Evaluación de antioxidantes provenientes de subproductos de mango en galletas

UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA

La Universidad Católica de Loja

ÁREA BIOLÓGICA

TÍTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS

Evaluación de antioxidantes provenientes de subproductos de mango en

galletas

TRABAJO DE TITULACIÓN

AUTOR: Ortega León, Nicole Alexandra

DIRECTOR: Guamán Balcázar, María del Cisne, Mgtr.

LOJA-ECUADOR

APROBACIÓN DE LA DIRECTORA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

Magíster.

María del Cisne Guamán Balcázar,

DOCENTE DE LA TITULACIÓN

De mi consideración:

El presente trabajo de titulación: Evaluación de antioxidantes provenientes de subproductos

de mango en galletas realizado por: Ortega León Nicole Alexandra, ha sido orientado y

revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del mismo.

Loja, septiembre de 2015

f) _………..

iii

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS

“Yo, Nicole Alexandra Ortega León declaro ser autora del presente trabajo de titulación:

Evaluación de antioxidantes provenientes de subproductos de mango en galletas, de la

Titulación de Ingeniería en Alimentos, siendo la Mgtr. María del Cisne Guamán Balcázar

directora del presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica Particular de

Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales. Además

certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente

trabajo investigativo, son de mi exclusiva responsabilidad.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 88 del Estatuto Orgánico de

la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice:

“Forman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones,

trabajos científicos o técnicos y tesis de grado o trabajos de titulación que se realicen con el

apoyo financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”

f. ………

Ortega León, Nicole Alexandra

DEDICATORIA

Este trabajo lo dedico especialmente a mis padres, Nancy y Hernán, mis primeros maestros,

los pilares de mi formación.

A mis hermanos, Johanna e Ian Carlos, quienes me han escuchado, acompañado y

apoyado.

A todos mis amigos y amigas que me han acompañado en esta travesía.

v

AGRADECIMIENTOS

A Dios por darme el privilegio de la vida y la oportunidad de crecer cada día más.

A mi tutora de proyecto Mg. Sc. María del Cisne Guamán, mi primera maestra en esta etapa

universitaria. Gracias por la orientación, por la confianza brindada, la amistad y por su

calidez humana.

Al Mg. Sc. Geovanny Figueroa, quien me introdujo en el mundo de los antioxidantes.

Gracias principalmente por la paciencia (que en unos instantes pensaba que ya la agotaba

pero no), los consejos, la confianza, las oportunidades, la predisposición en ayudarme y por

supuesto también por las llamadas de atención. Simplemente gracias por todo.

A mis maestros colegiales y a los docentes del Departamento de Ciencias de los Alimentos

y Química, quienes compartieron sus conocimientos y experiencias.

A mis amigas de la carrera: Nathaly, July, Jessy Z., Jessy B. y Michelle, sin ustedes no

hubiesen sido divertidas e interesante las clases; y a mi mejor amiga, Katty, gracias por

estar ahí, por ser mi segunda hermana.

A mis amigos y amigas por su acompañamiento, por su amistad verdadera.

Gracias a todos.

ÍNDICE DE CONTENIDOS

APROBACIÓN DE LA DIRECTORA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ... ii

_!

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS ... iii

!

DEDICATORIA ... iv

_!

AGRADECIMIENTOS ... v

!

ÍNDICE DE CONTENIDOS ... vi

_!

ÍNDICE DE FIGURAS ... ix

!

ÍNDICE DE TABLAS ... x

_!

ÍNDICE DE GRÁFICAS ... xi

!

ÍNDICE DE ANEXOS ... xii

_!

LISTA DE ABREVIATURAS ... xiii

_!

RESUMEN ... 1

_!

ABTRACT ... 2

_!

INTRODUCCIÓN ... 3

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1

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1.1

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1.2

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1.3

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1.4

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1.5

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!

viivii

1.5.2

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1.5.3

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1.5.4

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2

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3

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3.1

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3.1.1

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3.1.2

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3.1.3

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3.2

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3.2.1

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3.2.2

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3.2.3

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3.3

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3.4

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3.5

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3.5.1

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3.5.2

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3.5.3

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3.5.4

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viii

3.7

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4

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4.1

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4.2

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4.3

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4.4

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4.5

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4.6

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_!

4.7

!

!

CONCLUSIONES ... 43

_!

RECOMENDACIONES ... 44

!

BIBLIOGRAFÍA ... 45

_!

ix

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Mango (Mangifera indica L.) ... 6

_!

Figura 2: Subproductos de mango ... 7

!

Figura 3: Clasificación de antioxidantes ... 10

_!

Figura 4: El equilibrio aproximado de antioxidantes y especies reactivas in vivo. ... 11

_!

Figura 5: Reacción del reactivo Folin-Ciocalteu en la determinación de fenoles totales ... 12

_!

Figura 6: Reacción del ensayo ABTS!+ _{... 13}

!

!

Figura 8: Reacción del ensayo FRAP ... 14

_!

Figura 9: Esquema de extracción de antioxidantes ... 23

!

Figura 10: Metodología para cuantificación de fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu. a. Procedimiento para preparación de estándares b. Procedimiento para la lectura de muestras. ... 24

_!

Figura 11: Metodología para cuantificación de capacidad antioxidante por el método ABTS. a. Procedimiento para preparación de soluciones: madre y de trabajo. b. Procedimiento para preparación de estándares c. Procedimiento para la lectura de muestras ... 25

_!

Figura 12: Metodología para cuantificación de capacidad antioxidante por el método DPPH. a. Procedimiento para preparación de soluciones: madre y de trabajo. b. Procedimiento para preparación de estándares c. Procedimiento para la lectura de muestras. ... 27

_!

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Compuestos fenólicos identificados en piel de mango (mg/kg) en base seca. ... 8

_!

Tabla 2: Clases de compuestos fenólicos en plantas ... 9

!

Tabla 3: Formulación para la preparación de galletas. ... 22

_!

xi

ÍNDICE DE GRÁFICAS

Gráfica 1: Polifenoles extraíbles en subproductos agroindustriales. ... 32

_!

Gráfica 2: Contenido de fenoles totales en subproductos de mango y en productos procesados tras su incorporación. ... 33

_!

Gráfica 3: a. Capacidad antioxidante de productos y subproductos agroindustriales determinados por el método ABTS. b. Capacidad antioxidante determinada por el método ABTS de productos considerados como fuente de antioxidantes. ... 35

_!

Gráfica 4: a. Capacidad antioxidante determinada por el método DPPH de subproductos agroindustriales. b. Capacidad antioxidante determinada por el método DPPH de pulpas

de frutas comúnmente consumidas en Ecuador y la galleta con incorporación de piel de

mango. ... 36

_!

Gráfica 5: a. Capacidad antioxidante de subproductos agroindustriales determinada por el método FRAP. b. Capacidad antioxidante determinada por el método FRAP de productos considerados como fuente de antioxidantes y alimentos comúnmente

consumidos en una dieta normal ... 37

_!

Gráfica 6: a. Determinación de estabilidad de capacidad antioxidante (ABTS, DPPH y FRAP) de la galleta con piel de mango b. Determinación de estabilidad de fenoles totales de la galleta con piel de mango. ... 40

!

Gráfica 7: a. Comparación de fenoles totales y b. Capacidad antioxidante mediante ABTS, DPPH y FRAP entre la primera y la última semana de análisis en piel de mango, galleta

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo A: Cuantificación de fenoles totales. Método Folin- Ciocalteu ... 59

_!

Anexo B: Cuantificación de actividad antioxidante. Método ABTS ... 65

!

Anexo C: Cuantificación de actividad antioxidante. Método DPPH ... 72

_!

Anexo D: Cuantificación de actividad antioxidante. Método FRAP ... 79

_!

Anexo E: Determinación del Porcentaje de Humedad ... 86

_!

Anexo F: Determinación de color ... 88

_!

Anexo G: Análisis estadístico ... 89

!

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

Abs.: Absorbancia

Agua d.d. : Agua destilada

b: Intersección

BH: Base húmeda

BS: Base seca

Co: Concentración

CoSM: Concentración de la solución madre (µmol)

CoSt: Concentración del estándar (µmol)

EAG: Equivalentes de ácido gálico

ET: Equivalentes de Trolox

FD: Factor dilución

g: Gramo

GC: Galleta control

GS: Galleta subproducto

GalletaSub.SH: Incorporación del subproducto a la galleta control tras el horneado.

GalletaSub.H: Galleta con subproducto luego del proceso térmico.

HAT: Transferencia de un átomo de hidrógeno

%H: Porcentaje de Humedad

H2O: Agua

L: Litro

m: Pendiente

MeOH: Metanol

mL: Mililitro

nm: Nanómetro

PM: Peso molecular

S: Subproducto

Sem: Semana

SET: Reacción de transferencia de un electrón

ST: Solución de trabajo

SM: Solución madre

% ST: Porcentaje de sólidos totales

µmol: Micromol

VSM: Volumen de la solución madre

VSt: Volumen a preparar del estándar

x: Concentración

1 RESUMEN

A más de conocer los beneficios que traen consigo los subproductos agroindustriales, es

necesario conocer el comportamiento tras su incorporación en distintas matrices

alimenticias, evaluando los efectos de procesamiento y la estabilidad sobre las propiedades

antioxidantes. En este estudio, la piel de mango en polvo fue la materia prima que

reemplazó a la mezcla de harinas en 25% para la elaboración de galletas, evaluando la

actividad antioxidante tras el procesado y durante ocho semanas en el almacenamiento. La

masa se horneó a 170ºC por 10 minutos y se observó que el tratamiento térmico no

disminuyó la actividad antioxidante, por el contrario, el horneado condujo a un incremento,

especialmente en DPPH, con 19%. La piel de mango es una fuente rica en antioxidantes y

en las galletas elaboradas con este subproducto el contenido fenólico se incrementó de 217

a 860 mg EAG/100 g BH y actividad antioxidante determinada por ABTS, DPPH y FRAP de

6 a 120 µmol ET/g BH con respecto al control. El contenido de fenoles y capacidad antioxidante no fue afectado significativamente (p>0,05) durante el almacenamiento.

ABTRACT

Besides the well known benefits that bring agroindustrial byproducts, it is necessary to know

the behavior after their incorporation into different food matrices, evaluating process effects

and stability on the antioxidant properties. In this study, mango peel powder was the raw

material which replaced flour in 25% for making cookies in order to evaluate the antioxidant

activity after processing and during a period of eight weeks at storage. The dough was baked

at 170ºC for 10 minutes and it was observed that the heat treatment did not decrease the

antioxidant activity, otherwise, baking led an increase, especially in DPPH with 19%. Mango

peel is a rich source of antioxidants, and cookies with its incorporation increased the phenolic

content from 217 to 860 mg EAG/100 g fw and antioxidant activity by ABTS, DPPH and

FRAP assays from 6 to 120 µmol ET/g fw compared with control. The phenolic content and

antioxidant capacity were not affected significantly (p> 0.05) during storage.

3

INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas, el punto de vista en el consumo de productos alimenticios ha

cambiado (Hasler, 2002; Mollet y Rowland, 2002), el consumidor ya no sólo busca

cualidades organolépticas o nutricionales, sino también los efectos benéficos para la salud

que involucre su ingesta (Abeysinghe et al., 2007; Bigliardi y Galati, 2013; Ribeiro da Silva et

al., 2014; Rufino et al., 2010). El creciente interés en el desarrollo de ingredientes y

productos alimenticios que aporten compuestos bioactivos como fibra dietaria y

antioxidantes de fuentes naturales cada vez va tomando más fuerza dentro del ámbito

científico, académico y por supuesto la industria alimentaria (Betoret et al., 2011; Menrad,

2003).

Una dieta rica en frutas y hortalizas está vinculada a la prevención de diversas patologías

relacionadas con el envejecimiento celular, enfermedades cardiovasculares y ciertos tipos

de cáncer (Kris-Etherton et al., 2002; Obón et al., 2011; Schieber et al., 2001; Steinmetz y

Potter, 1996), por lo que indudablemente las frutas se han convertido en una gran

oportunidad por explorar (Ayala-Zavala et al., 2011), especialmente si se hace énfasis en el

uso de sus subproductos; material secundario con un contenido considerable de vitaminas,

enzimas, antioxidantes y fibra dietaria (Ajila, Bhat, et al., 2007; Balasundram et al., 2006).

Estos subproductos son en su mayoría piel y semillas (Contreras-Calderón et al., 2011), los

cuales representan una porción significativa del peso total de la fruta y que al no ser

procesados ni tratados adecuadamente se convierten en un gran foco de contaminación

(Ajila, Bhat, et al., 2007).

Dentro de las frutas mayormente cultivadas, con 35% de la producción de frutas tropicales a

nivel mundial por su atractivo perfil sensorial está el mango (Mangifera indica L.) (Kim et al.,

2010; Manjavacas, 2012). Esta fruta exótica y temporal, originaria de Asia genera toneladas

al año de subproductos (Ravani y Joshi, 2013; Ribeiro et al., 2008), los cuales escasamente

son aprovechados (Sumaya Martinez et al., 2012) a pesar de conocer que la piel y la semilla

contienen cantidades significativas de compuestos bioactivos (Kim et al., 2010) inclusive

mayores que la propia pulpa (Ayala-Zavala et al., 2010; Soong y Barlow, 2004).

El aprovechamiento de los subproductos es factible desde el punto de vista nutricional,

tecnológico, funcional, ambiental y económico que trae consigo (Ajila, Bhat, et al., 2007;

utilización como ingredientes o aditivos alimentarios, la recuperación y su transformación en

distintas matrices alimenticias ha sido objeto de estudio para asegurar el contenido

remanente tras el procesado y almacenamiento, además de conocer su actividad y

biodisponibilidad (Day et al., 2009).

Por lo mencionado anteriormente, el presente estudio tiene como objetivo evaluar la

estabilidad de antioxidantes provenientes de subproducto de mango frente al proceso de

1.1 Mango (Mangifera indica L.)

Figura 1: Mango (Mangifera indica L.)

Fuente: Agro Leding (2013)

El mango (Figura 1) es considerado como el rey de las frutas tropicales dado a su delicioso

sabor, aroma exótico y alto valor nutricional (Singh y Singh, 2012). Este fruto selecto

perteneciente a la familia de las Anacardiaceae es originario del sureste asiático y cultivado

en más de 90 países a nivel global (Evans, 2008).

Con su tremendo potencial, esta fruta en 2014 abarcó cerca del 35% de la producción

mundial de frutas tropicales, siendo el 14% de este aporte de América Latina y el Caribe

(Manjavacas, 2012).

En Ecuador, Guayas es la principal provincia de producción; siendo las variedades Tommy

Atkins, Haden, Ataulfo y Keitt las más cultivadas (PRO ECUADOR, 2015). Cerca de 7700

hectáreas están destinadas a la producción de mango, de las cuales 6500 aproximadamente

están dirigidas para exportación y las restantes para consumo nacional y obtención de

derivados (Revista El Agro, 2012). Su principal adquisidor internacional, con el 85% de toda

la producción es Estados Unidos, traduciéndose en un monto cercano a los 28 millones de

dólares (El Telégrafo, 2014; Fundación Mango Ecuador, s. f.).

1.2 Subproductos de mango

Un subproducto agroindustrial es aquel material secundario que se deriva tras el

procesamiento de un producto vegetal o animal en particular (Singh nee’ Nigam et al., 2009).

En el área del sector frutícola se generan grandes cantidades de subproductos que no son

aprovechados por completo (Blancas-Benitez et al., 2015). De la industrialización del

77

al., 2005), siendo la cáscara (7-24%) y la semilla (10-25%) los más distintivos (Figura 2)

(Ajila, Jaganmohan Rao, et al., 2010; Iqbal et al., 2009; Jahurul et al., 2015; Ravani y Joshi,

2013). Existe información sustentada que demuestra el poder antioxidante (Ajila,

Jaganmohan Rao, et al., 2010; Larrauri et al., 1997b), antimicrobiano (Masibo y He, 2009;

Vega-Vega et al., 2013), antiinflamatorio (Knödler et al., 2008), antiproliferativo (Kim et al.,

2010) y anticancerígeno (Noratto et al., 2010) de los subproductos de mango, especialmente

resultados positivos tras mejorar su calidad nutricional y tener la aceptación sensorial al

incorporarlos en diferentes matrices de la industria alimentaria, particularmente la panadera

y pastelera.

Figura 2: Subproductos de mango

Fuente:a. Anónimo (2015) b. Sahún I Fonto (s.f.) c. Mayra (2015)

Ajila, Aalami, et al. (2010) incorporaron piel de mango en tres concentraciones distintas (2,5;

5,0 y 7,5%) en la preparación de macarrones evaluando propiedades tras el tratamiento

térmico como firmeza, propiedades nutracéuticas y sensoriales. El contenido de fibra

dietaria, compuestos fenólicos, carotenoides incrementó gradualmente según la

concentración añadida, siendo 5% la concentración con más aceptación y concluyendo que

a este nivel, propiedades sensoriales ni de textura son afectadas, por el contrario, su calidad

nutricional mejora.

Así mismo Ramírez-Maganda et al. (2015) sustituyeron parcialmente harina de trigo y caña

de azúcar por piel de mango (26 y 39%) para la elaboración de muffins, analizando su Pulpa

Piel y Semilla Prod

ucto P rincip

al

Pr od

uct os _Se

cu nd

ari_os a.

b.

composición química, actividad antioxidante y propiedades de hidrólisis del almidón in vitro.

Tras el estudio concluyeron que los muffins con piel de mango exhibieron mejores

propiedades antioxidantes, el contenido de polifenoles totales solubles aumentó tres veces

más con respecto al control; determinaron que su incorporación podría modular la tasa de

hidrólisis del almidón lo que está relacionado con el índice glicémico y además un punto

importante, que la sustitución no afectó la preferencia del consumidor.

Gracias a las propiedades antes mencionadas, a estos subproductos se los podría

considerar como potenciales aditivos o ingredientes funcionales. En la Tabla 1 se observan los principales compuestos fenólicos en piel de mango.

Tabla 1: Compuestos fenólicos identificados en piel de mango (mg/kg) en base seca.

Compuesto Valor

Mangiferina 1690,4 ± 134,8

Isomangiferina 134,5 ± 1,9

Mangiferina galato 321,9 ± 24,4

Isomangiferina galato 82,0 ± 7,8

Quercetina 3-O-galactósido 651,2 ± 44,1

Quercetina 3-O-glucósido 557,7 ± 39,7

Quercetina 3-O-xilósido 207,3 ± 14,3

Quercetina 3-O-arabinopiranósido 101,5 ± 10,0

Quercetina 3-O-arabinofuranósido 103,6 ± 8,0

Quercetina 3-O-ramnósido 20,1 ± 1,5

Kaempferol 3-O-glucósido 36,0 ± 2,2

Ramnetina 3-O-galactósido / glucósido 94,4 ± 6,3

Quercetina 65,3 ± 7,1

Ácido eleágico n.d.

Total 4066,0 ± 151,1

Fuente: Berardini et al. (2005) 1.3 Compuestos fenólicos

Son productos secundarios del metabolismo de las plantas (Bravo, 1998). Están presentes

en un gran número de alimentos de origen vegetal (Perez-Jimenez et al., 2010), siendo las

principales fuentes las frutas y bebidas (Scalbert et al., 2005). Su ingesta se ha asociado

99

neurodegenerativos, cardiovasculares, diabetes y osteoporosis (Scalbert et al., 2005), dado

a su carácter de antioxidante.

Esta capacidad antioxidante atribuida a los compuestos fenólicos se debe principalmente a

su propiedad óxido-reducción (redox) lo que les permite actuar como agentes secuestrantes

de radicales libres, reductores o donantes de átomos de hidrógeno o electrones (Afanas'ev

et al., 1989; Amarowicz et al., 2004).

En términos de su naturaleza química, los polifenoles comprenden un anillo aromático, con

uno o más sustituyentes hidroxilo y un rango de moléculas fenólicas (Balasundram et al.,

2006). Existen más de 8000 polifenoles identificados en más de 10 clases diferentes; todos

ellos con estructura química y pesos moleculares distintos (Bravo, 1998). Están agrupados

desde las estructuras más sencillas como los ácidos fenólicos hasta compuestos altamente

polimerizados como los taninos (Kris-Etherton et al., 2002) (Ver Tabla 2).

Tabla 2: Clases de compuestos fenólicos en plantas

Clase Estructura Complejidad

Fenoles simples, benzoquinonas C6

Ácidos hidroxibenzoicos C6-C1

Acetofenonas, ácidos fenilacéticos C6-C2

Ácidos hidroxicinámicos, fenilpropanoides

(cumarina, isocumarina, cromonas, chromenas) C6-C3

Naftoquinonas C6-C4

Xantonas C6-C1-C6

Estilbenos, antraquinonas C6-C2-C6

Flavonoides, isoflavonoides C6-C3-C6

Ligninas, neolignanos (C6-C3)2

Biflavonoides (C6-C3-C6)2

Lignanos (C6-C3)n

Taninos condensados (proantocianidinas o flavolanos) (C6-C3-C6)n

Fuente: Balasundram et al. (2006)

1.4 Radicales libres y antioxidantes

Los radicales libres (ROS) están presentes continuamente en todas las células como parte

de un normal funcionamiento, pero cuando existe un excedente de ROS o una disminución

estrés oxidativo (Sen et al., 2010), la cual puede conllevar a la repercusión del ADN (Halliwell y Grootveld, 1987) y consecuentemente el desarrollo de cáncer, desórdenes autoinmunes, artritis, enfermedades cardiovasculares y otros trastornos degenerativos (Pham-Huy et al., 2008).

Un antioxidante se define como aquella molécula que protege a un blanco biológico contra el daño oxidativo (Halliwell y Gutteridge, 2007). Las funciones que puede desempeñar son de prevención (evitar formación de especies reactivas de oxígeno como hidroperóxidos o H2O2), intersección (desactivación de radicales mediante el secuestro de iones metálicos o captura de radicales libres) o de reparación (remediar daño una vez sucedido) (Sen et al., 2010; Sies, 1997). En la Figura 3 se puede apreciar los grupos que conforman los antioxidantes.

Figura 3: Clasificación de antioxidantes

Fuente: Carocho y Ferreira (2013)

Al desestabilizar la producción de ROS con el sistema de defensa de antioxidantes endógenos (Figura 4), es necesario recurrir a fuentes exógenas de antioxidantes, los cuales

ENZIMÁTICOS NO ENZIMÁTICOS

Enzimas Primarias Enzimas Secundarias

Superóxido dismutasa Catalasa

Peróxido de glutatión

Glutatión reductasa Glucosa 6 fosfato-dehidrogenasasa

Cofactores Vitaminas y Derivados

Minerales Compuestos organosulfurados Compuestos nitrogenados no proteicos Ácidos fenólicos Flavonoides ß caroteno Licopeno Luteína Zeaxantina

Flavonoles Flavanolas Antocianinas

Flavones Isoflavonoides Flavanonas

Carotenoides C (ácido ascórbico) E (tocoferol y tocotrienoles)

K

Ácido Gálico Ácido Eleágico Ácido Ferúlico

p- cumárico

Ácidos hidrocinámicos Ácidos hidroxibenzoicos Sulfuro de alilo

Índoles Quercetina Canferol Catequina Pelagonidina Cianidina Pelargonidina

Genistein Hesperidina Crisina

Zinc Selenio

Coenzima Q10 A (Retinol)

Ácido Úrico Glutatión

ANTIOXIDANTES

1111

se derivan principalmente de fuentes alimenticias, especialmente de frutas y verduras

(McDermott, 2000).

Figura 4: El equilibrio aproximado de antioxidantes y especies reactivas in vivo.

Fuente: Halliwell (2011)

1.5 Determinación de fenoles totales y capacidad antioxidante

Dados a los múltiples mecanismos de reacción, un método de evaluación de antioxidantes

no es suficiente para reflejar con precisión todas las fuentes de radicales libres o todos los

antioxidantes presentes en un sistema (Prior et al., 2005).

Los antioxidantes inhabilitan a los radicales por dos grandes mecanismos de reacción:

Reacción de transferencia de un electrón (SET) o de transferencia de un átomo de

hidrógeno (HAT) (Prior et al., 2005). El mecanismo HAT cuantifica la capacidad de ceder

átomos de hidrógeno, mientras que los ensayos basados en mecanismo SET miden la

capacidad reductora de los antioxidantes (Huang et al., 2005)

Los métodos comúnmente utilizados para determinar la capacidad antioxidante son: ABTS,

DPPH, FRAP, junto con el ensayo de fenoles totales (Pérez-Jiménez et al., 2008).

O₂/H₂O₂/NO Otros / RS

Antioxidantes

Respiración mitocondrial

Óxido nítrico sintasa

Xantina oxidasa Fagocitos Metabolismo del ácido araquidónico Otras fuentes Quelantes del hierro Componentes sanguíneos Albúmina Transferrina Haptoglobina Antioxidantes derivados de la dieta. Vitamina E, Carotenoides

SOD- Superóxido dismutasa RS- especies reactivas

1.5.1 Fenoles totales

La técnica basada en el reactivo de Folin-Ciocalteu (FCR) es comúnmente conocido como el

ensayo de fenoles totales (Huang et al., 2005). Este se ha convertido en un indicador global

de la cantidad de compuestos fenólicos en productos naturales (Perez-Jimenez et al., 2010),

aunque el mecanismo básico es una reacción de óxido-reducción por lo que puede ser

considerado como un método más de medición de actividad antioxidante (Prior et al., 2005).

A pesar de no conocer exactamente la naturaleza química del reactivo Folin-Ciocalteu, se

cree que éste contiene complejos fosfomolíbdicos/ fosfotungstenícos (Karadag et al., 2009).

Este método se fundamenta en la transferencia de electrones en medio alcalino (ajustado

con carbonato de sodio) de los compuestos fenólicos y otras especies reductoras con el

molibdeno. La disociación de un protón del compuesto fenólico da lugar a un anión fenolato,

el cual es capaz de reducir el FCR, formando complejos azules independientes de la

estructura del polifenol que se pueden monitorear a una longitud de onda de 745-750 nm

(Huang et al., 2005), siendo la intensidad de absorción de luz proporcional a la

concentración de fenoles (Waterhouse, 2003). En la Figura 5 se muestra la reacción del reactivo Folin-Ciocalteu.

Figura 5: Reacción del reactivo Folin-Ciocalteu en la determinación de fenoles totales

Fuente: Huang et al. (2005); Prior et al. (2005) 1.5.2 ABTS

El ensayo ABTS (2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico) se basa en la

reducción de la coloración verde/azul producida por la oxidación del radical catión ABTS

causada por el antioxidante presente en la muestra (Molina-Quijada et al., 2010). Este

método SET no requiere altas temperaturas para generar radicales y puede evaluarse en un

amplio rango de pH (Arnao et al., 2001). Al usar comúnmente Trolox como estándar también

se denomina TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity por sus siglas en inglés)

(Sánchez-Moreno, 2002). Es ampliamente utilizado para medir la actividad antioxidante de

compuestos hidrofílicos (Rufino et al., 2010), cuya captación produce una disminución de la

absorbancia a 734 nm. En la Figura 6 se expone la reacción del ensayo ABTS!+_.

1313 Figura 6: Reacción del ensayo ABTS!+

Fuente: Huang et al. (2005) 1.5.3 DPPH

Este método propuesto por Brand-Williams et al. (1995) mide la habilidad de los

antioxidantes para capturar el radical libre 2,2-difenil-1-picrihidracil (DPPH!_{). Este método}

SET no necesita ser generado como otras técnicas de captura de radicales como el ABTS

en el que involucra 12 horas para obtener el radical libre, sino que es altamente

reproducible, más selectivo y comparable (Roginsky y Lissi, 2005). La decoloración del

radical cromógeno estable púrpura a su correspondiente amarillo pálido hidracina (Figura 7)

se evalúa a una longitud de onda de 515 nm producida por la adición del antioxidante a la

solución DPPH! _{(Karadag et al., 2009; Sánchez-Moreno, 2002).}

Figura 7: Reacción del ensayo DPPH

Fuente: Liang y Kitts (2014) 1.5.4 FRAP

El principio de este ensayo SET está basado en el poder de los antioxidantes para que a pH

bajo, el complejo férrico _{2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ-Fe}+3_{) se reduzca a su forma ferrosa}

(TPTZ-Fe+2) (Ver Figura 8) (Benzie y Strain, 1996; Benzie y Szeto, 1999). Esta reducción se acompaña por la formación de una coloración azul a 593 nm, la cual incrementa

proporcionalmente con la cantidad presente de antioxidantes (Roginsky y Lissi, 2005). Esta

técnica es simple, rápida, reproducible, sensible, barata, y robusta, debido a que no necesita

-_O 3S S N N N N S

C₂H₅

SO₃

-C₂H₅

ABTS (Longitud de onda max= 734 nm)

+ antioxidante - K2SO5 -_O

3S S N N N N S

C₂H₅

SO₃

-C₂H₅

ABTS²& _{(Descolorido)}

N N NO2

O2N

NO2

H N N NO2

O2N

NO2

R H R

tratamiento previos, además de que factores estequiométricos son constantes y la linealidad

se mantiene en un amplio rango (Benzie y Strain, 1999).

Figura 8: Reacción del ensayo FRAP

Fuente: Huang et al. (2005); Prior et al. (2005) N

N

N N N

N N

N

N N

N

N

Fe (III)

N N

N N N

N N

N

N N

N

N

Fe (II)

Fe (III) (TPTZ)2 3+

Fe (II) (TPTZ)2 2+

Longitud de onda max= 593 nm + antioxidante

General:

• Evaluar la estabilidad de antioxidantes provenientes de subproducto de mango frente

al proceso de elaboración y almacenamiento de galletas.

Específicos:

• Cuantificar fenoles totales y capacidad antioxidante en subproducto de mango.

• Cuantificar fenoles totales y capacidad antioxidante en galletas.

• Evaluar fenoles totales y capacidad antioxidante durante el almacenamiento de

3.1 Materiales, reactivos y equipos utilizados

3.1.1 Ingredientes para elaboración de galletas.

• Aceite de girasol-oliva extra virgen (1:1)

• Almendras

• Harina de trigo autoleudante y fortificada

• Harina de maíz precocida y amarilla

• Hojuelas de avena

• Miel de abeja

• Polvo de hornear

• Sal yodada

• Siete Harinas comercial: Maíz, soya, haba, plátano, almidón de achira, arveja y trigo

3.1.2 Reactivos.

• Acetona, ácido clorhídrico 37%, reactivo Folin-Ciocalteu, carbonato de sodio, acetato

de sodio tri-hidratado, ácido acético (glacial) 100%, provenientes de Merck

• Ácido gálico, cloruro de hierro (III) hexahidratado 97%, TPTZ (2,4,6-Tris(2-pyridyl)-

s-triazine) ≥ 98%, Trolox ((±-6-Hydroxy-2,5,7,8,-tretra-methylchromane-2-carboxylic acid) 97%, DPPH (2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl , ABTS (2, 2´´-Azino-bis

(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) ≥ 98% procedentes de Sigma-Aldrich.

• Metanol Panreac

3.1.3 Instrumentación.

• Balanza analítica OHAUS Analytical Plus AP250D

• Baño María Precision Scientific

• Centrífuga CLAY ADAMS® Brand DYNAC 0101® (Becton, Dickinson and Company,

MD, USA)

• Colorímetro móvil CR-14 Konica Minolta

• Espectrofotómetro visible 6400 Jenway®.

• Estufa de tiro forzado Cole Parmer

• Estufa de vacío Lab Companion OV-12

• Horno semi industrial a gas Ochoa Hnos.

• Juego de tamices Humboldt

1919

• Micropipetas Thermo Scientific

• Plancha de agitación magnética RO 15 P SI IKA Labortechnik

• Potenciómetro Mettler Toledo S20 SevenEasy

3.2 Preparación y obtención de la materia prima

Se trabajó con mango variedad Tommy Atkins, el cual fue adquirido en un local comercial.

La materia prima se lavó para luego ser separada manualmente en piel, semilla y pulpa,

siendo la fracción utilizada en la presente investigación la piel a la que se sometió a

deshidratación, molienda y tamizado.

3.2.1 Obtención de la muestra.

La piel de mango fue deshidratada a 60ºC en una estufa de tiro forzado durante 11-12 horas

hasta obtener una humedad inferior al 10%. La elección de esta temperatura se debe a que

no existe pérdida significativa de antioxidantes frente al proceso de liofilización (Larrauri et

al., 1997a).

La molienda se la realizó primeramente mediante el empleo de un mortero y de ahí se lo

trituró en una licuadora por intervalos de 5 segundos para evitar el calentamiento de la

muestra. La muestra fue separada con ayuda de un juego de tamices, siendo el tamaño de

partícula seleccionado < 250 µm por razones de cantidad de materia prima para la elaboración de las galletas y la similitud en la textura de una harina que era la materia a

sustituir.

3.2.2 Determinación del contenido de humedad.

La determinación de humedad se realizó según el método gravimétrico descrito en la Norma

Técnica Ecuatoriana INEN 1462 con modificaciones. Se pesaron 2g de muestra en una

cápsula previamente secada y se llevó a una estufa de vacío a 70ºC ± 1ºC y -0,05MPa. Las

muestras se enfriaron por 30 minutos en un desecador y se las pesó continuamente cada

5-6 horas hasta alcanzar un peso constante (1mg de diferencia mínimo entre el peso anterior y

el actual). Los resultados se obtuvieron por pérdida de peso y se expresaron como la media

± desviación estándar de tres réplicas experimentales.

%

_Humedad

₌

P

−

P

P

*100

3.2.3 Determinación del color.

El color se midió tanto al subproducto en polvo como a las galletas mediante el empleo del

2121

CIE L*, a*, b*. El ángulo de tono (hº) y el croma (C*) fueron calculados según las

ecuaciones:

C* ₌

(

)

hº=arctgb *

a*

En donde: L* es la coordenada espacial que indica la luminosidad, a*_{indica el cambio entre}

el verde al magenta y b* entre el azul al amarillo; C* indica la intensidad de la partícula de

color, hº indica la percepción del color, similar al ojo humano (Salinas-Hernández et al.,

2013).

3.3 Preparación de las galletas

Las galletas se prepararon según la formulación presentada en la Tabla 3. Los ingredientes a excepción del subproducto de mango se adquirieron en locales comerciales. Para las

formulaciones preliminares de galletas, se partió de una formulación base de galletas a la

cual se la fue ajustando según parámetros como tamaño de partícula, una pequeña

aceptación sensorial y concretamente la concentración de subproducto a incorporar. Las

concentraciones empleadas de subproducto fueron 15%, 20% y 25%, siendo la última

concentración la elegida debido al sabor impartido a fruta que le otorgaba al producto.

Con la formulación final, la masa se horneó a 170ºC por 10 minutos. Los lotes se dejaron

enfriar hasta temperatura ambiente; se mezclaron y se distribuyeron en fundas ziploc

metálicas. Las galletas se almacenaron en un ambiente con condiciones controladas a

temperatura ambiente (21,5 ±1,7 ºC y 46,9 ±7,1% de humedad relativa), monitoreando

durante dos meses con el uso de un termo higrómetro. A la galleta control se la utilizó con

dos fines, el primero para saber el contenido de antioxidantes propio de la galleta (sin el

aporte de antioxidantes por parte del subproducto) y el segundo para determinar el

porcentaje de retención, es decir cómo influyó el proceso de horneado, si éste contribuyó en

el incremento o disminución del contenido fenólico y capacidad antioxidante, para lo cual

después del proceso térmico se la trituró y se le agregó homogéneamente 25% de la piel de

Tabla 3: Formulación para la preparación de galletas.

INGREDIENTES GS (%) GC (%)

7 Harinas comercial 11,0 22,0

Harina de maíz 2,0 4,0

Harina de trigo 4,0 8,0

Subproducto de mango 25,0 0,0

Hojuelas de avena 8,0 16,0

Almendras 5,0 5,0

Aceite de Oliva/ Girasol (1:1) 13,0 13,0

Miel de abeja 25,0 25,0

Polvo de hornear 1,8 1,8

Sal 0,2 0,2

Agua 5,0 5,0

GS: Galleta con subproducto de mango GC: Galleta control (sin subproducto)

Elaboración: La autora

3.4 Extracción de compuestos antioxidantes

La extracción del contenido de polifenoles extraíbles se realizó según lo propuesto por

Pérez-Jiménez y Saura-Calixto (2007) con una variación en cuanto al peso de la muestra.

En la Figura 9 se detalla el procedimiento. Se pesó por triplicado 1 g de muestra y se colocó

en frascos con tapa rosca cubiertos con papel aluminio; a cada uno se le agregó 20 mL de

una mezcla metanol-agua (50:50 v/v, pH 2 acidificados con HCl 2 N), tras lo que se llevó a

agitación en una plancha de agitación magnética durante 1 hora y luego a centrifugación por

30 minutos a 2800 rpm. Tras centrifugar, se separó el sobrenadante del residuo, y a este

último se lo trató con 20 mL de acetona-agua (70:30 v/v) al cual se lo agitó nuevamente

durante 1 hora y finalmente se lo centrifugó 30 minutos, obteniendo el residuo y un

sobrenadante. Este último sobrenadante se lo mezcló con el sobrenadante de la primera

extracción y en ellos se determinó el contenido de polifenoles extraíbles y la actividad

2323 Figura 9: Esquema de extracción de antioxidantes

3.5 Determinación de fenoles totales y capacidad antioxidante

Se emplearon tres métodos de actividad antioxidante: ABTS, DPPH y FRAP; y el ensayo de

fenoles totales con el fin de evaluar el índice global de compuestos antioxidantes, su

comportamiento, el modo de acción y las interacciones sinérgicas entre ellos

(Pérez-Jiménez y Saura-Calixto, 2007).

3.5.1 Fenoles Totales

El método colorimétrico de Folin- Ciocalteu, adaptado por Swain y Hillis (1959) y modificado

por Thaipong et al. (2006) se siguió para la determinación del contenido de polifenoles

totales. Los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de ácido gálico por

cada 100 gramos de muestra en base húmeda (mg EAG/100g BH). Cabe mencionar que el

factor dilución para el subproducto fue de 10; para la galleta con subproducto fue de 4 y que

para el control no se realizó ninguna dilución. En la Figura 10 se detalla el método aplicado y

en el Anexo A los cálculos realizados.

1g de muestra

Adicionar 20 mL Metanol-H O (50:50 v/v, pH 2) y agitar 1h

Centrifugar 30 min

Sobrenadante Residuo

Adicionar 20 mL Acetona-H O (70:30 v/v) y agitar 1h

Centrifugar 30 min

Sobrenadante Residuo Polifenoles

extraíbles

Determinación de Fenoles Totales y Actividad Antioxidante

Figura 10: Metodología para cuantificación de fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu. a. Procedimiento para preparación de estándares b. Procedimiento para la lectura de muestras.

3.5.2 ABTS

La reducción colorimétrica basada en lo descrito por Arnao et al. (2001) y ajustada por

Thaipong et al. (2006) se procedió a realizar. Se utilizó como estándar para las curvas de

calibración Trolox y se monitoreó las absorbancias a 734 nm mediante el empleo de un

espectrofotómetro UV visible. Los resultados se expresaron como micromoles equivalentes

de Trolox por gramo de muestra en base húmeda (µmol ET/g de muestra BH). El factor

dilución para el subproducto fue 40; para la galleta con subproducto 10 y para el control no

se realizó ninguna dilución. En la Figura 11 se detalla el procedimiento aplicado y en el Anexo B los cálculos realizados.

20 mg Ácido Gálico Aforar a 10 mL con MeOH Concentración: 1950 mg/L SOLUCIÓN MADRE

ÁCIDO GÁLICO

PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES

0,8 mL 0,1 mL 0,2 mL 0,3 mL 0,4 mL 0,5 mL 0,6 mL 0,7 mL

0,05 mL 0 mL

Tomar alícuotas y aforar a 10mL con

MeOH

Seguir procedimiento para muestra a.

LECTURA DE MUESTRAS

Tomar 150 µL de muestra

Adicionar 2400 µL de agua dd. y 150 µL de Folin-Ciocalteu 0,25 N

Agitar 5 min y dejar reaccionar 3 min

Agregar 300 µL de carbonato de sodio 1 N

Dejar reacionar 2h en la oscuridad a T ambiente

Realizar lectura a 725 nm CURVA CALIBRACIÓN 0 0,200 0,400 0,600 0,800

0 50,00 100,00 150,00 200,00 y = 0,0045x + 0,0338

R² = 0,9953

Se ñ a l (n m )

2525

Figura 11: Metodología para cuantificación de capacidad antioxidante por el método ABTS. a. Procedimiento para preparación de soluciones: madre y de trabajo. b. Procedimiento para

preparación de estándares c. Procedimiento para la lectura de muestras

Tomar 1 mL de SM y adicionar 60 mL de MeOH aprox.

Medir absorbancia a 734 nm

SOLUCIÓN TRABAJO ABTS “ST”

Ajustar a 1,1 ± 0,02 nm con MeOH 1,12 nm Agregar MeOH

1,08 nm Agregar SM

{

Pesar 40,6 mg ABTS y aforar a 10 mL con Agua dd. Pesar 70 mg Persulfato de Potasio y aforar a 10 mL con Agua dd.

Solución 2,6mM de Persulfato de Potasio

Mezclar volúmenes iguales y dejar reaccionar 12 h a T ambiente

SOLUCIÓN MADRE ABTS “SM”

a.

12,5 mg Trolox Aforar a 50 mL con MeOH Concentración: 968,88 µM SOLUCIÓN MADRE

TROLOX

PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES

4 mL 6 mL 8 mL 10 mL 12 mL 14 mL 2 mL

0,4 mL

Tomar alícuotas y aforar a 25 mL

con MeOH

Seguir procedimiento para muestra b.

LECTURA DE MUESTRAS

Tomar 150 µL de muestra

Adicionar 2850 µL de ST

Dejar reaccionar 2 h en la oscuridad

Realizar lectura a 734 nm c. 0 0,250 0,500 0,750 1,000

0 150,00 300,00 450,00 600,00 y = -0,0016x + 1,0099

R² = 0,9984

3.5.3 DPPH

La técnica de Brand-Williams et al. (1995) con modificaciones de Thaipong et al. (2006) se

realizó para medir la habilidad de los antioxidantes para capturar el radical DPPH. Se utilizó

como estándar Trolox y los resultados se expresaron como micromoles equivalentes de

Trolox por gramo de muestra en base húmeda (µmol ET/g de muestra BH). El factor dilución

para el subproducto fue 40; para la galleta con subproducto 10 y para el control no se realizó

ninguna dilución. Como la solución madre puede almacenarse en congelación, se debe

considerar la temperatura al tomar las alícuotas (que alcancen temperatura ambiente),

debido a que la temperatura modifica la densidad de la sustancia y por ende su volumen. En

la Figura 12 se detalla el procedimiento aplicado y en el Anexo C los cálculos realizados.

Pesar 24 mg de DPPH

Disolver en 100 mL de MeOH SOLUCIÓN

MADRE DPPH “SM”

Tomar 10 mL de SM y adicionar 45 mL de MeOH aprox

Medir absorbancia a 515 nm SOLUCIÓN

TRABAJO DPPH “ST”

Ajustar a 1,1 ± 0,02 nm con MeOH 1,12 nm Agregar MeOH 1,08 nm Agregar SM

{

a.

12,5 mg Trolox Aforar a 50 mL con MeOH Concentración: 968,88 µM

SOLUCIÓN MADRE TROLOX

PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES

4 mL 6 mL 8 mL 10 mL 12 mL 14 mL 2 mL

0,4 mL

Tomar alícuotas y aforar a 25 mL

con MeOH

Seguir procedimiento para muestra

2727

Figura 12: Metodología para cuantificación de capacidad antioxidante por el método DPPH. a. Procedimiento para preparación de soluciones: madre y de trabajo. b. Procedimiento para preparación de estándares c. Procedimiento para la lectura de muestras.

3.5.4 FRAP

Para la determinación de capacidad antioxidante mediante el mecanismo de reducción de

metales, FRAP, se realizó conforme al método descrito por Benzie y Strain (1996) con

modificaciones descritas por Thaipong et al. (2006). Trolox se utilizó como patrón de

referencia y los resultados se expresaron como micromoles equivalentes de Trolox por

gramo de muestra en base húmeda (µmol ET/g de muestra BH). La dilución realizada para

el subproducto fue de 1 mL de extracto en un volumen total de 50 mL de metanol; para la

galleta con subproducto fue de 1 mL de extracto en un volumen total de 5 mL de metanol y

para el control no se realizó ninguna dilución. En la Figura 13 se detalla el procedimiento aplicado y en el Anexo D los cálculos realizados.

LECTURA DE MUESTRAS

Tomar 150 µL de muestra

Adicionar 2850 µL de ST

Dejar reaccionar 24 h en la oscuridad

Realizar lectura a 515 nm 0

0,250 0,500 0,750 1,000

0 150,00 300,00 450,00 600,00 y = -0,0012x + 0,9766

R² = 0,9908

Se

ñ

a

l

(n

m

)

Concentración (µmol)

CURVA CALIBRACIÓN c.

Buffer Acetato (pH 3,6)

310 mg Acetato de Sodio + 1,6 mL Ácido Acético Aforar a 100 mL con Agua dd.

78 mg TPTZ Aforar a 25 mL con HCl 40 mM

Solución TPTZ Solución Cloruro Férrico

135 mg Cloruro Férrico Aforar a 25 mL con Agua

Tomar 25 mL Tomar 2,5 mL Tomar 2,5 mL

Mezclar e Incubar a 37ºC

Solución de trabajo FRAP “ST”

Figura 13: Metodología para cuantificación de capacidad antioxidante por el método FRAP. a. Procedimiento para preparación de solución de trabajo. b. Procedimiento para preparación de estándares c. Procedimiento para la lectura de muestras.

3.6 Retención de compuestos antioxidantes

Para evaluar el porcentaje de retención de los compuestos antioxidantes en las galletas se

relacionó su contenido sin someterlo al subproducto al tratamiento térmico y tras hacerlo;

para lo cual a la galleta control después del horneado se le incorporó el subproducto

(GalletaSub.SH). A este resultado se lo comparó con las galletas a las que se les añadió el

subproducto y luego se llevaron al proceso térmico (GalletaSub.H ), mediante la expresión:

12,5 mg Trolox Aforar a 50 mL con MeOH Concentración: 968,88 µM

SOLUCIÓN MADRE TROLOX

PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES

4 mL 6 mL 8 mL 10 mL 12 mL 14 mL 2 mL

0,4 mL

Tomar alícuotas y aforar a 25 mL

con MeOH

Seguir procedimiento para muestra

b.

LECTURA DE MUESTRAS

Tomar 150 µL de muestra

Adicionar 2850 µL de ST

Dejar reaccionar 30min en la oscuridad

Realizar lectura a 593 nm

0 0,375 0,750 1,125 1,500

0 150,00 300,00 450,00 600,00 y = 0,0022x + 0,0456

R² = 0,995

Se

ñ

a

l

(n

m

)

Concentración (µmol)

CURVA CALIBRACIÓN

2929

%

retención

₌

Galleta

Galleta

Sub.SH

!

"

#

$

%

&

*100

tomando en cuenta que 100% indica el valor base, 0% la pérdida total de actividad

antioxidante y valores superiores a 100% representan las ganancias que trajo consigo el

horneado (Jiménez-Monreal et al., 2009).

3.7 Análisis estadístico

Los resultados obtenidos se expresaron como media ± desviación típica y fueron analizados

estadísticamente a través del programa Minitab 16, mediante un análisis de varianza

(ANOVA), seguido de un test de rango múltiple (Tukey), con nivel de confianza del 95%,

para determinar si existió diferencia significativa entre la cantidad de compuestos

31 4.1 Extracción de compuestos antioxidantes

En la presente investigación se utilizó como fuente de antioxidantes a la piel de mango para

la elaboración de galletas, evaluando su estabilidad durante un período de ocho semanas

frente al procesado y almacenamiento. Al ser los compuestos fenólicos uno de los grupos

más grandes que contribuyen a la actividad antioxidante (Ajila, Naidu, et al., 2007; Martínez

et al., 2012) se cuantificó semanalmente el contenido de polifenoles totales junto a la

actividad antioxidante por los métodos ABTS, DPPH y FRAP dados a los distintos modos de

acción de cada uno dentro de la cadena oxidativa (Pulido et al., 2000).

La extracción acuosa-orgánica propuesta por Larrauri et al. (1997a) se utilizó con el fin de

extraer la mayor cantidad de compuestos fenólicos, gracias a la utilización de dos ciclos de

extracción: una primera mezcla polar acidificada metanol:agua en proporciones iguales y

una segunda extracción más apolar acetona:agua (Pérez Jiménez, 2007; Pérez-Jiménez et

al., 2008).

El tamaño de partícula <250 µm se seleccionó por brindar una textura similar a una harina,

que era el material a reemplazar en la formulación y la ventaja derivada es que al disminuir

el tamaño se mejora el rendimiento de extracción (Landbo y Meyer, 2001); posiblemente por

el rompimiento de estructuras de la matriz, liberándose así los antioxidantes ligados

(Pérez-Jiménez et al., 2008).

4.2 Fenoles totales

Los subproductos agroindustriales que comprenden principalmente piel y semillas

(Ayala-Zavala et al., 2010) son una gran fuente de antioxidantes como se puede apreciar en la

Gráfica 1. Según esta gráfica, la piel de mango se encuentra en un estado intermedio de contribución fenólica (3520 ± 103 mg EAG/100 g BS); existiendo subproductos como la piel

de guayaba y piel de otras variedades de mango (bambangan y Ubá) que poseen un mayor

contenido de polifenoles extraíbles que la fracción utilizada en la investigación. En el caso

del orujo de uva también posee un alto aporte, pero considérese también que comprende

piel y semillas, siendo la última fracción la que posiblemente brinde un mayor aporte que la

EAG: Equivalentes de ácido gálico. BS: Base seca

Fuente:a La experimentación. b Llobera y Cañellas (2008). c Al-Sheraji et al. (2011). d Llobera y Cañellas (2007). e Jiménez-Escrig et al. (2001). f Bensadón et al. (2010). g Hassan et al. (2011). hSánchez-Alonso et al. (2008). i Ribeiro et al. (2008).

Elaboración: La autora

Gráfica 1: Polifenoles extraíbles en subproductos agroindustriales.

En la Gráfica 2 se puede apreciar el contenido de fenoles totales en subproducto de mango,

fibra de mango (MDF), pasta de mango (MPB) y en productos ya procesados de la industria

panadera y pastelera (galletas, pan y muffins); todos ellos extraídos con los mismos

solventes y en las mismas proporciones (a excepción del MPB en el que no se menciona

método de extracción, más no los productos elaborados con éste). Tanto la galleta con piel

de mango (983 ± 7 mg EAG/100 g BS), como la galleta con MDF (1180 ± 120 mg EAG/100

g BS) y el pan (1010 ± 50 mg EAG/100 g BS) poseen valores similares tomando en cuenta

que las variedades de mango fueron distintas (Ataulfo para MPB y Tommy Atkins para MDF

y la experimentación), que el porcentaje de incorporación no fue el mismo (25%, 34% y 18%

respectivamente) y que la materia prima de partida (piel de mango, MPB y MDF) reportan

valores distintos en el siguiente orden: Experimentación > MPB > MDF. Esto puede deberse

a la combinación tiempo y temperatura involucradas en el proceso de elaboración de cada

producto, factores determinantes en la estabilidad de los antioxidantes. Así tenemos 170ºC

por 35 minutos para MPB y productos derivados; 200ºC por 20 minutos para el pan y galleta

MDF y 170ºC por 10 minutos en el caso de la experimentación.

Realizando un análisis de varianza tomando como base la media y los límites inferior y

superior proporcionados por la desviación estándar reportados en las referencias

bibliográficas, se determinó que el contenido fenólico de la galleta con piel de mango se

3520,7 3490,0 3164,0 2630,0 5870,0 7790,0 2760,0 1540,0 3710,0 2690,0 9830,0 7850,0 5724

0,0 2000,0 4000,0 6000,0 8000,0 10000,0 12000,0

Piel de mango Orujo de uva prensal blanca Orujo de mango silvetre Kort Orujo de uva Manto Negro Piel de Guayaba rosa Piel de Guayaba silvestre Espinas, epidermis y gloquidios de fruto de Tuna Verde Espinas, epidermis y gloquidio de fruto de Tuna Roja Espinas, epidermis y gloquidio de cladodio de Nopal var. Milpa Alta Espinas, epidermis y gloquidio de cladodio de Nopal var. Atlixco Piel de Bambangan Orujo de uva blanca (piel y semillas) Piel de mango variedad Ubá

Concentración mg EAG/100g BS a b c d e f g h e f f f i

Concentración mg EAG/100 g BS

33

ubica en tercer lugar, después de la galleta y el pan con MDF, no siendo estadísticamente

diferente (p>0,05) que el pan con MDF. Estos resultados son acordes ya que comparando

con la experimentación, la galleta con MDF que ocupa la primera posición tuvo la mayor

cantidad de subproducto incorporado (34%) y en segunda ubicación está el pan con MDF el

cual aunque se añadió 18%, la combinación de tiempo y temperatura (200ºC por 20

minutos) pudo potenciar la capacidad antioxidante como lo señala Morales et al. (2009) en el

que establece que a mayor temperatura y mayor tiempo de horneado la capacidad

antioxidante incrementa.

EAG: Equivalentes de ácido gálico. BS: Base seca. a

Galleta con piel de mango: Se incorpora 25% de subproducto en la formulación. Galleta control: Elaborada sin la incorporación del subproducto. Piel de mango: Subproducto deshidratado a 60 ºC (10 horas) y tamaño de partícula <250 µm. bMPB: Pasta resultante del procesamiento de mango. Muffin MPB-50: Se incorpora 26% de MPB en la formulación. Muffin MPB-75: Se incorpora 39% de MPB en la formulación. Muffin Control: Sin la incorporación de MPB. cMDF: Fibra dietaria de mango (piel y pulpa). Galleta con MDF: Se incorpora 34% de MDF en la formulación. Pan con MDF: Se incorpora 18% de MDF en la formulación. Pan y galleta control: No se detectaron

Fuente:a La experimentación, b Ramírez-Maganda et al. (2015), c Vergara-Valencia et al. (2007).

Elaboración: La autora

Gráfica 2: Contenido de fenoles totales en subproductos de mango y en productos procesados tras su incorporación.

De las pruebas preliminares en la formulación se determinó que el porcentaje máximo de

subproducto a incorporar era de 25% ya que se dificultaba trabajar la masa,

presumiblemente por el contenido de fibra de la piel de mango y las harinas, que se asoció

con el incremento en la absorción de agua de la masa (vinculación directa con el contenido

de humedad por la interacción entre el agua y los polisacáridos a través de puentes de

1614 1180 1010 2400 536 477 186 3520,7 253,62 982,83

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

MDF Galleta con MDF Pan con MDF Pan y Galleta MDF Control MPB Muffin MPB 75 Muffin MPB-50 Muffin Control Piel de mango Galleta Control Galleta con Piel de mango

Concentración (mg EAG/100g BS)

hidrógeno) y por consiguiente su resquebrajamiento (Ajila et al., 2008; Chaplin, 2003;

Martínez et al., 2012; Nanditha y Prabhasankar, 2008; Sudhakar y Maini, 2000); además del

color poco agradable. El porcentaje de humedad incrementó de 3,84% para el control a

7,90% para la galleta con subproducto, lo cual está relacionado con la absorción de agua de

las fibras del subproducto; además el color de la galleta con piel de mango y control se

colocaron entre la tonalidad roja (45º) a amarilla (90º) y el subproducto entre amarilla (90º) a

verde (135º) (McGuire, 1992; McLellan et al., 1995) (Ver Anexo F). Ashoush y Gadallah (2011) igualmente prepararon galletas con distintas concentraciones de piel y semilla de

mango en polvo, obteniendo un incremento gradual de polifenoles y porcentaje de humedad

conforme aumenta el nivel de incorporación. La mayor cantidad que agregaron para la

galleta con piel de mango fue de 20%, limitándose también por el color y sabor poco

atractivos para el panel de catadores y el resultado alcanzado en fenoles totales se ubicó en

945 mg GAE/100 g con un 6,98% de humedad, valores semejantes con los obtenidos en la

experimentación; señalando también que el proceso de extracción no fue el mismo.

La galleta con incorporación de piel de mango puede convertirse en un alimento fuente de

antioxidantes ya que comparada con otras fuentes con tal denominación como el vino tinto

(160 mg EAG/100 mL) o las frutas (538 mg EAG/100 g BS), este producto aporta mayor

cantidad de compuestos fenólicos (Saura-Calixto y Goñi, 2006).

4.3 ABTS

La capacidad antioxidante medida por el método ABTS señala que la piel de mango aporta

489 ± 4 µmol ET/g BS; valor superior a otros subproductos (de tuna, cladodio de nopal y orujo de uva) pero inferior a pulpas de frutos de origen brasileño (murici y marolo) como se

ilustra en la Gráfica 3a. Rojas Jiménez (2014) realizó la cuantificación en piel de mango con

pulpa adherida teniendo como resultado 339 µmol Trolox/g BS, el cual es menor a lo obtenido en la experimentación. Esto puede deberse en primer instancia a que en la

experimentación de forma general se usó en su totalidad la piel, por lo que la pulpa adherida

al poseer menor concentración de antioxidantes pudo reportar menos en su conjunto. Otro

aspecto muy importante es que el contenido de antioxidantes depende desde la variedad

(Olsson et al., 2004), genotipo (Howard et al., 2003), el lugar de procedencia (Deng et al.,

2010), factores climáticos o estacionales (de Sá y Rodriguez-Amaya, 2003), el manejo pre y

post cosecha (Deng et al., 2010) y también del grado de madurez; el mismo que está

vinculado con la degradación de pigmentos clorofílicos y el simultáneo incremento de

pigmentos carotenoides durante la etapa de maduración (Navarro et al., 2006; Singh y