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. ..
JNOMBRE : T E L E F ON0 : M A T R I C U L A : C L A V E :
CARRERA :
/AREA DE CONCENTRACIQN: T R I M E S T R E L E C T I V O :
HORAS/ SEMANA
L U G A R E N DONDE S E
----
L L E V A R A A CABO :F E C H A DE I N I C I O :
/FECHA DE TERMINACION : JTUTOR INTERNO: P U E S T O
Y A D C R I P C I O N :
F I R M A DEL ALUMNO
S R . L U I S F . S C H E T T I N 0
S C H E T T I N O Y A R E Z L U I S F E L I P E 6 8 8 - 8 8 - 6 0
.
8 2 3 4 0 3 8 1
2 3 .
l a - .13.86
B I O L O G I A
.
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c.1
L
B I O L O G I A E X P E R I M E N T A L
-
\ 86
-
P15
L A B O R A T O R I O DE B I O L O G I A MOLECULAR D E L D E P T O . DE C I E N C I A S DE L A S A L U D . 1 DE J U L I O DE 1986.
15 DE ENERO DE 1 9 8 7
2
RODOLFQ V E L A S C O L E Z A M A
.
P R O F E S O R A S O C I A D O " B " DE T E I M P O COMPLETO. P U R I F I C A C I O N Y C A R A C T E R I Z A C I O N DE UN F A C T O R M E G A C A R I O C I T O P O Y E T I C O A + -P A R T I R DE L A O R I N A DE P A C I E N T E S CON P U R P U R A T R O M B O C I T O P E N I C A I D I O P A T I C A " .
F I R M A D E L T U ?
I N T R O D U C C I Q N .
Las p l a q u e t a s t i e n e n un p a p e l i m p o r t a n t e e n l a h e m o s t a s i s ,
man e l c o á g u l o h e m o s t á t i c o i n i c i a l Y aumentan l a f o r m a c i ó n de t r o m b o s
de f i h r i n a más o e r m a n e n t e s . Normalmente l a p a r e d v a s c u l a r s i r v e como
b a r r e r a e n t r e e l f l u j o s a n g u í n e o y e l e s p a c i o e x t r a v a s c u l a r ; c u a n d o
-
e s t a b a r r e r a e s d e s t r u i d a , l a s p l a q u e t a s s e a d h i e r e n a los componen- t e s d e l s n b e n d o t e l i o , n o s t e r i o r m e n t e o t r a s p l a q u e t a s s e u n i r á n a l a s
p r i m e r a s p a r a p r o d u c i r un a g r e g a d o y f i n a l m e n t e e s t a s c o n t r i b u i r á n
-
a l a c o a g u l a c i ó n p l a s m á t i c a m e d i a n t e l a l i b e r a c i ó n de s u s t a n c i a s p r o
c o a m u l a n t n s ( 1 ) .
-
E l o r i g e n de l a s p l a q u e t a s s e e n c u e n t r a e n l a l í n e a m e g a c a r i o -
c í t i c a , c u y a s c é l u l a s D r e s e n t a n un p a t r ó n d e p r o l i f e r a c i ó n y madura
c i Ó n Ú n i c o e n l a b i o l o g í a d e mamíferos; Los m e a a c a r i o c i t o s maduran h a s t a o r i g i n a r f r a a m e n t o s c i t o p l a s m á t i c o s que son Ins p r e c u r s o r e s
-
de p l a q u e t a s (2).
E x i s t e n e v i d e n c i a s e x p e r i m e n t a l e s y c l í n i c a s que s e ñ a l á n que
t o d a s l a s c é l u l a s s a n g u í n e a s se o r i a i n a n a u a r t i r de un p r e c u r s o r
-
p l u r i p o t e n c i a l , e l c u a l p o s e e c a v a c i d a d de a u t o r r e p l i c a c i ó n ; a l d i v i
ñ i r s e , e s t a c é l u l a p r o d u c e d o s c é l u l a s h i j a s ; una p l u r i p o t e n c i a l p a -
r a p e r p e t u a r l a e s p e c i e , y o t r a l l a m a d a en c o m i t é n c o m i s + o n a d a p a -
r a a r t u a r como n r e r u r - o r p r i m i t i v o d- l a - 1:neas e r i t r o c i t o s
:
g r a n ul o c i t o s / m a c r Ó f a g o s . E s t a Ú l t i m a e t a p a , no h a s i d o d e m o s t r a d a ~ l e n a -
mente p a r a l a l í n e a m e g a c a r i o c í t i c a . S i n e m b a r g o , l a d i f e r e n c i a c i ó n
de e s t a l í n e a c e l u l a r i n i c i a en e l e s t a d o de m e a a c a r i o b l a s t o ( 4 n )
( 3 , 4 ) .
p a s a n d o a s e r m e a a c a r i o c i t o s b a s ó f i l o s a l t i e m p o nue q u s i s t e m a de
membranas s- d e E a r T o l ' a en g r a n a s c a l a
P o s t e r i o r m e n t e s e s i n t e t i z a n g r á n u l o s de p o l i s a c á r i d o s ae a l t a
d e n s i d a d e l e c t r ó n i c a , a l g u n o s de l o s c u a l e s c o n t i e n e n e n z i m a s l i s o s o
m a l e s . En e l s i g u i e n t e e s t a d o de m a d u r a c i ó n o de m e g a c a r i o c i t o g r a -
n u l a r , l o s a r á n u l o s c o n t i n ú a n aumentando en c a n t i d a d lo nue i n d i c a "ue l a s p r o t e í n a s e s p e c í f i c a s de l a s p l a q u e t a s s e s i g u e n s i n t e t i z a n
d o ; l a s c é l u l a s c r e c e n en volumen, e l c i t o p l a s m a s e h a l l a d i v i d i d o
p o r i n v a n i n a c i o n e s membrananles ( D M S , S i s t e m a de demarca2iÓn membra n a i ) .
A l f i n a l de e s t e e s t a d o de m a d u r a c i ó n , l o s m e q a c a r i o c i t o s d e s a
-
r r o l l a n p r o y e c c i o n e s r í g i d a s c a r g a d a s con m i c r o t Ú b u l o q . Aún n o e s-
c l a r o e l mecanismo p o r e l c u a l s e l i b e r a n l o s f r a s m e n t o s c i t o D l a s m á
t i c o s D r e c u r s o r e s de p l a q u n t a s , qiie l l e g a n a l o s nulmones dnnde con
t r a n s f n r m a d o c . Aún f a l t a mucha i n f o r m a c i ó n a c e r c a d e l p r o c e s o de li-
b e r a c i ó n de e s t o s s e u d ó p o d o s o de m e q a c a r i o c i t o s a l t o r r e n t e c i r c u l a
t o r i o ( 5 . 6 ) .
-
A v a n c e s en e l e s t u d i o de f a c t o r e s h u m o r a l e s r e g u l a d o r e s de megaca-
r i OD o i e s i s.
Se han d i s e ñ a d o s i s t e m a s de c u l t i v o p a r a c é l u l a s de m6dula 6 -
s e a , -ue p e r m i t e s c o n o c e r l o s r r q n e r i m i e n t o s e s p e c í f i c o s de l a s d i -
f e r e n t e s l í n e a s c e l u l a r e s h e m a t o p o y é t i c a s . E n t r e e l l o s , e l m e d i o
-
c o n d i c i o n a d o de c é l u l a s m u r i n a s o humanas. e n cuyo s o b r e n a d a n t e s ee n c u e n t r a n f a c t o r e s e s t i m u l a n t e s de l a h e m a t o p o i e s i s . Uno de e s t o s ,
e s e l 1 lamado f a c t o r e s t i m u l a n t e de c o l o n i a s de m e g a c a r i o c i t o s (CSF-Mea) que o r i g i n a e l d e s a r r o l l o de u n i d a d e s f o r m a d o r a s de c o l o n i a s de mega
c a r i o c i t o s a l s e r a d i c i o n a d o a l o s s i s t e m a s de c u l t i v o . E L número de e s t a s c o l o n i a s , s e e n c u e n t r a r e l a c i o n a d o a l a c a p a c i d a d e s t i m u l a n t e
d e l f a c t o r ( 7 , s ) .
I
También se ha e n c o n t r a d o que e n e l s i i e r n y I n o r i n a de p a c i e n -
t e s con anemia a p l á s t i c a y o t r o s d e s ó r d e n e s en l a p r o d u c c i ó n de p l a
q u e t a s , e x i s t e una a c t i v i d a d s e m e j a n t e a CSF-Meg (8,9,10). E s t a pue de s e r i n d e p e n d i e n t e de la t r o m b o p o i e t i n a . hormona a l a c u a l s e l e ha
a t r i b u i d o l a r e a u l a c i ó n de l a m a d u r a c i ó n n l a n u e t a r i a . A s í , l a l í n e a
c e l u l a r p u d i e r a e s t a r r e g u l a d a p o r v a r i o s f a c t o r e s ,
entre
e l l o s CSF-Meay t r o m b o p o i e t i n a ,
o
b i e n un qÓ1o f a c t o r de v a r i a s u n i d a d e s , e n e l-
c u a l , l a t r o m b o p o i e t i n a y e l CSF-Meg f u e s e n a l g u n o s de los c o n s t i t u - ven t e s I 1 1 i
.
.-
A c t i v i d a d b i o l Ó g ' 7 c a .
La a c t i v i d a d e s t ; m u l a n t e d e l f a c t o r p r o d u c i d o i n
v i v o
oe
v i t r op u e d e e s t u d i a r s e
en
s i s t e m a s :-
In v i t r o , m e d i a n t e c u l t i v o s de médula ó s e a c o n t a n d o e l númerode u n i d a d e s f o r m a d o r a s de m e g a c a r i o c i t o s (UFC-Meg) d e s a r r o l l a d a s co-
mo r e s p u e s t a a s u p r e s e n c i a en e l s i s t e m a de c u l t i v o .
I n
v i v o ,
m e d i a n t e e l i n c r e m e n t o e n e l número de D l a a u e t a s c i r -- -
c u l a n t e s en a n i m a l e s
a
l o s c i i a l e s s e l e s i n v e c t a e l m a t e r i a l de p r u e b a .. :,
.... I
....
.-
.
..,I_
..
....
A n t e c e d e n t e s d e l g r u p o de t r a b a j o .
V e l a s c o - L e z a m a , R. y N a k e f f , A. E s t a b l e c i e r o n l a s c o n d i c i o n e s r e q u e r i d a s p o r un c u l t i v o de c é l u l a s de b a z o de r a t ó n m a n t e n i d a s
en un medio l i b r e de s u e r o p a r a l a p r o d u c c i ó n de iin f a c t o r que e s t i
mula l a m e s a c a r i o p o i e s i s i n v i t r o . Como r e s u l t a d o de d i c h o t r a b a j o ,
s e conoce d e l f a c t o r l o s i g u i e n t e : Organo p r o d u c t o r i n v i t r o e n me-
d i o s l i b r e s de s u e r o , e s p e c i f i c i d a d e s t i m u l a n t e con r e s p e c t o a l a s
d i f e r e n t e s l í n e a s c e i u l a r e s h e m a t o D o i é t i C a S , p e s o m o l e c u l a r ( s u D e r i o r
a 6 0 , 0 0 0 d a l t o n s ) y s u m o v i l i d a d e l e c t r o f o r ~ t i c a ( l 3 \ .
E l medio de c u l t i v o en e l c u a l s e e n c u e n t r a e l f a c t o r e s t i m u l a n t e f u e a n a l i z a d o p o r c r o m a t o n r a f í a de l í q u i d o s a a l t a p r e s i ó n ( H P L C ) . E s t e método f u e i n c a p a z de p r e s e r v a r l a a c t i v i d a d b i o l ó s i c a d e l mate-
r i a l s o m e t i d o a d i n h o t r a t a m i e n t o , b i e n s e a e n su forma i n t e g r a l o e n
c a d a una de l a s f r a c c i o n e s o b t e n i d a s ; t a m b i é n m e d i a n t e HPLC se e n c o n -
t r á q u e un f a c t o r a n á l o g o p r o v e n i e n t e de l a o r i n a de un i n d i v i d u o con
p ú r p u r a t r o m b o c i t o p é n i c a i d e o p á t i c a , ~ r e s e n t a una s e ñ a l g r á f i c a seme-
j a n t e a l a dada p o r e l f a c t o r p r o d u c i d o i n v i t r o m a n i f e s t á n d o s e en
dos s u b u n i d a d e s ( g r á f i c a 1).
Justificación ~
En
forma paralela a l presente trabajo, se desarrollan en nuestrolaboratorio, l a caracterización de otros factores que influyen en l a megacariopoyesis
--
in vivo e -I_in vitro. Hasta e l momento, e l mejor dilu- cidado es e l obtenido en l o s medios de cultivo de bazo de ratón.Nuestro interés principal e s e l saber si en l a orina de pacien- tes con enfermedades mieloprolifezativas o desórdenes en l a coagula- ción, existe un factor análogo a l estudiado; e l cual pudiera ser pu- rificado y administrado en un futuro lejano, a aquellos pacientes que no pudiesen producirlo o que l o produjesen con alteraciones en su a c t i vidad. Siendo necesario administrar Únicamente l a s fracciones respon- sables de l a actividad biológica, para evitar reacciones inmunológi- cas indeseables.
o b j e t i v o s .
P u r i f i c a r v c a r a c t e r i z a r un f a c t o r m e g a c a r i o o o i é t i c o e x i s t e n t e
I . e n l a , , o r i n a de p a c i e n t e s con P ú r p u r a T r o m b o c i t o p é n i c a I d e o p á t i c a .
M a t e r i a l Y métodos.
Mate r i a 1 b i o l ó g i c o :
R e c o l e c c i ó n de m u e s t r a s p r o b l e m a y c o n t r o l . L a s
p r o b l e m a p r o v e n d r á n de c i n c o m u j e r e s de 3 0 a 40 anos de e d a d con púr p u r a t r o m b o c i t o p é n i c a i d e o p á t i c a , oue n o hayan s i d o t r a t a d a s con
f á r
macos d e l t i p o de los e s t e r o i d e s ; e l g r u p o c o n t r o l s e r á n , c i n c o muie- i
.
r e s s a n a s e n t r e
los
3 0 y l o s 4 0 a ñ o s de e d a d . a l e j a d a s d e l p e r í o d o-
m e n s t r u a l ambos g r u p o s ; l o s p a r á m e t r o s de n o r m a l i d a d se e s t a b l e c e r á np o r un examen g e n e r a l de o r i n a y una cruímica s a n g u í n e a .
P u r i f i c a c i ó n y c a r a c t e r i z a c i ó n d e l f a c t o r e s t i m u l a n t e de l a megaca-
r i o p o i e s i s .
1- C u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s t o t a l e s en l a o r i n a p o r e l método d e l
á c i d o s u l f o s a l i c í l i c o ( a n e x o 1).
2 - P u r i f i c a c i ó n de m u e s t r a s .
-
D i á l i s i s v s . agua d e s i o n i z a d a ( a n e x o 11).- c o n c e n t r a c i ó n p o r f i i t r a c i ó n m o l e c u l a r ( a n e x o 111).
-
S e p a r a c i ó n p o n c r o m a t o q r a f í a e n Sephadex G-25 ( a n e x o 1 1 1 ) . 3- F r a c c i o n a m i e n t o y c a r a c t e r i z a c i ó n .-
C r o m a t o n r a f í a en columna DEAE S e f a r o s a ( a n e x o iv).-
C r o m a t o g r a f í a en columna CM S e f a r o s a ( C a r b o x i m e t i l ) ( a n e x o V).-
C r o m a t o g r a f r a e n Sephadex G-100 ( a n e x o Vi).4- D e t e r m i n a c i ó n de l a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a .
-
--
I n v i t r o ( a n e x o VII).P o r c u l t i v o s de médula ó s e a c u a n t i f i c a n d n e l número de i r n i a a d e s
,
..
.,,
m o r e s p u e s t a
.a
l a a c t i v i d a d e s t i m u l a n t e de l a s m u e s t r a s ; a n t e s y d e s p u e s d e l f r a c c i o n a m i e n t o . P o s t e r i o r m e n t e s e d e t e r m i n a r á l a D O -s i b l e r e l a c i ó n e x i s t e n t e e n t r e e l f a c t o r o f a c t o r e s o b t e n i d o s de
e s t a f u e n t e v e l o b t e n i d o d e l medio c o n d i c i o n a d o de b a z o de r a t ó n
c u v a c a r a c t e r i z a c i ó n s e d e s a r r o l l a r á en f o r m a p a r a l e l a a l p r e s e n t e
t n a b a i o.
-
- -
I n v i v o ( a n e x o V I I I ) .I n y e c c i ó n d e l m a t e r i a l c r u d o a r a t o n e s , a s í como l a s f r a c c i o n e s
p r o t e í n i c a s d e 1 mismo, c u a n t i f i c a n d o e l número de p l a q u e t a s en s a n g r e
c i r c u l a n t e , a n t e s y d e s p u é s de l a a p l i c a c i ó n . A l l o t e c o n t r o l se l e
a n l i c a r á s o l u c i ó n s a l i n a f i s i o l ó g i c a .
5 - D e t e r m i n a c i ó n de a l g u n a s p r o p i e d a d e s f i s i c o a u í m i c a s .
A l a u n a s de l a s D r o D i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s t a l e s como e l D e s o mo-
B i b l i o g r a f í a .
1- B a r n h a r t , M . I .
p l a t e l e t r e s p o n s e s i n h e a l t h and d i s e a s e .
M o l e c u l a r & c e l l u l a r b i o c h e m i s t r y Vol. 2 2 Dec. 2 2 , 1978 The ñ a g u e , The N e t h e r l a n d s .
2 - P e n i n g t o n , D. G . T h r o m b o p o i e s i s
H a e m o s t a s i s & T h r o m b o s i s
Ed. A r t h u r
L.
Bloom, Duncan P . Thomasc h u r c h i l l L i v i n s g s t o n e 1981
-
C h a p t e r 1. 3 - B . I . L o r d .
P r o l i f e r a t i o n r e g u l a t o r s i n h a e m o p o i e s i s .
C l i n i c s i n h a e m a t o l o g y . 8 (2); 4 3 5 - 4 5 1 . 1 9 7 9 .
4- Hoffman, R., M a z u r , E . , G e r w i t z , A.M., S t r a n e v a , J., B r u n o , E . , Berkow. it.
C e l l u l a r & Humoral r e g u l a t i o n of human m e g a c a r y o c y t o p o i e s i s . Normal and n e o p l a s t i c h e m a t o p o i e s i s , p p . 2 6 9 - 3 0 0
A l a n
R.
L i s s , I N C . , New Y o r k , N . Y . 19835 - T a v a s s o l i , M .
F u s i o n - f i s i o n r e o r g a n i z a t i o n o f membrane : a d e v e l o p i n g membrane model f o r t h r o m b o c y t o g e n e s i s i n m e g a k a r y o c y t e s .
B l o o d c e l l s 5 : 89-98. 1 9 7 9 a .
6 - T a v a s s o l i , M.
7- N a k e f f , A . , D a n i e l s - M c Q u e e n , S .
.
i n v i t r o c o l o n y a s s a y f o r a new c l a s s of m e g a k a r y o c y t e pre-
c u r s o r : c o l o n y - f o r m a t i o n - u n i t m e g a c a r y o c y t e .
P r o c . Soc. Exp. B i o l . Med. 151: 758. 1 9 7 6 .
8- M a z u r , E.M., H o f f m a n , R., B r y n o , E.$
R e g u l a t i o n of human m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s : an
&
v i t r o a n a l y s i s .J. C l i n . I n v e s t . 68. 6 8 ; 733. 1 9 8 1
9 - Enomoto, K., K a w a k i t a , M., K i s h i m o t o , S . , K a t a y a m a , N.,‘ M i y a k e , T.
T h r o m b o p o i e s i s a n d m e g a k a r y o c y t e c o l o n y s t i m u l a t i n g f a c t o r i n t h e
u r i n e of p a t i e n t s w i t h a p l a s t i c anaemia.
B r i t i s h J o u r n a l of H a e m a t o l o g y , 1 9 8 0 , 4 5 , 5 5 1-556.
B l a c k w e l l S c i e n t i f i c P u b l i c a t i o n s , 1980.
-
10- Dukes, P.,P.,f Gomperts, E., I s a d i , P .
M o d u l a t i o n of m e g a k a r y o c y t e c o l o n y f o r m a t i o n b y p r o t e i n f r a c t i o n s
from t h e u r i n e of n o r m a l a n d a n e m i c i n d i v i d u a l s .
M e g a k a r y o c y t e B i o l o g y a n d P r e c u x j s o r s : i n v i t r o c l o n i n g and c e l l u l a r
p r o p e r t i e s .
P u b l . E l s e v i e r N o r t h H o l l a n d , I n c . 1981.
E v a t t , L e v i n e a n d W i l l i a m s , e d i t o r s .
11- S h r e i n e r , D.P., W e i n b e r g , J., Enoch, A .
-
P l a s m a t k r o m b o p o i e t i c a c t i v i t y i n humans w i t h n o r m a l a n d ab-
n o r m a l p l a t e l t c o u n t s .
B l o o d , V o l . 5 6 , No. 2 ( a u g u s t
Grune & S t r a t t o n I n c . 1980.
12- Hoffman, R., Mazur, E., B r u n o
,
1980.E., F l o y d , V.
A s s a y o f an a c t i v i t y i n t h e serum of p a t i e n t s w i t h d i s o r d e r s of
t h r o m b o p o i e s i s t h a t s t i m u l a t e s f o x m a t i o n o f m e g a k a r y o c y t e c o l o n i e s .
The N e W E n g l a n d J o u r n a l of M e d i c i n e . (sep. 1 9 8 1 ) . V o l . 305 No. 1 0
L “
1 3 - N a k e f f , A . V e l a s c o - L e z a m a , R.,
R e g u l a t i o n of m e g a k a r y o c y t i c p r o l i f e r a t i o n .
Blood Cuppl. 118 N O V . 1981.
...
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1
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G r á f i c a 1.
O r i n a de P a c i e n t e s c o n PGrpura T.rombocitopénica I d e o p á -
M E D I O C O N D I C I O N A D O D E BAZO 1 X EN d- M O P S .
M R r l T O <-MOPS.
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. .
CUANTIFICACION
DEPROTEINAS
EN
ORINAMETODO DEL
ACID0 SULFOSALICPLICO
CURVA
TIPO :Preparar una solución patrón de albGmina sérica bovina
de 1 mg/ml
y preparar l a siguiente s e r i e de tubos.
mg
de proteína/
1 0 0
ml
de orina
1 0 20
30
40
506 0
70
80
9 0
1 0 0
~ o i n . p a t r 6 n de
proteína(
ml
0.1
0.20.3
0 . 40.5 0.6
0 . 7 0 . 8 0 . 91 . 0
agua destilada(m1)
Ac.SulfOSaliCfliC0
( m i
1
5 . 0 a todos l o s tubos
Dejar rposar
los tubos
a
temperaura ambiente durante
5 minutos
para permitir l a reacci6n
y
l e e r a Densidad Optica de
420nm.
Dar
e l siguiente tratamiento para
los tubos blanco
yproblema
Cuadro
1
Problema
Blanco
I
Blanco
I1
1.0
m l
---.Orfna
(di1
1:20 )1 . 0
ml
Soluci6n de NaCl 0 . 8 5 %
- - 35 . 0
m l
1 . 0 m l
Soluci6n de Ac. Sulfo-
s a l i c í l i c o
3%
5.0
m l
---
5 . 0m l
Todas l a s determinaciones se hacen por duplicado. Contrir una
g r á f i c a con
l o s valores obtenidos e interpolar
e l
valor de
D.O.d e l problema para determinar l a concentracidn protéica d e l
---
mismo.
t
I
*.
.
. .
-.
I.
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. _ .
*.. "...
..
r-
P ,
..-.
. < .
I.
,...
...
b . .
I-
~ ..
21.
.,.
* ,-
I
-~
j
..,j
. _Reportar l a
concentration
de proteína por 1 0 0 m l de orfna.
B i b l i o g r a f í a
:Lynch,
J.,
Raphael,S,S., Mellor,L,D., Spare,P,D., e Inwood,
M,J,H.
Métodos de Laboratorio. Segunda Edicibn. Ed.Interamerkca
-
A n e x o I1
P r e p a r a c i ó n de membranas d e d i á l i s i s .
1. C o r t a r un t r o z o de membrana d e d i á l i s i s y c o l o c a r l a e n un v a s o d e p r e c i p i t a d o s d e 4 It c o n t e n i e n d o s o l u c i ó n de EDTA 0 . 5
M .
2 . Hervir d u r a n t s r e i n t a m i n u t o s .
3. D e c a n t a r l a s o l u c i ó n y r e p e t i r e s t e p r o c e d i m i e n t o o c h o v e c e s más e m p l e a n d o a g u a d e s t i l a d a e n s u t i t u c i ó n d e l EDTA.
4 . Después d e e s t e t r a t a m i e n t o e l t u b o d e b e r á m a n e j a r s e con g u a n t e s d e s e c h a b l e s o m a t e r i a l l i b r e d e n u c l e a s a s y p r o t e - a s a s y nunca c o n l a s manos d e s c u b i e r t a s .
5.Con un t r o z o d e h i l o , c e r r a r uno d e l o s e x t r e m o s d e l a b o l - s a d e d i á l i s i s .
6 . A d i c i o n a r agua y p r e s i o n a r h a c i a a b a j o l a b o l s a c o n t r a e l e x t r e m o s e l l a d o u t i l i z a n d o
l o s
d e d o s m e d i o s con e l p r o p ó -- s i t o de d e t e c t a r p i c a d u r a s e n l a b o l s a .
7 . De n o e x i s t i r f u g a s , l l e n a r 1 a . b o l s a c o n e l m a t e r i a l pa-
r a s e r d i a l i z a d o y c e r r a r e l o t r o e x t r e m o con h i l o .
8. C o l o c a r l a b o l s a e n un v a s o d e p r e c i p i t a d o s d e c u a t r o It c o n t e n i e n d o e l a m o r t i g u a d o r s e l e c c i o n a d o p a r a l a d i á l i s i s . 9. C o l o c a r una b a r r a de a g i t a c i ó n m a g n é t i c a y l l e v a r a l c u a r
t o f r í o y m a n t e n e r en a g i t a c i ó n c o n s t a n t e .
10. H a c e r v a r i o s c a m b i o s d e s o l u c i ó n a m o r t i g u a d o r a .
11.
A l
t é r m i n o , e x t r a e r e l c o n t e n i d o d e l a b o l s a m e d i a n t e su p u n c i ó n con una j e r i n g a y a g u j a d e l número 2 0 .1 2 . C o l o c a r e l m a t e r i a l a n a l i z a d o e n un r e c i p i e n t e y f i l t r a r e n c o n d i c i o n e s d e e s t e r i l i d a d , con membrana m i l l i p o r e d e
0 . 2 2 m i c r a s .
B i b l i o g r a f í a . C o o p e r , G.T.
The t o o l s o f B i o c h e m i s t r y , p a g . 378.
A n e x o 111
P r o c e d i m i e n t o t r a c i ó n .
1 . S e l e c c i o n a r
y
l a v a r c o n2 . C o l o c a r e n
p a r a l a c o n c e n t r a c i ó n m o l e c u l a r p o r u l t r a f i l -
l a membrana
o
e l c a r t u c h o q u e s e v a a u t i l i z a r 500 m l d e a g u a d e s t i l a d a .e l v a s o d e l c o n c e n t r a d o r e l m a t e r i a l que v a
a
s e r c o n c e n t r a d o .
3 . A p l i c a r una p r e s i ó n d e 0.8 k g / c m 2 r e g u l a n d o
e l
f l u j o , d e l11
q u i d o con e l manómetro a d j u n t o .
4 . R e c o g e r e l m a t e r i a 1 , r e t e n i d o e n e l r e c i p i e n t e y f i l t r a r
5 . S e p a r a r a l f c u o t a s p a r a c u a n t i f i c a c i e n d e p r o t e í n a s y o t r a s c o n membrana m i l l i p o r e d e
0.22
m i c r a s .d e t e r m i n a c i o n e s b i o q u f m i c a s .
6 . S e p a r a r a l l c u o t a s p a r a
e l
c o n t r o l d e e s t e r i l i d a de
i n c u b a ra
37 g r a d o s c e n t í g r a d o s e n a m b i e n t e húmedo d u r a n t e 36 Hrs. 7 . H a c e r p r u e b a s d e a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e l m a t e r i a l c o n c e n t r ado.
8 . A l f i n a l i z a r l a c o n c e n t r a c i ó n , l a v a r l a membrana o e l c a r -
t u c h o con 1000 m l d e a g u a d e s t i l a d a .
9 . C o l o c a r en NaOH 1% y m a n t e n e r e n r e f r i g e r a c i ó n h a s t a n u e v a u t i l i z a c i ó n .
B i b l i o g r a f í a .
Manual d e p r o c e d i m i e n t o y m a n t e n i m i e n t o d e c a r t u c h o s s e p a r a - d o r e s p o r i n m e r s i ó n , M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n . U S A . 11175.
Manual de p r o c e d i m i e n t o s p a r a c o n c e n t r a d o r d e c a r t u c h o d e b r a hueca. Amicon C o r p o r a t i o n . USA
.
1985..."
Anexo VTP r o t o c a l o p a r a f i l t r a d o m o l e c u l a r m e d i a n t e S e p h a d e x 6-100 I
1. C a l c u l a r e l volumen v a c í o d e
l a
columna s e g ú n l a f ó r m u l a ;...
,l...
...,.
.
..,
....
V =
r 2 h2 . C a l c u l a r l o s gramos d e s e p h a d e x q u e s e n e c e s i t a n h i n c h a r de a c u e r d o a l a d e n s i d a d d e l mismo:
peso- ( d e n s i d a d ) ( v o l u m e n d e l a columna) 3. H i n c h a r e l s e p h a d e x usando como d i s o l v e n t e s o l u c i ó n s a l i
n a - b a r a t o s (SSB) con un pH= 8.2 y h a c e r c a m b i o s c o n s t a n
te6 de é s t e h a s t a e l i m i n a r l a s p a r t l c u l a s en s u s p e n s i ó n .
4. Empacar l a c o l u m n a , t e n i e n d o c u i d a d o de n o i n t r o d u c i r
-
b u r b u j a s en é s t a y p a s a r e l e q u i v a l e n t e a t r e s v e c e s e l volumen de l a columna, d e S S B a f i n d e e q u i l i b r a rl a
c o -lumna.
5 . D e t e r m i n a r
e l
volumen v a c x o usando a z u l d e x t r á n . 6. Correr p o r s e p a r a d ol o s
s i g u i e n t e s m a r c a d o r e s :A l c o h o l D e s h i d r o g e n a c a : 1 5 0 , O00 D
A l b ú m i n a S é r i c a B o v i n a : 6 6 , 0 0 0 D A n h i d r a s a C a r b Ó n i c a : 2 9 , O00 D C i t o c r o m o C : 1 2 , O00 D
6 , O00 D
In
s u 1 i n a7 . A p l i c a r l a muestra p r o b l e m a en l a columna y c o l e c t a r l a s f r a c c i o n e s en v o l ú m e n e s d e 3 m l ( a j u s t a r l a bomba p e r i c - t á l t i c a a 2 0 m l / h r . ) .
8. D e t e r m i n a r l a a b s o t b a n c i a de l a s f r a c c i o n e s a 2 8 0 nm.
B i b l i o g r a f í a .
S e p a r a c i ó n y C u a n t i f i c a c i ó n de p l a q u e t a s d e R a t ó n .
-..
I ..
...
L . .
. _
.
<.1 . C o l o c a r uq r a t ó n macho, de 8 a 12 semanas de e d a d , b a j o l a i l u m i n a c i ó n d e una l á m p a r a , d u r a n t e aproximadamente 10 m i - n u t o s . E v i t a r l l e v a r a l a n i m a l a l a p o s t r a c i ó n p o r c a l e n t a miento i n t e n s o o p r o l o n g a d o .
2 . C o l o c a r a l r a t ó n en un s o p o r t e con un e x t r e m o a b i e r t o p o r donde s e l e pueda d e t e n e r l a c o l a .
3 . C o r t a r l a punta d e l a c o l a con un b i s t u r í y e l i m i n a ; l a
-
p r i m e r a g o t a de s a n g r e .4 . U t i l i z a n d o una p i p e t a p a r a g l ó b u l o s b l a n c o s ( 1 : 2 0 ) y un t u b o de s u c c i ó n , l l e n e c u i d a d o s a m e n t e l a p i p e t a h a s t a l a mar c a 0 . 5 . Tan r á p i d o como s e a p o s i b l e p a r a i m p e d i r l a coagu- l a c i ó n de l a s a n g r e , o r d e ñ e l a c o l a p a r a o b t e n e r mayor can t i d a d de s a n g r e .
Si
l a s a n g r e p a s a l a marca d e 0 . 5 , l i m p i e l a punta con un p a p e l 1 a b s o r b e n t e y a j u s t e e l n i v e l de l a s a n g r e .5.Inmediaca-mente d e s p u é s c o l o q u e l a p i p e t a en una s o l u c i ó n a m o r t i g u a d o r a de c i t r a t o d e x t r o s a f o s f a t o l a m o r t i g u a d o r de s a l i n a f o s f a t o s , y l l e n e con e l f l u i d o h a s t a l l e g a r a l a marca de 1 1. ( d i l . 1 : 2 0 ) .
6 D e s a c o p l a r e l t u b o de s u c c i ó n y c o l o c a r l a p i p e t a en un a g i t a d o r de p i p e t a s C a v i t r o n , a g i t a r d u r a n t e 3 0 s e g u n d o s . 7 T r a n s f e r i r e l m e z c l a d o ( l a s a n g r e d i l u í d a ) a un r e c i p i e n t e
d e p l á s t i c o marcado a p r o p i a d a m e n t e .
8 . C o l o q u e l a p i p e t a en s o l u c i ó n d e t e r g e n t e p a r a s u l a v a d o p o s t e r i o r .
9 . A g i t a r p o r i n v e r s i ó n l a m u e s t r a d i l u í d a 1 : 2 0 y l l e n a r un t u b o c a p i l a r h a s t a l a marca de 1 0 0 m i c r o l i t r o s .
. .
.
.-
I_.
~,., ..
.-
"... I,-
., . I .
. .
. .
...,
". "
.
..c a.
11. R e t i r a r e l t u b o y l i m p i a r e l excesO de s i l i c ó n , con e l t u b o en una p o s i c i ó n h o r i z o n t a l , c o l o q u e e l dedo p u l g a r
s o
b r e e l e x t r e m o o p u e s t o a l de l a s a n g r e , a s e g u r á n d o s e de-
n o f o r m a r b u r b u j a s .1 2 . A c o p l a r p o r e l e x t r e m o , con s i l i c ó n , en una b a r r a d e p l a s t i l i n a p a r a s e l l a r l o .
13. C o l o a a r l o s t u b o s en una c e n t r í f u g a de m i c r o h e m a t o c r i t o y c e n t r i f u g a r d u r a n t e 45 segundos en l a v e l o c i d a d ú n i c a d e l a p a r a t o .
1 5 . R e t i r a r l o s t u b o s c a p i l a r e s de l a c e n t r í f u g a y con una 4
s i e r r a c o r t a r l a z o n a i n f e r i o r a l p l a s m a r i c o en p l a q u e t a s . 16.Romper e l t u b o y t r a n s f e r i r e l c o n t e n i d o a un v i a l d e p l á s
t i c o que c o n t e n g a 1 0 m l de PBS ( e l
P B S
d e b e r á s e r f i l t r a - do p r e v i a m e n t e p a r a e v i t a r e l p a s o de b u r b u j a s ) c u b r i r e l v i a l y a g i t a r d u r a n t e 1 0 s e g u n d o s en un a g i t a d o r v o r t e x p a r a r e s u s - p e n d e r e l b o t ó n p l a q u e t a r i o .1 7 . C a r g a r l a cámara c u e n t a - g l ó b u l o s y d e j a r en r e p o s o en atmÓs f e r a húmeda d u r a n t e 1 0 m i n u t o s .
1 8 . C o n t a r a l m i c r o s c o p i o con o b j e t i v o de
4 0 X ,
e l número de-
p l a q u e t a s p r e s e n t e s en l a zona c e n t r a l d e l a c u a d r í c u l a ( z o n a de g l ó b u l o s r o j o s ) .
B i b l i o g r a f í a .
Manual d e t é c n i c a s de l a b o r a t o r i o s d e l Dr. A l e x a n d e r N a k e f f .
Cancer B i o l o g y S e c t i o n .
S c h o o l
o f M e d i c i n e .Wáshington U n i v e r x i t y i n S t . L o u i s M i s s o u r i . USA.
Lynch, J . M . , R a p h a e l ,
S.S.,
M e l l o r , D . L . , S p a r e ,D.P.?
Inwood,
J.H.M.
1 9 7 2 2 a . E d i c i ó n . Métodos de L a b o r a t o r i o .I
.
* t
”.
CULTIVO DE MEDULA OCEA DE FLATON PARA LA OBTENCION
DEUNIDADES
FORMADORAS DE COLONIAS
DEMEGACARIOCITOS. CFU-M.
M a t e r i a l .
y
Equipo
::I-
C
,,.
.
,....
.
”.<._
,.
.. .”
, .,..
Soporte de madera de
25x25cm.
Tachuelas.
Mechero de Bunsen.
2
p i n z a s
estériles.
2
t i j e r a s
estériles-
B i s t u r í .
Paño
estéril.
Agujas
22x32‘‘
.
2
j e r i n g a s de 1
m l
y 5m l .
2
tubos de c e n t r f f u g a
(1 5
mi.).
P i p e t a s P a s t e u r s i l i c o n i z a d a s .
Hemocit6metro.
Cajas de P e t r i
(50
mm.
de diametro
Cajas de P e t r i
(95
mm.
de
diametro
P i p e t a s de
0 . 1ml.
P i p e t a s de
0.5m l .
P i p e t a s de 1.0
m l .
P i p e t a s de 5.0
m l .
P l a c a s de c u l t i v o - ~ m u l t i p a z o s
Soluciones
y
R e a c t i v o s
:Etanol; a l 96%
Medio A l f a -
2Medio de L e i t v o t i z
Suero de C a b a l l o
Medio Condicionado
E x t r a c t o de Embridn de Bovino
Agar N o b l e Difco a l
3%
Procedimiento
:1.-
Sacrificar por dislocación cervical un ratdn macho de
8
a
122.-
Bañar l a regidn del fémur con solxi& de etanol a l
96%.
3.-
Bajo l a llama del mechero
yutilizando pinzas
yt i j e r a s
---
semanas de edad.
e s t é r i l e s ; separar l a s extremidades inferiores del animal.
PROCEDIMIENTO EN CAMPANA DE FLUJO LAMINAR
.._
,..,
.
..
4 . -
Eliminar e l músculo que recubre a l fémur.
5.-
Limpiar e l fémur con un paño e s t e r i l
yhacer un corte trans-
6.-
Pasar una aguja e s t é r i l del n(unero 22x32" a través del canal
7.-
Inyectar a través del conducto medular
1.0m l
de medio
-
2 .
8.-
Recoger l a suspensión medular en un tubo
decentrífuga -Nal-
gene- de
15m l
esterilizado previamente.
9 . -
Dispersar l a s células mediante pipeteo cuidadoso con una
p i -peta Pasteur siliconizada.
10.-
Contar l a s células nucieadas t o t a l e s e n una cámara cuenta912
-
bulos
yajustar l a concnetración celular a
4 . 0x
1 0 6células
por m i l i l i t r o
ycolocarlas en
un
tubo de ensayo conteniendo-
los
siguentes materiales,
los
cuales deberán colocarse en e l
orden en e l que se enlistan:
versal en l a zona del cuello quirügico.
medular haciendo movimientos hacia adelante
yhacia atrás.
Componentes del Medio
de
Cultivo para
CFU-MVolumen
._
Medio teibovitz
(L-15)
1.2
m l
Suero
de
Caballo
0 . 6
m l
Extracto de anbri6n de Bovino
( d i 11 : 4
en
L-15)
0.3
m l
*Medio Condicionado
0 . 3
m l
Cuspenci6n celular
2 .Ox106
células/ m l
0 . 3m l
Agar Noble Difco
1%
-
3 1 0 C-
0 . 3
m l
11.-
Una vez depositado e l agar. Colocar
0 . 5m l
del medio con
las
células en
los
pozos
de
l a s placas
decultivo dispuestos en
e l
I.I
.
. ,..,.. . I . . . .
I. . ,. ..
,..-.
....
.,.
1
.-
" ,I
.
..I
moviendo la caja de petri en forma circular.
humedad relativa de 90 a
1 0 0 %y atm6sfera de C02 de 4 a 10%.
12.- Incubar los cultivos durante siete días a 37OC, con
COSECHA DE CULTIVOS CON UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS
DE
MEGACARIOCITOS.
13.-
Revisar los cultivos ai invertoscopio. Desechar los culti-
vos que presenten contaminacidn microbiana.
14.- Introducir por los bordes del cultivo-(gel)- una espátula
metálica de punta roma para separarlo de la placa de
cultivo.
15.- Colocar los coágulos en un portaobjetos y teñir los cul-
tivos mediante la técnica de Jackson et al.
BIBLIOGRAFIA
Metcalf,D.,
McDonald,H.R.,Odartchenco,N.
and Sordat, B.1975.
Growth of Mouse Megakaryocyte Colonies in Vitro
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In Vitro Colony Assay for a New Class of Megakaryocyte Pre-
cursor; Colony Unit Forming (CFU-M).
Proc.Soc.Exp.Biol.Med.
151, pp.587-590.
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PROTOCOLO
PARALA
ELECTROFORESIS
DE D I S C O CONGELES
DE
ALMIDON
-
ACRILAMIDA
.
I . - SOLUCIONES
Soluci6n
A
HC1
1N
48
ml
T r i s 36.6
gTemed 0 . 2 3 m l
Se disuelve
ajusta e l pH a 8 . 9
yse afora a 100
m l con agua( f i l t r a r en
caso de ser necesario
).
e l
t r i s
en
un
poso
de agua
y se agrega"e1 HC1, se
-
.-
Solución
BAcrilamida 2 8 g
(recristalizada
)B i s acrilamida 0 . 7 5
C
recristalizada
Soluci6n
CAlmidbn soluble
0 . 8g
Se disuelve e l almiddn
en
100 n l de agua; se calienta
y se deja
-
hervir durante
un
minuto.
Soluci6n
DPersulfato de anonio 0 . 1 4 g
Se disuelve
en
un
poco de agua
ydespués se afora a
100
ml
.
Este
reactivo debe prepararse antes de preparar
los
geles.
Solvente para l a nuestra
Se
disuelvan
4 g de sacarosa en
10
m l de solución de aztil de
-
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I.,
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Amortiguador para
Los
electrodos
T r i s
6 g
Glicina 2 8 . 8 g
.
Se
disuelven
ambos
reactivos
en
250
m l de agua y se ajusta e l
pH
a
8.3;se diluye a
11 con agua. Esta solución
se
encuentra
10 veces
más
concentrada por l o que deberá d i l u i r s e 1
:10
--
antes de usarse.
solución para t e ñ i r
Az6l de Coomassie
0 . 2 5g
Metano1
50
m l
Acido acético g l a c i a l
10
mi
...
Soiucibn para desteñir
piletano1
50ml
Acido acétibo
10
m l
Se
mezclan
y se afora l a colucibn a
100
m l con agua destilada.
11.
-
PROCEDIMIENTOCorrida de l a e l e c t r o f o r e s i s
1.-
52lavan
los
tubos
para
los
geles con
"O3
a l 5 0 %
o
con ne2
I-2.-
Se
enjuagan con agua destilada
por
5 veces.
3.-
Se
Mvan
los
tubos nuevamente con una soluci6n de
SDSa l
2 %y se dejan secar a 1 0 0 a C
(No
enjuagar
)c l a crdmica.
4.- En
un
matrdz Kitasato de
125
m l
mezclas l a s siguientes s o l u c l o
ne5
para
obtener
36
m l
de g e l de acrilamida
a l 7 % .CülWdi6n
A 6m l
So"&iiCibn
B 9m l
Sailfcibn
C6
m l
se
tapa
e l
matraz
y
se desgasifica
l a
mezcla
para
eliminar
e l
02.
5 . -
Desconectar e i
matraz1
del vacio
y
añadir
12
m l de
Solu-
cion
D i
mezclar bien, evitando que se llene de aire
la
-
soluci6n.
6.-
S e tapa
un
extremo del tubo con
p a r a f i l m
y se colocan,
I d
i
a
en
una
gradilla donde puedan quedar en poskcibn vertical.
A
continuación y
con una
pipeta Pasteur
con
punta
larga,
proceder
a
llenarlos
lentamente;
evitando que se
formen,
Burbujas, dejando
un
espacio de aproximadamente
un
centf
-
metro antes del
f i n a l
del tubo.
con
una
jeringa‘añadir
-
st,
de 4sta
manera
se obtendrá
una
superficie plana
a i
--
polimerizar e l gel.
agua lentamente sobre e l g e l evitando que se
mezclen
entre
d1
E
7 . -
Llenar
l a
cdmara inferior del equipo de electroforesis para
tubo con
e l
amortiguador para
los
electrodos dilufdo
1
:
10.
8.-
Colocar
los
tubos en
los
compartimientos de
l a
parte superior
I
6 .
de
l a
cdmara.
E l i m i n a r
e l
p a r a f i l m
de
l a
parte inferior de
-
los
tubos. Hay que humedecer
l a
superficie inferior con
e l
objeto de evitar
que
se
formen
burbujas a l introducirlos
en
e l
amortiguador de
l a
cdmara.
Con un
papel absorbente elimi
-
3
nar
e l agua de
l a
parte
superior
de
los
geles.
Pr:
I9.-
Llenar
l a
&rara
superior del equipo de electroforesis son
e l
amortiguador de corrida; cuidando’ de eliminar cualquier
i
Y
burbuja
que
hubiese quedado tanto
en l a parte
superior como
en
l a inferior
de
los
tubos.
10.-
Preparar
l a
muestra en
un
tubo Eppendorf. Se coloca
una
parte
de
la
muestra por dos
partes
del solvente
para
muestra
11.-
Con
una
jeringa añadir lentamente, por las paredes
y
sin
--
tocar
e l
gel,
l a
muestra evitando
que
e l
volumen sea
mayor
-
de 150
ul.
12.-
Conectar
adecuadamente las terminales eléctricas del
aparato
,.
13.- Prender l a fuente de poder, teniendo cuidado de que se encuen-
14.-
E l f i n a l de l a corrida será cuando
e l
frente d e l colorante haya
llegado a
un
centímetro d e l extremo’inferior d e l
tubo.
Apagar
-
tre en
cero. Para a l corrida se usan
5mAmp por
tubo. cI
..
t
l a fuente de poder.
i
.^ 9
BIBLIOGRAFIA
Manual de Prácticas d e l
Primer
Curso de Técnicas Básicas
,
Facultad de Qufrnica
,
Divisidn de Estudios de Posgrado.
Universidad Nacional Autdnoma de México.
.
,/
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* . ~ . .9
I. -. . X ...
,.. , "PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION DE UNIDADES FOIWADORAS DE COLO-
NIAS DE MEGACARIOCITOS -CFU-M- MEDIANTE
LA
REACCION HISTOQUIMI-
CA DE
ACETIL-TIOCOLIN-ESTERACA.Tincidn Colinesterasa
Material
yequipo:
Espátula de punta roma
portaobjetos
tiras de papel filtro
pipetas Pasteur
vasos de coplin
embudo
soporte universal con anillo
puente de tincion
cubreobjetos
Microscopio 6ptico
baño con agitacidn
reloj de intervalo
Soluciones y Reactivos
Agar-Difco al
3%Amortiguador de fosfatos 0.1
MpH
5 . 8 - 6 . 2Gluteraldehido
2 . 5 %amortiguador
.de fosfatos 0.1
14
Solucidn para coloración por ance
Metanol absoluto
Metanol
50%Hematoxilina de Erlich
Procedimiento
1.-
Las muestras de médula 6sea cultivadas para el desarrollo de
CFU-M son cosechadas con una espátula metálica de punta roma
y los codgulos son transferidos a
un
portaobjetos.
amortiguador de fosfatos de pH
5 . 8-
6 . 2 .dor de
fosfattw 0.1M sobre cada uno de los coágulos. Dejar
en reposo durante 10 minutos
a
temperatura ambiente.
4.-
Recirar el pagel Ziltro y pasar la laminilla a un vaso de
Cogiin
@on amortiguador de fosfatos O.lM, agitar durante
1 minuto.
2.-
Colocar sobre
los
codgulos un papel filtro humedecido con
5.-
Escurrir
l a l a m i n i l l a
y
p a s a r l a a un vaso de C o p l i n
con
l a
solución
d e c o l o r a c i 6 n , l a c u a l deberá e s t a r
en
un baño
detemperatura c o n s t a n t e a
37'C.D e j a r l a preparacidn
en e s t a
solución
60 minutos a
37OCo
3
horas a temperatura ambiente.
de f o s f a t o s 0.1M durante 1 minuto.
Escurrir y p e r m i t i r que
l a l a m i n i l l a
-
p r e p a r a c i ó n
-
seque a temperatura ambiente
2-3 horas-; a n t e s de p r o s e g u i r con e l siguiente paso d e l
procedimiento.
6.-
Escurrir
l a
l a m i n i l l a
y
e n j u a g a r con
solucidn
amortiguadora
7.-
Sumergir l a l a m i n i l l a en metano1 a b s o l u t o durante'10 minutos.
8.-
Pasar a una s o l u c i ó n de metano1 a l
5 0 %durante 30 segundos.
9.-
Escurrir
y
colocar
l a p r e p a r a c i ó n en s o l u c i ó n de Hematoxi-
l i n a de E r l i c h durante
5minutos. F i l t r a r l a s o l u c i d n d e
Hematoxilina a n t e s d e r e g r e s a r l a a l f r a s c o de almacenaje.
F o s f a t o a g i t a n d o l a s o l u c i d n durante
1
minuto.
r a n t e
2minutos.
10.-
Lavar l a p r e p a r a c i d n
por
inmersidn en s o l u c i d n C i t r a t o -
11.-Colocar
l a
p r e p a r a c i ó n b a j o e l
f l u j o
de agua
corriente
du-
12.-Escurrir y d e j a r s e c a r l a p r e p a r a c i ó n .
13.-Colocar un c u b r e o b j e t o s y
s e l l a r
con e s m a l t e de uñas i n c o l o r o
y
transparente.
p r e s e n t e s en
l a
preparación.
14.-Observar a l
microscopio
de l u z
y
c o n t a r
e l
número de CFU-M
COMPONENTES
DELA
SOLUCION TINTORIAL
DEACTILTIOCOLIN-ESTERASA
Yoduro de a c e t i l t i o c o l i n a
20.0 mg
Emortiguador de f o s f a t o s 0.1 M,pH
5.8-
6.2
30.0
m l
C i t r a t o
de s o d i o O.2M
2.0 m l
S u l f a t o de
cobre 0.03
M
4.0
m l
.< .
...
I.. .
.-"
-.
SOLUCION AMORTIGUADORA
CITRATO-FOSFATOPARA LAVADO
Citrato de sodio
1 . 0
M
Fosfato de sodio dibásico
0 . 5 MAgua bidestilada (aforar)
31.2 m l
161.0
m l
q.b.p. 3.5
It
B
IBLIOGRAFIA:
-.
.I
-
I.
1-.
o
Jackgon.C.W.1973.
Cholinesterase as a possible marker f o r e a r l y c e l l s o f the
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Long.W.M., and Williams.N.1981.
Relationship o f Small Acetychoiinesterase Positive C e l l s t o
Megakaryocytes and CLonable Meg&karycytic Progenitor C e l l s .
Megakaryocyte Biology and Precursors
:In V i t r o Cloning and
C e l l u l a r Properties. Eds. Evatt.
L.B.
,
Levine,F.R. and Williams
L
c
I
r-.
...
r-.
r-
i.
*-
L. ...
..
.-
L.
Nomhre d e l
Alumno.
h i s Felipe Schettino Y a e s
Teléfono.
688-8860
Csrera.
Biología. Biologfa Brperimental
Lugar
de RealiwciÓn.
hboratorio de
Biología Molecular d e l Depto. de
Ciencias
del a Salud.
D.C.B.S.
UAM-Ietapalapa.
tar.
Q.B.P. Rcdolfo Velasco
Lap;aaia.Profesor Asociado
"E"
de Tiempo
Completo. Depsrtamento de Ciancias de l a Salud.
Título d e l Proyecto.
FurifLcación y Caracterización de
un Factor Mega-
cariocitopoyético
a
partir
de
ia
orina de Pacien-
tes con &pura wombocitopénica Idiopática.
I
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I
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PURIFICACION Y CARACTERIZACION
DE
UN FACTOR MEGACARIDCITOPOYETICQA FARTIR
DE
LA ORINA DE PACIENTES CON. .
INDICE
CAPITULO 1
1ntr.oduccidn
CAPITULO 2
CAPITULO 3
CAPITULO 4
CAPITULO 5
CAPITULO 6
CAPITULO 7
CAPITULO 8
CAPITULO 9
CAPIT~LO 10
CAPITULO 1 1
CAPITULO 12
Antecedentes
Justif icacian
Hipotesis de Trabajo
Objetivo
Material y Metodos
Diseho Experimental
Resultados
Discus1
on
de ResultadosConclusiones
Resumen
Eibliografia
6
7
8
9
10
1 1
23
30
34
35
I
.
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.<
. .
.
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d ) I n c r a m e n t o e n el v r i ? u m e n p l a y u e t a r i o . I .
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PURIFICACION Y CAHACTERIZñCION
DE UN FACTOR MEGACAHIOCITOPOYETICO
A PFIRTIR DE LFI ORINA DE PACIENTES CON
PURPURA TROMBOCIYOPENICA IDIOPATICA
. ... .. .
..
.
ODJET I VU
PURIFICAR Y CARACTERIZAR PARCIALMENTE UN FACTOR
M~GACARIOFOYETICO EXISTENTE EN LA ORINA DE
I'IATEK'IFIIL Y
METODOS
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!-Afilara cL1t.nt.a rj: -ibU:o5 i-Iii:i-oscopia h p t i c a Z e i i c ,
ik-rti-if~iga c l i n i c a C a l
Bat
Irincitiadora con COZ INational H e i n t e k e Co.
Invertoscopio Zeiss
Campana de f l u j o laminar Veco
Bake con agit:iciibii F a - m s S c i e n t i f i c
~spectrofotametro Z e i ss PM
C A i r i a r a p a r a microfoiagraf i a Zeftss C-35
CaLector de fracciones
LKB
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