Efecto de tipos de sustratos en el establecimiento ex vitro de Stevia rebaudiana Bertoni en Trujillo, La Libertad

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(1)CU AR IA. S. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. PE. UNT AG. RO. FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA PROFESIONAL DE AGRONOMIA. Efecto de tipos de sustratos en el establecimiento ex vitro. BI. BL IO TE. CA. DE. de Stevia rebaudiana Bertoni en Trujillo, La Libertad. TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE INGENIERO AGRÓNOMO. AUTOR :. Solano Rodríguez, Carmen Alegría. ASESOR :. Ing. Mejía Anaya, Rubino Maximiliano. TRUJILLO – PERÚ 2019. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. DEDICATORIA. Dedico este presente trabajo a mis padres Gustavo Solano y Ana María Rodríguez, ejemplo. S. de constancia y dedicación; quienes siempre estarán conmigo brindándome su apoyo. PE. A mis hermanos, quienes quiero mucho y alegran mis días.. CU AR IA. incondicional.. A mi abuelita María Arqueros, mi segunda madre quien ha estado conmigo en cada etapa de. DE. AG. RO. mi vida inculcándome los buenos valores.. BI. BL IO TE. CA. Solano Rodríguez, Carmen Alegría. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(3) BI. BL IO TE. CA. DE. AG. RO. PE. CU AR IA. S. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. AGRADECIMIENTO. Gracias al Divino Dios, por haberme permitido llegar hasta esta etapa de mi vida con salud y darme las fuerzas necesarias para seguir el sendero de la vida, pues sin él no lo hubiera. CU AR IA. S. logrado.. Gracias a mis padres quienes me dieron la vida y forjaron en mí los buenos valores.. A mi asesor Ing. Rubino Mejía por los conocimientos compartidos y su constante motivación. CA. DE. AG. RO. PE. en cada circunstancia de mi vida.. BI. BL IO TE. Solano Rodriguez, Carmen Alegria. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. ÍNDICE GENERAL. DEDICATORIA………………………………………………………………..……......ii. S. AGRADECIMIENTO……………………………………………………………… .....iv. CU AR IA. INDICE GENERAL… ………...……………………………………………………....v INDICE DE TABLAS………………...……………………………………….…..…..vii INDICE DE FIGURAS……………………………………………………………........ix. PE. PRESENTACION…………………………………………………………………….....x. RO. RESUMEN………………………………………………………………………….…..xi. AG. ABSTRACT…….……………………………………………………………………...xii CAPITULO I………………………………………………………………………….....1. DE. 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………..….....………..1 CAPITULO II………………...…………………………………………………….........7. CA. 2. MATERIALES Y METODOS………………………………………..….……...7 2.1 Materiales …………………………………………………………………...7. BL IO TE. 2.2 Métodos…………………………………………………………………....10 2.3 Técnicas...………………………………………………………………….13. 2.4 Procedimiento...............................................................................................14. CAPITULO III…...…………………………………………………………………......19. BI. 3. RESULTADOS Y DISCUCION………………………………………...……..19 3.1 Altura de planta…………………………………………………..………...19 3.2 Longitud de raíz……………………………………………………………22 3.3 Numero de brotes………………………………………………………......25 3.4 Área foliar………………………………………………………………….28 3.5 Peso fresco y peso seco...…………………………………………………..31. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. CAPITULO IV………………………………………………………………………….36 4. CONCLUSIONES……………………………………………………………...36 CAPITULO V…………………………………………………………………………..37. CU AR IA. S. 5. RECOMENDACIONES…………………………………………………….....37. CAPITULO VI………………………………………………………………………….38 6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS……………………………………..…...38. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. RO. PE. ANEXOS………………………………………………………………………………….. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 2.1. Descripción de tratamientos variando los tipos de sustratos que han sido en. el. presente. S. considerados. CU AR IA. estudio………………………………………………………….………………………….11 Tabla 3.1. Altura de planta por tratamiento……………………………………………….19. Tabla 3.2. ANOVA para el efecto de los tratamientos en altura promedio de planta……………………………………………………………………………………....21. PE. Tabla 3.3. Resultados de longitud promedio de raíz por tratamiento en 4. RO. evaluaciones….....................................................................................................................22 Tabla 3.4. Comparaciones múltiples de Tukey para el efecto de los tratamientos en longitud. Tabla. 3.5.. ANOVA. AG. de raíz……………………………………………………………………………….…......24 para. la. variable. de. respuesta. número. de. DE. brotes………………………………………………………………………………..…......25. CA. Tabla 3.6. Prueba múltiple de Tukey para la variable número promedio de brotes…………………………………………………………………………………..…..26. BL IO TE. Tabla 3.7. ANOVA para el efecto de los tratamientos para la variable área foliar…………………………………………………………………………………….....28 Tabla 3.8. Prueba múltiple de Tukey para la separación de medias para la variable área foliar de. Stevia. rebaudiana. BI. Bertoni………………………………………….…………………………………….........29 Tabla. 3.9.. Peso. fresco. foliar. y. radicular. por. tratamiento……………………………………………………………………….………...31 Tabla. 3.10.. ANOVA. para. las. variables. peso. fresco. y. peso. seco……………………...………………………………………………………………....32. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Tabla 3.11. Prueba múltiple de Tukey para la separación de medias con respecto a la variable peso. fresco. foliar. en. Stevia. rebaudiana. Bertoni………………………………………………………………….………………….33 Tabla 3.12. Prueba múltiple de Tukey para la separación de medias con respecto a la variable seco. foliar. en. Stevia. rebaudiana. S. peso. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. RO. PE. CU AR IA. Bertoni…………………………………………………………………………………......35. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. INDICE DE FIGURAS. Figura 2.1. Ubicación del experimento en un anaquel del estante dentro del Laboratorio de Biotecnología. Vegetal…………………………………………………………………12. S. Figura 3.1. Altura promedio de planta mostrando una respuesta creciente al incremento de. CU AR IA. tipos de sustratos………………………………………………………………….............20 Figura 3.2. Tendencia de crecimiento promedio de raíz…………………………………23 Figura3.3.Tendencia. de. desarrollo. del. número. de. brotes…………………………………………………………………………………...….27 Figura 3.4.Área foliar a 75 días de haber instalado las plántulas a bolsas de vivero………………………………………………………………………………………28. PE. Figura 3.5. Área foliar por tratamiento según las medidas descriptivas de valor mínimo, mediano y máximo……………………..………………………………………….…….29. RO. Figura 3.6. Peso fresco foliar por tratamiento según las medidas descriptivas de valor mínimo, mediano y máximo………………………………………………………….…33. AG. Figura 3.7. Peso seco foliar por tratamiento según las medidas descriptivas de valor mínimo,. BI. BL IO TE. CA. DE. mediano y máximo…………………………...…………………………………………….34. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. PRESENTACIÓN. S. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:. CU AR IA. En cumplimiento a las disposiciones vigentes contenidas en el Reglamento de Tesis Universitaria de la Escuela Profesional de Agronomía, someto a vuestro elevado criterio la. tesis titulada: Efecto de tipos de sustratos en el establecimiento ex vitro de Stevia rebaudiana Bertoni en Trujillo, La Libertad, con el propósito de obtener el título profesional de Ingeniero. Solano Rodríguez, Carmen Alegría. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. RO. PE. Agrónomo.. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Efecto de tipos de sustratos en el establecimiento ex vitro de Stevia rebaudiana Bertoni en Trujillo, La Libertad. E-mail: [email protected]. Asesor: Ing. Mejía Anaya, Rubino Maximiliano. E-mail: [email protected]. RESUMEN. CU AR IA. S. Autor: Solano Rodríguez, Carmen Alegría. PE. El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo determinar el efecto de tipos de sustratos en el establecimiento ex vitro de Stevia rebaudiana Bertoni en Trujillo, La. RO. Libertad. Se emplearon dieciséis tratamientos compuestos de diferentes sustratos a diferentes dosis, distribuidos en un Diseño de Bloques Completamente al Azar. La unidad experimental. AG. estuvo constituida por una bolsa con sustrato en la cual se colocó una plántula en estadio III, obtenida del laboratorio de cultivos in vitro. Las variables evaluadas fueron altura de planta, longitud de raíz, numero de brotes, área foliar, peso fresco y peso seco. Con los datos. DE. obtenidos se realizó el análisis de varianza y la prueba de tukey al 0.05%. Los tratamientos satisfactorios fueron el T7: Arena 80% + Musgo 10% + Humus de lombriz 10%; T8: Arena. CA. 70% + Musgo 15% + Humus de lombriz 15%; T9: Arena 60% + Musgo 20% + Humus de lombriz 20% y T10: Arena 50% + Musgo 25% + Humus de lombriz 25%; mostrando. BL IO TE. resultados estadísticamente no diferentes. Por lo que, se eligió al T7 como el mejor; siendo el más rentable económicamente y cuyos resultados obtenidos para las diferentes variables evaluadas fueron AP (44.3 cm), LR (8.93 cm), NB (15.75), AF (8.03 cm2), PFF (7.64g) y. BI. PSF (3.82g).. Palabras claves: Sustratos, dosis, laboratorio, plántula, humus de lombriz. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Effect of types of substrates in the ex vitro establishment of Stevia rebaudiana Bertoni in Trujillo, La Libertad. E-mail: [email protected]. Advisor: Ing. Mejía Anaya, Rubino Maximiliano. E-mail: [email protected]. PE. ABSTRACT. CU AR IA. S. Author: Solano Rodríguez, Carmen Alegría. The objective of this research was to determine the effect of substrates types in the ex vitro. RO. establishment of Stevia rebaudiana Bertoni in Trujillo, La Libertad .Sixteen treatments composed of different substrates at different doses were used, distributed in a Design of Blocks Completely Random. The experimental unit consisted of a bag with a substrate in. AG. which a stage III seedling was placed, obtained from the in vitro culture laboratory. The variables evaluated were plant height, root length, number of shoots, foliar area, fresh weight. DE. and dry weight. With the obtained data, the analysis of variance and the tukey test at 0.05% were performed. Satisfactory treatments were T7: Sand 80% + 10% Moss + 10% worm. CA. humus; T8: Sand 70% + Moss 15% + Humus worm 15%; T9: Sand 60% + Moss 20% + Humus of worm 20% and T10: Sand 50% + Moss 25% + Humus of worm 25%; showing. BL IO TE. results statistically not different. Therefore, the T7 was chosen as the best; being the most economically profitable and whose results obtained for the different variables evaluated were. BI. AP (44.3 cm), LR (8.93 cm), NB (15.75), AF (8.03 cm2), PFF (7.64g) and PSF (3.82g). Key words: Substrates, doses, laboratory, seedling, worm humus. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. CAPITULO I. 1. INTRODUCCIÓN. S. La producción mundial de esta planta es entre las 100.000 y 200.000 toneladas,. CU AR IA. siendo los principales productores China, con aproximadamente el 75% de la producción mundial, y Paraguay con cerca del 8%. Otros países productores son Brasil, Argentina, Bolivia, Colombia, Perú, Tailandia, Corea, Rusia, Indonesia, India, Australia, España, Canadá, Costa Rica (SENASA, 2012).. PE. En América es cultivada principalmente en Paraguay, Brasil, Argentina, Colombia, Perú y cultivos muy pequeños en Ecuador. Paraguay, es uno de los mayores. RO. productores de estevia a nivel mundial. Este país pretende aumentar sus ventas a 10 millones de dólares anuales, lo que significa el 10% de la facturación en comparación. AG. a los países del sudeste asiático (100 millones de dólares) (Landázuri y Tigrero,. DE. 2009).. En nuestro País, los lugares donde se viene cultivando la estevia son principalmente las regiones de Cajamarca, Amazonas, San Martin, Ucayali y Apurímac,. CA. obteniéndose cosechas de hasta10 tn hoja seca/ha, mientras que a nivel mundial solo. BL IO TE. llegan alcanzar una producción de 4-6 tn/ha. (Mercedes, 2015).. El Perú cuenta con tres empresas peruanas que cultivan y comercializan estevia en polvo, y son las siguientes: “Stevia Coronel S.A.C.”, “Stevia Perú S.A.C.” y “Stevia One Perú S.A.C”. Nuestro país ha ido ganando fama en la comercialización de la. BI. estevia debido a su contenido de esteviósido que es hasta 50% más en comparación de la estevia proveniente de China. (Flores, 2017). También, se ha experimentado producir este cultivo en algunas zonas costeras del Perú, como es el caso de Ica, Casma, Trujillo y Piura, los cuales se han obtenido buenos resultados.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Las tendencias en el consumo de productos alimenticios en los últimos años han dado un giro hacia lo natural debido al cambio de perspectiva cultural. En el nuevo siglo la comunidad mundial puso en práctica la prevención de enfermedades y el cuidado de la salud, a su vez impulsó el cuidado estético del cuerpo tanto de hombres como de mujeres. La estevia contribuye a satisfacer ésta necesidad mundial; los estudios. S. revelan que su uso está dirigido principalmente a tendencias alimentarias,. CU AR IA. medicinales y agrícolas (Gómez, 2014).. Como edulcorante, la stevia está teniendo éxito tanto como endulzante de mesa, como en el campo industrial, donde empresas reconocidas a nivel mundial la están utilizando dentro de sus productos. Tal es el impulso que ha tenido este ingrediente,. PE. que solo en el año 2015, han salido al mercado más de 180 productos que lo contienen. Ejemplos de estos 34 desarrollos son: Sprite Green y los jugos Odwalla. RO. de Coca Cola, SoBe Life Water y Trop 50 de PepsiCo, y All Sport Naturally Zero de. AG. Dr. Pepper. Según lo expuesto, en nuestro país se puede cultivar la estevia de forma masiva; sin embargo, es necesario recurrir a métodos más eficientes para mejorar su producción. DE. a escala comercial. Por lo que, el cultivo de tejidos es un método de propagación que permite plantaciones más uniformes en cuanto a su crecimiento y producción de. CA. esteviósidos; además, se obtiene una rápida multiplicación clonal que garantiza alta eficiencia y gran estabilidad genética en las plantas producidas (Suarez & Quintero,. BL IO TE. 2014; Vázquez et al., 2014).. La propagación in vitro o micropropagación se define como cualquier procedimiento aséptico que comprenda la manipulación en las plantas de órganos, tejidos o células que produzcan poblaciones de plántulas “limpias”, contrario a la propagación. BI. vegetativa no aséptica o convencional (Ayerbe, 1990).. La propagación in vitro consta de cinco etapas: la etapa 0 o inicial para seleccionar una planta elite; la etapa I de iniciación o establecimiento para el cultivo inicial o primario; la etapa II de multiplicación de brotes; la etapa III de enraizamiento o pre trasplante para producir una planta autotrófica que sobreviva en las condiciones de trasplante del suelo y la etapa IV de transferencia final al medio ambiente. 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Las ventajas de la micropropagación, en comparación con sistemas convencionales, son el incremento acelerado del número de plantas, la disminución del tiempo de multiplicación, un mayor número de plantas por superficie utilizada, el mayor control de sanidad, el fácil transporte para intercambio internacional de materiales y la posibilidad de multiplicar rápidamente especies en peligro de extinción (Martínez,. CU AR IA. S. 2015; Vásquez, 2012).. El problema surge cuando se traslada las plántulas de estevia a bolsas en invernadero, ya que no se llega a saber qué tipo de sustrato reaccionaría mejor debido a que solo con arena la planta no se desarrolla satisfactoriamente, por eso se busca el tipo de sustrato adecuado para que la planta aproveche todos los nutrientes y tenga un buen. PE. desarrollo a bajo costo.. RO. El trasplante de las vitroplantas del medio aséptico de cultivo al ambiente natural en el invernadero y luego a su sitio final involucra que deban pasar por un período de. AG. aclimatación para que puedan sobrevivir. Durante este período las plantitas se ven obligadas a formar raíces y brotes funcionales para volverse autótrofas, según el. DE. sustrato que se utilice (Hartman y Kester, 1997). El éxito de esta etapa radica en el cuidado que se tenga controlando la susceptibilidad de las vitroplantas a la deshidratación (Espinal-Rueda, 2002), ya que a pesar de que. CA. se tengan condiciones controladas de temperatura, luminosidad y humedad, se puede. BL IO TE. obtener pérdidas muy cuantiosas (Borys et al., 1995).. La duración de esta etapa depende principalmente de la rusticidad de las especies pero en general es de 45 a 60 días aproximadamente (Hartman y Kester, 1997). A continuación se describen ciertas modificaciones anatómicas y fisiológicas gracias a. BI. las cuales la vitroplanta tiene un gran potencial de supervivencia ex vitro. Estos cambios de aclimatación se encuentran asociados a la pérdida excesiva de agua, baja luminosidad y bajos porcentajes de humedad del sustrato (Pierik y Van de Pol, 1995).. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. La cutícula es una capa de cera que cubre la epidermis de las hojas protegiéndolas de la pérdida excesiva de agua. Esta no se encuentra bien desarrollada en las plantas que han sido producidas en tubos de ensayo debido a la alta humedad relativa in vitro (90-100%), provocando una pérdida rápida de agua en las vitroplantas cuando son trasplantadas al invernadero (Pierik, 1990). Por lo que, la aclimatación es un proceso. CU AR IA. (Morgado et al ., 2000; Mroginski et al, 2010).. S. gradual que implica la habilitación y desarrollo de los estomas de la epidermis. Los estomas son pequeñas aberturas localizadas en las hojas, encargadas del balance hídrico en las plantas así como del intercambio de gases necesario para el proceso fotosintético y la respiración. Las mayores pérdidas de agua en las vitroplantas se. PE. deben al relativo mal funcionamiento de los estomas que permanecen abiertos hasta. lumínica (Espinal-Rueda, 2002).. RO. que las plantas puedan ajustarse a un ambiente de baja humedad y mayor intensidad. AG. Es importante mantener la turgencia de las plantas mediante un riego continuo al momento de pasarlas al invernadero ya que existe una reducida conductividad hídrica. DE. entre las raíces y vástagos a consecuencia de la poca conexión vascular vigente. La turgencia además permite el alargamiento celular para el crecimiento. Las plantas han sido cultivadas bajo un ambiente heterotrófico, por lo cual, la energía y. CA. carbohidratos necesarios son obtenidos inicialmente a través de la sacarosa presente en el medio de cultivo. Eventualmente, esa energía y carbohidratos necesarios deben. BL IO TE. ser producidos mediante la fotosíntesis. Luego de aproximadamente diez días posteriores al trasplante, los plantines van iniciando normalmente sus procesos fotosintéticos (Pierik, 1990).. BI. Toogood (2007), hace alusión a los sustratos es de vital importancia puesto que se compone de diminutas partículas de distintos materiales, siendo las partículas más finas las que hacen que el drenaje sea deficiente mientras que las de un tamaño mayor da características como la porosidad que da facilidad de aireación y buen drenaje. El mejor suelo contiene una mezcla de partículas de distinto tamaño aunque para ser fértiles necesitan minerales y nutrientes.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Infoagro (2010), indica que “el sustrato es todo material solido distinto del suelo, este puede ser natural o de síntesis, mineral u orgánico; el cual permite el anclaje de la raíz de la planta por lo que cumple con la función de sostén de la planta. El sustrato puede o no intervenir con la función de nutrir a los vegetales, cumpliendo con las. S. propiedades físicas, químicas y biológicas.”. CU AR IA. Los sustratos aportan nutrientes adicionales, muy necesarios en las etapas tempranas. de desarrollo (Cifuentes, 2003; Espinal et al., 2006; Suarez & Quintero, 2014; Quezada, 2011).. PE. Por lo que es necesario seleccionar un material que lo sustituya tanto en sus propiedades físicas como químicas, tales como la capacidad de intercambio. RO. catiónico, espacio poroso, capacidad de retención de agua, pH y conductividad. AG. eléctrica; así mismo, la nutrición (Valdéz y Benavides, 2013).. El ambiente y sustrato adecuado mejora el enraizamiento de las plantas; estimulando. DE. el crecimiento radicular de las yemas (AGUIRRE, D. 2008.) Esto puede ser debido a que los sustratos pobres en su composición (arena y musgo) actúan más como soporte de la planta, por lo que se mejoraría su composición añadiendo humus de. CA. lombriz, mejorando los procesos de absorción y haciéndolos químicamente más. BL IO TE. activos (Pastor, 2000).. Por otro lado, se obtuvieron los mejores resultados en un trabajo de investigación, al emplear sustratos constituidos por arena, turba y humus de lombriz. Esto se debe a que estos sustratos aportan nutrientes adicionales, muy necesarios en las etapas. BI. tempranas de desarrollo (Cifuentes, 2003; Espinal et al., 2006; Suarez & Quintero, 2014; Quezada, 2011). Espinal de Rueda (2006), encontró un mayor porcentaje de sobrevivencia al utilizar bolsas plásticas, dicha diferencia significativa se vio acentuada en el sustrato compuesto por humus de lombriz, turba y arena; en donde. sobrevivieron el 100% de las vitroplantas siendo el mejor observado en este experimento.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Estos resultados concuerdan con los resultados obtenidos por Lyakhovkin et al., (1993), los que indican que se obtiene una alta sobrevivencia en la aclimatación de stevia utilizando sustratos sueltos, especialmente en la mezcla de arena con suelo agrícola (1:1) ó simplemente mayor parte de arena , ayudado con un abono orgánico. S. como el humus de lombriz (Cifuentes, 2003).. CU AR IA. Por lo expuesto, en el presente trabajo de investigación se busca determinar el efecto de tipos de sustratos en el establecimiento ex vitro de Stevia rebaudiana Bertoni en. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. RO. PE. Trujillo, La Libertad.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. CAPÍTULO II. 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1.1. CU AR IA. S. 2.1 Materiales. Campo experimental. El presente trabajo de investigación se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología Vegetal e invernadero de la Facultad de. PE. Ciencias Agropecuarias de la Escuela Académico Profesional de Agronomía, ubicada en la Universidad Nacional de Trujillo,. Material Vegetal. AG. 2.1.2. RO. departamento de La Libertad.. El material vegetal que se utilizó en este proyecto de investigación fueron. DE. plántulas “in vitro” de estevia (Stevia Rebaudiana Bertoni) en estadio II,. CA. los mismos que fueron proporcionados por el Ing. Rubino Mejía.. 2.1.3 Insumos para preparar medio de cultivo. BI. BL IO TE. . Insumos inorgánicos (Sales minerales). -. NH4NO3. -. KNO3. -. CaCl2.2H2O. -. KH2OPO4. -. H3BO3. -. MnSO4.H2O. -. ZnSO4.7H2O. -. KI. -. Na2MoO4.2H2O 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(20) CoCl2.6H2O. -. MgSO4.7H2O. -. Na2EDTA. -. FeSO4.7H2O. -. INOSITOL (Vitamina). CU AR IA. -. Vitaminas. Tiamina. -. Glicina. -. Acido nicotínico. -. Pyridoxina. RO. PE. -. Reguladores de crecimiento. AG. . CUSO4.5H2O. -. Auxinas : Ácido Naftalen acético (ANA 100ppm). -. Citoquininas: Bencil Aminopurina (BAP 50ppm). DE. . -. S. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Agar. . Agua destilada. . Azúcar refinada. BL IO TE. CA. . BI. 2.1.4. Utensilios de micropropagación. -. Bolsas transparentes de polipropileno 8x4x2”. -. Clips plastificados. -. Hojas de bisturí N° 11. -. Mango de bisturí N° 7. -. Mechero. -. Pinzas larga y pequeña. -. Papel aluminio. -. Placas Petri 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. -. Plástico film. -. Tijera quirúrgica. 2.1.5 Equipos de Laboratorio. -. Autoclave. -. Balanza analítica. -. Cámara de Flujo Laminar. -. Cocina eléctrica. -. Destilador de agua. -. Estufa. PE. CU AR IA. S. Acondicionador de aire. RO. Materiales de asepsia. Alcohol 96°. -. Algodón Absorbente hidrofilico. -. Balde. -. Hipoclorito de sodio al 10%. -. Frascos de plástico tipo taper Gorros asépticos. CA. -. AG. -. DE. 2.1.6. -. Guantes quirúrgicos. -. Guardapolvo. BI. BL IO TE. -. 2.1.7. -. Mascarilla. -. Jabón desinfectante liquido. -. Trapeador. -. Escoba de plástico. Sustratos y materiales de instalacion. -. Arena de rio. -. Musgo refinado. -. Humus de lombriz. -. Tierra agrícola 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Bolsas negras 4x7”. -. Bolsas de polipropileno 3x8x2”. -. Baldes de 20 L. -. Bandejas grandes. -. Malla para tamiz. -. Micas transparentes. -. Plástico negro 3m. -. Tapers transparentes. CU AR IA. S. -. Lápiz. -. Libreta de Apuntes. -. Bolígrafos. -. Escalimetro. -. Papel Bond. -. Memoria USB. -. Cámara Fotográfica. AG. Regla. Servicios terceros. BI. BL IO TE. 2.1.9. Computadora. CA. -. DE. -. RO. -. PE. 2.1.8 Materiales de escritorio. -. Tipeos e impresión. -. Fotocopiado. -. Empastado. -. Transporte. 2.2 Métodos 2.2.1. Diseño de contrastación y tratamientos. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Para la contrastación de la hipótesis del presente trabajo de investigación los tratamientos fueron distribuidos empleando un Diseño de Bloques Completos al Azar (DBCA) constituido de 4 bloques y 16 tratamientos incluyendo al testigo.. CU AR IA. paramétrica de rangos de Tukey con un nivel de significancia al 0.05.. S. A los datos generados se realizó el ANOVA y posteriormente se le aplicó una prueba. Tabla 2.1 Descripción de tratamientos variando los tipos de sustratos que han sido considerados en el presente estudio.. DESCRIPCIÓN. TRATAMIENTO. Arena 90% + Musgo 10%. T2. Arena 80% + Musgo 20%. T3. Arena 70% + Musgo 30%. T4. Arena 60% + Musgo 40%. AG. RO. PE. T1. T5. Arena 50% + Musgo 50%. Arena 90% + Musgo 5% + Humus de lombriz 5 %. T7. Arena 80% + Musgo 10% + Humus de lombriz 10%. DE. T6. T9. BL IO TE. T10. Arena 70% + Musgo 15% + Humus de lombriz 15%. T11. BI. Arena 60% + Musgo 20% + Humus de lombriz 20%. CA. T8. Arena 50% + Musgo 25% + Humus de lombriz 25%. T12. Arena 90% + Musgo 5% + Humus de lombriz 2.5 % + T.A 2.5 % Arena 80% + Musgo 5% + Humus de lombriz 5 % + T.A 10 %. T13. Arena 70% + Musgo 5% + Humus de lombriz 5 % + T.A 20 %. T14. Arena 60% + Musgo 10% + Humus de lombriz 10 % + T.A 20 % Arena 50% + Musgo 20% + Humus de lombriz 15 % + T.A 15 % Musgo 100%. T15. T16 (Testigo) Donde: *T.A: Tierra agricola. *C.E Humus de lombriz : 1.2 mS/cm 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Distribución de los tratamientos  En laboratorio. El ensayo se instaló en el anaquel de madera que se encuentra por debajo del. S. anaquel de malla, ya que las plántulas de estevia no toleran estar cerca a la. DE. AG. RO. PE. CU AR IA. iluminación.. CA. Figura 2.1. Ubicación del experimento en un anaquel del estante dentro del. BL IO TE. Laboratorio de Biotecnología Vegetal..  En invernadero. 5. 1. B 11. 6. 10 12. 7. B III. 1. 14. 4. 10 15. 5. BI. B I. B IV. 16 11. 8. 15 13. 3. 14 10. 2. 9. 7. 4. 12. 6. 3. 14 15. 2. 13. 9. 4. 16 11. 8. 5. 1. 10 13. 5. 9. 16 11. 2. 15. 8. 6. 12. 3. 7. 16. 3. 12. 8. 2. 7. 13. 9. 1. 11 14. 6. 4. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 2.3 Técnicas. 2.3.1 Variables a evaluar. S.  Altura de planta. CU AR IA. Se realizaron las mediciones a intervalos de 15 días desde la instalación hasta la culminación del experimento; en el cual permitió observar el crecimiento de la planta por tratamiento. Para esto se utilizó una regla milimetrada y se midió desde el cuello de planta hasta el ápice.. PE.  Longitud de raíz. RO. Se realizó visualizando el crecimiento radicular desde la bolsa de polipropileno transparente. Se procedió a marcar los puntos de crecimiento de los ápices. AG. radiculares seleccionados con un plumón tinta indeleble y se midió con una regla milimetrada el avance de su desarrollo a intervalos de 15 días.. DE.  Numero de brotes. CA. Se observaron los plantines a intervalo de 15 días de iniciado la conducción del trabajo de investigación para ver si hay efecto de los sustratos en la mayor o menor. BL IO TE. incidencia de número de brotes.  Área foliar. Se determinó el área foliar de los plantines mediante el método Gravimétrico según. BI. Salisbury (2000); el cual consistió en trazar el contorno de la hoja sobre un papel, recortarlo y pesarlo; el área de la hoja fue calculada mediante el pesado de las hojas de papel de área conocida, es decir:. Peso del papel con área conocida. - área conocida (del papel). Peso de la hoja trazada. - X (área de la hoja de la plántula). 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones.  Peso fresco y peso seco. Al término de las evaluaciones se llevaron las raíces y hojas de cada muestra seleccionada por tratamiento dentro de sobres de papel previamente identificados. Para el peso fresco, se llevó a la balanza y se pesaron las muestras de forma rápida y. S. precisa. Así mismo, para el peso seco se llevó estas muestras a la estufa a 60 °C por. CU AR IA. 120 min hasta obtener una humedad de 10%; para finalmente ser pesadas en la balanza.. Los tiempos obtenidos fueron comparables con un estudio japonés realizado a hojas. 2.3.2 Análisis estadísticos. RO. y 80 minutos (70°C) (Taharazako, 1985).. PE. y tallos de estevia que presentó resultados, 150 minutos (50°C), 120 minutos (60°C). AG. Los datos obtenidos fueron analizados mediante el ANOVA al 95% de confianza para determinar las diferencias estadísticas entre los tratamientos y luego se realizó. DE. el análisis POST ANVA para comparar las medias entre tratamientos mediante la prueba de TUKEY (α= 0.05).. BL IO TE. CA. 2.4 Procedimiento. Laboratorio. 2.4.1. Preparación de la solución stock. BI. -. Se usó un pedazo de papel platino de tamaño suficiente para pesar cada ingrediente en forma individual.. -. Se llenó agua destilada en el recipiente (beaker) casi el 80% del volumen total.. -. Se pesó uno por uno las sales minerales conservando el orden correspondiente y se adiciono al beaker agitando con la bagueta.. -. Se agito con una bagueta de modo que se disuelva cada componente. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. -. Se enrazó con agua destilada hasta el volumen indicado para cada stock. -. Se embolso las alícuotas de la solución en bolsitas de polipropileno 8x4x2 cm, para ello se utilizó la probeta de 50ml, y luego se amarro bien.. -. S. Se colocó las alícuotas dentro de una bolsa negra para evitar la. -. CU AR IA. incidencia de luz y posteriormente el desarrollo de algas.. Se llevó al refrigerador para su mejor conservación hasta ser empleados en la preparación del medio de cultivo.. Preparación de medio de cultivo. PE. 2.4.2. Se llenó hasta la mitad el vaso de precipitación 1L con agua destilada. AG. -. RO. Estadio II. Se agregó la solución stock 50ml. -. Se incorporó 7gr de agar y movió con la bagueta. -. Se añadió 30gr de azúcar. -. Se agregó 0.3 ml ANA y 1ml BAP (omitir para EIII). -. Se añadio0.4 ml de hidróxido de sodio para elevar el pH hasta 5.6. -. Se disolvió bien para luego enrazarlo hasta completar el litro. -. Se vertió en frascos de plástico 1200ml.. BL IO TE. CA. DE. -. BI. 2.4.3 Esterilización de instrumentos y medio de cultivo -. Se llevó el medio de cultivo previamente preparado a la autoclave. -. Se colocó los paquetes necesarios de 33 bolsitas junto con el papel bon en la autoclave.. -. Se aseguró bien la autoclave, previamente revisada el volumen de agua adecuada contenido en la autoclave, y se encendió. La temperatura llego hasta 120°, luego se programó para que se 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. mantenga a esta temperatura por 20 minutos, la cual dejo el medio de cultivo e instrumentos totalmente estériles. -. Se esperó que la temperatura de la autoclave baje a 0. Luego abrió la autoclave y se sacó el material autoclavado.. -. CU AR IA. 2.4.4 Limpieza de la cámara de flujo laminar y dispensación. S. -. Se preparó 200ml de solución de hipoclorito de sodio al 10% para desinfectar el interior de la cámara.. -. Se encendió la cámara de flujo laminar y coloco dentro los frascos de medio y bolsitas autoclavadas.. -. Se dispenso el medio de cultivo en las bolsitas previamente. Cada. -. PE. bolsita contuvo 33ml de medio.. Se hizo tres doblez por cada bolsita y coloco clip. Se esperó 15min. RO. para que gelifique el medio de cultivo dispensado en las bolsitas.. -. AG. 2.4.5 Micropropagación de estevia. Se desinfecto la cámara para luego colocar los instrumentos y. DE. materiales a utilizar durante la micropropagación: mechero, pinzas, bisturí,. hojas de bisturí , tijeras , papel bon autoclavado. CA. , algodón , lejía 10%, alcohol , material vegetal seleccionado de plántulas in vitro de estevia EII .. BL IO TE. -. BI. -. -. Se colocó la mascarilla y se desinfecto las manos e instrumentos de micropropagación.. Se flameo las herramientas dentro de la cámara y se cogió una bolsita contenida el material a micropropagar, se retiró cuidadosamente la microplanta de la bolsa y se colocó sobre una hoja de papel bon estéril. Se disecciono las microplantas en segmentos de microtallos de 2 – 3 nudos y se colocó 4 explantes en por bolsita con medio.. -. Terminada la micropropagación, se rotulo con un lapicero marcador indeleble señalando la fecha, cultivo, estadio y nombre del propagador que ha realizado esta labor. Se llevó las bolsas con el material micropropagado al estante o cámara de incubación. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 2.4.6 Incubación -. Al culminar la micropropagación se llevaron las bolsas a la sala de incubación y se ubicaron en el tercer nivel del estante de madera. CU AR IA. S. de acuerdo al croquis a 23°C, HR 70% e iluminación 3000 lux.. 2.4.7 Monitoreo de las plántulas in vitro -. Después de la instalación de las plántulas de estevia en EIII se realizó evaluaciones durante su desarrollo hasta que tuvo el. PE. sistema radicular adecuado para su aclimatación en invernadero.. RO. Invernadero Instalación del Proyecto. AG. 2.4.8 Preparación del sustrato y llenado en bolsas. DE. Los sustratos que se utilizaron en el trabajo de investigación fueron conseguidos en una casa comercial, como en el caso del musgo y humus de lombriz; mientras que. CA. la arena se trajo del rio; y el suelo agrícola, de un lugar donde no se haya utilizado con algún cultivo agrícola.. BL IO TE. Cada uno de los sustratos se mullo y tamizo por separado, luego se desinfecto de la misma manera utilizando una solución de hipoclorito de sodio al 5% (v/v), para luego dejarse orear al sol sobre un plástico limpio por un lapso de 1 día. Después se preparó las mezclas de sustrato y se llenó a las bolsas. Para este ensayo se ha planifico utilizar bolsas transparentes de polipropileno 3x8x2” con cuatro agujeros. BI. en la base, y en cuyo interior se colocó micas transparentes para mantener al sustrato en forma plana con la finalidad de facilitar la visualización del crecimiento y desarrollo radicular. A fin de dar las condiciones de oscuridad y no alterar el fototropismo radicular de las plántulas, cada bolsa se cubrió dentro de una bolsa de polietileno negra 4x7”. Después de cada evaluación se volvió a cubrir con las bolsas negras a cada unidad experimental.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 2.4.9 Conducción del cultivo: Aclimatación y establecimiento ex vitro de las plántulas estevia. Las plántulas recibieron cuidados agronómicos adecuados, tales como riego cada vez que la planta lo necesite, para ello se utilizó un aspersor. Finalmente, se realizó. S. las evaluaciones respectivas según los parámetros a evaluar que se indicó el. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. RO. PE. CU AR IA. proyecto de investigación.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. CAPÍTULO III. 3.. RESULTADOS Y DISCUSION. S. 3.1. Altura de planta. CU AR IA. En la tabla 3.1 se muestra el promedio de los datos obtenidos para la variable altura planta durante cinco evaluaciones.. PE. Tabla 3.1. Altura de planta por tratamiento.. ALTURA DE PLANTA (cm). TIEMPO (Días). 1. 45. 60. 75. 9.3. 19.2. 30.1. 38.4. 9.5. 19.4. 30.3. 38.5. 10.6. 20.5. 31.4. 39.6. 2. 11.7. 21.6. 32.5. 40.8. 2. 11.4. 21.7. 32.7. 41.0. 2. 11.6. 22.1. 33.0. 41.2. 2. 15.1. 25.0. 36.0. 44.3. 2. 15.2. 25.1. 36.1. 44.4. T9. 2. 15.4. 25.3. 36.3. 44.6. T10. 2. 15.6. 25.5. 36.5. 44.7. T11. 2. 10.2. 20.1. 31.0. 39.3. T12. 2. 11.1. 21.0. 32.6. 40.9. T13. 2. 11.4. 21.3. 33.5. 41.7. T14. 2. 11.5. 21.4. 33.5. 41.9. T15. 2. 11.7. 21.6. 33.7. 42.0. T16 (Testigo). 2. 12.4. 22.4. 34.4. 42.8. 2. T2. 2. T3. 2. DE. T1. T4 T5 T6 T7. BI. BL IO TE. T8. AG. 30. CA. RO. TRATAMIENTO. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 10. 15. PE. 5. CU AR IA. 24. 25. 26. 27. S. 28. Promedio de Altura de Planta (cm). 29. 30. Altura de Planta por Tratamiento. RO. Tratamientos. Figura 3.1. Altura promedio de planta mostrando una respuesta creciente al. AG. incremento de tipos de sustratos.. DE. En la figura 3.1 se presenta las medidas descriptivas para la variable altura de planta mostrando una respuesta creciente a los incrementos en los componentes de cada sustrato; así mismo, unas ligeras diferencias entre los diferentes tipos de sustratos. Siendo los mejores. BL IO TE. CA. tratamientos {7, 8, 9,10}, señalando que el tratamiento T16 es el Testigo.. El análisis de varianza que se muestra en la tabla 3.2 manifestó que existe diferencia significativa (p<0.05), lo que indica que la altura de planta depende de la composición de. BI. sustratos, así como las dosis que se utilice entre las mismas.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Tabla 3.2. ANOVA para el efecto de los tratamientos en altura promedio de planta. Tipo I de suma Origen. de cuadrados. Ocasión de. Media gl. cuadrática. F. 8047,591. 3. 2682,530. 24862,266. 218,000. 15. 14,533. 134,698. 4,855. 45. ,108. 8270,446. 63. Sig. ,000. Error Total corregido. ,000. CU AR IA. Tratamientos. S. Evaluación. PE. Estas diferencias significativas entre tratamientos demostraron que los mejores resultados obtenidos fueron de los tratamientos T7 (arena80% +musgo10% + humus de lombriz10%),. RO. T8 (arena 70% +musgo 15% + humus de lombriz 15%), T9 (arena 60% +musgo 20% + humus de lombriz 20%) con 30.11, 30.21, 30.40 y 30.57 cm promedio. Esto se debe a que estos sustratos aportan nutrientes adicionales, muy necesarios en las etapas tempranas de. AG. desarrollo (Cifuentes, 2003; Espinal et al., 2006; Suarez & Quintero, 2014; Quezada, 2011). Espinal de Rueda (2006), encontró un mayor porcentaje de sobrevivencia al utilizar bolsas. DE. plásticas, dicha diferencia significativa se vio acentuada en el sustrato compuesto por humus. BI. BL IO TE. CA. de lombriz, turba y arena; en donde sobrevivieron el 100% de las vitroplantas.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 3.2 Longitud de raíz. Los resultados obtenidos para la variable de respuesta de longitud promedio de raíces durante el proceso de aclimatación de Stevia rebaudiana Bertoni, utilizando diferentes sustratos. CU AR IA. S. (simples y compuestos) se muestran en la Tabla 3.3.. Tabla 3.3. Resultados de longitud promedio de raíz por tratamiento en 4 evaluaciones.. PE. LONGITUD DE RAIZ (cm) TRATAMIENTOS. TIEMPO (Días) 60. 75. 3.24. 4.74. 6.44. 3.31. 4.81. 6.52. 2.33. 3.50. 5.02. 6.73. 2.87. 3.92. 5.43. 7.14. 3.15. 4.23. 5.71. 7.42. 2.13. T2. 2.24. AG. T1. T3. T6. 3.24. DE. 4.34. 5.84. 7.55. CA. T4. T7. 4.65. 5.71. 7.22. 8.93. T8. 4.73. 5.82. 7.31. 9.02. T9. 4.80. 5.93. 7.44. 9.16. T10. 4.93. 6.12. 7.62. 9.34. T11. 2.75. 3.78. 5.26. 6.97. T12. 2.86. 3.95. 5.43. 7.15. T13. 3.10. 4.10. 5.61. 7.30. T14. 3.45. 4.33. 5.82. 7.53. T15. 3.62. 4.72. 5.23. 6.94. T16 (TESTIGO). 3.71. 4.85. 6.36. 8.07. BL IO TE. T5. BI. 45. RO. 60. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 10.00 8.00 7.00 6.00 5.00. S. 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. TRATAMIENTOS. CU AR IA. LONGITUD DE RAIZ (CM). 9.00. 11. 12. 13. 14. 15. 16. PE. Figura 3.2. Tendencia de crecimiento promedio de raíz. RO. La figura 3.2 muestra el ritmo de crecimiento radicular para los 16 tratamientos en estudio, durante 75 días después de haber instalado las plántulas in vitro a bolsas de vivero. Se. AG. observa que el tratamiento T16 (testigo) manifiesta un crecimiento activo (8.07 cm); mientras que los mejores tratamientos representan T7, T8, T9, T10 con (8.93, 9.02, 9.16,. DE. 9.34 cm) respectivamente.. CA. En la tabla 3.4 de comparaciones múltiples de tukey para la variable longitud de raíz, muestra. BI. BL IO TE. que los mejores resultados obtenidos fueron de los tratamientos T7, T8, T9 y T10.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Tabla 3.4. Comparaciones múltiples de tukey para la variable longitud de raíz. Grupo de. Tratamientos. de Raíz. Tratamientos. T1. 4.14. a. T2. 4.22. a. T3. 4.40. a b. T 11. 4.69. T4. 4.84. T 12. 4.85. T 13. 5.03. T5. 5.13. T 15. 5.13. T6. 5.24. T 14. 5.28. Testigo. 5.75. T7. 6.63. CU AR IA c d. c d e. d e. PE. d e. RO. e e f g. 6.72. g. 6.83. g. 7.00. g. CA. T 10. c d. AG. T9. b c. DE. T8. S. Longitud. Según se muestra en la tabla 3.4 los tratamientos presentan diferencia estadísticamente. BL IO TE. significativa para la variable de respuesta longitud de raíz entre, destacando los tratamientos T7, T8, T9 y T10. Esto fue debido al ambiente y sustrato adecuado que se utilizó, estimulando el crecimiento radicular de las yemas (AGUIRRE, D. 2008). Además, debido a que los sustratos pobres en su composición (arena y musgo) actúan más como soporte de la planta, mientras que añadiendo humus de lombriz mejora los procesos de absorción y los. BI. hace químicamente más activos (Pastor, 2000).. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 3.3. Numero de brotes El análisis de varianza para la variable de respuesta número promedio de brotes manifestó diferencia significativa para la fuente de variación dosis de sustratos. Lo cual indica que el número promedio de brotes generados depende de la composición y dosis que se utilice. Tipo I de suma de cuadrados. Media gl. cuadrática. F. Sig.. 1328,750. 3. 442,917. 8858,333. ,000. 124,750. 15. 166,333. ,000. Error. 2,250. 45. PE. Origen. CU AR IA. Tabla 3.5. ANOVA para la variable de respuesta número de brotes.. S. (Tabla 3.5).. Total. 13012,000. 8,317 ,050. 64. AG. Tratamiento. RO. Ocasión. DE. Según la prueba de Tukey (α= 0.05) se observa que existe diferencia significativa en cuanto al número de brotes para los tratamientos de dos, tres y cuatro componentes de sustratos (Tabla 3.6). Los tratamientos que alcanzaron desarrollar mayor número promedio de brotes. CA. corresponden al T7, T8, T9 y T10 (15.75), mientras que los tratamientos T1, T2 y T3. BI. BL IO TE. presentan el menor número de brotes (12).. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Tabla 3.6. Prueba múltiple de tukey para la variable número promedio de brotes. Tratamientos. 12,00a. T2. 12,00a. T3. 12,00a. T 11. 12,00a. 3. CU AR IA. T1. 2. S. 1. 13,00b. T5. 13,00b. T6. 13,00b. T 12. 13,00b. PE. T 4. 13,00b. RO. T 13. 13,00b. T 14. 13,00b. AG. T 15 T16 Testigo. T8 T9. 15,75c 15,75c. DE. T7. 13,00b. 15,75c 15,75c. CA. T 10. 1,000. 1,000. 1,000. BI. BL IO TE. Sig.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 20. 15. S. 10. 5. 0 1. 30. 45. CU AR IA. NUMERO BROTES (UNID). 25. 60. TIEMPO (DIAS) T2. T3. T4. T5. T9. T10. T11. T12. T13. T6. T7. T8. T14. T15. T16. PE. T1. 75. AG. RO. Figura 3.3. Tendencia de desarrollo del número de brotes.. Estos resultados se contrasta con lo que dijo Hartman y Kester (1997), según el tipo de. DE. sustrato que se utilice en el trasplante de las vitroplantas del medio aséptico de cultivo al ambiente natural en invernadero y luego a su sitio final involucra que deban pasar por un período de aclimatación para que puedan sobrevivir. Durante este período las plantitas se. BL IO TE. CA. ven obligadas a formar raíces y brotes funcionales para volverse autótrofas.. Además, Infoagro (2010) indica que “el sustrato puede o no intervenir con la función de. BI. nutrir a los vegetales, cumpliendo con las propiedades físicas, químicas y biológicas.”. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 3.4. Area foliar 10.000 9.000. 8.03. 8.74 8.40 8.52. 6.000. 5.62 5.35 5.41. 5.53. 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 T2. T3. T4. T5. T6. T7. T8. T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16. PE. T1. 6.57 6.21 6.40 6.03 5.82. S. 6.84 6.43 6.61. 7.000. CU AR IA. AREA FOLIAR (Cm2). 8.000. RO. TRATAMIENTOS. AG. Figura 3.4. Área foliar a 75 días de haber instalado las plántulas a bolsas de vivero.. En la figura 3.4 se observa que los T7, T8, T9 y T10 a base de sustratos compuestos de arena,. DE. humus de lombriz y musgo manifiestan una mayor área foliar (8.42 cm2 promedio) con. CA. respecto a los demás tratamientos.. BL IO TE. El análisis de varianza para la variable de respuesta área foliar en plántulas de estevia, manifestó que existe diferencia significativa para la fuente de variación dosis de sustratos (Tabla 3.7).. BI. Tabla 3.7. ANOVA para el efecto de los tratamientos para la variable área foliar. Origen Tratamiento Error Total corregido. Tipo I de suma de cuadrados. Media gl. cuadrática. 18,912. 4. 4,728. ,844. 11. ,077. 19,756. 15. F 61,630. Sig. ,000. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Al realizar la prueba de separación de medias de Tukey al 0.05% (Tabla 3.8), se observa que existe diferencia entre los tratamientos de dos, tres y cuatro componentes de sustratos. Los tratamientos T1, T2 y T3 (5.46 cm2 promedio) muestran una diferencia significativa con respecto a los. S. tratamientos T7, T8, T9 y T1O (8.42 cm2 promedio).. de Stevia rebaudiana Bertoni.. 1. 2. Primeros (T1,T2,T3). 5,4567a. Cuartos (T11,T12,T13,T14,T15). 5,9980a. 3. PE. Tratamientos. CU AR IA. Tabla 3.8. Prueba múltiple de Tukey para la separación de medias para la variable área foliar. 6,6267b. RO. Segundos (T4,T5,T6) Terceros (T7,T8,T9,T10). ,096. 1,000. 1,000. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. Sig.. 8,4175c. Figura 3.5. Área foliar por tratamiento según las medidas descriptivas de valor mínimo, mediano y máximo.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Los tratamientos que alcanzaron mayor área foliar corresponden al T7, T8, T9 y T10, lo cual concuerda con lo que dijo Pierik y Van de Pol (1995), estos cambios de aclimatación se encuentran asociados a la pérdida excesiva de agua, baja luminosidad y bajos porcentajes de humedad del sustrato. Las plántulas cultivadas in vitro usualmente tienen una cutícula poco. CU AR IA. de los estomas de la epidermis (Morgado et al ., 2000; Mroginski et al, 2010).. S. desarrollada y la aclimatación es un proceso gradual que implica la habilitación y desarrollo. La duración de esta etapa depende principalmente de la rusticidad de las especies pero en. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. RO. PE. general es de 45 a 60 días aproximadamente (Hartman y Kester, 1997).. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. 3.5. Peso fresco y peso seco En la tabla 3.9 se muestran los datos obtenidos para la variables peso fresco y peso seco, para determinar el efecto de los diferentes tipos de sustratos en la aclimatación ex vitro de. S. Stevia rebaudiana Bertoni.. PESO FRESCO (cm2). CU AR IA. Tabla 3.9. Peso fresco foliar y radicular por tratamiento.. TRATAMIENTO. FOLIAR. T1. 2.64. T2. 2.77. T3. 3.48. T4. 4.26. T5. 4.76. T6. 4.98. 2.49. T7. 7.40. 3.70. 7.60. 3.80. 7.73. 3.86. 7.84. 3.92. 3.26. 1.63. T12. 3.85. 1.92. T13. 4.05. 2.02. T14. 4.13. 2.07. T15. 4.26. 2.13. T16. 4.74. 2.37. BL IO TE. CA. DE. T9. T11. 1.10. PE. 1.24. RO. AG. T8. T10. RADICULAR. 1.51 1.72 2.38. BI. El análisis de varianza para las variables peso fresco y peso seco (Tabla 3.10), manifestó que existe diferencias significativas para la fuente de variación dosis de sustratos.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Tabla 3.10. ANOVA para las variables peso fresco y peso seco.. gl 4. Media cuadrática 11,600. 4. 3,227. 57,712. 4 4. 2,895 ,810. 90,827 58,846. ,000 ,000. 4,725. 61,449. ,000. 11. S. ,000. CU AR IA. 4. F Sig. 90,819 ,000. ,128 ,056. 11 11. ,032 ,014. 11. ,077. 15 15 15 15 15. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. 11. RO. PE. Variable Tipo III de suma Origen dependiente de cuadrados 46,400 Tratamiento Peso Fresco Foliar 12,908 Peso Fresco Radicular 11,581 Peso Seco Foliar 3,239 Peso Seco Radicular 18,902 Área Foliar (cm²) 1,405 Error Peso Fresco Foliar ,615 Peso Fresco Radicular ,351 Peso Seco Foliar ,151 Peso Seco Radicular ,846 Área Foliar (cm²) 47,805 Total Peso Fresco corregido Foliar 13,523 Peso Fresco Radicular 11,932 Peso Seco Foliar 3,391 Peso Seco Radicular 19,747 Área Foliar (cm²). 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(45) RO. PE. CU AR IA. S. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Figura 3.6. Peso fresco foliar por tratamiento según las medidas descriptivas de valor. DE. AG. mínimo, mediano y máximo.. Según la prueba de Tukey (α= 0.05) se observa que existe diferencia significativa para la. CA. variable peso fresco foliar (Tabla 3.11).. BL IO TE. Tabla 3.11. Prueba múltiple de Tukey para la separación de medias con respecto a la variable peso fresco foliar en Stevia rebaudiana Bertoni.. Tratamientos Primero (T1,T2,T3). 1 2,9633a. 2. 3. 3,9100b. Segundo (T4,T5,T6). 4,6667b. BI. Cuarto (T11,T12,T13,T14,T15). 7,6425c. Tercero (T7,T8,T9,T10) 1,000. Sig.. ,067. 1,000. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Las plantas han sido cultivadas bajo un ambiente heterotrófico, por lo cual, la energía y carbohidratos necesarios son obtenidos inicialmente a través de la sacarosa presente en el medio de cultivo. Eventualmente, esa energía y carbohidratos necesarios deben ser producidos mediante la fotosíntesis. Luego de aproximadamente diez días posteriores al trasplante (aclimatación), los plantines van iniciando normalmente sus procesos. S. fotosintéticos (Pierik, 1990). Por lo que, los sustratos son de vital importancia puesto que se. CU AR IA. compone de diminutas partículas de distintos materiales, siendo las partículas más finas las que hacen que el drenaje sea deficiente mientras que las de un tamaño mayor da características como la porosidad que da facilidad de aireación y buen drenaje.. El mejor suelo contiene una mezcla de partículas de distinto tamaño aunque para ser fértiles. BI. BL IO TE. CA. DE. AG. RO. PE. necesitan minerales y nutrientes (Toogood ,2007).. Figura 3.7. Peso seco foliar por tratamiento según las medidas descriptivas de valor mínimo, mediano y máximo.. En el gráfico se presenta cinco medidas descriptivas de la variable peso seco foliar en base a las observaciones obtenidas en el experimento. Las medidas descriptivas son: el valor mínimo, el valor del cuartil 1, la mediana, el cuartil 3 y el valor máximo.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas y Comunicaciones. Según la prueba de Tukey (α= 0.05) para la variable peso seco foliar en la aclimatación de plántulas de Stevia rebaudiana Bertoni, se observa que existe diferencia significativa para la separación de medias (Tabla 3.12).. variable peso seco foliar en Stevia rebaudiana Bertoni.. Tratamientos Primero (T1,T2,T3) Cuarto. 1 1,4833a. 2. CU AR IA. S. Tabla 3.12. Prueba múltiple de Tukey para la separación de medias con respecto a la. 3. 1,9540b. (T11,T12,T13,T14,T15). 2,3333b. 1,000. ,066. RO. Tercero (T7,T8,T9,T10) Sig.. PE. Segundo (T4,T5,T6). 3,8200c 1,000. AG. Los tratamientos T1, T2 y T3 (1.48 g) muestran diferencia significativamente inferior en comparación a los tratamientos T7, T8, T9 y T1O (3.82 g) que alcanzaron los mejores. DE. resultados. El peso seco de los órganos refleja a nivel fisiológico los cambios bioquímicos. BI. BL IO TE. CA. que se manifiestan en función de la nutrición (Barraza et al., 2004).. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-ca/2.5/pe/.