrollo. Adicionalmente a partir del estadio post eclosión se aprecian hipertrofias (Figura 13) en el desarrollo de la aleta caudal (Figura 2).
En la concentración de 0,5 ppm de Pb (NO3)2 se observa un total de 70% de malformaciones. De este 70 % el 100% presentó alteraciones implicadas con el desarrollo de la espina. La cifosis (Figura 9) es la malformación más abundante en este tratamiento con 22 individuos, esta se presenta en menor proporción en los primeros estadios y aumenta su incidencia a medida que avanza el tratamiento, siendo más numerosa a partir de la eclosión de los embriones. El edema pericárdico (Figura 11) se presentó desde las 24 horas de exposición de este tratamiento y perduró durante las 144 horas del experimento (Figura 3). La deshidratación del corion se evidenció en dos oportunidades durante el estudio, sin embargo no es un problema permanente durante el resto del experimento.
12). En esta concentración se hace evidente los problemas de formación de columna vertebral, pues se presenta cifosis (Figura 9) en el 40 % de los embriones malformados; esta se ve desde las 72 horas de exposición o después del periodo de eclosión. La escoliosis tiene un 5 % de incidencia (Figura 8) y por último la lordosis tiene un 3 % (Figura 9), observándose solo después de la eclosión de los embriones (Figura 4).
Para la concentración de 3 ppm se denota una completa acumulación de las malformaciones desde las 72 horas de exposición hasta las 144 horas del experimento con un total de 100% de embriones malformados (Tabla 3). Se presentan en mayor proporción las malformaciones anteriormente mencionadas, con una incidencia en hemorragia cefálica (Figura 12), cifosis (Figura 9) y edema pericárdico (Figura 11). Existe una menor incidencia de lordosis (Figura 9), escoliosis (Figura 8) y presencia casi nula de hipertrofia de aletas (Figura 13). Al presentarse estas alteraciones desde la hora 72 en la cual los embriones se encontraban en el periodo de eclosión y formación de vejiga natatoria, se puede concluir que el efecto del plomo internamente se da en los primeros estadios y su evidencia morfológica se presenta después de la eclosión (Figura 6).
El análisis de incidencia de malformaciones se estableció utilizando una prueba de Ji Cuadrado
(ᵡ2) comparando los individuos malformados y no malformados en cada uno de los tratamientos.
Se obtuvo un ᵡ2= 115,17 (Ji cuadrado calculado), que comparado con el ᵡ2 de tablas con 5 grados
tablas lo cual indica que se acepta la hipótesis alterna, es decir, que la presencia de malformaciones es dependiente de la concentración de nitrato de plomo (Tabla 4.)
Tabla 4.Prueba de Ji Cuadrado para la malformaciones y las concentraciones (ppm) de nitrato de plomo.
Aquellas malformaciones asociadas a edema pericárdico y hemorragia cefálica suman un total de 36 % del total de las malformaciones presentadas. Las malformaciones que se presentaron en menor proporción fueron la deshidratación de corion, la columna bífida, el vitelo adicional e hipertrofia de aletas con un total del 5 % (Tabla 3).Por ultimo del total de 360 embriones de Pez Cebra (Danio rerio) expuestos a las cinco concentraciones subletales, el 79 % de estos presento algún tipo de malformación (Tabla 3).
malformaciones. Del mismo modo se nota como a medida que las concentraciones son menores la cantidad de malformaciones también disminuye.
Figura 8. Embriones de Pez Cebra (Danio rerio) con escoliosis. (A). Embrión con escoliosis severa en forma de c y hemorragia en la cúpula óptica. (B). Embrión con desarrollo normal de la columna vertebral. (C). Embrión con escoliosis en forma de s. (D). Embrión con desarrollo normal.
B
C
D
[image:32.612.78.502.155.541.2] [image:32.612.313.503.156.316.2]Figura 9. Embrión de Pez Cebra (Danio rerio) con Cifosis. (A). Embrión con cifosis severa e hipertrofia de aleta cauda. (B). Embrión con desarrollo normal. (C). Embrión con lordosis leve.
A
B
C
Figura 10. Malformaciones en embriones de Pez Cebra (Danio rerio). (A). Embrión con columna bífida y vitelo adicional (ex ovado). (B). Embrión con desarrollo normal.
[image:34.612.74.548.139.298.2]Figura 11. Embriones de Pez Cebra (Danio rerio). (A). Embrión con edema pericárdico. (B). Embrión de pez cebra normal.
Figura 12. Embriones de Pez Cebra (Danio rerio). (A). Embrión con hemorragia encefálica. (B) Embrión con desarrollo normal.
B
A
[image:34.612.81.536.418.591.2] [image:34.612.73.290.421.593.2]Figura 13. Aleta caudal de Pez Cebra (Danio rerio). (A). Aleta caudal con hipertrofia, desorden tisular. (B) Aleta caudal con desarrollo normal.
8. DISCUSIÓN
El impacto de los metales pesados sobre el desarrollo embrionario del pez cebra ha sido estudiado ampliamente; se ha demostrado que el efecto teratogénico se relaciona de manera directa con la dosificación y el tiempo de exposición a estos compuestos. El nitrato de plomo afecta la sobrevivencia, la eclosión y la morfología en los primeros estadios de vida del Pez Cebra (Danio rerio); aunque en este estudio se utilizaron cinco dosis subletales se llego a la conclusión que la mortalidad es una variable determinante en este tipo de experimentos. Se presentó una relación directa a la dosis empleada, es decir que entre mayor fuera la dosis mayor sería la mortalidad, si embargo esta relación no es proporcional [44].
La mortalidad observada en los cinco diferentes tratamientos no supero el 50 % de la población estudiada, no obstante el mayor porcentaje de mortalidad (23%) se presento en la dosis de 1 ppm de Pb (NO3)2 y tan solo un 8 % de la población no sobrevivió a la dosis de 3 ppm. Según autores existen toxinas que no actúan a altas concentraciones pues se inhibe completamente su acción en el organismo, en el caso del plomo es posible que afecte de otras maneras los primeros estadios de su desarrollo. Ansavy & Kumar (1984) sugieren que los embriones son más resistentes a las toxinas mientras su saco vitelino se reabsorbe completamente, una vez esto ha sucedido entonces la exposición a esta toxina incrementará, pues el organismo se ve obligado a buscar alimento en el medio en el que crece [38].
Según Osorio (2010) las dosis letales medias de nitrato de plomo para trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) son 3 ppm, 1 ppm y 0,5 ppm. Para el presente estudio no existió dosis letal media, ya que existe la posibilidad de que la absorción del nitrato de plomo sea completamente diferente para las dos especies debido a una diferencia en el metabolismo de estos.
plomo se ha distribuido por el organismo se acumula en los huesos donde no es toxico [46]. Lo anterior deja en evidencia porqué la mortalidad se da en las primeras horas de exposición de este compuesto y posteriormente se evidencian malformaciones [5, 38].
Así mismo, el agente fúngico fue una variable determinante en el porcentaje de mortalidad de los embriones de Pez Cebra (Danio rerio). El comportamiento de la mortalidad (Figura 1) sugiere que a menores dosis de nitrato de plomo existe una mayor mortalidad causada por hongo y que a mayores dosis de nitrato de plomo existe una baja mortalidad causada por este agente. Estos resultados sugieren que el plomo resulta ser un controlador directo del hongo, situación que evidencia su uso intensivo como plaguicida o pesticida.
Las malformaciones que se observaron en los embriones del Pez Cebra (Danio rerio), fueron desarrolladas durante la embriogénesis y repercuten en los estadios más avanzados, causando retardo del crecimiento parcial, completo o alteraciones funcionales [9]. Similares tipos de malformaciones se han encontrado en diversos estudios con teratógenos diferentes, esto quiere decir que la mayoría de las respuestas son reacciones inespecíficas de las etapas tempranas del desarrollo frente a los tóxicos [13].
Cuando se evalúan dosis subletales se esperan encontrar malformaciones que no comprometan la supervivencia de las larvas como las implicadas con la movilidad de las mismas, esta situación se hizo evidente en este estudio.
Por otro lado las malformaciones como el edema pericárdico (Figura 11) o la hemorragia cefálica (Figura 12) comprometen de manera directa la sobrevivencia de las larvas. El plomo interfiere en la neurotransmisión y tono vascular lo que explicaría que contracciones involuntarias hicieran que las larvas eclosionaran antes de tiempo. Este problema genera también hipertensión y neurotoxicidad efecto que se puede relacionar con las hemorragias cefálicas encontradas en el desarrollo de las larvas, estas pueden estar ocasionadas por la acumulación de plomo en el espacio endoneural lo cual produce edemas, aumenta la presión y termina generando hemorragia y daño axonal causando posteriormente la muerte [46].
Según Samson & Shenker (2000), los periodos más críticos para anormalidades de la aleta caudal comienzan a partir de las 18 horas después de fertilización, pues es el momento en el cual la parte medial de esta estructura comienza su desarrollo; para este estudio los primeros indicios de hipertrofias en la aleta caudal comienzan alrededor de las 24 horas de exposición al compuesto lo cual concuerda con lo planteado por estos autores, no obstante después de la eclosión esta anormalidad es aún más evidente [5].
Otra de las malformaciones presentes en este estudio fue el edema pericárdico, reportado por diferentes autores. Se planea que estos edemas pueden ser causados por la súper hidratación del órgano implicado, debido a problemas de la regulación osmótica derivados de la acumulación de toxina [13, 38, 47]. Según Reimers y col. (2004), reportan este tipo de edemas asociadas a crecimiento de larvas de pez cebra en etanol.
Los estadios de desarrollo tempranos son más sensibles a anormalidades, se indica que entre mayor sea el periodo de exposición se inducen a amoralidades severas. Comenzando por los periodos de segmentación del desarrollo embrionario del pez cebra, se concluye que los estadios tardíos en el desarrollo demuestran mayor número de anormalidades mientras que estadios tempranos muestran mayor porcentaje de mortalidad [5].
9. CONCLUSIONES
Las dosis subletales de nitrato de plomo 3 ppm, 1 ppm, 0.8 ppm, 0.5 ppm, 0.1 ppm aplicadas en el desarrollo embrionario del Pez Cebra (Danio rerio), causaron anomalías congénitas morfológicas evidentes.
La mortalidad tiene una relación directa con las dosis empleadas, sin embargo no existe para este estudio una proporcionalidad en esta relación.
El desarrollo de malformaciones tiene una relación directamente proporcional a las dosis de nitrato de plomo empleadas. El mayor número de malformaciones se presentó en la dosis de 3 ppm, se evidenció un 100% de la población con anomalías en su morfología.
Las malformaciones más frecuentes fueron: cifosis con 125 individuos, hemorragia cefálica con 53 individuos y por ultimo edema pericárdico con 49 individuos. Las malformaciones menos frecuentes fueron: escoliosis con 25 individuos, lordosis con 15 individuos, hipertrofia de aletas con 10 individuos y por último vitelo adicional y columna bífida.
Existe una relación directamente proporcional entre las tres variables estudiadas, es decir que a mayor concentración y duración, habrá posiblemente mayor cantidad de anomalías morfológicas y que a menor concentración y menor duración posiblemente habrá un menor número de anomalías.
10.RECOMENDACIONES
Realizar experimentos para determinar las dosis letales medias para esta especie con el fin de encontrar el límite entre la mortalidad y la anomalía.
Realizar un análisis histológico de los primeros estadios del desarrollo del Pez Cebra (Danio rerio), ya que es probable que el nitrato de plomo afecte órganos vitales internos, ocasionando su muerte.
Evaluar la influencia de otros metales pesados como cobre, zinc, cadmio, sobre el desarrollo embrionario del Pez Cebra Danio rerio.
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