PERFILES DE EXPRESIÓN DE MICRORNAS EN PACIENTES
CON LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA TRATADOS CON
EL ESQUEMA HIPERCVAD: EFECTO EN LAS TASAS DE
RESPUESTA Y SUPERVIVENCIA
LEONARDO JOSÉ ENCISO OLIVERA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
BOGOTÁ, D.C.
PERFILES DE EXPRESIÓN DE MICRORNAS EN PACIENTES CON
LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA TRATADOS CON EL ESQUEMA
HIPER-CVAD: EFECTO EN LAS TASAS DE RESPUESTA Y SUPERVIVENCIA
LEONARDO JOSE ENCISO OLIVERA
Tesis de grado para aspirar al título de
Maestría en ciencias biológicas
Director
ISMAEL JUAN PABLO SAMUDIO PH.D
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
BOGOTÁ, D.C.
Agradecimientos
Al personal de Banco Nacional de Tumores Terry Fox del Instituto Nacional de Cancerología por toda la ayuda que me han brindado durante este proceso la cual ha sido definitiva para poder culminar este proyecto. Gracias por su paciencia y sus enseñanzas.
Al personal médico y de enfermería de la Clínica de hematología y trasplante de médula ósea del Instituto Nacional de Cancerología por su ayuda invaluable para la identificación y seguimiento de los pacientes.
A todos los pacientes y familiares participantes quienes han ofrecido sus muestras y han confiado en este grupo investigador.
A mi esposa Diana y a mis hijos Sara y David quienes han soportado con paciencia mis largas horas de trabajo y me han acompañado en todo momento.
Índice General
I. Alcance y Objetivos
1. 1.1 Consideraciones generales ………..7
2. 1.2 Los miRNAs y el cáncer………..8
3. 1.3 Iguales esquemas, inferiores resultados………...9
II. Marco teórico 1. 2.1 Biogénesis de los miRNAs………12
1. 2.1.1 Introducción………..12
2. 2.1.2 Localización genómica de los miRNAs………....12
3. 2.1.3 Expresión de los miRNAs ………14
4. 2.1.4 Maduración de los mIRNAs: el complejo microprocesador ………15
5. 2.1.5 Transporte de los pre-miRNAs ………17
6. 2.1.6 Maduración de los miRNAs: eventos citoplasmáticos ... 17
7. 2.1.7 El complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) ... 18
2. 2.2 Naturaleza de las interacciones miRNA/mRNA y predicción de los genes blanco ... 21
1. 2.2.1 La complejidad de las interacciones microRNA / RNA mensajero (mRNA) ... 21
2. 2.2.2 Algoritmos de predicción de las interacciones miRNA/mRNA ... 25
3. 2.3 microRNAs y leucemia: Nuevos paradigmas, nuevas esperanzas ... 28
1. 2.3.1 miRNAs y hematopoyesis ... 28
2. 2.3.1 miRNAs y leucemia ... 31
1. 2.3.1.1 OncomiRs: miRNAs oncogénicos ... 31
2. 2.3.1.2 miRNAs y LLA ... 34
4. 2.4 Conclusiones ... 38
III. Hipótesis y Objetivos 1. 3.1 Hipótesis ... 40
2. 3.2 Objetivos ... 40
1. 3.2.1 Objetivo primario ... 40
2. 3.2.2 Objetivos Secundarios ... 40
IV. Materiales y métodos 1. 4.1 Tipo de estudio y criterios de selección ... 42
1. 4.1.1 Tipo de estudio ... 42
2. 4.1.2 Criterios de inclusión ... 42
3. 4.1.3 Criterios de exclusión ... 42
4. 4.1.4 Controles ... 43
2. 4.2 Identificación de sujetos del estudio ... 43
3. 4.3 Procedimientos específicos del estudio ... 44
1. 4.3.1 Aspirado y biopsia de la médula ósea ... 44
1. 4.3.1.1 Materiales requeridos ... 45
2. 4.3.1.2 Procedimiento ... 45
2. 4.3.2 Procedimientos institucionales para procesamiento de muestras de médula ósea ... 47
1. 4.3.2.1 Coloraciones del mielograma y conteo de blastos ... 47
alto riesgo ……… 52
3. 4.3.3 Procedimientos experimentales para análisis del perfil de expresión de miRNAs: Separación de mononucleares y extracción de RNA ... 54
1. 4.3.3.1 Separación de mononucleares por gradiente de densidad ... 54
2. 4.3.3.2 Conteo de células y determinación de la viabilidad celular ... 55
3. 4.3.3.3 Extracción y cuantificación del RNA ... 56
4. 4.3.4 Diseño personalizado de la placa de PCR para análisis de microRNAs ... 57
5. 4.3.5 Configuración del experimento de PCR cuantitativa en tiempo real ... 61
1. 4.3.5.1 Retrotranscripción y PCR cuantitativa en tiempo real ... 62
6. 4.3.6 Conducción del estudio y visitas de seguimiento ... 65
1. 4.3.6.1 Sitio de investigación ... 65
2. 4.3.6.2 Archivo de datos y sistematización ... 65
3. 4.3.6.3 Consideraciones éticas ... 65
4. 4.3.6.4 Plan de visitas de seguimiento ... 66
4. 4.4 Métodos estadísticos ... 66
1. 4.2.1 Cálculo del tamaño de la muestra ... 66
2. 4.2.2 Definiciones ... 67
3. 4.2.3 Análisis de los datos ... 70
1. 4.2.3.1 Estadística descriptiva y análisis de supervivencia ... 70
2. 4.2.3.2 Análisis del perfil de expresión de microRNAs ... 71
V. Resultados 1. 5.1 Características de la población ... 72
1. 5.1.1 Flujo de pacientes en el estudio ... 72
2. 5.1.2 Variables demográficas y antropométricas ... 74
3. 5.1.3 Variables hematológicas al momento del diagnóstico ... 75
4. 5.1.4 Características citogenéticas al diagnóstico ... 76
5. 5.1.5 Inmunofenotipo por citometría de flujo ... 77
6. 5.1.6 Calidad de las muestras para análisis de miRNAs ... 82
7. 5.1.7 Perfiles de expresión de microRNAs en las muestras incluidas ... 82
1. 5.1.7.1 Pre-procesamiento de los datos ... 83
2. 5.1.7.2 Normalización y transformación de los datos ... 84
3. 5.1.7.3 Perfil de expresión de microRNAs y agrupamiento no supervisado ... 85
4. 5.1.7.4 microRNAs diferencialmente expresados ... 89
5. 5.1.7.5 microRNAs diferencialmente expresados de acuerdo a variables clínicas ... 93
8. 5.1.8 Respuesta al tratamiento y análisis de supervivencia ... 93
1. 5.1.8.1 La expresión del hsa-miR-1296 y del hsa-miR-16 son determinantes independientes de la supervivencia global ... 95
2. 5.1.8.2 Supervivencia libre de evento ... 99
VI. Discusión………. 100
VII. Conclusiones………105
VIII. Bibliografía………106
Índice de figuras
Ecuación 1: Ecuación utilizada para el cálculo del tamaño de la muestra del estudio basado en la
estimación del riesgo relativo ... 67
Figura1: Estructura de los pri-miRNAs ... 16
Figura2: Biogénesis de losmiRNAs……….….………20
Figura3: Tipos de interacciones miRNA/mRNA ... 24
Figura4: Los algoritmos de predicción. ... 27
Figura5: Hematopoyesis normal: Integración entre factores de transcripción y miRNAs. ... 31
Figura6: Grupos de micro-RNAs incluidos para análisis ... 58
Figura7: Plan de procesamiento de las muestras ... 61
Figura8: Diagrama del flujo de pacientes en el estudio ... 73
Figura9: Inmunofenotipo por citometria de flujo ... 78
Figura10: Plan de pre - procesamiento de los datos ... 84
Figura11: Resultados de la normalización ... 85
Figura12: Resultados del agrupamiento con Consensus Cluster. ... 87
Figura13: Recuento de leucocitos de acuerdo al grupo identificado por consensus cluster. ... 88
Figura14: Gráfico de volcán para todos los microRNAs entre el grupo 1 y el grupo 3 ... 90
Figura15: Boxplot de los microRNAs diferencialmente expresados entre el grupo 1 y el grupo 3 91 Figura16: miRNAs diferencialmente expresados entre otros grupos. ... 92
Figura17: Supervivencia global para todo el grupo. ... 93
Figura18: Supervivencia global de acuerdo a diferentes variables al diagnóstico ... 94
Figura19: Supervivencia global de acuerdo al nivel de expresión del hsa-miR-1296 mayor o menor al punto de corte ... 96
Figura20: Supervivencia global de acuerdo a la expresión de hsa-miR-16a mayor o menor al punto de corte ... 98
Índice de tablas
Tabla 1: Panel de anticuerpos y fluorocromos utilizados para el análisis por citometría de flujo 52 Tabla 2: Secuencias de los cebadores utilizados para la detección de genes de fusión específicos 53 Tabla 3: Nombres, secuencias y conjuntos de cebadores de cada microRNA incluído en la placa 59
Tabla 4: Definiciones de variables ... 68
Tabla 5: Características de los pacientes ... 74
Tabla 6: Variables hematológicas al momento del diagnóstico ... 76
Tabla 7: Resultados de citogenética y PCR al diagnóstico ... 77
Tabla 8: Coeficientes de correlación de Pearson para los marcadores seleccionados en los casos de LLA de precursores B ... 80
Tabla 9: Valores de P para los coeficientes de correlación para cada marcador ... 80
Tabla 10: Valores normalizados de IMF para marcadores seleccionados en LLA B ... 81
Tabla 11: Características de las muestras de LLA incluidas ... 82
Tabla 12: Grupos definidos de acuerdo al agrupamiento por Consensus Cluster ... 86
1. Alcance y Objetivos
1.1 Consideraciones generales
La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) ha sido un modelo de investigación del cáncer
en humanos desde el inicio de la hematología oncológica moderna. La descripción de la
capacidad de los antagonistas del ácido fólico de inducir remisiones transitorias en niños con
leucemia aguda en 1948, cambio para siempre las perspectivas del tratamiento de los pacientes
con cáncer, con la promesa de encontrar medicamentos efectivos los cuales, administrados solos
o en combinación pudieran ofrecer posibilidades de curación (Farber, 1948)(DeVita &
Rosenberg, 2012)
Los esfuerzos iniciales por encontrar medicamentos activos dejaron sin embargo a un
lado; por lo menos de forma transitoria, los estudios de la biología de los diferentes tipos de
tumores y de los mecanismos oncogénicos que permiten la transformación de un tejido sano en
uno tumoral.
Los resultados del tratamiento actual de la LLA en niños, en los cuales las tasas de
curación se espera que excedan el 80% parecerían justificar una búsqueda mas extensa de
combinaciones activas de medicamentos con diferentes mecanismos de acción, dejando en un
plano secundario la definición de características etiológicas o biológicas particulares (Pui et al.,
2000).
La extensión de estas mismas estrategias de tratamiento a pacientes adultos con LLA ha
dejado en claro que si bien la enfermedad tiene idénticas características citológicas entre niños y
adultos, es una enfermedad con un comportamiento biológico y clínico distinto. Con los
esquemas de tratamiento actuales y aún con la incorporación del trasplante alogénico de médula
ósea dentro de las estrategias de tratamiento, la supervivencia libre de enfermedad (SLE) a cinco
años de pacientes adultos con LLA es cercana al 35% (Bassan & Hoelzer, 2011). Asi mismo, los
estudios realizados por diferentes grupos cooperativos a nivel mundial, han establecido que la
LLA en adultos es una enfermedad heterogénea y con un pronóstico variable.
-La determinación precisa del riesgo al momento del diagnóstico permitiría la
identificación de aquellos pacientes que se beneficiarian de intervenciones más agresivas para
mejorar su pronóstico, evitando además que los pacientes que tienen menor riesgo de recaída o
muerte sean expuestos a terapias con excesiva toxicidad. Los sistemas actuales de determinación
del riesgo siguen siendo imprecisos y un gran número de pacientes considerados de riesgo
estándar presenta falla al tratamiento, recaída y muerte, siendo necesario determinar nuevas
características clínicas o biológicas que permitan una mejor discriminación de los pacientes en
grupos pronósticos distintos.
1.2 Los miRNAs y el cáncer
El descubrimiento de los microRNAs (miRNAs) como secuencias no codificantes
reguladoras de la expresión génica promete revolucionar nuestra idea del cáncer como una
enfermedad genética. La posibilidad de que un solo tipo de miRNA puede determinar aumento o
disminución de la expresión de cientos de genes, demuestra la complejidad de las redes
biológicas que regulan la adquisición de un fenotipo maligno. En las neoplasias hematológicas se
ha descrito la existencia de alteraciones en la expresión de distintos miRNAs. Algunos de estos
miRNAs pueden actuar como moléculas supresoras de tumores, como el miR-15a y el miR-16 en
las leucemias o como productos oncogénicos como el miR-155 y el miR-17-92 en los linfomas
(Fabbri, Croce, & Calin, 2009). Adicionalmente, la compresión del proceso de hematopoyésis se
ha modificado de forma substancial, por el descubrimiento de la acción de diferentes miRNAs
los cuales se piensa actúan como reguladores que permiten el “ajuste fino” del proceso
hematopoyético y cuya alteración puede derivar en la alteración del proceso normal de
maduración y la adquisición de un fenotipo maligno.
A pesar de su relevancia potencial, solamente algunos estudios han evaluado el perfil de
expresión de miRNAs en muestras de pacientes adultos con LLA. Esta información es aún más
escasa en la población de América del sur y no existen en nuestro conocimiento estudios
publicados en población colombiana. Investigadores en Brasil, compararon muestras de
sanos, encontrando que los miRNAs expresados de manera más frecuente fueron el miR-128b, el
miR-204, el miR-218, el miR-331 y el miR-181b-1. El grupo miR-17-92 se encontró igualmente
sobre-expresado en los pacientes con LLA (Zanette et al., 2007). Aunque este estudio no
permitió establecer un valor pronóstico del analisis de miRNAs, este y otros estudios en
diferentes modelos tumorales, han demostrado la factibilidad de este tipo de investigaciones en
muestras de pacientes y su potencial relevancia al permitir la identificación de perfiles
específicos de expresión de miRNAs que pudieran tener implicaciones pronósticas.
1.3 Iguales esquemas, inferiores resultados
La utilización de diferentes esquemas de tratamiento en la población de pacientes adultos
colombianos con LLA ha mostrado resultados insatisfactorios. Un estudio realizado por
Combariza y colaboradores en el Instituto Nacional de Cancerología en Bogotá, Colombia, en el
año 2007 mostró, en una cohorte de 83 pacientes con LLA tratados con el esquema Hiper-CVAD,
una tasa de remisión completa de 61%, con una mediana de supervivencia global de 11.3
meses, con una alta mortalidad durante la inducción del 24% (Combariza et al., 2005). Las
características demográficas, de inmunofenotipo o citogenéticas al momento del diagnóstico
descritas en esta cohorte, no difieren de las de pacientes tratados en otros centros, siendo las tasas
de remisión un 20% a 30% menor a las reportadas y la supervivencia global casi dos años
inferior
La publicación de estos resultados derivó en una mejor estandarización del uso de este
esquema en nuestro centro, siguiendo de manera estricta el diseño publicado y registrando de
manera prospectiva los datos como parte de un programa de vigilancia. El análisis de los datos
después de 12 meses de seguimiento mostró que las tasas de remisión completa de la nueva
cohorte eran similares a las reportadas de manera previa (datos no publicados).
Considerando que las características de los pacientes en cuanto a la edad, carga tumoral
inicial y citogenética son similares a los de otras cohortes con mejores resultados, se planteó la
hipótesis que los pacientes colombianos tienen características biológicas diferentes que
determinan el mal pronóstico.
-Siendo los miRNAs reguladores centrales de la hematopoyésis y existiendo información
de una relación entre la deregulación de los mismos y la leucemogénesis se planteó la hipotesis
de que el perfil de expresión de miRNAs difiere entre los pacientes que responden o fallan con
el tratamiento.
Basado en estas consideraciones, este estudio pretende entonces responder a las
siguientes preguntas:
-¿Cuál es el perfil de expresión de miRNAs de pacientes colombianos adultos con
leucemia linfoblástica aguda?
-¿Cuáles perfiles de expresión de miRNAs se relacionan con una menor supervivencia
global y libre de evento en pacientes colombianos con leucemia linfoblástica aguda tratados con
el esquema Hiper-CVAD, independiente de otras variables pronósticas conocidas?
- ¿ Existen diferencias entre el perfil de expresión de miRNAs entre pacientes con LLA,
Leucemia Mieloide Aguda (LMA) y controles normales ?
Si se demostrara que un determinado perfil de expresión de miRNAs identifica pacientes
de alto riesgo de falla de la inducción o recaída, sería posible plantear estrategias de tratamiento
2. Marco teórico
2.1 Biogénesis de los miRNAs
2.1.1 Introducción
El descubrimiento de los microRNAs ha permitido entender como se realiza el control de
diversos procesos biológicos dentro de los cuales se destacan el control del desarrollo, la
diferenciación, la proliferación, el metabolismo y la muerte celular (Davis & Hata, 2009). Los
mecanismos por lo cuales se lleva a cabo el control de estos y otros procesos implica la
interacción de los miRNAs con el mRNA de los genes blanco cuya consecuencia final es la
represión de la expresión. Las reglas que subyacen estas interacciones entre miRNAs y mRNAs
y los mecanismos por lo cuales se produce la represión de la expresión génica, han sido objeto de
diversas investigaciónes y serán desarrolladas en un capítulo posterior.
La capacidad de que un solo miRNAs interactue y regule cientos de genes de manera
simultanea; que un determinado perfil de expresión de miRNAs pueda determinar un
comportamiento celular específico ; el reconocimiento de que hasta el 60% de los genes
codificantes de proteínas en el genoma humano pueden ser objeto de control por este mecanismo
y el descubrimiento de esta forma de RNA no codificante tanto en animales como en plantas,
hacen que no sea sorprendente que el proceso de biogénesis sea estrictamente regulado y que
además sea altamente conservado entre diferentes especies (Davis & Hata, 2009; Bartel, Lee,
Feinbaum,file = :Users/leonardoenciso/Library/Application Support/Mendeley Desktop/
Downloaded/Bartel, Lee, Feinbaum - 2004 - MicroRNAs Genomics, Biogenesis, Mechanism, &
Function, 2004)
2.1.2 Localización genómica de los miRNAs
Los miRNAs son codificados en varias regiones del genoma, incluyendo unidades de
transcripción no codificantes como también codificantes de proteínas. Aunque de manera inicial
-no se reco-nociera la importancia de los miRNAs como reguladores de la expresión génica, el
descubrimiento de lin-4 derivó en la búsqueda especifica de elementos con la misma
característica estructural, siendo descubierto finalmentelet-7en el modelo de C. elegans, el cual
se demostró era fundamental para el desarrollo desde el estadio larvario tardío al estadio adulto,
de la misma forma que lin-4 era fundamental para el desarrollo larvario temprano y que era
además un RNA de 21 nucleótidos no codificante (Reinhart et al., 2000). La descripción de
homólogos de estos genes en otras especies y en particular de let-7 en humanos, derivo en un
inusitado interés en encontrar secuencias similares y en las consecuencias funcionales de su
expresión. A partir de este momento, se ha realizado el descubrimiento de numerosos miRNAs
en diferentes especies, lo cual obligo a la constitución de un repositorio donde se realiza la
anotación de los mismos. La última versión (Junio de 2013) de la base de datos miRBase (http:/
/mirbase.org), contiene 24221 locus de microRNAs que al ser procesados generan 30424
productos de microRNAs maduros en 206 especies (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014).
Diversos estudios han mostrado que las secuencias de los miRNAs se pueden encontrar
en las regiones intrónicas de los mRNA de genes que ellas mismas regulan; en regiones
codificantes o en regiones distantes del genoma (Bartel et al., 2004). Aquellos que tienen
localización en los intrones de genes suelen tener la misma orientación del mRNA lo que indica
que la mayoría no son transcritos a partir de sus propios promotores sino que son procesados
desde los intrones. Este procesamiento se realiza antes de la edición del mRNA por la maquinaria
de splicing y es llevado a cabo por una ribonucleasa llamada Drosha, sin que se produzca
alteración de la secuencia codificante final (Davis & Hata, 2009).
Varios miRNAs se encuentran agrupados en el genoma y son expresados como transcritos
policistrónicos los cuales pueden variar entre 2 y 18 miRNAs codificados en una sola región.
Esto no implica sin embargo que sean co-regulados y algunos miRNAs agrupados pueden
originarse en transcritos independientes. Los ortólogos de lin-4 y lin-7 de C. elegans, se
encuentran agrupados en el genoma de los humanos y son co-expresados, lo cual sugiere que la
separación de la expresión temporal de ambos genes es propiedad exclusiva de los gusanos.
2.1.3 Expresión de los miRNAs
Uno de los pasos centrales en donde se lleva a cabo el control de la síntesis de los
microRNAs es durante la transcripción. En la mayoría de los casos, la transcripción es llevada a
cabo por la RNA-Polimerasa II y los microRNAs comparten con los mRNA mensajeros la
característica de tener una caperuza de 7-metilguanosina y una cola de poliadeninina como
resultado de este proceso (Davis-Dusenbery & Hata, 2010).
El proceso de regulación transcripcional de los miRNAs es complejo y la organización de
las regiones promotoras ha sido caracterizado de una forma relativamente reciente. Mediante la
realizacion de un experimento de inmunoprecipitación de cromatina de Polimerasa II en una
microarreglo de DNA (ChIp on chip) se pudo describir que los promotores de los miRNAs tienen
características similares a los de los genes codificantes de proteínas aunque su organización es
más compleja y se demostró además que hasta el 26% de los miRNAs intragénicos pueden ser
transcritos a partir de sus propios promotores (Corcoran et al., 2009).
El control del proceso de transcripción de los genes de microRNAs es regulado por el
proto-oncogen c-Myc. El c-Myc actua como un factor de transcripción que se une a las cajas E
en las regiones promotoras y activa la expresión génica. Cerca del 10 al 15% de los genes
codificantes de proteínas son regulados por c-Myc. El c-Myc activa la transcripción del grupo de
microRNAs 17-92, el cual incluye 6 miRNAs de los cuales el miR-17 y el miR-20, se sabe que
actuan reprimiendo el regulador del ciclo celular E2F1. A su vez, c-Myc activa la transcripción
de E2F1 lo cual demuestra que el ajuste fino de la regulación del ciclo celular es llevado a cabo
mediante la regulación tanto del mRNA como de los miRNAs (O’Donnell, Wentzel, Zeller,
Dang, & Mendell, 2005; Davis & Hata, 2009).
El proceso de transcripción llevado a cabo por Pol II produce transcritos primarios que
pueden tener varios kilobases de longitud y que además tiene una caperuza de 7-metilguanosina
y una cola de poliadenina. Estos transcritos primarios llamados pri-miRNAs deben ser
inicialmente recortados para dar lugar a estructuras en forma de horquilla de aproximadamente
65 kilobases de longitud llamados precursores de microRNAs o pre-miRNAs, dando inicio al
proceso de maduración del transcrito.
-2.1.4 Maduración de los mIRNAs: el complejo microprocesador
El proceso de maduración de los pri-miRNAs es llevado a cabo de manera inicial por un
miembro de la familia de las ribonucleasas III (RNAsa-III), de clase 2 llamada Drosha. La acción
de Drosha va a derivar en el corte del pri-miRNA para producir los pre-miRNAs.
Característicamente los pri-miRNAs tienen una estructura constituida por un tallo que
contiene los extremos 3’ y 5’ del transcrito y un asa terminal, formando una horquilla como
consencuencia de la existencia de secuencias complementarias en ambos extremos. Una
evaluación mas detallada de la estructura buscando determinar el sitio de clivado de estos
precursores por Drosha, mostro que los pri-miRNAs pueden dividirse en varias partes desde una
perspectiva de la función, como se muestra en la figura 1 (Bartel et al., 2004).
- Los segmentos basales que corresponden a los extremos 3’ y 5’ que se encuentran libres y
no tienen complementariedad
- Una tallo inferior de aproximadamente 11 pb (pares de bases), terminando en el sitio
donde se produce el clivado por Drosha
- Un tallo superior de aproximadamente 22 pb que se extiende hasta el inicio de asa donde
se encuentra el sitio de clivado por Dicer la cual es la segunda ribonucleasa implicada en
el proceso
- El asa terminal
En los humanos, Drosha esta compuesto por dos complejos multiproteicos de los cuales
el complejo mayor esta formado por múltiples clases de proteínas asociadas al RNA como son
helicasas; proteínas que se unen al RNA de doble cadena y proteínas de la familia de la proteína
N
5' N N N
N
3' N N N
N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
N N N
N N N N N N N N N N N N N
Segmentos basales
Tallo inferior 11 pb
Tallo superior 22 pb
[image:18.612.106.535.73.218.2]Asa terminal +1 -2 Clivado por Drosha Clivado por Drosha Clivado por Dicer Clivado por Dicer MicroRNA maduro
Figura 1.Estructura de los pri-miRNAs. La estructura en forma de tallo y asa característica de los miRNAs garantiza el adecuado posicionamiento de los centros catalíticos de las endonucle-asas lo cual es requerido para el procesamiento y la maduración. Adaptado de Bartel et al. 2004
El complejo menor esta compuesto por Drosha y la proteína de unión al RNA de doble
cadena DGCR8, la cual es el producto del gen que se encuentra delecionado en el Síndrome de
Di George. Este complejo pequeño recibe el nombre de Microprocesador (Gregory et al., 2004).
Las bases moleculares del reconocimiento de los pri-miRNAs por el complejo
Drohsa-DGCR8 han sido dilucidadas por medio de la realización de experimentos de mutagénesis
dirigida en la cual se eliminaron de forma selectiva cada uno de los componentes del pri-miRNA
(como se muestra en la figura 1), y evaluando la capacidad de procesamiento por el complejo de
cada una de las formas mutantes. De esta forma se ha podido establecer que el asa terminal no es
indispensable para que se lleve a cabo el procesamiento, pero que los segmentos de cadena
sencilla que corresponden a los extremos 3’ y 5’ son críticos para que se lleve a cabo el
procesamiento. En este modelo, los extremos de cadena sencilla son reconocidos por la proteína
DGCR8 y permiten el posicionamiento adecuado el pri-miRNA, de manera que el centro
catalítico de Drosha quede ubicado exactamente a 11 pares de bases del sitio de unión entre los
segmentos de cadena sencilla y el inicio de la doble cadena, donde se realizada entonces la
actividad catalítica, dejando dos nucleótidos sobresalientes en el extremo 3’, los cuales van a ser
fundamentales para el siguiente paso el transporte hacia el núcleo (Han et al., 2006; Davis &
Hata, 2009).
-Los niveles de Drosha son estrictamente regulados a nivel celular y existe un complejo
sistema de retroalimentación entre los niveles de Drosha y la proteína DGCR8. El complejo
microprocesador puede clivar el mRNA de diversos genes codificantes de proteínas dentro de los
cuales se encuentre el mRNA deDGCR8,constituyendo un asa de regulación. El producto de las
acciones del complejo Drosha/DGCR8 se denomina precursor de microRNA o pre-miRNA el
cual es una estructura con forma de tallo y asa que tiene una longitud aproximada de 60 a 70
nucleótidos. Este producto debe ser reconocido y transportado desde el núcleo hasta el
citoplasma, en donde debe continuar el proceso de maduración.
2.1.5 Transporte de los pre-miRNAs
Los pre-miRNAs producto de la actividad catalitica del complejo microprocesador a nivel
del núcleo, son transportados al citoplasma por una proteina de 1204 aminoácidos, de la familia
de las exportinas llamada exportina 5. Esta proteína media la exportación desde el núcleo de
moléculas de RNA de doble cadena y proteínas con un dominio de unión de RNA de doble
cadena. En el núcleo, esta proteína se une al RNA y a la forma unida a GTP de Ran. Una vez se
produce el transporte hacia el citoplasma el GTP es hidrolizado y se produce la liberación del
RNA (Davis & Hata, 2009; Consortium, 2014). La interacción del RNA con la exportina 5 es
independiente de la secuencia pero requiere que la región de doble cadena sea de por lo menos
16 pares de bases.
Además, la presencia de nucleotidos sobresalientes en el extremo 3’ facilita la interacción,
siendo una de las características de la actividad catalítica del complejo microprocesador, el dejar
dos nucleótidos sobresalientes en el extremo 3’ libre.
2.1.6 Maduración de los miRNAs: eventos citoplasmáticos
La incorporación final de una de las hebras de RNA en el complejo de silenciamiento
inducido por RNA (RISC por sus siglas en inglés), requiere una secuencia de menor longitud y la
degradación final de una de las hebras. Este proceso es llevado a cabo a nivel del citoplasma por
una segunda ribonucleasa III de clase 3 llamada Dicer. Las RNAsas III de clase 3, procesan
tipicamente de 21 a 27 nucleótidos de longitud. Estos pequeños RNAs producidos por Dicer van
a sevir como guía para que se produzca el silenciamiento secuencia-específico de diversos genes,
ya sea mediante RNA interferentes (RNAi) o mediante microRNAs (MacRae & Doudna, 2007).
En los humanos Dicer contiene un dominio helicasa-like N-terminal con un dominio DExH; un
dominio originalmente llamado Dominio de Función desconocida (DUF283); un dominio PAZ;
dos dominios RNAsa-III y un dominio de unión a RNA de doble cadena (dsRBD). El centro
procesador dsRBD es formado por la dimerización intramolecular de dos dominios de RNAsa III
funcionando juntos para clivar los enlaces fosfodiester en tiras opuestas de RNA. Dicer no lleva
a cabo sus acciones solo, sino en cooperación con otras proteínas dentro de las cuales se
encuentran miembros de la familia AGO; HIV-1 TAR RNA Binding Protein (TRBP); la proteína
activadora de PKR (PACT) y posiblemente otras (Koscianska, Starega-Roslan, & Krzyzosiak,
2011).
El clivado por Dicer genera un miRNA de doble cadena de aproximadamente 22
nucleotidos de longitud. De forma similar a Drosha, Dicer genera 2 nucleotidos sobresalientes en
el extremo 3’ luego del proceso de clivado.
2.1.7 El complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC)
El silenciamiento especificos de mRNAs por los microRNAs requiere como paso final, la
incoporación del microRNA maduro, producto de la acción de Dicer, en un complejo proteico
llamado complejo de silenciamiento inducido por RNA o RISC por sus siglas en ingles. El
componente principal del complejo RISC y que ademas actuan como efectoras del la represión
de la expresión mediada por microRNAs son proteínas de la familia AGO o proteínas argonautas.
El genoma humano contiene ocho proteínas de esta familia (AGO 1-4 y PIWI 1-4), de las cuales
unicamente AGO2 tiene la capacidad de clivar el RNA.
En estudios realizadosin vivo se encontró que AGO2 se asocia con Dicer y TRBP/PACT
para formar el complejo de carga de RISC (RISC Loading Complex o RLC por su sigla en
inglés). El clivado por Dicer resulta en un RNA de doble cadena el cual esta compuesto de una
cadena activa o cadena guía y una cadena pasajero. Cuando se produce la formación del RLC, se
-produce la separación de las dos hebras de RNA lo cual es seguido de la incorporación de la
cadena guía para forma el complejo miRNA-Ribonucleoproteína (miRNP) y la degradación de la
cadena pasajero. Si bien no se han dilucidado por completo los mecanimos por los cuales se
selecciona la cadena como cadena guía, se ha encontrado que en general tiende a ser la que tiene
mayor estabilidad termodinamica en el extremo 5’ (Davis & Hata, 2009). Este complejo una vez
formado será el que finalmente se dirija y reconozca secuencias complementarios en la región
3’-UTR de los mRNA mensajeros blanco permitiendo finalmente la degradación del mRNA o la
represión de su traducción. La figura 2, resume el proceso de biogenesis de los microRNAS
Figura 2. Biogénesis de los miRNAs. El procesamiento de los miRNAs inicia desde su transcripción por la RNA Pol II, seguida de dos pasos de clivado endonucleolíticos por dos RNAsas III y finalmente su incorporación el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC).
Núcleo
Citoplasma
AAAAAAAAA
m7G
RNA
Pol II Transcripción
Pri-miRNA
DG CR 8 Dro sha
Corte
XPO 5
Pre-miRNA
Poro nuclear
Exportación
Dicer
PACT Otras
TRBP AGO
DICING
RISC
¨Carga" de RISC
Duplex miRNA/miRNA* (* Cadena pasajero)
RISC
Selección de cadena conductora
miRNA
ORF AAAAAAAAA
RISC
miRNA / mRNA
Deadenilación / Degradación Represión
traduccional
-2.2 Naturaleza de las interacciones miRNA/mRNA y predicción de los genes blanco
2.2.1 La complejidad de las interacciones microRNA / RNA mensajero (mRNA)
Cada uno de los miRNAs pueden interactuar y regular gran número de genes mediante la
interacción con secuencias en la región 3’ UTR del mRNA de los mismos. El conocimiento de
las reglas que subyacen la naturaleza de estas interacciones, puede permitir una mejor
compresión de las redes de regulación de la expresión génica que controlan procesos celulares
específicos y forma además la base para el desarrollo de algoritmos bioinformáticos de
predicción de blancos para un determinado miRNA. Estas interacciones predichas pueden
además ser validadas por diferentes metodologías experimentales para verificar la precisión del
algoritmo. Una de las preguntas iniciales que debemos responder es ¿cuales son los requisitos
mínimos que debe tener la interacción entre un miRNA y su blanco para que el duplex sea
funcional y derive en regulación de la expresión génica?.
La asignación de una función biológica a un microRNA basado en sus interacciones
predichas, ha demostrado ser posible en las plantas. Sin embargo, la naturaleza de las
interacciones entre miRNA/mRNA en las plantas es más simple, pues requiere
complementariedad casi perfecta entre las dos secuencias y la localización de las secuencias
complementarias pueden estar tanto en la región 3’ UTR como en el marco abierto de lectura
(ORF) (Rhoades et al., 2002). Las interacciones en los modelos animales, desde los modelos de
Drosophila hasta los humanos son mucho más variables en su estructura y en muchos casos,
contienen solamente un corto segmento complementario con multiples brechas y desajustes
(mismatch). La realización de un experimentoin vivo en el cual un grupo de células de la franja
central del disco imaginal de las alas de Drosophila, fue transfectado y contenia un transgen el
cual tenia bajo su control la expresión de Proteína fluorescente verde (GFP) y en cuya region 3’
UTR se encontraba una secuencia reconocida de manera exclusiva por miR-7, permitió mediante
la construcción de múltiples mutantes determinar los efectos de la modificación uno a uno de los
nucleotidos de la secuencia en la expresión génica. Así, aquellos mutantes en los cuales el duplex
expresión de GFP. En la primera parte del experimento se generaron mutaciones en el sitio
blanco en el mRNA. La represión eficiente no se vio afectada por mutaciones en las posiciones
1,9 o 10, pero cualquier mismatch en posiciones 2 a 8 reduce de manera significativa la magnitud
de la regulación del blanco (Brennecke, Stark, Russell, & Cohen, 2005).
Esta secuencia que requiere un pareamiento perfecto siguiendo las normas de Watson y
Crick para que se conserve la capacidad de regular la expresión génica es la llamada Secuencia
Semilla.La incorporación de esta característica en los algoritmos de predicción de los blancos ha
sido fundamental para disminuir el número de predicciones falsamente positivas.
Se ha demostrado además que estas secuencias son altamente conservadas en la región
3’UTR en diferentes especies demostrando que el mantenimiento de las secuencias blanco de los
miRNAS es fundamental para garantizar la regulación de la expresión génica y es conservada
por la evolución (Friedman, Farh, Burge, & Bartel, 2009).
Se han descrito otras caracteristicas de la estructura de las interacciones miRNAS/
mRNAS que determinan que tan eficiente puede ser la regulación de un blanco específico y que
han permitido clasificar los tipos de sitios blanco en aquellos sitios con una estructura canónica,
atípica o marginal. Los tres tipos de interacción canónica descritos son: aquellos en los cuales se
encuentra un pareamiento perfecto entre los nucleótidos 2 a 7 de la secuencia semilla localizada
en el extremo 5’ del miRNA y la secuencia en la región 3’ UTR del mRNA y en los cuales,
adicionalmente se encuentra una adenina en posición 1 en el mRNA. Estos sitios son referidos
entonces como 7mer-A1 y tienen la mayor eficiencia en regular la expresión génica. La segunda
estructura se caracteriza por la presencia de un pareamiento perfecto entre los nucleótidos 2 a 8
del miRNA con la secuencia en la región 3’ UTR del mRNA pero sin presencia de adenina en
posición 1, los cuales son referidos como 7mer-m8. Finalmente, se encuentran sitios en los
cuales se produce interacción de los nucleótidos 2 a 8 con presencia adicional de adenina en
posición 1, llamados 8mer. Los sitios atipicos se han divido en dos grupos llamados 3’
suplementarios o 3’ compensatorios. En el primer caso, la interacción de los nucleotidos 2 a 7 de
la secuencia semilla tienen pareamiento perfecto con la secuencia en el mRNA, sin que exista
una adenina conservada en posición 1 pero además existe complementariedad adicional entre
nucleótidos localizados en sentido 3’ de la secuencia del miRNA, siendo característico que se
produzca en los nucleótidos 13 a 16 y requiriendo generalmente 3 a 4 pares contiguos
-correctamente posicionados para que se conserve su eficacia. Los sitios 3’ compensatorios
presentan por lo menos un mismatch en la secuencia semilla el cual pareciera compensarse con
pareamientos correctos entre los nucleótidos 13 a 17 de la secuencia del miRNA y el mRNA,
requeriendose en general de por los menos 4 a 5 pares consecutivos con un pareamiento correcto
para mantener la función (Bartel, 2009). La figura 3 muestra de una manera gráfica los tipos
ORF NNNNNNA AAAAAAAA
NNNNNNN 5'
87654321
NNNNNNNNNNNNNN
3'
Semilla
Sitio 7mer-A1
ORF NNNNNNN AAAAAAAA
NNNNNNN 5' 87654321
NNNNNNNNNNNNNN
3'
Semilla
Sitio 7mer-m8
ORF NNNNNNA AAAAAAAA
NNNNNNN 5' 87654321 NNNNNNNNNNNNNN 3' Semilla Sitio 8mer Sitios canónicos Sitios Atipicos
ORF NNNNNNN AAAAAAAA
NNNNNNN 5' 87654321
NNNNNNNNNNNNNN
3'
Semilla
Sitio 3' suplementario
NNNNNNN NN NNN
1. Match en semilla 2. Asa
3. 3-4 pares seguidos (12-18)
ORF NNN NNN AAAAAAAA
NNNNNNN 5' 87654321
NNNNNNNNNNNNNN
3'
Semilla
Sitio 3' compensatorio
NNNNNNNNNN NN NNN
1. Match en semilla 2. Asa
3. 4-5 pares seguidos (12-20)
[image:26.612.106.528.74.510.2]N
Figura 3. Tipos de interacciones miRNA/mRNA: el número de nucleótidos de la secuencia semilla que se unan por un pareamiento de tipo Watson-Crick con secuencias en la región 3'UTR de los mRNA blanco y la existencia de complementariedad corriente abajo, determina la clasifi-cación del sitio de interacción como canónico o atípico. Adaptado de Bartel et al. 2004
-2.2.2 Algoritmos de predicción de las interacciones miRNA/mRNA
La complejidad de la regulación de la expresión génica por los miRNAs aún no es
comprendida en su totalidad. La descripción de un número cada vez mayor de miRs en todas las
especies de las que se tiene información y la naturaleza compleja de las interacciones con sus
blancos hacen que las herramientas bioinformáticas para predicción de las interacciones incluyan
cada vez un mayor número de variables lo cual permite una identificación más precisa de los
blancos y un menor número de predicciones equivocadas.
Además de las características propias de cada una de las interacciones presentadas en el
capítulo anterior se ha reconocido que no solamente un miRNAs puede interactuar y regular
cientos de genes sino que a la vez un mismo gen puede ser blanco de diferentes miRNAs, al
coincidir su secuencia en la región 3’ UTR con la secuencia de diferentes miRNAs. Esta
característica refleja las complejas e intrincadas redes de interacción entre miRNAs y mRNAs y
resalta las dificultades en encontrar un algoritmo universal de predicción de los blancos, por lo
menos con la información y el conocimiento disponibles hasta este momento (Peter, 2010).
Los algoritmos computacionales para predecir las interacciones entre miRNAs y mRNAs
pueden ser clasificados en dos tipos: aquellos basados en reglas y aquellos dirigidos por datos.
En general, todos los algoritmos bioinformáticos para predecir interacciones miRNA/
mRNA en anímales y humanos toman en consideración cuatro aspectos (Dweep, Sticht, & Gretz,
2013):
1. Patrón del pareamiento de bases en la secuencia semilla
2. Estabilidad termodinámica del duplex miRNA/mRNA
3. Conservación de los sitios blanco
4. Presencia de múltiples sitios blanco
En lo que respecta al patrón de pareamiento de bases en la secuencia semilla la
clasificación de los sitios de interacción utilizada por los algoritmos bioinformáticos difiere en su
nomenclatura con la presentada en el capítulo 2, aunque corresponde al mismo fenómeno
Los seis tipos de interacción posible que actualmente son consideradas por la mayoría de
los algoritmos son:
1. Sitio 5’ dominante canónico
2. Sitio 5’ semilla solamente
3. Sitio 3’ compensatorio
4. Sitio con pareamiento central
5. Sitio miBridge
6. Sitio Pivot
Los tres primeros sitios han sido descritos con anterioridad. Un estudio realizado
analizando los resultados de un arreglo de DNA luego de la transfección de 11 microRNAs en
células HeLa describió la existencia de un tipo de sitio único que estaba asociado con regulación
a la baja del mRNA y fue denominado como “sitio centrado”, el cual se caracteriza por la
existencia de por lo menos 11 nucleótidos contiguos con pareamiento perfecto de tipo
Watson-Crick en la región central del miRNA entre los nucleótidos 4-14 o 5-15, sin pareamiento
substancial ni en la región 3’ ni en la región 5’ del miRNA. Estos sitios representan un sitio
intermedio entre los sitios con pareamiento en la secuencia semilla y los que tienen sitios
complementarios (Shin et al., 2010).
La caracterización de los sitios miBridge y los sitios Pivot, ha sido realizada por
experimentos de validación de blancos, como han sido ensayos de luciferasa y por secuenciación
de alta eficiencia de RNA aislado por entrecruzamiento e inmunoprecipitación (HITS-CLIP)
(Lee et al., 2009; Chi, Hannon, & Darnell, 2012).
El segundo aspecto considerado por la mayoría de los algoritmos de predicción es la
estabilidad termodinámica del duplex miRNA/mRNA expresada como la mínima energía libre
(MFE por sus siglas en inglés). Recientemente se ha demostrado que este aspecto puede ser
excluído sin afectar de forma significativa los algoritmos de predicción (Dweep et al., 2013).
La conservación de los sitios blancos es un aspecto fundamental en la predicción
bioinformática de las interacciones miRNA/mRNA. Varios algoritmos analizan regiones 3’-UTR
-ortólogas en diferentes especies y toman en consideración la conservación para validar o no un
sitio como posible blanco. La inclusión de este tipo de filtros incrementa la posibilidad de falsos
negativos (Ghosh, Chakrabarti, & Mallick, 2007).
Finalmente y dado que multiples miRNAs pueden regular un mismo gen y a la vez un gen
puede ser blanco de varios miRNAs, la presencia en la región 3’-UTR de un sitio que puede ser
blanco de múltiples miRNAs incrementa la posibilidad de que se produzca de manera efectiva su
silenciamiento y esta característica es considerada por varios algoritmos de predicción.
Aunque existen múltiples algoritmos para predecir las interacciones, la figura 4 muestras
los flujogramas de trabajo de TargetScan y Diana-microT los cuales son ampliamente utilizados.
Figura 4.Los algoritmos de predicción toman en cuenta diferentes variables para determinar la probabilidad de que un mRNA sea blanco de un miRNA específico. En el caso de TargetScan el análisis de conservación de las regiones 3'-UTR ortólogas, el número de apareamientos en la se-cuencia semilla y otras características permiten asignar un puntaje para establecer si un mRNA es o no considerado blanco. Otros algoritmos tienen una aproximación diferente pero en general la conservación, el número de pareamientos en la secuencia semilla y la conservación de la energía son utilizados como variables de predicción.
Uno de los algoritmos más recientes y que presenta algunas características particulares es
extremo 5’ del miRNA y recorre la secuencia completa del gen que este analizando.
Tan pronto como identifica un pareamiento perfecto del heptámero inmediatamente
extiende la longitud del alineamiento hasta que aparece un “mistmatch”. En consecuencia al
algoritmo devuelve todos los posibles “hits” con 7 o mas nucleótidos con pareamiento perfecto.
El algoritmo asigna la predicción de los resultados en cinco partes: región promotora, 5’-UTR,
CDS, regiones 3’-UTR y genes mitocondriales. Adicionalmente, este algoritmo permite dentro
de su configuración la combinación de 8 bases de datos diferentes, de manera que los resultados
de predicción obtenidos tienen una menor probablidad de resultados falsos positivos o negativos
(Dweep et al., 2013; Dweep, Sticht, Pandey, & Gretz, 2011).
2.3 microRNAs y leucemia: Nuevos paradigmas, nuevas esperanzas
2.3.1 miRNAs y hematopoyesis
La médula ósea es uno de los microambientes donde residen células madre o células
“stem” mejor caracterizado y es además el sitio primario de la hematopoyesis en los mamíferos,
incluidos los humanos. Las células maduras y terminalmente diferenciadas del sistema
hematopoyético; las cuales cumplen funciones altamente especializadas, tienen
caracteristicamente una vida media corta. Esto deriva en que de forma continua y durante toda la
vida del organismo, las células madre hematopoyéticas (HSC por su sigla en inglés), deben
garantizar la generación de progenitores multipotentes que se diferencien de forma progresiva y
garanticen el mantenimiento de las poblaciones celulares requeridas para la homeostásis.
El estudio de la hematopoyesis murina y de forma más reciente en el modelo de Pez
Cebra ha permitido una mejor compresión de los sitios de origen del tejido hematopoyético en la
vida embrionaria (ej. la existencia de un precursor común de las células hematopoyéticas y
endoteliales llamado hemangioblasto); y una caracterización de los factores de transcripción
requeridos en cada parte del proceso para restringir de forma progresiva el linaje hasta llegar
finalmente a células terminalmente diferenciadas (Orkin & Zon, 2008).
-No es sorprendente, que un proceso tan complejo como la hematopoyesis requiera de la
participación de los miRNAs los cuales se encuentran implicados en la regulación de cada uno
de los pasos de diferenciación en todos los linajes así como del mantenimiento de las HSC y la
regulación del microambiente de la médula ósea.
La deleción completa de Dicer que deriva en la ausencia de formación de microRNAs
tiene letalidad embrionaria. La deleción condicional de Dicer en estadios mas avanzados del
desarrollo así como la inactivación genética selectiva de algunos miRNAs han mostrado efectos
severos en el fenotipo y han permitido definir además cuales miRNAs son esenciales en
diferentes linajes y estadios del proceso hematopoyético.
La figura 5 resume de manera gráfica estos conceptos, relacionando los diferentes
factores de transcripción que se ha demostrado a nivel experimental que son esenciales para
alguna transición en el proceso de desarrollo y los diferentes miRNAs descritos como
LT-HSC
ST - HSC
PM
PMC PLC
PME PGM
P-Eri P-MK
GR M B E N MM D B T NK
Pro B Pro T Pro NK Globulo&
rojo Megacariocito Basófilo Eosinófilo Neutrófilo
Monocito Macrógago Célula& Dendrítica Linfocito B Linfocito T Célula&NK Runx-1 Scl/ tal-1 Lmo-2 Mill Tel Bmi-1 Gfi-1 GATA-2 PU-1 GATA-1 FOG-1 Gfi-1b EKLF GATA-1 Gfi-1b PU-1 PU-1 C/EBP-a GATA-1 GATA-1 Gfi-1b IKAROS PU-1 NOTCH GATA-1 FOG-1 Gfi-1b EKLF miR 125a miR 125b miR-520h miR-29a miR-196b miR-223 miR-15 / miR-155
miR-181 miR-223 miR-150 miR-34 miR-10a miR-144 miR-16 miR-451 miR-150 miR-424 miR-17-5p miR-20a miR-106a HSC Pluripotente Progenitores multipotentes Precursores comisionados Células maduras
-Figura 5. (Página anterior). Hematopoyesis normal: Integración entre factores de transcripción y miRNAs. En letra verde y negrita: miRNAs que favorecen el tránsito de un estadio celular a otro. En letra negra: miRNAs que lo reprimen. LT-HSC: Long Term HSC (Hematopoietic Stem Cell); ST-HSC: Short Term HSC; PM: Progenitor multipotente; PMC: Progenitor mieloide común; PLC: Progenitor linfoide común; PME: Progenitor megacariocítico-eritroide; PGM: progenitor granulocito-macrófago. Adaptado de Bissels et al (2012). (Bissels, Bosio, & Wagner, 2012)
2.3.1 miRNAs y leucemia
2.3.1.1 OncomiRs: miRNAs oncogénicos
La participación de los miRNAs como un mecanismo de regulación del proceso
hematopoyético y los efectos que puede tener el silenciamiento genético de un miRNA
específico en el fenotipo hacen que estas móleculas surjan como un potencial contribuyente a la
leucemogénesis. La alteración de las complejas redes de regulación que garantizan desde el
mantenimiento de las HSC hasta la diferenciación terminal de las células es una atractiva área de
investigación en particular por la posibilidad de encontrar antagonistas de los miRs oncogénicos
que puedan tener un potencial terapéutico.
La primera descripción de la participación de los miRNAs en la génesis de un cáncer en
humanos fue en un modelo de leucemia (Calin et al., 2002). La leucemia linfocítica crónica
(LLC) es un desorden linfoproliferativo clonal en el cual células maduras de linaje B se
acumulan de forma progresiva en la sangre periférica, la médula ósea, el bazo, los ganglios
linfáticos y ocasionalmente en sitios extramedulares. En la mayoría de los casos, las células
tienen un bajo índice de proliferación y una alta resistencia a la apoptosis. Característicamente
los estudios citogenéticos son negativos en esta condición, en parte en relación con el bajo índice
mitótico de las células. Por el contrario, los estudios de citogenética de interfase mediante
técnicas de fluorescencia por hibridización in situ (FISH por su sigla en inglés), demuestran
anormalidades cromosómicas en mas del 80% de los casos, siendo en la gran mayoría deleciones
La anormalidad cromosómica más frecuente en esta condición es la deleción del
cromosoma 13 (del 13q14), la cual es reportada hasta en el 55% a 60% de los casos (Döhner et
al., 2000). La búsqueda de los mecanismos específicos por medio de los cuales esta deleción es
leucemogénica derivó en el hallazgo de que no era producto de la pérdida de ninguno de los
ocho genes que se localizan en esta región sino de la deleción de dos miRNAs que se encuentran
en una región de 30-kb y que forman un grupo designado como miR-15a/16-1 (Calin et al.,
2002). La demostración de la capacidad leucemogénica de la deleción de estos miRNAs fue
realizada en un modelo experimental. La deleción condicional de miR-15a/16-1 derivó
inicialmente en la expansión de una población de linfocitos B maduros anormales y finalmente
en el desarrollo de una enfermedad linfoproliferativa semejante a una leucemia linfocítica
crónica y otras formas de linfoma con mayor grado de agresividad (Klein et al., 2010).
Los estudios en otros modelos de leucemia tanto en animales como en humanos han
mostrado que la expresión de perfiles específicos de miRNAs pueden tener implicaciones
pronósticas y adicionalmente pueden permitir la identificación precisa del linaje linfoide o
mieloide en casos de leucemia aguda y caracterizar grupos citogeneticamente definidos de
leucemia linfoblastica aguda infantil.
El perfil de expresión de miRNAs puede permitir diferenciar de una manera precisa entre
leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoblastica aguda (LLA). Un estudio que analizó
el perfil de expresión de 435 miRNAs en 72 muestras de leucemia aguda, de las cuales 54
correspondian a casos de LMA, 18 a casos de LLA y tres a controles normales, demostró que en
un análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado de genes contra muestras, las mismas se
agrupaban claramente en dos grupos de los cuales uno estaba conformado por todas las muestras
de LLA y el otro por las muestras de LMA y los controles normales los cuales formaban un
sub-grupo. Los miRNAs mas discriminatorios fueron miR-128a, miR-128b, let-7b y miR-223.
Tomando estos cuatro miRNAs se pudo discriminar de manera efectiva entre los casos de LMA y
LLA con precisión del 97% y una sensibilidad y especificidad entre 96 y 100%. Tanto miR-128a
como miR-128b fueron expresados a mayores niveles en los casos de LLA comparados con los
casos de LMA. Por el contrario, la expresión de miR-223 y let-7b fue mayor en los casos de
LMA. Si bien este estudio no estableció mecanismos leucemogénicos relacionados con estas
alteraciones del perfil de expresión de miRNAs, si permite establecer que estas dos condiciones
-tienen diferencias mas allá del inmunofenotipo y que mecanismos epigenéticos pueden estar
vinculados a la génesis de estas condiciones (Mi et al., 2007).
El efecto de la regulación anormal de la expresión de miR-125b ha sido igualmente
evaluado en otros modelos tumorales. En el modelo de cáncer de colon y de igual forma que en
los tumores del tejido hematopoyético los niveles elevados de expresión de miR-125b se han
relacionado con una regulación a la baja de proteínas anti-apoptóticas, con la consecuente
reducción de la apoptósis de las células tumorales, el favorecimiento de la proliferación celular y
finalmente del crecimiento tumoral. En otros tipos de tumores como el cáncer de vejiga, cáncer
de mama, cáncer endometrial y cáncer de ovario, la regulación a la baja de miR-125b ha
demostrado tener potencial oncogénico mediante la regulación de blancos específicos en cada
tipo tumor (Banzhaf-Strathmann & Edbauer, 2014). Esto resalta la necesidad de realizar estudios
en modelos tumorales específicos y demuestra como el potencial de regular de forma simultánea
múltiples genes hace que los micro-RNAs puedan tener efectos distintos cuando se expresan de
manera anormal en un tejido específico.
La capacidad leucemogénica de los miRNAs ha sido evaluada experimentalmente. La
sobreexpresión de miR-125b es capaz de inducir leucemia aguda en un modelo murino. En cerca
del 50% de un grupo de ratones transplantados con células de hígado fetal que sobreexpresaban
de manera estable miR-125b se desarrolló una neoplasia hematológica entre 12 y 29 semanas
luego del trasplante, De manera llamativa, los niveles de miR-125b en sangre periférica,
determinados por RT-PCR parecieron relacionarse con el tipo de neoplasia desarrollada, siendo
mas bajos en los casos de LLA de precursores T y mayores en los casos de neoplasias mieloides.
Estos resultados demuestran claramente que miR-125b actúa como un oncogén (Bousquet,
Harris, Zhou, & Lodish, 2010).
Los mecanismos por los cuales miR-125b es leucemogénico están relacionados con su
efecto son LIN28A. Tanto en ratones como en humanos LIN28A actúa como un regulador de la
embriogénesis temprana y su expresión ectópica en conjunto con Oct4, Sox2 y Nanog causa
de-diferenciación de células humanas maduras en células stem pluripotentes inducidas con
características de células stem embriónicas (Chaudhuri et al., 2012; Yu, Schneiderhan-Marra,
2.3.1.2 miRNAs y LLA
Los estudios del perfil de expresión de miRNAs en muestras de leucemia linfoblastica
aguda provienen en su mayoría de estudios realizados en población pediátrica donde esta
enfermedad es más prevalente. De hecho, la distribución por edades muestra un incremento del
número de casos de LLA en la primera década de la vida seguida por un rápido descenso y
posteriormente un incremento lento y sostenido de la incidencia en las últimas décadas .
De acuerdo con los datos de GLOBOCAN 2012, durante dicho año se presentaron a nivel
mundial 14.1 millones de casos nuevos de cáncer; 8.2 millones de muertes por cáncer y un
estimado de 32.5 millones de personas conviviendo con algún tipo de neoplasia maligna. Para
Colombia durante el mismo año, la leucemia en general represento el noveno tipo de cáncer más
frecuente con una tasa de 5.4 por 100.000 (http://globocan.iarc.fr/. Consultado el 05 de Julio de
2014).
Las características biológicas de la LLA en humanos se han estudiado a partir de las
anormalidades citogenéticas recurrentes encontradas en la enfermedad. Aproximadamente el
80% de los pacientes con esta condición tienen evidencia de anormalidades citogenéticas
clonales al momento del diagnóstico siendo las más comunes las traslocaciones. Es además claro
que las anormalidades citogenéticas son una variable pronóstica independiente y que es posible
clasificar a los pacientes en grupos de riesgo basados en esta característica, siendo el grupo con
mayores posibilidades de recaída y menor supervivencia los que presentan t(9;22)(q34;q12) la
cual deriva en la formación de la fusión BCR-ABL y altera el funcionamiento normal de la
actividad de tirosina kinasa de ABL derivando en bloqueo de la diferenciación, proliferación e
inhibición de la apoptosis, alteración de la adhesión celular e inestabilidad genómica (Dombret et
al., 2002; Mancini et al., 2005; Moorman et al., 2007; Moorman et al., 2010).
Los estudios de los perfiles de expresión de miRNAs en LLA en adultos han estado
orientados a su caracterización con miras a identificar genes y vías de señalización
potencialmente alteradas y que estén vinculadas al proceso leucemogénico; a la identificación de
miRNAs con un potencial valor pronóstico y a la identificación de potenciales blancos
terapéuticos.
Es necesario además resaltar que existen grandes diferencias en cuento al pronóstico entre
-los pacientes adultos y niños con LLA y es por tanto indispensable que la investigación se centre
en un grupo específico de edad.
Un estudio realizado en Brasil cuyo objetivo era analizar el perfil de expresión de
miRNAs en una muestra de pacientes adultos con leucemia comparados con pacientes normales,
incluyó muestras de sangre periférica de nueve pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC)
y muestras de médula ósea de siete pacientes con LLA. Una vez realizado un procedimiento de
separación de mononucleares por un gradiente de densidad y de seleccionar las células CD19
positivas mediante perlas inmunomagnéticas en los casos de LLC, se realizó el análisis del perfil
de expresión de miRNAs mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los cinco miRNAs
expresados con mayor frecuencia en los pacientes con LLA fueron miR-128b, miR-204,
miR-218, miR-331, y miR-181b-1, siendo el mas representativo el miR-128b el cual se encontró
expresado en las células tumorales 436.5 veces más que en las células CD19 positivas normales.
La predicción de las interacciones realizada por tres diferentes algoritmos bioinformáticos
mostró que uno de los genes cuya función podría perderse como consecuencia de la expresión de
miR-331 era SOCS1 el cual actúa como un regulador negativo de la acción de STAT lo cual
podría favorecer la proliferación y la supervivencia de las células tumorales (Zanette et al.,
2007).
La LLA en los adultos es una enfermedad variable cuyas características genéticas y
moleculares difieren considerablemente de las de la población pediátrica. La anormalidad
genéticas más frecuente es la presencia de la fusiónBCR/ABLla cual se presenta hasta en el 25%
de los casos. Otras anormalidades menos frecuentes son la presencia de la fusión MLL/AF4
presente en el 5% a 10% de los pacientes y finalmente la fusiónE2A/PBX1 la cual se encuentra
en el 2% a 3% de los casos (Advani & Lazarus, 2010). Chiaretti et al. (2005) caracterizaron las
firmas de expresión génica en células de pacientes adultos con LLA con anormalidades
citogenéticas conocidas encontrando de forma inicial en un agrupamiento jerárquico no
supervisado que los casos con los rearreglos genéticos E2A/PBX1 y MLL/AF4 formaban dos
grupos diferentes correspondientes precisamente a la clasificación molecular de estas muestras
pero que, por el contrario, los casos con el rearreglo BCR/ABL mostraban un perfil más
heterogéneo y se distribuían en varios grupos. Posteriormente realizaron el análisis mediante un
ABL;Negativo) para encontrar los genes con valores medios de expresión significativamente
distintos, encontrando que los casos con el rearreglo MLL/AF4 estaban caracterizados por altos
niveles de expresión de un grupo de aproximadamente 50 genes que incluían la regulación al alta
de varios genes de la familia HOX y el receptor de FLT3 en tanto que los casos con el rearreglo
E2A/PBX1también mostraban un patrón distintivo y homogeneo caracterizado por un alto nivel
de expresión de aproximadamente 35 genes siendo los más fuertemente asociados con este grupo
PBX1, FAT, NID2 y KANK. El grupo BCR/ABL fue nuevamente más heterogéneo y con una
regulación al alta de aproximadamente 70 genes (Chiaretti et al., 2005). La descripción de estas
firmas de expresión génica características de un tipo molecular específico de LLA plantea
claramente la existencia de mecanismos diferentes de leucemogénesis entre las diferentes
categorías y adicionalmente la posibilidad de que se puedan identificar blancos terapéuticos
especificos.
Con el proposito de identificar si un perfil de expresión de miRNAs discriminaba entre
los diferentes grupos citogenéticos y moleculares de LLA, incluidos los que no tenian
anormalidades detectables, Fulci et al. (2009) condujeron un estudio en el cual fueron incluidas
muestras de 52 pacientes adultos con LLA con una mediana de edad de 42 años y de los cuales
nueve tenían LLA de precursores T y 43 de precursores B y dentro de este último grupo 17
tenían el rearreglo BCR/ABL; 15 no tenían anormalidades detectables; cuatro tenían el rearreglo
E2A/PBX1 y 7MLL/AF4. El análisis de los niveles de expresión de 420 miRNAs fue analizado
mediante un microarreglo o por medio de PCR cuantitativa en tiempo real. De forma simultanea
se realizó el análisis del perfil de expresión génica en una plataforma de microarreglos. Veinte
muestras fueron analizadas mediante un microarreglo para identificar los miRNAs expresados,
las cuales pertenecían a cinco clases diferentes de LLA (Precursores T, BCR/ABL, E2A/PBX1,
MLL/AF4, y precursores B sin anormalidades detectables). En este grupo un filtro inicial
seleccionó 135 miRNAs que mostraban variabilidad en el nivel de expresión entre las muestras.
El agrupamiento jerárquico no supervisado basado en la expresión de estos miRNAs agrupó
correctamente los casos de LLA T así como los casos con los rearreglos BCR/ABL, E2A/PBX1,
MLL/AF4. Para identificar los miRNAs que podía discriminar entre los diferentes subtipos
clínicos se realizaron inicialmente comparaciones entres los casos de LLA-T y LLA-B
encontrando una disminución a la baja de miR-151 y una regulación al alta de miR-148 y
-miR-224 en los casos de LLA T. Por otra parte, la discriminación entre los diferentes subgrupos
de LLA-B usando un ANOVA encontró que los miRNAs discriminantes entre las diferentes
clases de LLA-B fueron: miR-425-5p, miR-191 y miR-128 los cuales fueron expresados
preferencialmente en los casos con el rearreglo E2A/PBX1; miR-629 el cual se encontró
fuertemente expresado en los casos con el rerregloMLL/AF4y finalmente miR-146b y miR-126
que fueron expresados en los casos BCR/ABL positivos (Fulci et al., 2009). Los resultados
obtenidos por estos autores demuestran como el perfil de expresión de miRNAs difiere entre los
grupos citogenéticos y moleculares de LLA en adultos. Es además claro que cada uno de estos
grupos tiene características particulares en cuanto a su comportamiento clínico con una
supervivencia global y libre de enfermedad diferente. Los hallazgos plantean entonces la
posibilidad de que la alteración en el perfil de expresión de miRNAs y la consecuente
modificación del perfil de expresión génica con alteración de diferentes vías como las de
señalización del receptor de la célula B y T y la presentación y el procesamiento de antígenos
sean mecanismos leucemogénicos (Fulci et al., 2009).
La identificación de factores pronósticos en pacientes con LLA es crucial para el
planeamiento adecuado de las estrategias de tratamiento. Tradicionalmente los factores de riesgo
han sido clasificados en aquellos derivados de las características de los pacientes al momento de
la presentación dentro de los cuales el principal es la edad al momento del diagnóstico siendo el
punto de corte para algunos grupos 30 años y para otros 35 años y otros como la citogenética; el
recuento de leucocitos al diagnóstico; la presencia de compromiso del sistema nervioso central;
el no logró de remisión a la cuarta semana de tratamiento y de manera más reciente la
enfermedad mínima residual después del tratamiento (Bassan & Hoelzer, 2011).
Un porcentaje significativo de pacientes es clasificado por estos criterios dentro del grupo
de riesgo estándar el cual de acuerdo con el comportamiento de la supervivencia libre de
enfermedad y global es un grupo particularmente heterogéneo. La mejor clasificación de los
pacientes en grupos de riesgo claramente definidos con un comportamiento clínico homogéneo,
permitiría plantear nuevas estrategias de tratamiento en las que aquellos pacientes con un riesgo
más alto sean intensificados de manera temprana y llevados a trasplante alogénico, en tanto que
los que tengan un pronóstico más favorable reciban un tratamiento menos intensivo
