Los m e g a c a r i o b l a s t o s c o m i e n z a n a madurar c i t o o l a s m á t i c a m e n t e ,

r

. ..

JNOMBRE : T E L E F ON0 : M A T R I C U L A : C L A V E :

CARRERA :

/AREA DE CONCENTRACIQN: T R I M E S T R E L E C T I V O :

HORAS/ SEMANA

L U G A R E N DONDE S E

----

L L E V A R A A CABO :

F E C H A DE I N I C I O :

/FECHA DE TERMINACION : JTUTOR INTERNO: P U E S T O

Y A D C R I P C I O N :

F I R M A DEL ALUMNO

S R . L U I S F . S C H E T T I N 0

S C H E T T I N O Y A R E Z L U I S F E L I P E 6 8 8 - 8 8 - 6 0

.

8 2 3 4 0 3 8 1

2 3 .

l a - .

13.86

B I O L O G I A

.

i;

,¿,

c.

1

L

B I O L O G I A E X P E R I M E N T A L

-

\ 86

-

P

15

L A B O R A T O R I O DE B I O L O G I A MOLECULAR D E L D E P T O . DE C I E N C I A S DE L A S A L U D . 1 DE J U L I O DE 1986.

15 DE ENERO DE 1 9 8 7

2

RODOLFQ V E L A S C O L E Z A M A

.

P R O F E S O R A S O C I A D O " B " DE T E I M P O COMPLETO. P U R I F I C A C I O N Y C A R A C T E R I Z A C I O N DE UN F A C T O R M E G A C A R I O C I T O P O Y E T I C O A + -

P A R T I R DE L A O R I N A DE P A C I E N T E S CON P U R P U R A T R O M B O C I T O P E N I C A I D I O P A T I C A " .

F I R M A D E L T U ?

I N T R O D U C C I Q N .

Las p l a q u e t a s t i e n e n un p a p e l i m p o r t a n t e e n l a h e m o s t a s i s ,

man e l c o á g u l o h e m o s t á t i c o i n i c i a l Y aumentan l a f o r m a c i ó n de t r o m b o s

de f i h r i n a más o e r m a n e n t e s . Normalmente l a p a r e d v a s c u l a r s i r v e como

b a r r e r a e n t r e e l f l u j o s a n g u í n e o y e l e s p a c i o e x t r a v a s c u l a r ; c u a n d o

-

e s t a b a r r e r a e s d e s t r u i d a , l a s p l a q u e t a s s e a d h i e r e n a los componen- t e s d e l s n b e n d o t e l i o , n o s t e r i o r m e n t e o t r a s p l a q u e t a s s e u n i r á n a l a s

p r i m e r a s p a r a p r o d u c i r un a g r e g a d o y f i n a l m e n t e e s t a s c o n t r i b u i r á n

-

a l a c o a g u l a c i ó n p l a s m á t i c a m e d i a n t e l a l i b e r a c i ó n de s u s t a n c i a s p r o

c o a m u l a n t n s ( 1 ) .

-

E l o r i g e n de l a s p l a q u e t a s s e e n c u e n t r a e n l a l í n e a m e g a c a r i o -

c í t i c a , c u y a s c é l u l a s D r e s e n t a n un p a t r ó n d e p r o l i f e r a c i ó n y madura

c i Ó n Ú n i c o e n l a b i o l o g í a d e mamíferos; Los m e a a c a r i o c i t o s maduran h a s t a o r i g i n a r f r a a m e n t o s c i t o p l a s m á t i c o s que son Ins p r e c u r s o r e s

-

de p l a q u e t a s (2).

E x i s t e n e v i d e n c i a s e x p e r i m e n t a l e s y c l í n i c a s que s e ñ a l á n que

t o d a s l a s c é l u l a s s a n g u í n e a s se o r i a i n a n a u a r t i r de un p r e c u r s o r

-

p l u r i p o t e n c i a l , e l c u a l p o s e e c a v a c i d a d de a u t o r r e p l i c a c i ó n ; a l d i v i

ñ i r s e , e s t a c é l u l a p r o d u c e d o s c é l u l a s h i j a s ; una p l u r i p o t e n c i a l p a -

r a p e r p e t u a r l a e s p e c i e , y o t r a l l a m a d a en c o m i t é n c o m i s + o n a d a p a -

r a a r t u a r como n r e r u r - o r p r i m i t i v o d- l a - 1:neas e r i t r o c i t o s

:

g r a n u

l o c i t o s / m a c r Ó f a g o s . E s t a Ú l t i m a e t a p a , no h a s i d o d e m o s t r a d a ~ l e n a -

mente p a r a l a l í n e a m e g a c a r i o c í t i c a . S i n e m b a r g o , l a d i f e r e n c i a c i ó n

de e s t a l í n e a c e l u l a r i n i c i a en e l e s t a d o de m e a a c a r i o b l a s t o ( 4 n )

( 3 , 4 ) .

p a s a n d o a s e r m e a a c a r i o c i t o s b a s ó f i l o s a l t i e m p o nue q u s i s t e m a de

membranas s- d e E a r T o l ' a en g r a n a s c a l a

P o s t e r i o r m e n t e s e s i n t e t i z a n g r á n u l o s de p o l i s a c á r i d o s ae a l t a

d e n s i d a d e l e c t r ó n i c a , a l g u n o s de l o s c u a l e s c o n t i e n e n e n z i m a s l i s o s o

m a l e s . En e l s i g u i e n t e e s t a d o de m a d u r a c i ó n o de m e g a c a r i o c i t o g r a -

n u l a r , l o s a r á n u l o s c o n t i n ú a n aumentando en c a n t i d a d lo nue i n d i c a "ue l a s p r o t e í n a s e s p e c í f i c a s de l a s p l a q u e t a s s e s i g u e n s i n t e t i z a n

d o ; l a s c é l u l a s c r e c e n en volumen, e l c i t o p l a s m a s e h a l l a d i v i d i d o

p o r i n v a n i n a c i o n e s membrananles ( D M S , S i s t e m a de demarca2iÓn membra n a i ) .

A l f i n a l de e s t e e s t a d o de m a d u r a c i ó n , l o s m e q a c a r i o c i t o s d e s a

-

r r o l l a n p r o y e c c i o n e s r í g i d a s c a r g a d a s con m i c r o t Ú b u l o q . Aún n o e s

-

c l a r o e l mecanismo p o r e l c u a l s e l i b e r a n l o s f r a s m e n t o s c i t o D l a s m á

t i c o s D r e c u r s o r e s de p l a q u n t a s , qiie l l e g a n a l o s nulmones dnnde con

t r a n s f n r m a d o c . Aún f a l t a mucha i n f o r m a c i ó n a c e r c a d e l p r o c e s o de li-

b e r a c i ó n de e s t o s s e u d ó p o d o s o de m e q a c a r i o c i t o s a l t o r r e n t e c i r c u l a

t o r i o ( 5 . 6 ) .

-

A v a n c e s en e l e s t u d i o de f a c t o r e s h u m o r a l e s r e g u l a d o r e s de megaca-

r i OD o i e s i s.

Se han d i s e ñ a d o s i s t e m a s de c u l t i v o p a r a c é l u l a s de m6dula 6 -

s e a , -ue p e r m i t e s c o n o c e r l o s r r q n e r i m i e n t o s e s p e c í f i c o s de l a s d i -

f e r e n t e s l í n e a s c e l u l a r e s h e m a t o p o y é t i c a s . E n t r e e l l o s , e l m e d i o

-

c o n d i c i o n a d o de c é l u l a s m u r i n a s o humanas. e n cuyo s o b r e n a d a n t e s e

e n c u e n t r a n f a c t o r e s e s t i m u l a n t e s de l a h e m a t o p o i e s i s . Uno de e s t o s ,

e s e l 1 lamado f a c t o r e s t i m u l a n t e de c o l o n i a s de m e g a c a r i o c i t o s (CSF-Mea) que o r i g i n a e l d e s a r r o l l o de u n i d a d e s f o r m a d o r a s de c o l o n i a s de mega

c a r i o c i t o s a l s e r a d i c i o n a d o a l o s s i s t e m a s de c u l t i v o . E L número de e s t a s c o l o n i a s , s e e n c u e n t r a r e l a c i o n a d o a l a c a p a c i d a d e s t i m u l a n t e

d e l f a c t o r ( 7 , s ) .

I

También se ha e n c o n t r a d o que e n e l s i i e r n y I n o r i n a de p a c i e n -

t e s con anemia a p l á s t i c a y o t r o s d e s ó r d e n e s en l a p r o d u c c i ó n de p l a

q u e t a s , e x i s t e una a c t i v i d a d s e m e j a n t e a CSF-Meg (8,9,10). E s t a pue de s e r i n d e p e n d i e n t e de la t r o m b o p o i e t i n a . hormona a l a c u a l s e l e ha

a t r i b u i d o l a r e a u l a c i ó n de l a m a d u r a c i ó n n l a n u e t a r i a . A s í , l a l í n e a

c e l u l a r p u d i e r a e s t a r r e g u l a d a p o r v a r i o s f a c t o r e s ,

entre

e l l o s CSF-Mea

y t r o m b o p o i e t i n a ,

o

b i e n un qÓ1o f a c t o r de v a r i a s u n i d a d e s , e n e l

-

c u a l , l a t r o m b o p o i e t i n a y e l CSF-Meg f u e s e n a l g u n o s de los c o n s t i t u - ven t e s I 1 1 i

.

.-

A c t i v i d a d b i o l Ó g ' 7 c a .

La a c t i v i d a d e s t ; m u l a n t e d e l f a c t o r p r o d u c i d o i n

v i v o

o

e

v i t r o

p u e d e e s t u d i a r s e

en

s i s t e m a s :

-

In v i t r o , m e d i a n t e c u l t i v o s de médula ó s e a c o n t a n d o e l número

de u n i d a d e s f o r m a d o r a s de m e g a c a r i o c i t o s (UFC-Meg) d e s a r r o l l a d a s co-

mo r e s p u e s t a a s u p r e s e n c i a en e l s i s t e m a de c u l t i v o .

I n

v i v o ,

m e d i a n t e e l i n c r e m e n t o e n e l número de D l a a u e t a s c i r -

- -

c u l a n t e s en a n i m a l e s

a

l o s c i i a l e s s e l e s i n v e c t a e l m a t e r i a l de p r u e b a .

. :,

.... I

....

.-

.

..

,I_

..

....

A n t e c e d e n t e s d e l g r u p o de t r a b a j o .

V e l a s c o - L e z a m a , R. y N a k e f f , A. E s t a b l e c i e r o n l a s c o n d i c i o n e s r e q u e r i d a s p o r un c u l t i v o de c é l u l a s de b a z o de r a t ó n m a n t e n i d a s

en un medio l i b r e de s u e r o p a r a l a p r o d u c c i ó n de iin f a c t o r que e s t i

mula l a m e s a c a r i o p o i e s i s i n v i t r o . Como r e s u l t a d o de d i c h o t r a b a j o ,

s e conoce d e l f a c t o r l o s i g u i e n t e : Organo p r o d u c t o r i n v i t r o e n me-

d i o s l i b r e s de s u e r o , e s p e c i f i c i d a d e s t i m u l a n t e con r e s p e c t o a l a s

d i f e r e n t e s l í n e a s c e i u l a r e s h e m a t o D o i é t i C a S , p e s o m o l e c u l a r ( s u D e r i o r

a 6 0 , 0 0 0 d a l t o n s ) y s u m o v i l i d a d e l e c t r o f o r ~ t i c a ( l 3 \ .

E l medio de c u l t i v o en e l c u a l s e e n c u e n t r a e l f a c t o r e s t i m u l a n t e f u e a n a l i z a d o p o r c r o m a t o n r a f í a de l í q u i d o s a a l t a p r e s i ó n ( H P L C ) . E s t e método f u e i n c a p a z de p r e s e r v a r l a a c t i v i d a d b i o l ó s i c a d e l mate-

r i a l s o m e t i d o a d i n h o t r a t a m i e n t o , b i e n s e a e n su forma i n t e g r a l o e n

c a d a una de l a s f r a c c i o n e s o b t e n i d a s ; t a m b i é n m e d i a n t e HPLC se e n c o n -

t r á q u e un f a c t o r a n á l o g o p r o v e n i e n t e de l a o r i n a de un i n d i v i d u o con

p ú r p u r a t r o m b o c i t o p é n i c a i d e o p á t i c a , ~ r e s e n t a una s e ñ a l g r á f i c a seme-

j a n t e a l a dada p o r e l f a c t o r p r o d u c i d o i n v i t r o m a n i f e s t á n d o s e en

dos s u b u n i d a d e s ( g r á f i c a 1).

Justificación ~

En

forma paralela a l presente trabajo, se desarrollan en nuestro

laboratorio, l a caracterización de otros factores que influyen en l a megacariopoyesis

--

in vivo e -I_in vitro. Hasta e l momento, e l mejor dilu- cidado es e l obtenido en l o s medios de cultivo de bazo de ratón.

Nuestro interés principal e s e l saber si en l a orina de pacien- tes con enfermedades mieloprolifezativas o desórdenes en l a coagula- ción, existe un factor análogo a l estudiado; e l cual pudiera ser pu- rificado y administrado en un futuro lejano, a aquellos pacientes que no pudiesen producirlo o que l o produjesen con alteraciones en su a c t i vidad. Siendo necesario administrar Únicamente l a s fracciones respon- sables de l a actividad biológica, para evitar reacciones inmunológi- cas indeseables.

o b j e t i v o s .

P u r i f i c a r v c a r a c t e r i z a r un f a c t o r m e g a c a r i o o o i é t i c o e x i s t e n t e

I . e n l a , , o r i n a de p a c i e n t e s con P ú r p u r a T r o m b o c i t o p é n i c a I d e o p á t i c a .

M a t e r i a l Y métodos.

Mate r i a 1 b i o l ó g i c o :

R e c o l e c c i ó n de m u e s t r a s p r o b l e m a y c o n t r o l . L a s

p r o b l e m a p r o v e n d r á n de c i n c o m u j e r e s de 3 0 a 40 anos de e d a d con púr p u r a t r o m b o c i t o p é n i c a i d e o p á t i c a , oue n o hayan s i d o t r a t a d a s con

f á r

macos d e l t i p o de los e s t e r o i d e s ; e l g r u p o c o n t r o l s e r á n , c i n c o muie- i

.

r e s s a n a s e n t r e

los

3 0 y l o s 4 0 a ñ o s de e d a d . a l e j a d a s d e l p e r í o d o

-

m e n s t r u a l ambos g r u p o s ; l o s p a r á m e t r o s de n o r m a l i d a d se e s t a b l e c e r á n

p o r un examen g e n e r a l de o r i n a y una cruímica s a n g u í n e a .

P u r i f i c a c i ó n y c a r a c t e r i z a c i ó n d e l f a c t o r e s t i m u l a n t e de l a megaca-

r i o p o i e s i s .

1- C u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s t o t a l e s en l a o r i n a p o r e l método d e l

á c i d o s u l f o s a l i c í l i c o ( a n e x o 1).

2 - P u r i f i c a c i ó n de m u e s t r a s .

-

D i á l i s i s v s . agua d e s i o n i z a d a ( a n e x o 11).

- c o n c e n t r a c i ó n p o r f i i t r a c i ó n m o l e c u l a r ( a n e x o 111).

-

S e p a r a c i ó n p o n c r o m a t o q r a f í a e n Sephadex G-25 ( a n e x o 1 1 1 ) . 3- F r a c c i o n a m i e n t o y c a r a c t e r i z a c i ó n .

-

C r o m a t o n r a f í a en columna DEAE S e f a r o s a ( a n e x o iv).

-

C r o m a t o g r a f í a en columna CM S e f a r o s a ( C a r b o x i m e t i l ) ( a n e x o V).

-

C r o m a t o g r a f r a e n Sephadex G-100 ( a n e x o Vi).

4- D e t e r m i n a c i ó n de l a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a .

-

--

I n v i t r o ( a n e x o VII).

P o r c u l t i v o s de médula ó s e a c u a n t i f i c a n d n e l número de i r n i a a d e s

,

..

.,,

m o r e s p u e s t a

.a

l a a c t i v i d a d e s t i m u l a n t e de l a s m u e s t r a s ; a n t e s y d e s p u e s d e l f r a c c i o n a m i e n t o . P o s t e r i o r m e n t e s e d e t e r m i n a r á l a D O -

s i b l e r e l a c i ó n e x i s t e n t e e n t r e e l f a c t o r o f a c t o r e s o b t e n i d o s de

e s t a f u e n t e v e l o b t e n i d o d e l medio c o n d i c i o n a d o de b a z o de r a t ó n

c u v a c a r a c t e r i z a c i ó n s e d e s a r r o l l a r á en f o r m a p a r a l e l a a l p r e s e n t e

t n a b a i o.

-

- -

I n v i v o ( a n e x o V I I I ) .

I n y e c c i ó n d e l m a t e r i a l c r u d o a r a t o n e s , a s í como l a s f r a c c i o n e s

p r o t e í n i c a s d e 1 mismo, c u a n t i f i c a n d o e l número de p l a q u e t a s en s a n g r e

c i r c u l a n t e , a n t e s y d e s p u é s de l a a p l i c a c i ó n . A l l o t e c o n t r o l se l e

a n l i c a r á s o l u c i ó n s a l i n a f i s i o l ó g i c a .

5 - D e t e r m i n a c i ó n de a l g u n a s p r o p i e d a d e s f i s i c o a u í m i c a s .

A l a u n a s de l a s D r o D i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s t a l e s como e l D e s o mo-

B i b l i o g r a f í a .

1- B a r n h a r t , M . I .

p l a t e l e t r e s p o n s e s i n h e a l t h and d i s e a s e .

M o l e c u l a r & c e l l u l a r b i o c h e m i s t r y Vol. 2 2 Dec. 2 2 , 1978 The ñ a g u e , The N e t h e r l a n d s .

2 - P e n i n g t o n , D. G . T h r o m b o p o i e s i s

H a e m o s t a s i s & T h r o m b o s i s

Ed. A r t h u r

L.

Bloom, Duncan P . Thomas

c h u r c h i l l L i v i n s g s t o n e 1981

-

C h a p t e r 1. 3 - B . I . L o r d .

P r o l i f e r a t i o n r e g u l a t o r s i n h a e m o p o i e s i s .

C l i n i c s i n h a e m a t o l o g y . 8 (2); 4 3 5 - 4 5 1 . 1 9 7 9 .

4- Hoffman, R., M a z u r , E . , G e r w i t z , A.M., S t r a n e v a , J., B r u n o , E . , Berkow. it.

C e l l u l a r & Humoral r e g u l a t i o n of human m e g a c a r y o c y t o p o i e s i s . Normal and n e o p l a s t i c h e m a t o p o i e s i s , p p . 2 6 9 - 3 0 0

A l a n

R.

L i s s , I N C . , New Y o r k , N . Y . 1983

5 - T a v a s s o l i , M .

F u s i o n - f i s i o n r e o r g a n i z a t i o n o f membrane : a d e v e l o p i n g membrane model f o r t h r o m b o c y t o g e n e s i s i n m e g a k a r y o c y t e s .

B l o o d c e l l s 5 : 89-98. 1 9 7 9 a .

6 - T a v a s s o l i , M.

7- N a k e f f , A . , D a n i e l s - M c Q u e e n , S .

.

i n v i t r o c o l o n y a s s a y f o r a new c l a s s of m e g a k a r y o c y t e pre-

c u r s o r : c o l o n y - f o r m a t i o n - u n i t m e g a c a r y o c y t e .

P r o c . Soc. Exp. B i o l . Med. 151: 758. 1 9 7 6 .

8- M a z u r , E.M., H o f f m a n , R., B r y n o , E.$

R e g u l a t i o n of human m e g a k a r y o c y t o p o i e s i s : an

&

v i t r o a n a l y s i s .

J. C l i n . I n v e s t . 68. 6 8 ; 733. 1 9 8 1

9 - Enomoto, K., K a w a k i t a , M., K i s h i m o t o , S . , K a t a y a m a , N.,‘ M i y a k e , T.

T h r o m b o p o i e s i s a n d m e g a k a r y o c y t e c o l o n y s t i m u l a t i n g f a c t o r i n t h e

u r i n e of p a t i e n t s w i t h a p l a s t i c anaemia.

B r i t i s h J o u r n a l of H a e m a t o l o g y , 1 9 8 0 , 4 5 , 5 5 1-556.

B l a c k w e l l S c i e n t i f i c P u b l i c a t i o n s , 1980.

-

10- Dukes, P.,P.,f Gomperts, E., I s a d i , P .

M o d u l a t i o n of m e g a k a r y o c y t e c o l o n y f o r m a t i o n b y p r o t e i n f r a c t i o n s

from t h e u r i n e of n o r m a l a n d a n e m i c i n d i v i d u a l s .

M e g a k a r y o c y t e B i o l o g y a n d P r e c u x j s o r s : i n v i t r o c l o n i n g and c e l l u l a r

p r o p e r t i e s .

P u b l . E l s e v i e r N o r t h H o l l a n d , I n c . 1981.

E v a t t , L e v i n e a n d W i l l i a m s , e d i t o r s .

11- S h r e i n e r , D.P., W e i n b e r g , J., Enoch, A .

-

P l a s m a t k r o m b o p o i e t i c a c t i v i t y i n humans w i t h n o r m a l a n d ab-

n o r m a l p l a t e l t c o u n t s .

B l o o d , V o l . 5 6 , No. 2 ( a u g u s t

Grune & S t r a t t o n I n c . 1980.

12- Hoffman, R., Mazur, E., B r u n o

,

1980.

E., F l o y d , V.

A s s a y o f an a c t i v i t y i n t h e serum of p a t i e n t s w i t h d i s o r d e r s of

t h r o m b o p o i e s i s t h a t s t i m u l a t e s f o x m a t i o n o f m e g a k a r y o c y t e c o l o n i e s .

The N e W E n g l a n d J o u r n a l of M e d i c i n e . (sep. 1 9 8 1 ) . V o l . 305 No. 1 0

L “

1 3 - N a k e f f , A . V e l a s c o - L e z a m a , R.,

R e g u l a t i o n of m e g a k a r y o c y t i c p r o l i f e r a t i o n .

Blood Cuppl. 118 N O V . 1981.

...

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I..

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...

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1

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G r á f i c a 1.

O r i n a de P a c i e n t e s c o n PGrpura T.rombocitopénica I d e o p á -

M E D I O C O N D I C I O N A D O D E BAZO 1 X EN d- M O P S .

M R r l T O <-MOPS.

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.

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. .

CUANTIFICACION

DE

PROTEINAS

EN

ORINA

METODO DEL

ACID0 SULFOSALICPLICO

CURVA

TIPO :

Preparar una solución patrón de albGmina sérica bovina

de 1 mg/ml

y preparar l a siguiente s e r i e de tubos.

mg

de proteína/

1 0 0

ml

de orina

1 0 20

30

40

50

6 0

70

80

9 0

1 0 0

~ o i n . p a t r 6 n de

proteína(

ml

0.1

0.2

0.3

0 . 4

0.5 0.6

0 . 7 0 . 8 0 . 9

1 . 0

agua destilada(m1)

Ac.SulfOSaliCfliC0

( m i

1

5 . 0 a todos l o s tubos

Dejar rposar

los tubos

a

temperaura ambiente durante

5 minutos

para permitir l a reacci6n

y

l e e r a Densidad Optica de

420

nm.

Dar

e l siguiente tratamiento para

los tubos blanco

y

problema

Cuadro

1

Problema

Blanco

I

Blanco

I1

1.0

m l

---.

Orfna

(

di1

1:20 )

1 . 0

ml

Soluci6n de NaCl 0 . 8 5 %

- - 3

5 . 0

m l

1 . 0 m l

Soluci6n de Ac. Sulfo-

s a l i c í l i c o

3%

5.0

m l

---

5 . 0

m l

Todas l a s determinaciones se hacen por duplicado. Contrir una

g r á f i c a con

l o s valores obtenidos e interpolar

e l

valor de

D.O.

d e l problema para determinar l a concentracidn protéica d e l

---

mismo.

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I

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I.

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21.

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j

..,

j

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Reportar l a

concentration

de proteína por 1 0 0 m l de orfna.

B i b l i o g r a f í a

:

Lynch,

J.,

Raphael,S,S., Mellor,L,D., Spare,P,D., e Inwood,

M,J,H.

Métodos de Laboratorio. Segunda Edicibn. Ed.Interamerkca

-

A n e x o I1

P r e p a r a c i ó n de membranas d e d i á l i s i s .

1. C o r t a r un t r o z o de membrana d e d i á l i s i s y c o l o c a r l a e n un v a s o d e p r e c i p i t a d o s d e 4 It c o n t e n i e n d o s o l u c i ó n de EDTA 0 . 5

M .

2 . Hervir d u r a n t s r e i n t a m i n u t o s .

3. D e c a n t a r l a s o l u c i ó n y r e p e t i r e s t e p r o c e d i m i e n t o o c h o v e c e s más e m p l e a n d o a g u a d e s t i l a d a e n s u t i t u c i ó n d e l EDTA.

4 . Después d e e s t e t r a t a m i e n t o e l t u b o d e b e r á m a n e j a r s e con g u a n t e s d e s e c h a b l e s o m a t e r i a l l i b r e d e n u c l e a s a s y p r o t e - a s a s y nunca c o n l a s manos d e s c u b i e r t a s .

5.Con un t r o z o d e h i l o , c e r r a r uno d e l o s e x t r e m o s d e l a b o l - s a d e d i á l i s i s .

6 . A d i c i o n a r agua y p r e s i o n a r h a c i a a b a j o l a b o l s a c o n t r a e l e x t r e m o s e l l a d o u t i l i z a n d o

l o s

d e d o s m e d i o s con e l p r o p ó -

- s i t o de d e t e c t a r p i c a d u r a s e n l a b o l s a .

7 . De n o e x i s t i r f u g a s , l l e n a r 1 a . b o l s a c o n e l m a t e r i a l pa-

r a s e r d i a l i z a d o y c e r r a r e l o t r o e x t r e m o con h i l o .

8. C o l o c a r l a b o l s a e n un v a s o d e p r e c i p i t a d o s d e c u a t r o It c o n t e n i e n d o e l a m o r t i g u a d o r s e l e c c i o n a d o p a r a l a d i á l i s i s . 9. C o l o c a r una b a r r a de a g i t a c i ó n m a g n é t i c a y l l e v a r a l c u a r

t o f r í o y m a n t e n e r en a g i t a c i ó n c o n s t a n t e .

10. H a c e r v a r i o s c a m b i o s d e s o l u c i ó n a m o r t i g u a d o r a .

11.

A l

t é r m i n o , e x t r a e r e l c o n t e n i d o d e l a b o l s a m e d i a n t e su p u n c i ó n con una j e r i n g a y a g u j a d e l número 2 0 .

1 2 . C o l o c a r e l m a t e r i a l a n a l i z a d o e n un r e c i p i e n t e y f i l t r a r e n c o n d i c i o n e s d e e s t e r i l i d a d , con membrana m i l l i p o r e d e

0 . 2 2 m i c r a s .

B i b l i o g r a f í a . C o o p e r , G.T.

The t o o l s o f B i o c h e m i s t r y , p a g . 378.

A n e x o 111

P r o c e d i m i e n t o t r a c i ó n .

1 . S e l e c c i o n a r

y

l a v a r c o n

2 . C o l o c a r e n

p a r a l a c o n c e n t r a c i ó n m o l e c u l a r p o r u l t r a f i l -

l a membrana

o

e l c a r t u c h o q u e s e v a a u t i l i z a r 500 m l d e a g u a d e s t i l a d a .

e l v a s o d e l c o n c e n t r a d o r e l m a t e r i a l que v a

a

s e r c o n c e n t r a d o .

3 . A p l i c a r una p r e s i ó n d e 0.8 k g / c m 2 r e g u l a n d o

e l

f l u j o , d e l

11

q u i d o con e l manómetro a d j u n t o .

4 . R e c o g e r e l m a t e r i a 1 , r e t e n i d o e n e l r e c i p i e n t e y f i l t r a r

5 . S e p a r a r a l f c u o t a s p a r a c u a n t i f i c a c i e n d e p r o t e í n a s y o t r a s c o n membrana m i l l i p o r e d e

0.22

m i c r a s .

d e t e r m i n a c i o n e s b i o q u f m i c a s .

6 . S e p a r a r a l l c u o t a s p a r a

e l

c o n t r o l d e e s t e r i l i d a d

e

i n c u b a r

a

37 g r a d o s c e n t í g r a d o s e n a m b i e n t e húmedo d u r a n t e 36 Hrs. 7 . H a c e r p r u e b a s d e a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e l m a t e r i a l c o n c e n t r a

do.

8 . A l f i n a l i z a r l a c o n c e n t r a c i ó n , l a v a r l a membrana o e l c a r -

t u c h o con 1000 m l d e a g u a d e s t i l a d a .

9 . C o l o c a r en NaOH 1% y m a n t e n e r e n r e f r i g e r a c i ó n h a s t a n u e v a u t i l i z a c i ó n .

B i b l i o g r a f í a .

Manual d e p r o c e d i m i e n t o y m a n t e n i m i e n t o d e c a r t u c h o s s e p a r a - d o r e s p o r i n m e r s i ó n , M i l l i p o r e C o r p o r a t i o n . U S A . 11175.

Manual de p r o c e d i m i e n t o s p a r a c o n c e n t r a d o r d e c a r t u c h o d e b r a hueca. Amicon C o r p o r a t i o n . USA

.

1985.

.."

Anexo VT

P r o t o c a l o p a r a f i l t r a d o m o l e c u l a r m e d i a n t e S e p h a d e x 6-100 I

1. C a l c u l a r e l volumen v a c í o d e

l a

columna s e g ú n l a f ó r m u l a ;

...

,l...

...,.

.

..

,

....

V =

r 2 h

2 . C a l c u l a r l o s gramos d e s e p h a d e x q u e s e n e c e s i t a n h i n c h a r de a c u e r d o a l a d e n s i d a d d e l mismo:

peso- ( d e n s i d a d ) ( v o l u m e n d e l a columna) 3. H i n c h a r e l s e p h a d e x usando como d i s o l v e n t e s o l u c i ó n s a l i

n a - b a r a t o s (SSB) con un pH= 8.2 y h a c e r c a m b i o s c o n s t a n

te6 de é s t e h a s t a e l i m i n a r l a s p a r t l c u l a s en s u s p e n s i ó n .

4. Empacar l a c o l u m n a , t e n i e n d o c u i d a d o de n o i n t r o d u c i r

-

b u r b u j a s en é s t a y p a s a r e l e q u i v a l e n t e a t r e s v e c e s e l volumen de l a columna, d e S S B a f i n d e e q u i l i b r a r

l a

c o -

lumna.

5 . D e t e r m i n a r

e l

volumen v a c x o usando a z u l d e x t r á n . 6. Correr p o r s e p a r a d o

l o s

s i g u i e n t e s m a r c a d o r e s :

A l c o h o l D e s h i d r o g e n a c a : 1 5 0 , O00 D

A l b ú m i n a S é r i c a B o v i n a : 6 6 , 0 0 0 D A n h i d r a s a C a r b Ó n i c a : 2 9 , O00 D C i t o c r o m o C : 1 2 , O00 D

6 , O00 D

In

s u 1 i n a

7 . A p l i c a r l a muestra p r o b l e m a en l a columna y c o l e c t a r l a s f r a c c i o n e s en v o l ú m e n e s d e 3 m l ( a j u s t a r l a bomba p e r i c - t á l t i c a a 2 0 m l / h r . ) .

8. D e t e r m i n a r l a a b s o t b a n c i a de l a s f r a c c i o n e s a 2 8 0 nm.

B i b l i o g r a f í a .

S e p a r a c i ó n y C u a n t i f i c a c i ó n de p l a q u e t a s d e R a t ó n .

-..

I ..

...

L . .

. _

.

<.

1 . C o l o c a r uq r a t ó n macho, de 8 a 12 semanas de e d a d , b a j o l a i l u m i n a c i ó n d e una l á m p a r a , d u r a n t e aproximadamente 10 m i - n u t o s . E v i t a r l l e v a r a l a n i m a l a l a p o s t r a c i ó n p o r c a l e n t a miento i n t e n s o o p r o l o n g a d o .

2 . C o l o c a r a l r a t ó n en un s o p o r t e con un e x t r e m o a b i e r t o p o r donde s e l e pueda d e t e n e r l a c o l a .

3 . C o r t a r l a punta d e l a c o l a con un b i s t u r í y e l i m i n a ; l a

-

p r i m e r a g o t a de s a n g r e .

4 . U t i l i z a n d o una p i p e t a p a r a g l ó b u l o s b l a n c o s ( 1 : 2 0 ) y un t u b o de s u c c i ó n , l l e n e c u i d a d o s a m e n t e l a p i p e t a h a s t a l a mar c a 0 . 5 . Tan r á p i d o como s e a p o s i b l e p a r a i m p e d i r l a coagu- l a c i ó n de l a s a n g r e , o r d e ñ e l a c o l a p a r a o b t e n e r mayor can t i d a d de s a n g r e .

Si

l a s a n g r e p a s a l a marca d e 0 . 5 , l i m p i e l a punta con un p a p e l 1 a b s o r b e n t e y a j u s t e e l n i v e l de l a s a n g r e .

5.Inmediaca-mente d e s p u é s c o l o q u e l a p i p e t a en una s o l u c i ó n a m o r t i g u a d o r a de c i t r a t o d e x t r o s a f o s f a t o l a m o r t i g u a d o r de s a l i n a f o s f a t o s , y l l e n e con e l f l u i d o h a s t a l l e g a r a l a marca de 1 1. ( d i l . 1 : 2 0 ) .

6 D e s a c o p l a r e l t u b o de s u c c i ó n y c o l o c a r l a p i p e t a en un a g i t a d o r de p i p e t a s C a v i t r o n , a g i t a r d u r a n t e 3 0 s e g u n d o s . 7 T r a n s f e r i r e l m e z c l a d o ( l a s a n g r e d i l u í d a ) a un r e c i p i e n t e

d e p l á s t i c o marcado a p r o p i a d a m e n t e .

8 . C o l o q u e l a p i p e t a en s o l u c i ó n d e t e r g e n t e p a r a s u l a v a d o p o s t e r i o r .

9 . A g i t a r p o r i n v e r s i ó n l a m u e s t r a d i l u í d a 1 : 2 0 y l l e n a r un t u b o c a p i l a r h a s t a l a marca de 1 0 0 m i c r o l i t r o s .

. .

.

.-

I_

.

~,

., ..

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"... I,

-

., . I .

. .

. .

...,

"

. "

.

..

c a.

11. R e t i r a r e l t u b o y l i m p i a r e l excesO de s i l i c ó n , con e l t u b o en una p o s i c i ó n h o r i z o n t a l , c o l o q u e e l dedo p u l g a r

s o

b r e e l e x t r e m o o p u e s t o a l de l a s a n g r e , a s e g u r á n d o s e de

-

n o f o r m a r b u r b u j a s .

1 2 . A c o p l a r p o r e l e x t r e m o , con s i l i c ó n , en una b a r r a d e p l a s t i l i n a p a r a s e l l a r l o .

13. C o l o a a r l o s t u b o s en una c e n t r í f u g a de m i c r o h e m a t o c r i t o y c e n t r i f u g a r d u r a n t e 45 segundos en l a v e l o c i d a d ú n i c a d e l a p a r a t o .

1 5 . R e t i r a r l o s t u b o s c a p i l a r e s de l a c e n t r í f u g a y con una 4

s i e r r a c o r t a r l a z o n a i n f e r i o r a l p l a s m a r i c o en p l a q u e t a s . 16.Romper e l t u b o y t r a n s f e r i r e l c o n t e n i d o a un v i a l d e p l á s

t i c o que c o n t e n g a 1 0 m l de PBS ( e l

P B S

d e b e r á s e r f i l t r a - do p r e v i a m e n t e p a r a e v i t a r e l p a s o de b u r b u j a s ) c u b r i r e l v i a l y a g i t a r d u r a n t e 1 0 s e g u n d o s en un a g i t a d o r v o r t e x p a r a r e s u s - p e n d e r e l b o t ó n p l a q u e t a r i o .

1 7 . C a r g a r l a cámara c u e n t a - g l ó b u l o s y d e j a r en r e p o s o en atmÓs f e r a húmeda d u r a n t e 1 0 m i n u t o s .

1 8 . C o n t a r a l m i c r o s c o p i o con o b j e t i v o de

4 0 X ,

e l número de

-

p l a q u e t a s p r e s e n t e s en l a zona c e n t r a l d e l a c u a d r í c u l a ( z o n a de g l ó b u l o s r o j o s ) .

B i b l i o g r a f í a .

Manual d e t é c n i c a s de l a b o r a t o r i o s d e l Dr. A l e x a n d e r N a k e f f .

Cancer B i o l o g y S e c t i o n .

S c h o o l

o f M e d i c i n e .

Wáshington U n i v e r x i t y i n S t . L o u i s M i s s o u r i . USA.

Lynch, J . M . , R a p h a e l ,

S.S.,

M e l l o r , D . L . , S p a r e ,

D.P.?

Inwood,

J.H.M.

1 9 7 2 2 a . E d i c i ó n . Métodos de L a b o r a t o r i o .

I

.

* t

”.

CULTIVO DE MEDULA OCEA DE FLATON PARA LA OBTENCION

DE

UNIDADES

FORMADORAS DE COLONIAS

DE

MEGACARIOCITOS. CFU-M.

M a t e r i a l .

y

Equipo

::

I-

C

,,.

.

,..

..

.

”.<

._

,.

.. .”

, .,..

Soporte de madera de

25x25

cm.

Tachuelas.

Mechero de Bunsen.

2

p i n z a s

estériles.

2

t i j e r a s

estériles-

B i s t u r í .

Paño

estéril.

Agujas

22x32‘‘

.

2

j e r i n g a s de 1

m l

y 5

m l .

2

tubos de c e n t r f f u g a

(

1 5

mi.).

P i p e t a s P a s t e u r s i l i c o n i z a d a s .

Hemocit6metro.

Cajas de P e t r i

(

50

mm.

de diametro

Cajas de P e t r i

(

95

mm.

de

diametro

P i p e t a s de

0 . 1

ml.

P i p e t a s de

0.5

m l .

P i p e t a s de 1.0

m l .

P i p e t a s de 5.0

m l .

P l a c a s de c u l t i v o - ~ m u l t i p a z o s

Soluciones

y

R e a c t i v o s

:

Etanol; a l 96%

Medio A l f a -

2

Medio de L e i t v o t i z

Suero de C a b a l l o

Medio Condicionado

E x t r a c t o de Embridn de Bovino

Agar N o b l e Difco a l

3%

Procedimiento

:

1.-

Sacrificar por dislocación cervical un ratdn macho de

8

a

12

2.-

Bañar l a regidn del fémur con solxi& de etanol a l

96%.

3.-

Bajo l a llama del mechero

y

utilizando pinzas

y

t i j e r a s

---

semanas de edad.

e s t é r i l e s ; separar l a s extremidades inferiores del animal.

PROCEDIMIENTO EN CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

.._

,..,

.

..

4 . -

Eliminar e l músculo que recubre a l fémur.

5.-

Limpiar e l fémur con un paño e s t e r i l

y

hacer un corte trans-

6.-

Pasar una aguja e s t é r i l del n(unero 22x32" a través del canal

7.-

Inyectar a través del conducto medular

1.0

m l

de medio

-

2 .

8.-

Recoger l a suspensión medular en un tubo

de

centrífuga -Nal-

gene- de

15

m l

esterilizado previamente.

9 . -

Dispersar l a s células mediante pipeteo cuidadoso con una

p i -

peta Pasteur siliconizada.

10.-

Contar l a s células nucieadas t o t a l e s e n una cámara cuenta912

-

bulos

y

ajustar l a concnetración celular a

4 . 0

x

1 0 6

células

por m i l i l i t r o

y

colocarlas en

un

tubo de ensayo conteniendo-

los

siguentes materiales,

los

cuales deberán colocarse en e l

orden en e l que se enlistan:

versal en l a zona del cuello quirügico.

medular haciendo movimientos hacia adelante

y

hacia atrás.

Componentes del Medio

de

Cultivo para

CFU-M

Volumen

._

Medio teibovitz

(L-15)

1.2

m l

Suero

de

Caballo

0 . 6

m l

Extracto de anbri6n de Bovino

( d i 1

1 : 4

en

L-15)

0.3

m l

*Medio Condicionado

0 . 3

m l

Cuspenci6n celular

2 .

Ox106

células/ m l

0 . 3

m l

Agar Noble Difco

1%

-

3 1 0 C

-

0 . 3

m l

11.-

Una vez depositado e l agar. Colocar

0 . 5

m l

del medio con

las

células en

los

pozos

de

l a s placas

de

cultivo dispuestos en

e l

I.I

.

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I. . ,. ..

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1

.-

" ,

I

.

..

I

moviendo la caja de petri en forma circular.

humedad relativa de 90 a

1 0 0 %

y atm6sfera de C02 de 4 a 10%.

12.- Incubar los cultivos durante siete días a 37OC, con

COSECHA DE CULTIVOS CON UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS

DE

MEGACARIOCITOS.

13.-

Revisar los cultivos ai invertoscopio. Desechar los culti-

vos que presenten contaminacidn microbiana.

14.- Introducir por los bordes del cultivo-(gel)- una espátula

metálica de punta roma para separarlo de la placa de

cultivo.

15.- Colocar los coágulos en un portaobjetos y teñir los cul-

tivos mediante la técnica de Jackson et al.

BIBLIOGRAFIA

Metcalf,D.,

McDonald,H.R.,Odartchenco,N.

and Sordat, B.1975.

Growth of Mouse Megakaryocyte Colonies in Vitro

Proc.Nat.Acad.Sci.USA.Vo1.

72, No.5, pp.1744-1748.

Nakeff,N.A. and Daniels-McQueen,S. 1976.

In Vitro Colony Assay for a New Class of Megakaryocyte Pre-

cursor; Colony Unit Forming (CFU-M).

Proc.Soc.Exp.Biol.Med.

151, pp.587-590.

....

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PROTOCOLO

PARA

LA

ELECTROFORESIS

DE D I S C O CON

GELES

DE

ALMIDON

-

ACRILAMIDA

.

I . - SOLUCIONES

Soluci6n

A

HC1

1N

48

ml

T r i s 36.6

g

Temed 0 . 2 3 m l

Se disuelve

ajusta e l pH a 8 . 9

y

se afora a 100

m l con agua( f i l t r a r en

caso de ser necesario

)

.

e l

t r i s

en

un

poso

de agua

y se agrega"e1 HC1, se

-

.-

Solución

B

Acrilamida 2 8 g

(

recristalizada

)

B i s acrilamida 0 . 7 5

C

recristalizada

Soluci6n

C

Almidbn soluble

0 . 8

g

Se disuelve e l almiddn

en

100 n l de agua; se calienta

y se deja

-

hervir durante

un

minuto.

Soluci6n

D

Persulfato de anonio 0 . 1 4 g

Se disuelve

en

un

poco de agua

y

después se afora a

100

ml

.

Este

reactivo debe prepararse antes de preparar

los

geles.

Solvente para l a nuestra

Se

disuelvan

4 g de sacarosa en

10

m l de solución de aztil de

-

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Amortiguador para

Los

electrodos

T r i s

6 g

Glicina 2 8 . 8 g

.

Se

disuelven

ambos

reactivos

en

250

m l de agua y se ajusta e l

pH

a

8.3;

se diluye a

11 con agua. Esta solución

se

encuentra

10 veces

más

concentrada por l o que deberá d i l u i r s e 1

:

10

--

antes de usarse.

solución para t e ñ i r

Az6l de Coomassie

0 . 2 5

g

Metano1

50

m l

Acido acético g l a c i a l

10

mi

...

Soiucibn para desteñir

piletano1

50

ml

Acido acétibo

10

m l

Se

mezclan

y se afora l a colucibn a

100

m l con agua destilada.

11.

-

PROCEDIMIENTO

Corrida de l a e l e c t r o f o r e s i s

1.-

52

lavan

los

tubos

para

los

geles con

"O3

a l 5 0 %

o

con ne2

I

-2.-

Se

enjuagan con agua destilada

por

5 veces.

3.-

Se

Mvan

los

tubos nuevamente con una soluci6n de

SDS

a l

2 %

y se dejan secar a 1 0 0 a C

(

No

enjuagar

)

c l a crdmica.

4.- En

un

matrdz Kitasato de

125

m l

mezclas l a s siguientes s o l u c l o

ne5

para

obtener

36

m l

de g e l de acrilamida

a l 7 % .

CülWdi6n

A 6

m l

So"&iiCibn

B 9

m l

Sailfcibn

C

6

m l

se

tapa

e l

matraz

_y

se desgasifica

l a

mezcla

para

eliminar

e l

02.

5 . -

Desconectar e i

matraz1

del vacio

y

añadir

12

m l de

Solu-

cion

D i

mezclar bien, evitando que se llene de aire

la

-

soluci6n.

6.-

S e tapa

un

extremo del tubo con

p a r a f i l m

y se colocan,

I d

i

a

en

una

gradilla donde puedan quedar en poskcibn vertical.

A

continuación y

con una

pipeta Pasteur

con

punta

larga,

proceder

a

llenarlos

lentamente;

evitando que se

formen,

Burbujas, dejando

un

espacio de aproximadamente

un

centf

-

metro antes del

f i n a l

del tubo.

con

una

jeringa‘añadir

-

st,

de 4sta

manera

se obtendrá

una

superficie plana

a i

--

polimerizar e l gel.

agua lentamente sobre e l g e l evitando que se

mezclen

entre

_d

1

E

7 . -

Llenar

l a

cdmara inferior del equipo de electroforesis para

tubo con

e l

amortiguador para

los

electrodos dilufdo

1

:

10.

8.-

Colocar

los

tubos en

los

compartimientos de

l a

parte superior

I

6 .

de

l a

cdmara.

E l i m i n a r

e l

p a r a f i l m

de

l a

parte inferior de

-

los

tubos. Hay que humedecer

l a

superficie inferior con

e l

objeto de evitar

que

se

formen

burbujas a l introducirlos

en

e l

amortiguador de

l a

cdmara.

Con un

papel absorbente elimi

-

3

nar

e l agua de

l a

parte

superior

de

los

geles.

P

r:

_I

9.-

Llenar

l a

&rara

superior del equipo de electroforesis son

e l

amortiguador de corrida; cuidando’ de eliminar cualquier

i

Y

burbuja

que

hubiese quedado tanto

en l a parte

superior como

en

l a inferior

de

los

tubos.

10.-

Preparar

l a

muestra en

un

tubo Eppendorf. Se coloca

una

parte

de

la

muestra por dos

partes

del solvente

para

muestra

11.-

Con

una

jeringa añadir lentamente, por las paredes

y

sin

--

tocar

e l

gel,

l a

muestra evitando

que

e l

volumen sea

mayor

-

de 150

ul.

12.-

Conectar

adecuadamente las terminales eléctricas del

aparato

,.

13.- Prender l a fuente de poder, teniendo cuidado de que se encuen-

14.-

E l f i n a l de l a corrida será cuando

e l

frente d e l colorante haya

llegado a

un

centímetro d e l extremo’inferior d e l

tubo.

Apagar

-

tre en

cero. Para a l corrida se usan

5

mAmp por

_tubo. c

I

..

t

l a fuente de poder.

i

.^ 9

BIBLIOGRAFIA

Manual de Prácticas d e l

Primer

Curso de Técnicas Básicas

,

Facultad de Qufrnica

,

Divisidn de Estudios de Posgrado.

Universidad Nacional Autdnoma de México.

.

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PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION DE UNIDADES FOIWADORAS DE COLO-

NIAS DE MEGACARIOCITOS -CFU-M- MEDIANTE

LA

REACCION HISTOQUIMI-

CA DE

ACETIL-TIOCOLIN-ESTERACA.

Tincidn Colinesterasa

Material

y

equipo:

Espátula de punta roma

portaobjetos

tiras de papel filtro

pipetas Pasteur

vasos de coplin

embudo

soporte universal con anillo

puente de tincion

cubreobjetos

Microscopio 6ptico

baño con agitacidn

reloj de intervalo

Soluciones y Reactivos

Agar-Difco al

3%

Amortiguador de fosfatos 0.1

M

pH

5 . 8 - 6 . 2

Gluteraldehido

2 . 5 %

amortiguador

.

de fosfatos 0.1

14

Solucidn para coloración por ance

Metanol absoluto

Metanol

50%

Hematoxilina de Erlich

Procedimiento

1.-

Las muestras de médula 6sea cultivadas para el desarrollo de

CFU-M son cosechadas con una espátula metálica de punta roma

y los codgulos son transferidos a

un

portaobjetos.

amortiguador de fosfatos de pH

5 . 8

-

6 . 2 .

dor de

fosfattw 0.1M sobre cada uno de los coágulos. Dejar

en reposo durante 10 minutos

a

temperatura ambiente.

4.-

Recirar el pagel Ziltro y pasar la laminilla a un vaso de

Cogiin

@on amortiguador de fosfatos O.lM, agitar durante

1 minuto.

2.-

Colocar sobre

los

codgulos un papel filtro humedecido con

5.-

Escurrir

l a l a m i n i l l a

y

p a s a r l a a un vaso de C o p l i n

con

l a

solución

d e c o l o r a c i 6 n , l a c u a l deberá e s t a r

en

un baño

de

temperatura c o n s t a n t e a

37'C.

D e j a r l a preparacidn

en e s t a

solución

60 minutos a

37OC

o

3

horas a temperatura ambiente.

de f o s f a t o s 0.1M durante 1 minuto.

Escurrir y p e r m i t i r que

l a l a m i n i l l a

-

p r e p a r a c i ó n

-

seque a temperatura ambiente

2-3 horas-; a n t e s de p r o s e g u i r con e l siguiente paso d e l

procedimiento.

6.-

Escurrir

l a

l a m i n i l l a

y

e n j u a g a r con

solucidn

amortiguadora

7.-

Sumergir l a l a m i n i l l a en metano1 a b s o l u t o durante'10 minutos.

8.-

Pasar a una s o l u c i ó n de metano1 a l

5 0 %

durante 30 segundos.

9.-

Escurrir

y

colocar

l a p r e p a r a c i ó n en s o l u c i ó n de Hematoxi-

l i n a de E r l i c h durante

5

minutos. F i l t r a r l a s o l u c i d n d e

Hematoxilina a n t e s d e r e g r e s a r l a a l f r a s c o de almacenaje.

F o s f a t o a g i t a n d o l a s o l u c i d n durante

1

minuto.

r a n t e

2

minutos.

10.-

Lavar l a p r e p a r a c i d n

por

inmersidn en s o l u c i d n C i t r a t o -

11.-Colocar

l a

p r e p a r a c i ó n b a j o e l

f l u j o

de agua

corriente

du-

12.-Escurrir y d e j a r s e c a r l a p r e p a r a c i ó n .

13.-Colocar un c u b r e o b j e t o s y

s e l l a r

con e s m a l t e de uñas i n c o l o r o

y

transparente.

p r e s e n t e s en

l a

preparación.

14.-Observar a l

microscopio

de l u z

y

c o n t a r

e l

número de CFU-M

COMPONENTES

DE

LA

SOLUCION TINTORIAL

DE

ACTILTIOCOLIN-ESTERASA

Yoduro de a c e t i l t i o c o l i n a

20.0 mg

Emortiguador de f o s f a t o s 0.1 M,pH

5.8

-

6.2

30.0

m l

C i t r a t o

de s o d i o O.2M

2.0 m l

S u l f a t o de

cobre 0.03

M

4.0

m l

.< .

...

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-.

SOLUCION AMORTIGUADORA

CITRATO-FOSFATO

PARA LAVADO

Citrato de sodio

1 . 0

M

Fosfato de sodio dibásico

0 . 5 M

Agua bidestilada (aforar)

31.2 m l

161.0

m l

q.b.p. 3.5

It

B

IBLIOGRAFIA:

-.

.I

-

I.

1-.

o

Jackgon.C.W.1973.

Cholinesterase as a possible marker f o r e a r l y c e l l s o f the

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Blood. 42:413-421.

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Relationship o f Small Acetychoiinesterase Positive C e l l s t o

Megakaryocytes and CLonable Meg&karycytic Progenitor C e l l s .

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C e l l u l a r Properties. Eds. Evatt.

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Levine,F.R. and Williams

L

c

I

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...

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r-

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*-

L. ...

..

.-

L.

Nomhre d e l

Alumno.

h i s Felipe Schettino Y a e s

Teléfono.

688-8860

Csrera.

Biología. Biologfa Brperimental

Lugar

de RealiwciÓn.

hboratorio de

Biología Molecular d e l Depto. de

Ciencias

de

l a Salud.

D.C.B.S.

UAM-

Ietapalapa.

tar.

Q.B.P. Rcdolfo Velasco

Lap;aaia.

Profesor Asociado

"E"

de Tiempo

Completo. Depsrtamento de Ciancias de l a Salud.

Título d e l Proyecto.

FurifLcación y Caracterización de

un Factor Mega-

cariocitopoyético

a

partir

de

ia

orina de Pacien-

tes con &pura wombocitopénica Idiopática.

I

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I

I

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PURIFICACION Y CARACTERIZACION

DE

UN FACTOR MEGACARIDCITOPOYETICQ

A FARTIR

DE

LA ORINA DE PACIENTES CON

. .

INDICE

CAPITULO 1

1ntr.oduccidn

CAPITULO 2

CAPITULO 3

CAPITULO 4

CAPITULO 5

CAPITULO 6

CAPITULO 7

CAPITULO 8

CAPITULO 9

CAPIT~LO 10

CAPITULO 1 1

CAPITULO 12

Antecedentes

Justif icacian

Hipotesis de Trabajo

Objetivo

Material y Metodos

Diseho Experimental

Resultados

Discus1

on

de Resultados

Conclusiones

Resumen

Eibliografia

6

7

8

9

10

1 1

23

30

34

35

I

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PURIFICACION Y CAHACTERIZñCION

DE UN FACTOR MEGACAHIOCITOPOYETICO

A PFIRTIR DE LFI ORINA DE PACIENTES CON

PURPURA TROMBOCIYOPENICA IDIOPATICA

. ... .. .

..

.

ODJET I VU

PURIFICAR Y CARACTERIZAR PARCIALMENTE UN FACTOR

M~GACARIOFOYETICO EXISTENTE EN LA ORINA DE

I'IATEK'IFIIL Y

METODOS

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!-Afilara cL1t.nt.a rj: -ibU:o5 i-Iii:i-oscopia h p t i c a Z e i i c ,

ik-rti-if~iga c l i n i c a C a l

Bat

Irincitiadora con COZ INational H e i n t e k e _Co.

Invertoscopio Zeiss

Campana de f l u j o laminar Veco

Bake con agit:iciibii F a - m s S c i e n t i f i c

~spectrofotametro Z e i ss PM

C A i r i a r a p a r a microfoiagraf i a Zeftss C-35

CaLector de fracciones

LKB

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ISEN0

EXPER

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