COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LA β-XILOSIDASA DURANTE LA MADURACIÓN DEL LULO Solanum quitoense
LISBET KARINA QUIROGA ALVAREZ LINA MARCELA MURILLO CAVIEDES
TRABAJO DE GRADO MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LA β-XILOSIDASA DURANTE LA MADURACIÓN DEL LULO Solanum quitoense
LISBET KARINA QUIROGA ALVAREZ LINA MARCELA MURILLO CAVIEDES
INGRID SCHÜLLER, PhD Decana Académica Facultad de Ciencias
JANETH ARIAS, M.Sc Directora
Carrera de Microbiología industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
2012
COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LA β-XILOSIDASA DURANTE LA MADURACIÓN
DEL LULO Solanum quitoense
LISBET KARINA QUIROGA ALVAREZ LINA MARCELA MURILLO CAVIEDES
YENNY MARITZA DUEÑAS GÓMEZ, M.Sc Directora del Trabajo de Grado
NADENKA MELO, M.Sc Jurado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
BOGOTÁ D.C. 2012
Artículo 23, Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea el anhelo de
nuestra base, nuestro apoyo y nuestra
fuerza para salir adelante.
Lisbet Karina Quiroga A.
[image:6.612.69.541.268.717.2]Lina Marcela Murillo C.
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN………....………….8
INTRODUCCIÓN………...………..9
1. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA………..……..11
1.1 Planteamiento del problema……….………..11
1.2 Justificación………...12
2. MARCO TEÓRICO……….….13
2.1. Generalidades en la maduración.……….……….………13
2.2. Enzimas posiblemente implicadas en la hidrólisis de la pared celular vegetal…………14
2.3. Actividad β-xilosidasa………...15
3. OBJETIVOS……….……..16
3.1. Objetivo General……….....16
3.2. Objetivos Específicos………..……….16
4. METODOLOGÍA……….……….17
4.1. ETAPA 1: Optimización del proceso de extracción de la β-xilosidasa………...17
4.1.1 Material Vegetal………..………....17
4.1.2 Extracción de la enzima....………..……….…......17
4.1.3 Cuantificación de la actividad de la enzima…………………......17
4.1.4 Cuantificación de proteína……….…..17
4.1.5 Variables que se modificaron para la extracción de la enzima………...18
4.2 ETAPA 2: Comportamiento de la enzima durante la maduración………..18
4.2.2 Comportamiento cinético de la β-xilosidasa durante la maduración del lulo……19
4.3 Análisis Estadístico………....19
5. RESULTADOS………......20
5.1. Selección de variables para la extracción de la enzima en pulpa y cáscara………20
5.1.1. Concentración de polivinilpirrolidona………..…...20
5.1.2. Concentración de NaCl.………..……….….………….21
5.1.3. Concentración de buffer..……….……….……….22
5.1.4. Rangos de pH…...……….……….………23
5.1.5. Rangos de temperatura………..……….24
5.1.6. Rangos detiempo……….….………..…………...25
5.1.7. Concentración de sustrato………..……26
5.2. Comportamiento de la enzima durante la maduración……….………27
6. CONCLUSIONES……….....31
7. RECOMENDACIONES………...32
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………......33
9. ANEXOS……….....36
9.1. ANEXO 1: Curva patrón de p-nitrofenol..………….……. ………36
9.2. ANEXO 2: Curva patrón de Lowry..………37
9.3. ANEXO 3: Experimento 1: Concentraciones de PVPP en pulpa y cáscara………….....38
9.4. ANEXO 4: Experimento 2: Concentraciones de NaCl en pulpa y cáscara..………39
9.5. ANEXO 5: Experimento 3: Concentraciones de buffer en pulpa y cáscara...…………..40
9.6. ANEXO 6: Experimento 4: Concentraciones de pH en cáscara y pulpa………41
9.7. ANEXO 7: Experimento 5: Rangos de temperatura en pulpa y cáscara.……….42
9.8. ANEXO 8: Experimento 6: Rangos de tiempo en pulpa y cáscara……….…….43
9.9. ANEXO 9: Experimento 7: Concentraciones de sustrato en pulpa y cáscara…………..44
9.10. ANEXO 10: Días de muestreo…………...………....45
RESUMEN
Las β-xilosidasas son exo-enzimas encargadas de hidrolizar el xilano presente en la pared
celular vegetal, liberando residuos de β-D-xilosa. El estudio de estas enzimas se ha centrado en
frutos como fresa, aguacate, entre otros; y a nivel microbiológico en hongos y bacterias. En el
presente trabajo se tomó como objeto de estudio el lulo variedad Solanum quitoense, con el fin
de profundizar en el comportamiento cinético de la β-xilosidasa, y analizar si está involucrada
en el proceso de ablandamiento de este fruto climatérico.
La investigación se dividió en dos etapas, donde en la primera con la utilización de la cáscara y
la pulpa del lulo, se evaluaron y seleccionaron las mejores variables que permitieran una
óptima extracción de la β-xilosidasa, siendo los mejores resultados: 0.5 %p/v, PVPP(polivilnilpirrolidona), 0.05M buffer acetato de sodio, pH 6.0. También se evaluó tiempo,
temperatura y concentración de sustrato, cuyos resultados fueron 30 minutos, 37°C y 5mM
respectivamente. En la segunda etapa se tomaron 33 lulos que maduraron a temperatura
ambiente durante 11 días, empleando la corteza y realizando la respectiva medición de la
actividad de β-xilosidasa, utilizando los resultados obtenidos en la primera etapa.
Durante la maduración del lulo se evidenció que la β-xilosidasa ejerce un papel significativo en
la hidrólisis del xilano, especialmente durante los primeros ocho días de maduración, dado que
en este intervalo de tiempo se aprecian cambios en la coloración del fruto. Después del día 8, la
actividad disminuye, por tanto, no cuenta con los mecanismos suficientes para continuar con el
proceso de ablandamiento del fruto. Gracias a los resultados obtenidos se podría deducir que la
β-xilosidasa junto con otras enzimas hidrolíticas estarían implicadas en el proceso de
INTRODUCCIÓN
El lulo crece en forma espontánea en los Andes, entre los 1200 y 2100 m.s.n.m. encontrándose,
especialmente, en sitios frescos y sombreados, cercanos a corrientes de agua, con temperaturas
entre 17 y 20°C. Desde hace más de 80 años ha ganado importancia como una planta de
potencial económico en el sector industrial para la fabricación de jugos, yogurt, saborizantes,
refrescos y alimentos procesados, además, a nivel internacional el lulo es apetecido por sus
características organolépticas como su aroma y sabor agridulce, también por sus propiedades
nutricionales (1). A pesar de ser un fruto con alta demanda, el problema en su distribución bien
sea nacional o internacional, radica en la baja continuidad o perdurabilidad del mismo, sobre
todo en lo relacionado con la maduración del fruto ya que los cambios de color, el
ablandamiento, la textura, el aroma y las alteraciones en el metabolismo de azúcares,
aumentan la susceptibilidad al ataque por patógenos ocasionando una disminución en su
aceptabilidad frente al consumidor.
Como consecuencia de lo anterior se hace necesario entender los factores enzimáticos que
aceleran la maduración, donde se cree que enzimas como la β-xilosidasa, está relacionada con los cambios producidos en la pared celular del fruto pos-cosecha y su velocidad de
ablandamiento, por lo que genera importancia determinar su cinética, a partir de la extracción
de la enzima en la corteza y pulpa del especie (Solanum quitoense), para posteriormente
determinar la correlación de la β-xilosidasa en el proceso de hidrólisis de xilanos en la pared
celular.
Este estudio comprendió dos etapas características, en la primera se seleccionaron las mejores
variables que permitieran una óptima extracción de la β-xilosidasa, utilizando la corteza y
pulpa de lulos amarillos color 4 (2), posteriormente, en la segunda etapa se evaluó el
comportamiento cinético de la enzima, con las mejores variables ya seleccionadas, durante el
proceso de maduración del lulo, iniciando en color 0 (2).
Con esto se buscó caracterizar la actividad de la β-xilosidasa, para que en estudios posteriores se puedan desarrollar mecanismos de control de la enzima con el fin de prolongar los tiempos
El tipo de muestreo implementado fue aleatorio simple; la finalidad del diseño es de tipo
descriptiva, el control de asignación de los factores del estudio fue observacional, la secuencia
1. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.1 Planteamiento de problema:
En Colombia, el cultivo de lulo variedad Solanum quitoense representa el 1.7% de la producción
nacional de frutas, cultivadas por pequeños y medianos agricultores pero la demanda de
consumo del fruto a nivel nacional no se satisface con la producción local, por lo que
aproximadamente un 21.7% del consumo nacional se importa de Ecuador. El bajo aporte
regional está relacionado con el mal manejo y el avanzado estado de madurez de la fruta
comercializada. (3)
El lulo al ser un fruto climatérico, después de su recolección continúa con su proceso de
maduración, por tanto, los procesos metabólicos se pueden acelerar, ocasionado un deterioro
del mismo, haciéndolo inadecuado para su consumo, por eso es necesario conocer factores que
puedan acelerar los procesos oxidativos en los cultivos, para poder determinar mecanismo de
mitigación a este problema.
A la fecha se han estudiado diversas enzimas y proteínas que tienen algún tipo de influencia
sobre polímeros de pared celular, con el fin de determinar su participación en el proceso de
ablandamiento, pero, en enzimas como la β-xilosidasa la variación de su actividad está
involucrada con la expresión de genes que codifican para esta enzima y que no siguen el mismo
patrón en frutos de distintas especies, por eso y debido a los pocos estudios que se han realizado
con respecto a esta enzima en el lulo, es necesario complementarlos debido al interés económico
en el país, y que además se desconoce su comportamiento pos-cosecha.
1.2 Justificación
Por su importancia económica y valor nutricional, el lulo es fuente de interés investigativo, tal
es el caso de estudios relacionados con la caracterización fisicoquímica de las variedades de
lulo, investigaciones enfocadas en el entendimiento del comportamiento de algunas enzimas tipo
hidrolasas, que se cree, son responsables de los diferentes procesos bioquímicos que gobiernan
-galactosidasa, endo-β-1,4-glucanasa, pectin metilesterasa, α-L-arabinofuranosidasa, entre otras. En este sentido, y en aras de seguir contribuyendo en este campo, se propuso analizar el
comportamiento de la β-xilosidasa, enzima que no ha sido reportada en el lulo.
Así mismo, es importante determinar las condiciones experimentales óptimas para la extracción
de la enzima, la selección de variables que permitan una mejor respuesta en la activad de la
enzima, con el fin, de brindar un nuevo conocimiento analítico y objetivo del comportamiento de
la β-xilosidasa frente a procesos que involucran cambios en la pared y así mejorar las condiciones actuales referentes a las altas pérdidas en el manejo pos-cosecha del lulo para
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades en la maduración
Durante la maduración de los frutos se observan cambios organolépticos, tales como
modificaciones externas e internas en el color, atribuidas a la acción de compuestos como las
antocianinas (almacenadas en vacuolas) que son flavonoides hidrosolubles, sintetizadas por vía
fenilpropanoide, ó la actividad de carotenoides localizados en cromoplastos (6). Por otra parte,
el sabor del fruto luego se la cosecha se puede ver alterado por la acción de ácidos orgánicos
que disminuyen durante la maduración ya que son utilizados como sustrato en el proceso de
respiración (7); también el cambio del dulzor es consecuencia de la hidrólisis del almidón,
característica de todos los frutos climatéricos. Además de estos dos factores, los cambios en el
aroma son responsabilidad de compuestos volátiles dentro de los que se encuentran aldehídos,
alcoholes, ésteres, entre otros (6).
Los cambios fisiológicos que se precisan en los frutos climatéricos, se relacionan estrechamente
con la actividad del etileno, una de las principales hormonas que regulan los procesos de
maduración. En el tomate, se sugiere que está asociado a la expresión de genes que codifican
para la síntesis de enzimas como la xilosidasa y que activa a otros genes involucrados en el
fenómeno de ablandamiento (8)
El ácido abscísico es otra hormona que se acumula durante la maduración de los frutos
climatéricos, causando cambios en el color, en el ablandamiento y variaciones en la producción
de etileno (9). Otro compuesto importante implicado en el incremento de los niveles de etileno,
es el óxido nítrico, descrito como importante mensajero secundario en células animales y
vegetales, el cual disminuye sinérgicamente en la maduración, y si es aplicado exógenamente
prolonga la vida útil post-cosecha del fruto disminuyendo la producción de etileno (10).
Si bien estos dos últimos favorecen el aumento en la producción de etileno, el ácido salicílico,
que es un compuesto fenólicos disminuye su producción y protege al fruto del ataque de hongos
2.2 Enzimas posiblemente implicadas en la hidrólisis de la pared celular vegetal
Dentro de las enzimas que tienen potencial despolimerizante de la pectina que representa el
35% del componente de la pared (4) y que son partícipes del proceso de maduración se
encuentran: a) poligalacturonasas cuyo papel es hidrolizar el ácido galacturónico donde las de
actividad endo son responsables del ablandamiento en frutos (14), b) β-galactosidasas, que
remueven la β-D-galactosa produciendo grandes cambios durante la maduración (15) y c) α -L-arabinofuranosidasas responsables de liberar arabinosa actuando en pectina y hemicelulosa,
cuya actividad se acentúa durante la maduración (16).
Las expansinas son otras proteínas que se cree actúan sobre los enlaces no covalentes de la
celulosa y hemicelulosa, interviniendo en el proceso de ablandamiento durante la maduración
de frutos, aunque no se conoce la actividad hidrolítica de estas enzimas a nivel de pared celular.
(17).
2.3 Actividad β-xilosidasa:
La firmeza de los frutos está caracterizada por la rigidez y composición de la pared celular, que
está constituida por celulosa (conformada por cadenas lineales de β-1,4-D-glucopiranosa),
hemicelulosa (constituida por polisacáridos flexibles como xiloglucanos, que son polímeros
lineales de β-1,4-D-glucopiranosa con cadenas laterales de xilosa o galactosa que dependiendo de la etapa de desarrollo puede contener xilanos y glucomananos), pectina (compuesto por
ácidos galacturónico y glucurónico) y proteínas estructurales (11).
El xilano, constituido por una cadena lineal de β-1,4-D-xilopiranosa con ramificaciones laterales de ácido 4-O-metilglucurónico y arabinosa, es el componente principal de la
hemicelulosa, y su estructura puede cambiar durante el proceso de desarrollo y maduración del
fruto. Su degradación está dada por la acción sinérgica de las enzimas endo-β-1,4 quienes
hidrolizan los enlaces β-1,4-glicosídicos del xilano liberando xilooligosacáridos y β-xilosidasas encargadas de la hidrólisis de los xilooligosacáridos liberando xilosa (12).
Las β-xilosidasas son enzimas que poseen alta estabilidad térmica y cuya actividad óptima se
dada por la expresión del gen FaXyl1 bajo la influencia de hormonas implicadas en el proceso
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general:
Evaluar el comportamiento cinético de la enzima β-xilosidasa durante el proceso de maduración en el lulo variedad Solanum quitoense y su relación con el ablandamiento tanto en la corteza y
en la pulpa del fruto.
3.2 Objetivos específicos:
• Optimizar el proceso de extracción de la β-xilosidasa utilizando la corteza y pulpa de lulo
• Realizar una caracterización cinética parcial de la β-xilosidasa a partir de la corteza y pulpa del lulo.
• Evaluar el comportamiento de la enzima durante el proceso de maduración del lulo a
4. METODOLOGÍA
4.1 ETAPA 1: Optimización del proceso de extracción de la β-xilosidasa
4.1.1 Material vegetal: Se trabajó con lulos de la variedad Solanum quitoense obtenidos
de la finca San Antonio, vereda Guacaica Departamento de Caldas. La coloración de
los lulos, según tablas de colores, debía ser categoría 4 (2), libre de imperfectos y
completamente sanos.
4.1.2 Extracción de la enzima: Se utilizaron 3 g de pulpa y 3 g de corteza de los frutos,
por separados se maceraron con nitrógeno líquido, hasta obtener una mezcla
homogénea, las cuales se lavaron con acetona fría. A los pellet obtenidos tanto de
corteza como de pulpa se les adicionó el buffer de extracción teórico (0.05 M acetato
de sodio/acido acético, 1 M NaCl, 1 % PVPP, pH: 6.0) (18), dejándolo actuar
durante dos horas, en agitación a 4°C. Seguido a esto, se centrifugó a 3900 rpm por
20 min, utilizando el sobrenadante como extracto enzimático, para la cuantificación
de la actividad de la enzima y de la proteína.
4.1.3 Cuantificación de la actividad de la enzima: Se determinó la actividad de la β
-xilosidasa tomando 750µL del extracto enzimático más 750 µL
p-nitrofenil-ß-D-xilopiranósido. La mezcla se incubó a temperatura de 37°C durante 30 min. Esta
reacción se detuvo con 500µL de Trizma base al 1%p/v, luego se leyó en el
espectrofotómetro a 410nm (4). La actividad de la β-xilosidasa se expresó en
micromoles de p-nitrofenol liberado por segundo por miligramo de proteína bajo las
condiciones de ensayo.
4.1.4 Cuantificación de proteína: Se utilizó el método de Lowry (17), utilizando 400µL de
4.1.5 Variables que se modificaron para la extracción de la enzima: Los parámetros
que se modificaron para optimizar la extracción de la β-xilosidasa, se hicieron de forma escalonada, por triplicado y en el siguiente orden:
Experimento 1: se evaluaron diferentes concentraciones de polivilnilpirrolidona (PVPP) en el
buffer: 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0% p/v, manteniendo los demás parámetros estables.
Experimento 2: se evaluaron diferentes concentraciones de cloruro de sodio (NaCl) en el buffer:
0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0M; manteniendo constantes las demás variables.
Experimento 3: se evaluaron diferentes concentraciones de buffer (acetato de sodio/ácido
acético): 0.01, 0.05, 0.1, 0.15 y 0.2M (moles/L); sin modificar las demás variables.
Experimento 4: se evaluaron diferentes rangos de pH en el buffer: 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 y 7.0; las
demás variables se mantuvieron.
Experimento 5: se evaluaron diferentes rangos de temperatura: 20, 37, 40, 60 y 60 °C; se
dejaron estables las demás variables.
Experimento 6: se evaluaron diferentes tiempos de reacción: 15, 30, 45, 60 y 75 min; se dejaron
las demás variables estáticas.
Experimento 7: se evaluaron diferentes concentraciones de sustrato
(p-nitrofenil-ß-D-xilopiranósido): 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 y 7.0 mM.
4.2 ETAPA 2: Comportamiento de la β-xilosidasa en la maduración
4.2.1 Selección de frutos: Se seleccionaron lulos color 0 (2), sanos, sin abrasiones en su
corteza. Se distribuyeron uniformemente en canastillas y se dejaron en maduración
completa a temperatura ambiente en el laboratorio de Química de Alimentos de la
Pontificia Universidad Javeriana.
4.2.2 Cinética de la β-xilosidasa en el lulo: El proceso de maduración completa del lulo
duró 11 días, por lo tanto, se hicieron muestreos diarios, donde por triplicado se
- Actividad de la β-xilosidasa: se utilizaron las mejores variables de respuesta obtenidas en la primera fase, teniendo en cuenta los protocolos de extracción de la enzima y de
cuantificación de la proteína descritos anteriormente.
- ° Brix: Se utilizó un refractómetro manual, aplicando 3 gotas de la pulpa del fruto en el
prisma, para posteriormente hacer la lectura correspondiente.
4.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO:
La información obtenida se analizó mediante la prueba ANOVA, donde se contrastó la hipótesis
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Selección de las variables para la extracción de la enzima en pulpa y cáscara:
El criterio de selección para cada una de las variables utilizadas fue la mejor respuesta en la
actividad de la enzima tanto en cáscara como en pulpa.
La actividad de la β-xilosidasa en cada uno de los ensayos se expresó como micromoles de p-nitrofenol liberado por segundo por miligramo de proteína bajo las condiciones de ensayo.
5.1.1 Concentración de PVPP
Se emplearon diferentes concentraciones de PVPP para cáscara y pulpa (Gráfica 1). Se observó
que para el caso correspondiente a cáscara (A), con una concentración de 0.5 % p/v se logra
una mejor respuesta en la actividad de la enzima siendo de 0.032 U/mg proteína; mientras que
en pulpa (B), a concentración de 2.0% p/v se obtuvo la mayor actividad, pero al comparar los
valores obtenidos con los de cáscara estos son considerablemente bajos, seleccionándose así la
concentración de 0.5 % p/v para ambos (Ver Anexo 3).
Gráfica 1. Concentraciones de PVPP en cáscara (A) y pulpa (B).
0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,0250 0,0300 0,0350 0,0400
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
β -xi lo si da sa U/m g de p ro te ína
Concentraciones de PVPP en cáscara (% p/v)
Concentraciones de PVPP
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Concentraciones de PVPP en pulpa (% p/v)
La utilización del PVPP radica principalmente en que es un aditivo que colabora en la
eliminación de los compuestos fenólicos, dado que estos pueden reaccionar con las enzimas,
inactivarlas o disminuir su actividad (21).
Según un estudio realizado en guayaba, empleando PVPP a una concentración de 0.5 % p/v, se
puede llegar a desfenolizar hasta un 68.9% (22), y, aunque en este trabajo no se cuantificaron
los fenoles en cáscara y pulpa, se reporta que el contenido fenólico equivale a 58.3mg / 100g de
lulo fresco (23); ahora, si se compara la concentración del aditivo utilizado en el presente
estudio, la respuesta en la actividad de la β-xilosidasa, quizás se atribuya a la efectiva
eliminación de los fenoles.
5.1.2 Concentración de NaCl:
Se trabajaron diferentes concentraciones de sal para la extracción de la enzima (Gráfica 2). En
los resultados obtenidos para la cáscara (Gráfica 2A) se encontraron diferencias
estadísticamente significativas entre las concentraciones evaluadas, mostrando que la mayor
respuesta en la actividad de la enzima se presentó en ausencia de la sal, siendo su valor de
0.003 U/mg proteína (Ver anexo 4).
Para el caso de la pulpa (Gráfica 2B), se observó una actividad específica de 0.001U/mg
proteína a una concentración 0.5 M NaCl, esta actividad decae significativamente en la
concentración de 1.0M NaCl, después de observar este comportamiento en la enzima se decidió
tomar la concentración anterior a la de 0.5 M, que era la de 0.0 M que mostró una actividad
específica de la β-xilosidasa de 0.001U/mg proteína (Anexo 4).
Gráfica 2. Concentraciones de NaCl en cáscara (A) y pulpa (B).
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035 0,0040
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Concentraciones de NaCl en cáscara (moles/L)
Concentraciones de NaCl
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Concentraciones de NaCl en pulpa (moles /L)
El NaCl ha sido ampliamente utilizado para extraer enzimas por efecto de potencial osmótico o
por fuerzas iónicas (23), por lo cual, al ser la β-xilosidasa una exo-enzima no es necesaria la
utilización de esta sal para lograr una mejor solubilización, ya que estas enzimas son
naturalmente liberadas al medio por la célula. Aunque en estudios realizados anteriormente
para el monitoreo de la actividad de xilanasas en lulillo muestran la necesidad de la utilización
de NaCl para la extracción de esta enzima, se encontró que hay una mejor respuesta en la
actividad de la enzima cuando las cortezas maceradas con nitrógeno líquido son inmersas en
buffer fosfato con 1.5M de NaCl durante 5 minutos (19). Las diferencias observadas entre el
presente estudio y el mencionado podrían radicar en la especie de lulo utilizado, al tipo de
enzima y el tiempo de acción en el cual se midió la actividad.
5.1.3 Concentración de buffer (acetato de sodio/ácido acético).
Se evaluaron diferentes concentraciones de buffer para la extracción de la enzima en cáscara
(A) y en pulpa (B) (Gráfica 3). Con respecto a cáscara estadísticamente no hay diferencias entre
las medias de los tratamientos, dado que se obtuvieron valores similares en las actividades
específicas de las 5 concentraciones, las cuales oscilaron entre 0.003 y 0.0036 U/mg proteína,
por lo tanto, se seleccionó la concentración de 0.05M en la cual la actividad fue de 0,0036 U/mg
proteína (Ver anexo 5).
Para la pulpa, las variaciones en los datos obtenidos no fueron homogéneas, mostrando que el
valor más alto en la actividad específica fue de 0.002U/mg proteína con una concentración de
0.1M. El comportamiento que se evidencia en la gráfica, muestra una tendencia en crecimiento,
hasta la concentración de 0.10M y decae a 0.15M; por tanto, se seleccionó la concentración de
Gráfica 3. Concentraciones de buffer acetato de sodio/ácido acético en cáscara (A) y en pulpa (B).
5.1.4 Rangos pH:
Los rangos de pH trabajados en el buffer acetato de sodio/ácido acético, oscilaron entre 3.0 y
7.0 para cáscara (A) y pulpa (B) (Gráfica 4). Se observó que en la cáscara había un
comportamiento no homogéneo en las varianzas de las actividades específicas de la enzima,
donde el valor de pH: 6.0 fue el que presentó mayor actividad siendo esta de 0.003U/mg
proteína. (Anexo 6). En pulpa se apreció el mismo comportamiento, siendo la mayor actividad a
pH 6 de 0,0019 U/mg proteína.
Gráfica 4. Rangos de pH en cáscara (A) y en pulpa (B).
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035 0,0040
0.01 0.05 0.10 0.15 0.20
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Concentraciones de buffer acetato de sodio/ácido acético en cáscara (moles/L)
Concentraciones de buffer acetato de sodio/ácido acético
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030
0.01 0.05 0.10 0.15 0.20
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Concentraciones de buffer acetato de sodio/ácido acético en pulpa (moles/L)
Concentraciones de buffer acetato de sodio/ácido acético
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025
3 4 5 6 7
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Rangos de pH en cascara
Rangos de pH
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025
3 4 5 6 7
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Rangos de pH en pulpa
Para el buffer acetato los resultados obtenidos con referencia a la concentración de 0.05 M
indica una similitud con estudios realizados en fresa y guayaba donde se trabaja con esta misma
concentración obteniéndose una alta actividad de la enzima. (4, 18, 23)
Los rangos de pH óptimos que permiten mejores respuestas en la actividad de las enzimas, están
entre 4.5-6.0, dado que valores inferiores a 4.5 causan una disminución en su actividad,
aproximadamente de un 67.2%, y por encima de 6.0 decae alrededor de 50.8%; esto puede
darse por la posible modificación del sitio activo de la enzima, reportándose así una estabilidad
de esta a pH cercanos a 6.0 (25).
5.1.5 Rangos de temperatura:
En los 5 rangos de temperatura evaluados (Gráfica 5) en cáscara los datos fueron cercanos, por
esta razón se seleccionó el valor teórico de 37°C que presentó una actividad de 0.002 U/mg
proteína, (Anexo 7). En pulpa los datos no mostraron evidencia estadísticamente significativa
entre los rangos de temperatura, por tanto, las reacciones se trabajaron a 370C, con una
actividad específica de 0.0006 U/mg proteína. (Anexo 7)
Gráfica 5. Rangos de temperatura en cáscara (A) y en pulpa (B).
Existen algunas β-xilosidasas que presentan una elevada estabilidad térmica, especialmente a temperaturas entre 30 y 50°C (19). Los rangos evaluados en este trabajo están en temperaturas
de 20 a 60°C, los resultados obtenidos mostraron un comportamiento similar en la actividad de
la enzima en todas las temperaturas, pero dicha actividad fue mayor a temperatura ambiente, 0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025
20 37 40 50 60
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Rangos de temperatura en cascara (0C)
Rangos de temperatura
0,0000 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,0010 0,0012
20 37 40 50 60
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Rangos de temperatura en pulpa (0C)
dado que esta no es constante si no que depende de las fluctuaciones climáticas, se tomó el valor
teórico de 37°C que fue la segunda actividad más alta. Se pudo observar también dentro del
ensayo que a 50°C hay una disminución en la actividad, que según literatura puede llegar a ser
de un 36 a un 80% en un periodo de incubación de 30 minutos (24), el comportamiento que se
aprecia a los 50 y 60°C puede deberse a una represión de actividad y por ende el clivaje de la
enzima porque a altas temperaturas se desnaturalizan (25).
5.1.6 Rangos de tiempo
En la determinación del mejor tiempo para la cuantificación de la actividad enzimática los datos
obtenidos para los rangos de 15, 30, 45, 60 y 75 min (Gráfica 6) en cáscara (A), mostraron que
a los 30 minutos se obtuvo la mayor actividad específica de la enzima siendo de 0,0040 U/mg
proteína. (Anexo 8). En el caso de pulpa (B) se observó un comportamiento similar que en
cáscara, siendo la mayor actividad específica a los 30min, cuya actividad fue de 0,0009 U/mg
proteína.
Gráfica 6. Rangos de tiempo en cáscara (A) y en pulpa (B)
La mayor actividad hidrolítica de la enzima tanto en pulpa como en cascara coincidió con la
literatura donde el mejor tiempo es de 30 minutos (24), porque es el tiempo en que la enzima
cataliza el rompimiento del sustrato artificial utilizado (p-nitrofenil-ß-D-xilopiranósido). 0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035 0,0040 0,0045 0,0050
15 30 45 60 70
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Rangos de tiempo en cascara (min)
Rangos de tiempo
0,0000 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,0010 0,0012
15 30 45 60 70
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Rangos de tiempo en pulpa (min)
5.1.7 Concentración de sustrato, p-nitrofenol- ß-D-xilopiranósido
Se evaluaron distintas concentraciones de sustrato para cáscara (A) y para pulpa (B) (Gráfica
7). En este parámetro para cáscara se observó que las concentraciones 4.0 y 5.0 mM mostraron
una actividad específica de la enzima igual siendo esta de 0.003 U/mg, por ende para la
selección de la mejor concentración de sustrato se tomó 5.0 mM que coincide con la
concentración teórica. (Anexo 9) En pulpa la varianza en los datos obtenidos es homogénea,
mostrando que el valor más alto en la actividad específica fue de 0.00098 U/mg proteína a
concentración 6.0 mM, pero después de dicho valor la actividad decae considerablemente por lo
cual se seleccionó el valor teórico, siendo este de 5mM. (Anexo 9)
Gráfica 7. Concentraciones de sustrato en cáscara (A) y pulpa (B).
Las xilanasas como la β-xilosidasa tienen la característica de hidrolizar sustratos naturales y
artificiales (19) como el utilizado en los ensayos (p-nitrofenil-ß-D-xilopiranósido), con este
sustrato se observó una disminución de la actividad a concentraciones mayores de 6.0mM,
donde la concentración que mejor resultado presentó fue 5.0mM siendo esta la referenciada por
la literatura (4). Este comportamiento puede darse debido a que la afinidad de las β-xilosidasas
disminuye al incrementar el grado de polimerización de los compuestos xilooligosacáridos, ya
que actúan en aquellos que son cortos o la xilobiosa hidrolizando los enlaces β(1-4), liberando D-xilobiosa a partir del extremo no reductor de estos sustratos (26).
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035 0,0040
3 4 5 6 7
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Concentraciones de sustrato p-nitrofenil-ß-D-xilopiranósido en cascara
(mmoles/L)
Concentraciones de sustrato
0,0000 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,0010 0,0012
3 4 5 6 7
β -xi lo si da sa U/m g pr o te ína
Concentraciones de sustrato p-nitrofenil-ß-D-xilopiranósido en pulpa
(mmoles/L)
5.2 Comportamiendo de la enzima durante los días de maduración.
Al analizar el comportamiento en la actividad de la enzima, entre pulpa y cáscara, no se
observaron diferencias significativas en los resultados de pulpa, debido a la baja concentración
de hemicelulosa en su conformación, por ello no se realizaron las mediciones de los días de
maduración para ésta, solo se determinó la actividad en cascara.
Al trascurrir los 11 días en los que el fruto pasó de color 0 a color 4 (como se observa en la
Figura 1), se determinó el incremento de la actividad específica, la actividad osciló entre 0.0008
y 0.003 U/mg proteína. Este aumento fue representativo solo hasta el día 8 donde se observó el
tope máximo de actividad siendo esta de 0.003 U/mg proteína. Después del octavo día, la
actividad disminuyó drásticamente llegando a ser de 0.001 U/mg proteína al día noveno,
terminando al día 11 con una actividad específica de 0.001 U/mg proteína. (Ver Grafica 3 y
anexo10)
[image:28.612.77.541.360.597.2]Grafica 8. Actividad de la β-xilosidasa durante la maduración del lulo.
Se realizó la comparación de la actividad específica de la enzima β-xilosidasa en los 11 días de
muestreo frente al grado de maduración, en el caso de pulpa no se observaron resultados
significativos durante la selección del mejor buffer de extracción para la enzima en estudio,
teniendo actividades específicas entre los rangos de 0,000 a 0,001 U/mg proteína, estos
resultados se consideran despreciables con respecto a los valores obtenidos para cáscara, por
ello este ensayo solo se hizo para este último.
Durante los 11 días del ensayo se observó que la actividad de la enzima aumentó a medida que
se presentaron cambios en la maduración de los frutos recolectados, presenciándose un viraje
de color 0 a color 4, mostrando la mayor actividad específica de la enzima al día 8 siendo de
0,0027 U/mg proteína, esto debido al posible rol de la actividad de la β-xilosidasa en el
ablandamiento y cambios de textura del fruto analizado, que se producen en la etapa de
maduración donde la enzima hidroliza la hemicelulosa presente en la pared primaria de la
corteza que es producto de la acumulación de micro fibrillas de celulosa y representa del 20 al
35% de esta pared (19), formando una red laxa que permite el crecimiento celular. Además está
claro que el proceso de maduración en frutas climatéricas como el lulo está asociado con la
degradación enzimática en compuestos de pared celular como celulosa, hemicelulosa o pectina, 0,0000
0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
β
-xi
lo
si
da
sa
U/m
g
pr
o
te
ína
ACTIVIDA DE LA Β-XILOSIDASA DURANTE LA MADURACION DEL LULO
por la acción de diversas enzimas hidrolíticas como poligalacturonasas, β-xilosidasas,
expansinas, pectato liasas, es decir no solo por la acción de la β-xilosidasa (19).
Ahora bien, uno de los parámetros que permitió determinar si evidentemente la degradación de
polímeros de pared en el proceso de maduración es significativo, es el comportamiento de
sólidos solubles que representan aproximadamente el 85% de azúcares, estos fueron medidos en
pulpa para los mismos 11 días como grados Brix (Gráfica 9), los cuales permitieron observar
las sustancias solubles en agua, y la correlación con la firmeza del fruto, donde un dato mayor o
igual a 4, representa una concentración mayor de sólidos y por consiguiente una mayor firmeza
según literatura (27). Los resultados obtenidos mostraron esta tendencia, lo que quiere decir
que los lulos con los que se trabajaron concentraron sólidos solubles a medida que aumentó la
maduración, estos son producto de la diferente participación enzimática que libera azucares
como sacarosa, glucosa o fructosa, resultado de la hidrolisis de compuesto como almidón o la
oxidación de ácidos como el acido cítrico.
Gráfica 9. Grados Brix.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
G
rados
B
ri
x
Grados Brix en los días de maduración
A pesar de no llevar el experimento a la etapa de senescencia, se observó que los sólidos
solubles tienden a estabilizarse después del día 9 lo que indicaría el momento de mayor
actividad enzimática, lo que concuerda con estudios anteriores donde dicha estabilidad se da a
los 10 días de maduración, viéndose similar a los resultados obtenidos en este estudio donde la
6. CONCLUSIONES
Las variables seleccionadas para la óptima extracción de la β-xilosidasa en cáscara y
pulpa fueron 0.5%p/v PVPP, buffer (acetato de sodio/acido acético) 0.05M y pH6 que
permitió un máximo de actividad específica de la enzima en lulo variedad Solanum
quitoense de 0.00311U/mg de proteína y 0.000982 U/mg de proteína, respectivamente.
Se encontraron los mejores parámetros cinéticos de tiempo y temperatura siendo estos de
30 minutos y 37 °C respectivamente, permitiendo un máximo de actividad de la enzima,
0.00407U/mg de proteína para tiempo en cáscara y en pulpa 0,00094 U/mg de proteína;
para temperatura el punto más alto de actividad en cáscara fue 0,00211 U/mg de
proteína y en pulpa de 0,00064 U/mg de proteína.
La concentración de sustrato que permitió cuantificar la mayor actividad estuvo en
5.0mM, mostrando para cáscara una actividad específica de 0,0031 U/mg de proteína y
en pulpa de 0,0009005 U/mg de proteína.
Estableciendo un paralelo en el comportamiento en la actividad de la enzima, entre
pulpa y cáscara, no se observó diferencia significativa en los resultados, debido a la baja
concentración de hemicelulosa en pulpa, por ello no se realizaron las mediciones de los
días de maduración.
En los 11 días de muestreo se observó aumento de la actividad β-xilosidasa mostrando el
mayor pico de actividad al día 8 siendo de 0,0027 U/mg de proteína, donde el lulo paso
de color 0 a color 4, por lo que podría decirse que esta enzima se encuentra implicada en
los procesos de degradación de la pared y ablandamiento del lulo.
Al medir los grados Brix en pulpa se pudo determinar que aumentaron al transcurrir la
maduración del fruto, lo que indicaría actividad hidrolítica de enzimas, relacionadas con
7. RECOMENDACIONES
Sería importante hacer una electroforesis bidimensional (Isoelectroenfoque) con el fin de
separar las proteínas con un gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de
acuerdo con su punto isoeléctrico, para determinar específicamente la proteína
evaluada.
Continuar con el estudio del efecto de la actividad de la β-xilosidasa en frutos
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Barcelona, facultar de biología, departamento de Microbiología. 2007. 6p.
(28) Josafad S, Mendoza M, Borrego F. Evaluación de tomate (lycopersicon esculentum,
mill) en invernadero: criterios fenológicos y fisiológicos. Agronomía mesoamericana.
ANEXOS
ANEXO 1
Curva patrón de p-nitrofenol
[]mM ml de
p-nitrofenol ml Buffer
0.5 0.8 3.2
1.0 1.6 2.4
1.5 2.4 1.6
2.0 3.2 0.8
2.5 4 0
[image:37.612.211.402.147.259.2]blanco 0 4
Tabla 1. Tabla de concentraciones utilizadas para la curva a partir de la solución stock de 2,5mM de P-nitrofenol.
[] Mm ABS ẋ a 410nm
0.5 0.091 1.0 0.172 1.5 0.346 2.0 0.549 2.5 0.843
Tabla 2. Tabla de resultado con el promedio de las absorbancia (Cada concentración se leyó por triplicada), de cada concentración leída.
Curva Ptrón P-nitrofenol
Concentración mM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
A b s o rv a n c ia 4 1 0 n m 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
concentracion vs absorbancia Plot 1 Regr
[image:37.612.179.421.449.670.2]ANEXO 2
Curva patrón de Lowry
[]µg/ml µg/ml de
albumina µl H20
25 20 380
75 60 380
125 100 300
250 200 200
500 400 0
[image:38.612.213.401.123.235.2]blanco 0 400
Tabla 3. Tabla de concentraciones utilizadas para la curva a partir de la solución stock de 500 µg/ml de Albumina.
[]µg/ml ABS ẋ a 500nm
25 0.223
75 0.143
125 0.267 250 0.539 500 1.054
Tabla 4. Tabla de resultado con el promedio de las absorbancia (Cada concentración se leyó por triplicada), de cada concentración leída.
Curva Método de Lowry
Concentración µg/ml
0 100 200 300 400 500 600
A b s o rb a n c ia 5 0 0 n m 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Concentracón vs Absorbancia Plot 1 Regr
[image:38.612.176.425.424.634.2]ANEXO 3
Experimento 1: concentraciones de PVPP en pulpa y cascara
3.1 Ensayo en cascara
Concentraciones de PVPP
(% p/v )
β-xilosidasa U/mg proteína
0.0 0.0015
0.5 0.0324
1.0 0.0020
1.5 0.0016
2.0 0.0018
Tabla 5. Tabla de resultado con el promedio de las actividades especificas en cada ensayo, con las diferentes concentraciones de PVPP.
3.2 Ensayo en pulpa
Concentraciones de PVPP
(% p/v )
β-xilosidasa U/mg proteína
0.0 0.0016
0.5 0.0016
1.0 0.0013
1.5 0.0023
2.0 0.0027
[image:39.612.226.385.150.268.2] [image:39.612.224.386.347.468.2]ANEXO 4
Experimento 2: concentraciones de NaCl en pulpa y cascara
4.1 Ensayo en cascara
Concentraciones de NaCl (moles/L)
β-xilosidasa U/mg proteína
0.0 0.0032
0.5 0.0019
1.0 0.0019
1.5 0.0021
2.0 0.0018
Tabla 7. Tabla de resultado con el promedio de las actividades especificas en cada ensayo, con las diferentes concentraciones de NaCl.
4.2 Ensayo en pulpa
Concentraciones de NaCl (moles/L)
β-xilosidasa U/mg proteína
0.0 0.0018
0.5 0.0019
1.0 0.0012
1.5 0.0011
2.0 0.0012
[image:40.612.222.389.137.268.2] [image:40.612.216.398.355.478.2]ANEXO 5
Experimento 3: concentraciones de buffer en pulpa y cascara
5.1 Ensayo en cascara
Concentraciones de buffer acetato de sodio/ácido acético
(moles/L)
β-xilosidasa U/mg proteína
0.01 0.0035
0.05 0.0036
0.10 0.0035
0.15 0.0031
0.20 0.0030
Tabla 9. Tabla de resultado con el promedio de las actividades especificas en cada ensayo, con las diferentes concentraciones de buffer.
5.2 Ensayo en pulpa
Concentraciones de buffer acetato de sodio/ácido acético
(moles/L)
β-xilosidasa U/mg proteína
0.01 0.0018
0.05 0.0017
0.10 0.0024
0.15 0.0016
0.20 0.0021
[image:41.612.220.391.151.281.2] [image:41.612.222.391.370.505.2]ANEXO 6
Experimento 4: rangos de pH en pulpa y cascara
6.1 Ensayo en cascara
Rangos de pH β-xilosidasa U/mg proteína
3 0.0012
4 0.0019
5 0.0021
6 0.0025
7 0.0025
Tabla 11. Tabla de resultado con el promedio de las actividades especificas en cada ensayo, con los diferentes rangos de pH.
6.2 Ensayo en pulpa
Rangos de pH β-xilosidasa U/mg proteína
3 0.0013
4 0.0012
5 0.0011
6 0.0019
7 0.0016
[image:42.612.223.388.149.273.2] [image:42.612.70.240.354.499.2]ANEXO 7
Experimento 5: rangos de temperatura en pulpa y cascara
7.1 Ensayo en cascara
Temperatura (0C)
β-xilosidasa U/mg proteína
20 0.0021
37 0.0021
40 0.0021
50 0.0018
60 0.0020
Tabla 13. Tabla de resultado con el promedio de las actividades especificas en cada ensayo, con los diferentes rangos de temperatura.
7.2 Ensayo en pulpa
Temperatura (0C)
β-xilosidasa U/mg proteína
20 0.0007
37 0.0006
40 0.0007
50 0.0007
60 0.0010
[image:43.612.70.241.150.272.2] [image:43.612.71.252.364.486.2]ANEXO 8
Experimento 6: rangos de tiempo en pulpa y cascara
8.1 Ensayo en cascara
Tiempo (min)
β-xilosidasa U/mg proteína
15 0.0029
30 0.0041
45 0.0039
60 0.0035
70 0.0033
Tabla 15. Tabla de resultado con el promedio de las actividades especificas en cada ensayo, con los diferentes rangos de tiempo.
8.2 Ensayo en pulpa
Tiempo
(min) β-xilosidasa U/mg proteína
15 0.0008
30 0.0009
45 0.0009
60 0.0009
70 0.0009
[image:44.612.71.241.161.282.2] [image:44.612.71.234.384.511.2]ANEXO 9
Experimento 7: concentraciones de sustrato en pulpa y cascara
9.1 Ensayo en cascara
Concentraciones de sustrato p- nitrofenil-ß-D-xilopiranósido (mmoles/L)
β-xilosidasa U/mg proteína
3 0.0026
4 0.0031
5 0.0031
6 0.0029
7 0.0027
Tabla 17. Tabla de resultado con el promedio de las actividades especificas en cada ensayo, con las diferentes concentraciones de sustrato.
9.2 Ensayo en pulpa
Concentraciones de sustrato
p-nitrofenil-ß-D-xilopiranósido (mmoles/L)
β-xilosidasa U/mg proteína
3 0.0009
4 0.0009
5 0.0009
6 0.0010
7 0.0009
[image:45.612.211.400.162.298.2] [image:45.612.201.413.460.598.2]ANEXO 10
Actividad enzimática en cascara durante los 11 días de muestreo
Días muestreados
β-xilosidasa U/mg proteína
1 0.0015
2 0.0007
3 0.0017
4 0.0009
5 0.0015
6 0.0012
7 0.0027
8 0.0027
9 0.0010
[image:46.612.236.378.122.332.2]10 0.0011 11 0.0013
Tabla 19. Tabla de resultado con el promedio de las actividades especificas en cada día de muestreo.
ANEXO 11
Grados Brix
Días
muestreados Grados brix
1 4
2 5
3 4
4 5
5 5
6 6
7 7
8 5
10 8
11 8
[image:46.612.243.371.420.614.2]
