Casa Abierta al Tiempo

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Universidad Autónoma Metropolitana

UNIDAD IZTAPALAPA

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

,y Título del trabajo:

1

ESTRÉS OXIDATIVO Y EL POSIBLE EFECTO

PROTECTOR DE B c u

/ Tesis que presenta la alumna: O h i a Huchín Espinosa de

los

Matrícula: 923307 13

Para la Obtención del Grado de: Licenciada en Biología Experimental.

Asesora: M. En Biol. Exp. Mina Konigsberg Fainstein.

Agosto/ 02.

ANTECEDENTES:

1 . I ENVEJECIMIENTO Y ESTRÉS OXIDATIVO

El envejecimiento es un fenómeno que se caracteriza por el deterioro de las funciones

celulares. Sin embargo, las bases moleculares del envejecimiento aún no están

totalmente comprendidas (Harman, 1956).

En la actualidad no existe una teoría única que pueda explicar el fenómeno. Sin

embargo, una de las hipótesis más aceptada, es la que relaciona la mitocondria y el

estrés oxidativo con el envejecimiento (Lenaz, 1998). El concepto de que la

mitocondria está íntimamente involucrada en el envejecimiento deriva de la teoría de

Harman (Harman, 1956), que propone que el daño producido por los radicales libres o

especies reactivas de oxígeno (ROS), inducen los cambios que producen el

envejecimiento. Todos los seres vivos están expuestos a ROS exógenos entre los que

se encuentran los rayos UV, la nicotina del tabaco, la contaminación y ROS

endógenos como subproductos de la cadena respiratoria y otros proceso metabólicos.

Puesto que se calcula que entre el 1 y el 4 YO de oxígeno que utiliza la cadena

respiratoria mitocondrial, es reducido en forma incompleta hacia ROS (Dimitry, 1997);

se ha observado que específicamente en el complejo Ill (Ubiquinol citocromo c

reductasa) la salida de electrones produce al radical superóxido ( 0 2 ), que a su vez

genera al peróxido de hidrógeno H 2 0 2 ,que no es propiamente un radical libre pero

que posteriormente produce al extremadamente agresivo radical hidroxilo OH

(Halliwell, 1984; Christoph, 1988). Sin embargo, para contrarrestar el efecto de estas

dismutasa, el glutatión, y las vitaminas C y E, que funcionan como protectores contra

los radicales libres de las ROS (Lenaz, 1998).

La mitocondria al ser la mayor fuente de producción de las ROS, está constantemente

expuesta a ellos y puede ser suceptible a un ataque de los mismos (Christoph, 1988) .

Existen evidencias de que las ROS pueden dañar a los componentes de la

mitocondria disminuyendo la actividad de las enzimas y el potencial de la membrana

mitocondrial. El daño por estrés oxidativo en los componentes de la mitocondria en

particular y la célula en general incluye peroxidación de lípidos, oxidación de proteínas

y mutaciones en el DNA (Halliwell, 1984).

El daño al DNA mitocondrial tiene especial interés, ya que al no tener histonas de

protección ni enzimas de reparación, es altamente suceptible al daño por estrés

oxidativo (Christoph, 1988) . La acumulación de mutaciones en el DNA mitocondrial

inducidas por una exposición continua al ataque de radicales libres, codificará errores

en las cadenas del DNA mitocondrial, que se traducirán como errores en la síntesis de

proteínas y en una cadena de respiración defectuosa (Lenaz, 1998 ; Yau-Hei, 1998),

incluso se han reportado una inducción extensiva.de fragmentaciones y deleciones

( más de 187 diferentes deleciones se presentan en una lista mostrada por Ozawa)

(Pang, 1994) después de 3 días de exponer a estrés oxidativo a una línea celular

humana transformada de fibroblastos. Así mismo se han observado una serie de

mutaciones y deleciones en el DNA mitocondrial durante el envejecimiento y

enfermedades asociadas al mismo (Lenaz, 1998 ; Yau-He¡, 1998).

En el análisis realizado en el DNA mitocondrial de personas de edad avanzada, es

común”. Esta deleción es un fragmento que tiene una longitud de 4977 pares de bases

y se localiza entre

los

FACTOR DE NECROSIS TUMORAL a (TNF-a)

El TNF-a es una citocina llamada “Factor de necrosis tumoral ” ; estructuralmente es

una proteína de 17 kDa producida por macrofagos y otros tipos celulares. TNF-a fue

identificado por su potencial citotóxico y se ha relacionado como un mediador letal

agudo de infecciones crónicas(Tracey, 1995).

El gen de TNF-a humano, esta localizado en el cromosoma 6 cerca del locus HLA-B

codificando la prohormona del aminoácido 233 (Wang et al., 1985; Spies et al., 1986;

Davies et al. , 1987; Muller et al., 1987), ésta puede servir para promover el precursor

de la membrana plasmatica, sin embargo el secretor de TNF-a maduro se encuentra

en la en la superficie de la membrana extracelular (Kriegler et al., 1988; Jue et al.,

1990). AI exponer a la membrana a TNF-a extracelular se encontró que había

disminución de la bioactividad como en las células expuestas a citotoxicos (Kriegler et

al., 1988 ; Jue et al., 1990 ; Perez et al., 1990).

Los estudio cristalograficos de la estructura de TNF revelaron una similitud con una

“campana” compuesta por tres monomeros asociados no covalentemente dentro un

triímero que forma un eje de tres pliegues de simetría (Jones et al., 1989). Con esta

estructura, cada monomero de 157 aminoacidos esta atrás del pliegue sobre sí mismo,

como un P-plegamiento ; las interacciones entre los tres pliegues adyacentes

estabilizan la estructura del triímero (Sprang and Eeck, 1992). El amino terminal de

cada monomero se encuentra expuesto en la superficie y el carboxilo terminal se

estructural sugieren que las mutaciones que desestabilizan la asociación trimérica del

monómero provocan la pérdida de la actividad biológica (Lin, 1992).

La biosíntesis de TNF-a esta en gran parte regulada por eventos moleculares que han

sido cuidadosamente estudiados en el monocitolmacrófago.

Clones de cDNAs que codifican para dos receptores de TNF-a, han facilitado el

aislamiento y la secuenciación del fragmento de péptido que procesa la actividad

inhibitoria de TNF-a (Gray et a1.,1990 ; Loetscher et al., 1990 ; Nophar et al., 1990). Se

ha probado que éstos péptidos llamados “Proteinas ligadoras de TNF-a” (TNF-a BPI y

TNF-a BP2) provocan degradación proteolítica en los receptores de TNF-a ; y estos

receptores a su vez, son componentes de una región intracelular del segmento

transmembranal y un dominio extracelular correspondiente a los TNF-a BPS (Howard

et al., 1991 )

Bcl-2

Bcl-2, una proteína relacionada con la apoptosis y se ha reportado que además

prolonga la viabilidad celular en presencia de estrés oxidativo (David, 1993). Esta

proteína se localiza en la membrana interna mitocondrial, membrana nuclear y retículo

endoplásmico (Juliane, 1998) y forma parte de una gran familia de moléculas

antiapoptóticas, sin embargo, el mecanismo por el cual aumenta la longevidad en

JUSTIFICACION :

Desde tiempos remotos, los hombres han tratado de encontrar alguna manera de

impedir el deterioro progresivo al que todos estamos condenados : el envejecimiento.

Hoy en día se conocen algunas enfermedades degenerativas relacionadas con el

envejecimiento, las más comunes y devastadoras han sido relacionadas con el

metabolismo mitocondrial. Ciertas enfermedades como Huntington, Parkinson y la

degeneración cerebral presentan una patología con un común denominador que afecta

a diferentes áreas específicas con atrofia celular que pueden ser debidas a un

metabolismo oxidativo reducido y una baja síntesis de ATP (Lenaz, 1998)(Yau-Hei

1 998).

Como se mencionó anteriormente, la molécula de Bcl-2 prolonga la viabilidad celular

frente a un reto de estrés oxidativo, sin embargo se desconoce si Bcl-2 tiene la

capacidad de proteger al DNA celular de daño durante dicho estrés.

Por lo tanto el objetivo de este trabajo será evaluar la capacidad de Bcl-2 para prevenir

el daño al DNA generado por estrés oxidativo, ya sea con H 2 0 2 o con TNF.

Para ello se utilizará una línea celular de fibroblastos de pulmón de ratón (L929) que

sobreexpresa a Bcl-2; se le someterá a distintos tratamientos de estrés oxidativo y se

evaluará el daño y protección sobre el DNA en las células silvestres y en las que

sobreexpresan Bcl-2.

Este estudio contribuirá a entender el mecanismo de acción de Bcl-2, así como al

fenómeno del envejecimiento celular y su relación con el fenómeno de apoptosis y

OBJETIVO GENERAL :

Evaluar el daño generado por estrés oxidativo sobre las células L929 que

sobreexpresa Bcl-2 y las que no

lo

OBJETIVOS PARTICULARES :

1 .I Encontrar las condiciones óptimas para evaluar el daño en el DNA de las células

tratadas con H202 (concentración y tiempo de exposición).

1.2 Encontrar las condiciones óptimas para evaluar el daño en el DNA de las células

L929 tratadas con TNF (concentración y tiempo de exposición).

1.3 Someter a las células P6 (silvestres) y C.2 (que sobreexpresan Bcl-2) a tratamiento

con la concentración y tiempo de H202 y TNF establecidos previamente.

METODOLOGIA :

Mantenimiento del cultivo celular.

La línea celular que sobreexpresa Bcl-2 (C.2) se mantuvo en medio mínimo esencial

(MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino y 2pg/mI de puromicina, mientras

que la línea celular que no sobreexpresa Bcl-2 (P6) se mantuvo en MEM

suplementado con 10% de suero de ternera. El medio se reemplazó cada 3 días. Las

células se crecieron a 37"C, en botellas de plástico desechables (Nunc, Kamstrup,

Denmark) en una atmósfera de 95% de aire y 5% de COZ.

Establecimiento de las condiciones óptimas.

Nuestro grupo de investigación realizó trabajos previos para evaluar el efecto protector

de la sobreexpresión de Bcl-2 en tratamientos crónicos de 1 a 6 días con

concentraciones crecientes desde O hasta 10 mM estableciendo que la concentración

óptima era de 0.05 mM por 3 días. Para tratamientos agudos la concentración óptima

fue de 2 mM por 4 horas. Sin embargo al tratar de utilizar estas concentraciones a

dichos tiempos, fue imposible recuperar las células al momento de despegarlas.

Posiblemente esto se deba al daño que ya presentaban las células. De manera que se

decidió utilizar las mismas concentraciones (0.2mM y 0.05mM) de H202 a tiempos de

10, 20 y 30 minutos, y se les llamó tratarnientos de alta y baja concentración.

Tratamiento con TNF : Para el TNF se realizaron experimentos a los 30 minutos,

1,3,6,9,12 y 16 horas. Con una concentración de 5qg/ml. Dicha concentración se

estableció previamente en el laboratorio del Dr. Zentella del IFC, UNAM como la

Tratamiento comparativo de las diferentes líneas celulares

Para el tratamiento de baja concentración se adicionó 0.05mM de H 2 0 2 a las células

P6, C.2 y P R I durante 30 minutos; El tratamiento de alta concentración se realizó

adicionando 2 mM de H202 a las células P6, C.2 y PRI durante 30 minutos. Para el

tratamiento con TNF, se agregó 5qg/ml de la citocina a las 3 y 6 horas.

Cuantificación del daño al DNA

Se utilizo la técnica del ensayo cometa o electroforésis celular alcalina, para

observar el rompimiento en las cadenas sencillas de DNA y se cuantificó en un

analizador de imágenes marca Sinoptics (Collins, 1997).

Ensayo Cometa :

Preparación de las muestras

1. Se sembraron las células de tal manera que el día del ensayo se tuvieron 100,000

células /cm2

2. Se tripsinizaron y se transfirieron a tubos Ependorff

3. Se centrifugaron a 4,000 rpm por 4 min

4. Se tiro

el

5. Se tomaron

lop1

tubo Ependorff conteniendo 75111 por preparación de agarosa de bajo punto de

fusión (LMP) al 0.5% tibia

Preparación de los minigeles

1. Se depositó una gota de 1 2 0 ~ ~ 1 de agarosa regular al 1 Ohsobre un cubreobjetos y se

sin burbujas. La agarosa debe estar tibia y el cubreobjetos sobre una parrilla

caliente para que no gelifique antes de tiempo.

2. Se puso el portaobjetos en hielo hasta que gelifico

3. Con mucho cuidado se deslizó el cubreobjetos y sobre el lado que no se usó se

agrego una gota de 80pl de la mezcla del homogenado celular que se encuentra en

agarosa LMP. Se cubrió con el portaobjetos cuidando de no hacer burbujas.

4. Se puso en hielo hasta que gelificó

5. Con mucho cuidado se deslizó el cubreobjetos y se deshecho.

6. En un nuevo cubreobjetos se agrego una gota de 85pl de agarosa LMP 0.5% y se

tapó con el portaobjetos que contiene las 2 capas anteriores.

7. Se puso en hielo hasta que gelificó

8. Se quitó el cubreobjetos y se depositó el portaobjetos con las 3 capas de agarosa

en la solución de lisis fría.

9. Se dejaron las muestras en esta solución por 24h (pueden estar hasta 7 días) en

refrigeración.

Electroforesis

1. Se sacaron los geles de la solución de lisis y se enjuagaron con el amortiguador de

corrida

2. Se acomodaron en la cámara de electroforesis, se cubrieron con la solución de

corrida y se dejaron estabilizar por 20 minutos

3. Pasado el tiempo de equilibrio se corrieron los geles por 20 minutos a un voltaje de

RESULTADOS :

I. Tratamientos de alta y baja concentración con peróxido de hidrógeno

En la gráfica 1 .I ,se muestran las diferencias de migración del cometa entre las células

P6 y C.2 que han sido tratadas con H202 a baja concentración ( 0.05 mM ) a diferentes

tiempos. Aquí se pueden ver los distintos grados de daño temprano al DNA que

provoca el H202 en las condiciones establecidas; cabe notar que en el tiempo cero

(células control), también se nota daño, y esto es debido a que se están cuantificando

eventos únicos; a los 10 minutos, en las células P6 se observa una menos migración

con respecto a las células C.2 de 10 minutos, en éstas últimas, se observan

migraciones desde 1 hasta 60 micómetros, en cambio, en las P6

solo

hasta 40 micrómetros. A los 20 minutos si se puede observar una pequeña protección

en las C.2, ya que su migracón va desde 1 hasta 40 micrómetros, y en las P6

migraciones desde 1 hasta 60 micrómetros, y a los 30 minutos, en las C.2, se observan

daños desde 1 hasta 80 micrómetros, pero en las P6, se observa daño desde 1 hasta

40 y de 40 hasta 1 OO.

En la gráfica 1.2 se muestran las diferencias de migración del cometa entre las células

P6 y C.2 que han sido tratadas con H202 a alta concentración ( 0.2 mM ) a diferentes

tiempos. En este caso se observa de manera muy evidente como aumenta el daño, es

decir la migración del cometa, con respecto al tiempo. En especial en las células P6.

La figura 1.3 es una comparación de los tratamientos anteriores en las dos líneas

en ambos tratamientos hay una diferencia significhtiva que no existe a los 10 y 20

minutos.

2. Tratamiento con TNF

Las células P6 se trataron con Snglml de TNF durante los tiempos antes mencionados

y como se observa en la figura 2.1 existe un daño al DNA que va aumentando

conforme aumenta el tiempo. Si se comparan estos resultados por los mostrados en

las fotografías (figura 2.2), se observa que aún y cuando las células no mostraban

daño aparente, ya presentaban daño temprano en el DNA.

3.

Para evaluar el efecto protector de Bcl-2 de una manera más evidente, se realizó un

experimento comparativo y simultáneo entre las célluas P6 y c.2, junto con otra línea

celular (PRI) a la cual se le insertó el plásmido de pBabePuro sin Bcl-2, pero que se

sabe que debido a esa transfección, son resistentes a TNF.

En la figura 3.1 se observan los resultados de la migración de los cometas a los

diferentes tratamientos con peróxido y TNF. Es importante notar que el

comportamiento de las células P6 fue como lo que se esperaba, mientras que en las

células c.2 si se encontró un efecto protector. Sin embargo en las células P R I se

1

P6 expuestas a 0.05mM [H202]

migración del cometa (um)

c.2 e n presencia de 0.05mM [H202]

cn

O

C

al

>

al al

U

z

c )

o

1

Migracióndel cometa (urn)

P6 expuestas a 0.2mM [H202]

40

20

tJ 10

longitud del cometa

tiempos, O, 10 20, y 30 m i n

longitud del cometa

0-20, 2 1-40, 4 1-60,

61-80, 81-100

c.2 expuestas a 0.2mm [H202]

40

/ I

35

1

I U

migración del cometa (urn)

P6 y c.2 expuestas a 0.05mM [H202]

70

60 E

4 50

40

-

c

9)

-

30

.O

.- 20

10 0

O

O 1 O' 20' 30'

tiempo

P6 y c.2 expuestas a 0.2mM [H202]

80

,

O 1 O' 20' 30'

tiempo

azul = P6, rojo= c.2

P6 expuestas a Bnglml de TNF

30

16

6 tiempode exposici6n ( h )

longitud del cometa (um)

P6 expuestas a 5nglml de TNF

" ~ . . .. - . . ." .. ~. . . ~ ~~ ~ ~~

O 0.5 1 3 6 9

tiempo de exposición (h)

Células L929 control

1

oox

Células L929 expuestas a

Células L929 expuestas a

5

ng/mL de TNF por 6h

Figura 2.2b

Células L929 expuestas

a

migración

del cometa

(Urn)

140

120

I

O0

80

60

40

20

O

control

H202

TNF TNF

3h

6h

Q

p6

c.

2

o

PRI

J

DISCUSION Y CONCLUSION:

La molécula de Bcl-2 es una proteína que se ha observado que prolonga la viabilidad

celular frente a un reto de estrés oxidativo, sin embargo se desconoce si Bcl-2 tiene la

capacidad de proteger al DNA celular de daño durante dicho estrés. Es por ello que en

este trabajo se evaluó el daño temprano producido por el peróxido de hidrógeno sobre

las células silvestres y las que sobreexpresan Bcl-2. Con respecto a los resultados con

los tratamientos de peróxido se encontró que las células c.2 (que sobreexpresan Bcl-2)

protegen al DNA del daño con H 2 0 2 . Los resultados fueron significativamente

diferentes en las células tratadas por media hora, y más evidentes en las de alta

concentración que en las de baja.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNF) es una citocina producida por macrófagos

activados que al unirse a sus receptores de membrana p55 y p75 induce muerte por

apoptosis en diferentes células tumorales o inmortalizadas. En estudios previos del

laboratorio se observó que las células L929 (P6) empiezan a morir 12 h después de

haber sido expuestas al TNF, pero durante este periodo, el número de células no

aumenta como en las células control. Pensando que este bloqueo del ciclo celular

pudiera deberse a daño sobre el genoma, es por ello que en este trabajo también se

evaluó el daño que produce esta citocina a lo largo del tiempo, para después evaluar

la protección que confiere Bcl-2. Los resultados indican que se confirma el efecto

protector en las células c.2 tanto para los tratamientos con peróxido como con TNF.

daño a las 6 horas,

lo

células. Que también se observa en las c.2 pero no de manera tan evidente.

Sin embargo, hasta el momento no se conoce el mecanismo por el cual se genera

REFERENCIAS :

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to mitochondrial and nuclear DNA ; Proc." Natl. Acad. Sci. USA ; 85 : 6465-

6467.

Collins, A.R., Dobson, J.P. Dusinska, M. Kennedy, G . , Stetina, R.(1997) ; The

comet assay : what can it really tell us ; Mufat. Res ; 375 : 183-193.

David M . , Zoltan N , , Xiao-Ming, Curt L., and Stanley J.(1993) ; Bcl-2 functions

in an antioxidant pathway to prevent apoptosis ; Cell Press ; 75 :241-251.

Dimitry B.Z ; Boris F . K ; Alevtina E.K ; Michail Y.V. and Ljubava D.Z.

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dieses ; Biochem. J ; 21 9 : 1-1 4

Juliane M . , Shigemi M.(1998) ; Bcl-2 family proteins and mitochondria ; Bioch

et Bioph ; 1366 : 127-1 37.

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Wang, A.M., (1985) Science ; 228, 149-154.

Yau-He¡ W. (1998), Oxidative stres and mitochondrial DNA mutations in

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS :

o Se evaluó el daño generado por estrés oxidativo sobre las células L929 que

sobreexpresan Bcl-2 y las que no lo expresan.

o Se encontraron las condiciones óptimas para evaluar el daño en el DNA de las

células tratadas con H 2 0 2 (concentración y tiempo de exposición).

o Se encontraron las condiciones óptimas para evaluar el daño en el DNA de las

células L929 tratadas con TNF (concentración y tiempo de exposición).

o Se sometieron a las células P6 (silvestres) y C.2 (que sobreexpresan Bcl-2) a

tratamiento con la concentración y tiempo de H202 y TNF establecidos previamente.

CRITERIOS DE EVALUACION

El presente proyecto de Servicio Social se culminó en un 100%. Se alcanzaron

todos los objetivos y metas planteadas. Inclusive se presentarán los resultados

obtenidos en el XXlll Congreso de la Sociedad Mexicana de Bioquímica a

realizarse del 19 al 24 de Noviembre del 2000 en Acapulco, Gro. (Se anexa

copia del resumen).

Sociedad Mexicana de

Bioquímica,

A.

C.

FUNDADA EN 1957 INSTITUTO DE FlSlOLOGlA CELULAR U.N.A.M. APARTADO POSTAL 70-600

C.P. 04510 MEXICO. D.F. TEL. FAX 56-22-56-11

TEL. 56-22-5643

MESA DIRECTIVA 1999-2001

’RESIDENTE

IR. EDMUNDO CHAVEZ COSSlO

/ICEPRESIDENTE

IR. HELIODORO CELE SANDOVAL

SECRETARIO TESORERO

IR. FEDERICO MARTINEZ MONTES

SUB-SECRETARIO TESORERO

3RA. GLORIA SOBERON CHAVEZ

México,

D.F.

OLIVIA HUCHIN

P r e s e n t e .

Estimado autor:

Tenemos el gusto de comunicarle que su resumen “Daño temprano al ADN inducido por el factor de necrrosis tumoral alfa en celulas L9L29” de Huchín

O.,

J.L., Gómez E,O., Konigsberg M., Zentella A. fue aceptado para ser presentado en forma de poster con el número 442 en tamaño lm X l m durante el XXIII Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Bioquímica que se celebrará del 19 al 24 de noviembre de 2000.

Atentamente,

DAÑO TEMPRANO AL ADN INDUCIDO POR EL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA EN CELULAS L929

Huchín, O.n; Ventura, J.L.§; Gómez, E.O. §; Konigsberg, M.n; Zentella. A.

nDepartamento de Ciencias de la Salud, CBS, UAM- Iztapalapa. §Departamento de Biología Celular, Instituto de Fisiología Celular, UNAM Apartado Postal 70-243, Mexico

D.F.04510; FAX 56-22-56-1 1 , correo electrónico [email protected].

El factor de necrosis tumoral alfa (TNF) es una citocina producida por macrófagos activados que al unirse a sus receptores de membrana p55 y p75 induce muerte por