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D E T E R M I N A C I Ó N D E L A S P O B L A C I O N E S M I C R O B I O L Ó G I C A S E N E L P R O C E S O D E
E X T R A C C I Ó N D E J U G O D E C A Ñ A D E A Z Ú C A R E N E L I N G E N I O M A N U E L I T A S . A .
LAURA SERRANO GALVIS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
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D E T E R M I N A C I Ó N D E L A S P O B L A C I O N E S M I C R O B I O L Ó G I C A S E N E L P R O C E S O D E
E X T R A C C I Ó N D E J U G O D E C A Ñ A D E A Z Ú C A R E N E L I N G E N I O M A N U E L I T A S . A .
LAURA SERRANO GALVIS
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N 13 de Julio de 1946 “ La Universidad no se hace responsable por los conceptos
emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica
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LAURA SERRANO GALVIS
APROBADO
___________________________ __________________________
María Luisa Guzmán; Microbióloga Ana Karina Carrascal, Docente CENICAÑA Universidad Javeriana
Director Asesor
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LAURA SERRANO GALVIS
APROBADO
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“Si le han dicho como a mí, siempre hay alguien más pequeño y más grande que usted, entonces haga lo que yo: abrace al más pequeño y déjese abrazar por el mayor.”
7
AGRADECIMIENTOS
Al Ingenio Manuelita S.A., especialmente al Ingeniero Jaime H. Cardona, por o el apoyo y el respaldo brindado para desarrollar mi trabajo de grado, y por la oportunidad de ser parte de la empresa.
Al Centro de investigación de la caña de azúcar de Colombia, CENICAÑA, especialmente a María Luisa Guzmán, por la dirección en el desarrollo y culminación del proyecto, y a Alberto Palma por la asesoría y el respaldo para el análisis estadístico. A Ana Karina Carrascal, docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por la asesoría en la realización del proyecto.
Al personal del laboratorio central del Ingenio Manuelita S.A. por la amistad y la confianza, porque creyeron siempre en mí y en el éxito del proyecto.
A mis padres y mis hermanos, que a pesar de la distancia estuvieron siempre conmigo, porque fueron mi apoyo y mi fortaleza.
A Víctor Manuel, por entenderme, apoyarme y por confiar en mí.
A mi familia caleña, por acogerme y apoyarme.
A todos los que aportaron de una u otra forma a la realización de este proyecto,
8
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN 1
1. INTRODUCCIÓN 5
2. MARCO TEÓRICO 8
2.1. Generalidades del proceso de producción de azúcar 8
2.1.1. Procesamiento de la caña en fábrica 8
2.1.2. Microorganismos en el proceso 10
2.2. Pérdidas de sacarosa 10
2.2.1. Características físico-químicas de los jugos 11
2.2.1.1. Pureza 11
2.2.1.1.1. Pol 11
2.2.1.1.2. Grados Brix 11
2.2.1.2. Azúcares Reductores 12
2.2.2. Pérdidas indeterminadas 12
2.2.3. Contaminación microbiológica 14
2.2.4. Determinación de pérdidas por contaminación
microbiológica y sus implicaciones 16
2.2.5. Polisacáridos bacterianos 17
2.2.5.1. Dextranos 18
2.2.5.2. Levanos 19
2.3. Control de la actividad microbiológica 20
2.3.1. Agentes biocida 21
2.3.1.1. Busan 881® 22
2.3.1.2. Lipesa 106C® 23
2.3.1.3. Nalco 5581® 23
2.3.2. Beneficios en los subproductos 23
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 25
4. OBJETIVOS 26
4.1. General 26
4.2. Específicos 26
5. MATERIALES Y MÉTODOS 28
5.1. Lugar de muestreo 28
5.2. Población de estudio y muestra 28
5.2.1. Análisis directo de caña (DAC) 30
9
Pág.
5.2.3. Jugo de 4° molino 30
5.2.4. Jugo de 2° molino 30
5.2.5. Jugo del colador 31
5.2.6. Jugo diluido 31
5.3. Unidad de muestreo 32
5.4. Muestreo 32
5.5. Variables del estudio 32
5.6. Variables respuesta y unidades de medida 33
5.7. Variables independientes a tener en cuenta 33
5.8. Métodos 35
5.8.1. Recuento de microorganismos 35
5.8.1.1. Mesófilos 35
5.8.1.2. Bacterias ácido-lácticas productoras de
exopolisacáridos (BALPE) 35
5.8.1.3. Mohos y levaduras 36
5.8.1.4. Bacterias aerobias termófilas esporuladas 36 5.8.2. Aislamiento y clasificación de microorganismos 36
5.8.3. Análisis físico-químico 37
5.8.3.1. pH 37
5.8.3.2. Temperatura (°C) 37
5.8.3.3. % de Pureza 37
5.8.3.3.1. Determinación de grados brix 37
5.8.3.3.2. Análisis de POL (Sacarosa aparente) 37 5.8.3.4. Determinación de azúcares reductores: Método de
Eynon y Lane 38
5.8.3.5. Concentración de dextranos: Método de Roberts 38
5.8.4. Evaluación de los bactericidas 39
5.9. Recolección de la información 40
5.10.Análisis de la información 40
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 42
6.1. Población de microorganismos 42
6.2. Análisis físico-químico 42
6.2.1. Temperatura y pH 42
6.3. Variables de respuesta 44
6.3.1. Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos en la muestra de DAC
44
6.3.1.1. Influencia de las características de la caña sobre las
poblaciones microbiológicas en la muestra de DAC 45 6.3.1.2. Influencia de las características de la caña sobre los
10
Pág. 6.3.2. Poblaciones microbiológicas y su correlación con las
características físico-químicas en los puntos de muestreo 53 6.3.2.1. Cuantificación de las poblaciones de mesófilos, BALPE,
levaduras, mohos y termófilas aerobias 53 6.3.2.2. Dextranos, % de azúcares reductores, ºBrix, POL,
%Sacarosa y Pureza 59
6.3.3. Clasificación de los microorganismos 60
6.3.3.1. Mesófilos 60
6.3.3.2. Bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos (BALPE)
63
6.3.3.3. Levaduras y mohos 65
6.3.3.4. Bacterias termófilas aerobias 68
6.4.Evaluación de desinfectantes 69
6.4.1. Busan 881® 70
6.4.2. Lipesa 106C ® 72
6.4.3. Nalco 5581® 74
6.4.4. Hipoclorito de calcio 76
7. CONCLUSIONES 79
8. RECOMENDACIONES 81
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 82
11
ÍNDICE DE TABLAS
Pág. Tabla 1. Características de la caña que entró a la fábrica durante el estudio 34 Tabla 2. Bactericidas evaluados, sus concentraciones y los tiempos de
contacto 39
Tabla 3. Promedios de temperatura y pH en cada punto de muestreo 43 Tabla 4. Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones
microbiológicas y los parámetros físico-químicos en la muestra de DAC.
Análisis estadístico (SAS) (10% de significancia). n = 40 46 Tabla 5. Test de Tukey. Comparación de los valores medios de poblaciones
microbiológicas y características físico-químicas de la muestra de DAC, por
tipo de caña y tipo de cosecha, y sus diferencias. n = 40 47 Tabla 6. Correlaciones entre las poblaciones microbiológicas y las
características físico-químicas de los jugos en cada punto de muestreo. 55 Tabla 7. Evaluación de Busan 881®. Promedio de los porcentajes de
inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y
tiempos de contacto. n = 3 70
Tabla 8. Evaluación de Busan 881®. Promedio de los parámetros
físico-químicos. 71
Tabla 9. Evaluación de Lipesa 106C®. Promedios de los porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y
tiempos de contacto. n = 3 73
Tabla 10. Evaluación de Lipesa 106C®. Promedio de los parámetros
físico-químicos. 73
Tabla 11. Evaluación de Nalco 5581®. Promedio de los porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y
tiempos de contacto. n = 3 75
Tabla 2. Evaluación de Nalco 5581®. Promedio de los parámetros
12
Pág. Tabla 13. Evaluación del hipoclorito de calcio. Porcentajes de inhibición de
las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de
contacto. 77
13
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Estructura del dextrano 18
Figura 2. Estructura del levano 19
Figura 3. Puntos de muestreo: muestra 1, muestra directa de caña (DAC) 28 Figura 4. Puntos de muestreo en el proceso de extracción: muestra 2, jugo
de 1era extracción; muestra 3, 2º molino; muestra 4, 4º molino; muestra 5,
jugo del colador; muestra 6, jugo diluido 29
Figura 5. Diferencias entra las poblaciones microbiológicas de acuerdo al
tipo de caña 48
Figura 6. Tendencias de las poblaciones microbiológicas de acuerdo al incremento de los tiempos de permanencia de la caña en campo en caña
larga (cosecha manual) 49
Figura 7. Influencia del % de materia extraña sobre las poblaciones de
microorganismos en caña larga (cosecha manual) 50
Figura 8. Influencia del tipo de caña y el tiempo de permanencia sobre la
concentración de dextranos en caña cosechada manualmente 52 Figura 9. Promedio de las poblaciones microbiológicas por punto de
muestreo. n = 40 54
Figura 10. Promedio del % de azúcares reductores, y de la concentración
de dextranos por punto de muestreo. n = 40 57
Figura 11. Promedio de los parámetros físico-químicos por punto de
muestreo. n = 40 60
Figura 12. Clasificación por tinción de Gram de la población de mesófilos
por punto de muestreo 61
Figura 13. Morfología y coloración de las colonias de mesófilos. Vista al
microscopio (100X) 62
Figura 14. Clasificación de la población de BALPE en cada punto de
14
Pág. Figura 15. Colonias de BALPE en agar MRS hipersacarosa 64
Figura 16. Colonias de BALPE en agar MRS hipersacarosa 65 Figura 17. Colonias de levaduras y mohos en agar YGC 66 Figura 18. Colonias de mohos al estereoscopio 20X en agar YGC 67 Figura 19. Visión microscópica de mohos (1000X). Coloración con azul
de lacto-fenol 68
Figura 20. Clasificación de la población de bacterias termófilas aerobias
15
ÍNDICE DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1: Formato de evaluación 89
Anexo 2: Promedio de las poblaciones microbiológicas y los parámetros
físico-químicos en cada punto de muestreo 90
Anexo 3: Descripción de las colonias aisladas 91 Anexo 4: Ensayo adicional de la efectividad de los agentes biocida a
concentraciones máximas permitidas 95
Anexo 5: Medios de cultivo 96
16 RESUMEN
17
18 ABSTRACT
19
20
1. INTRODUCCIÓN
La industria azucarera colombiana es una de las principales agroindustrias del país; el sector está conformado por 13 ingenios ubicados en el valle geográfico del río Cauca con aproximadamente 200.000ha cultivadas, que se extienden desde el norte del departamento del Cauca, pasando por el Valle del Cauca hasta el sur del departamento de Risaralda, territorio donde se producen alrededor de 20.4 millones de toneladas de azúcar anuales. Para este importante sector de la economía, el crecimiento en la producción ha cobrado protagonismo en los últimos años, tanto por el cumplimiento de la demanda del mercado, como por la importancia biotecnológica que han adquirido los subproductos del proceso, para lo cual se adelantan proyectos de investigación y desarrollo en un mejoramiento continuo y optimización de los rendimientos en la producción.
El mantenimiento de niveles altos de sacarosa depende de múltiples factores, algunos relacionados con la planta en el campo como son: el clima, el suelo, disponibilidad de agua y nutrimentos, la variedad sembrada, prácticas agronómicas, presencia de enfermedades y plagas, además de otros factores relacionados con los sistemas de recuperación de la sacarosa en fábrica; de acuerdo a la eficiencia de éstos se obtendrá un mejor rendimiento en la producción de azúcar.
21
El seguimiento del contenido de sacarosa desde la caña en pie hasta los procesos fabriles es de gran importancia para los ingenios, razón por la cual, controlar y disminuir las pérdidas de sacarosa ha sido tema de muchas investigaciones en el mundo azucarero.
Numerosos estudios, realizados en Colombia y el mundo, relacionan gran parte de las pérdidas indeterminadas y formación de productos metabólicos no deseados a la actividad de la microflora presente en la caña, favorecida por condiciones de operación como el corte y quema de la caña, condiciones de temperatura y humedad, tiempos prolongados entre corte y molienda; sin embargo, el proceso de extracción del jugo representa un punto importante de contaminación, pues a nivel de molinos, las pérdidas de azúcar corresponden: un 13% a inversión química por efectos de pH y temperatura de los jugos de caña; un 25% a efecto enzimático, por la procedencia biológica de la materia prima que sintetiza y metaboliza la sacarosa, y un 62% a inversión microbiológica, pues se presentan las condiciones favorables para el crecimiento de los microorganismos, tanto por la presencia de nutrientes y factores ambientales como por la falta de asepsia generalizada en los molinos de caña.
Tal como se entregan a los molinos, los tallos de la caña de azúcar presentan una gran cantidad de microorganismos (bacterias, levaduras, mohos) provenientes del suelo, aguas de lavado de caña, condiciones de cosecha, tiempo de permanencia de la caña después de la cosecha y condiciones de operación, agua de extracción y por el aire; la mayoría quedan en el jugo extraído, donde, si la temperatura es adecuada para el crecimiento, el desarrollo microbiano se presenta inmediatamente, disminuyendo así la pureza de los jugos en cuanto a sacarosa y produciendo cantidades apreciables de gomas y sus subproductos metabólicos y, por ende, pérdidas para la industria.
22
23
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades del proceso de producción de azúcar
La savia de la caña de azúcar (Saccharum officinarum, S. spontaneum, S. sinense, etc.) y de la remolacha (Beta vulgaris) contiene alrededor de 17% de sacarosa, un carbohidrato disacárido de fórmula general C12H22O11, compuesto de los
monosacáridos D-glucosa y D-fructosa que se condensan en grupos glucosídicos, formado por un proceso fotosintético de asimilación. Mediante el proceso de extracción realizado en Ingenios azucareros, se obtiene el jugo de caña o remolacha, que es purificado por medios físicos y químicos, evaporando luego el agua y separando los cristales de azúcar para obtener finalmente el azúcar comercial refinado, que contiene alrededor de 99.99% de sacarosa (Honig, 1969).
2.1.1 Procesamiento de la caña en fábrica
La caña que llega a la fábrica se descarga sobre las mesas de alimentación al conductor de caña, y luego es sometida a un proceso de preparación que consiste en romper o desfibrar las celdas de los tallos por medio de picadoras y desfibradoras; posteriormente, unas bandas transportadoras la conducen al tándem de molinos, donde se realiza el proceso de extracción de la sacarosa, consistente en exprimir y lavar el colchón de bagazo. El lavado de este colchón se hace con el jugo extraído en el molino siguiente y el lavado en el último molino se hace con agua caliente, que facilita la desinfección y la extracción de la sacarosa en el bagazo. El bagazo del último molino es usado como combustible en las calderas para generar vapor o como materia prima en la elaboración de papel.
24
crudo o jugo puro, puesto que proviene únicamente de la molienda de la caña, sin agua o algún componente adicional. Puede considerarse como la corriente que aporta mayor cantidad de sacarosa al jugo diluido y portador de la carga microbiana que ingresa a la fábrica procedente de la materia prima de los molinos. Una vez sale el bagazo del 1er molino es conducido al 2º molino, el cual realiza una segunda extracción; luego pasa al 3er molino, de éste al 4º y así sucesivamente hasta el 6to molino, donde finalmente el bagazo es llevado a las calderas. En dirección inversa, es decir, del 6to molino al 2º, se aplica agua de maceración a altas temperaturas para extraer la cantidad máxima de sacarosa posible del bagazo y el jugo así obtenido pasa el 5to molino ayudando también al proceso de extracción en los molinos posteriores.
El jugo de 1era extracción y el de los molinos posteriores se reúne en el colador donde se retira parte del bagacillo. Finalmente el jugo es conducido por tuberías hacia los tanques báscula que descargan en el tanque de jugo mezclado donde se
alcaliniza para regular su acidez y evitar la destrucción de la sacarosa; luego pasa a clarificadores continuos a altas temperaturas, donde se sedimentan las impurezas y el jugo claro que sobrenada es extraído por la parte superior. Las impurezas sedimentadas pasan a los filtros rotatorios al vacío que dejan pasar el jugo y retienen la cachaza que es utilizada como abono. El jugo clarificado pasa a los evaporadores, en donde se le extrae el 80% del contenido de agua hasta obtener el jarabe.
25 2.1.2. Microorganismos en el proceso
Las condiciones favorables para el desarrollo de los microorganismos en las fábricas están limitadas a un área particular: el ciclo de extracción, puesto que las altas temperaturas y el bajo contenido de agua, característicos de la mayor parte del proceso de fabricación, se consideran como las principales condiciones adversas para una actividad microbiológica excesiva. La extracción comprende una operación de molienda en la que se obtiene el jugo mixto de la caña o jugo crudo, cuyas características físicas y químicas lo convierten en un excelente sustrato para el desarrollo de una gran variedad de microorganismos (Cerutti de Guglielmone et al., 2000; Honig, 1969).
Las etapas de operación posteriores a la extracción consisten en cierta forma de tratamiento químico a alta temperatura (clarificación), seguido de sedimentación y filtración, la concentración de jugo clarificado y la cristalización del producto comercial. El número de microorganismos presente en cualquier punto desde el clarificador hasta el azúcar bruto, es relativamente bajo en comparación con el jugo de caña crudo (Antier, 1996; Hoing, 1969).
2.2 Pérdidas de sacarosa
26
2.2.1 Características físico-químicas de los jugos
Las poblaciones microbiológicas que degradan la sacarosa y los azúcares reductores presentes en el jugo determinan las características físico/químicas de los mismos e influyen en el desarrollo posterior del proceso de extracción; por esta razón, los subproductos metabólicos son tomados como indicadores indirectos de las pérdidas de sacarosa en el proceso, aunque las pérdidas reales son mayores que las que se pueden calcular con base en estos indicadores debido a que están influenciados por factores ajenos a la actividad microbiana. (Duarte et al., 1982; Hernández, 1978).
2.2.1.1 Pureza
La relación de la lectura del polarímetro (Pol) con los ºbrix permite determinar la pureza de una solución en términos de sacarosa.
2.2.1.1.1 Pol
Los azúcares diluidos gozan de la propiedad de desviar el plano de vibración de la luz polarizada. Esta propiedad se utiliza en la industria azucarera para determinar la riqueza de los jugos de caña mediante un aparato óptico llamado polarímetro, de donde se deriva la expresión de POL; este aparato envía un rayo de luz polarizada a través de una solución de sacarosa y mide la rotación de la luz después de pasar por el líquido. Con el valor de rotación resultante se estima el % de sacarosa en el jugo mediante fórmulas y tablas establecidas (Engelke, 2002).
2.2.1.1.2. Grados Brix
Los ºbrix determinan la concentración de sólidos disueltos en una solución de sacarosa, basándose en una relación entre los índices refractivos a 20ºC y el % de masa total de sólidos solubles de una solución acuosa de sacarosa pura (Laboratory Manual for South African sugar factories, 1985).
27 2.2.1.2Azúcares reductores
La sacarosa puede ser invertida por efecto enzimático o físico-químico en sus azúcares reductores, glucosa y fructosa. Su poder reductor se debe al grupo carbonilo que queda libre en su molécula. Este carácter reductor puede ponerse de manifiesto mediante diversos métodos, entre los cuales el más utilizado en los Ingenios Azucareros es el método de Eynon y Lane, en que se produce una reacción redox entre los azúcares reductores y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul y tras la reacción con el azúcar reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la reacción y que, por lo tanto, el azúcar reductor está presente (Laboratory Manual for South African sugar factories, 1985).
Los azúcares reductores son el producto intermedio de la descomposición de la sacarosa y son el índice más empleado para la detección de pérdidas en jugos; sin embargo, estos azúcares son utilizados por la gran variedad de microorganismos encontrados en los jugos como fuente de carbono para desarrollarse y generar otros productos metabólicos como etanol, ácidos orgánicos y CO2. Por esta razón, algunos
autores sugieren la cuantificación de otros productos finales del metabolismo como el ácido láctico, que son indicadores más precisos de pérdidas de sacarosa por actividad microbiológica en el tándem de molinos, pero se hace necesario realizar estudios que permitan tener criterios de selección entre los indicadores que muestren mayor correlación con el metabolismo de los microorganismos (McMaster, 1990; Ravnö, 2001).
2.2.2 Pérdidas indeterminadas
28
Las causas físicas incluyen pérdidas directas debidas a las pobres técnicas de corte de la caña, almacenamiento y o transporte, dispersión, pérdidas de sacarosa en aguas y productos residuales y absorbentes (Clarke et al., 1996).
Las pérdidas influenciadas por la descomposición química incluyen la descomposición térmica, la acidez del jugo y la presencia de la enzima invertasa (Anónimo, 1993; Clarke et al., 1996). El jugo tiene una acidez natural que es neutralizada pocos minutos después de la extracción, disminuyendo la incidencia de este factor en la inversión de la molécula, y por lo general se mantiene a temperatura ambiente durante le proceso de extracción, lo que indica que cuando estos factores se mantienen en valores óptimos que aseguren una inversión mínima, el factor de mayor incidencia está relacionado con la actividad enzimática (Anónimo, 1993).
La enzima invertasa (β -D fructofuranósido fructohidrolasa, E.C 3.2.1.26 ó β -fructofuranosidasa) en el jugo de caña tiene 2 orígenes: la caña de azúcar y la actividad microbiológica. La caña de azúcar sintetiza y cataboliza la sacarosa mediante esta enzima para obtener la energía necesaria para sus funciones fisiológicas y la producción enzimática varía de acuerdo a los requerimientos nutricionales y el tiempo entre corte (cosecha) y molienda. La planta produce 2 tipos de enzima diferentes: una es más activa bajo condiciones ácidas y está presente en células inmaduras como las del cogollo, mientras que la otra es más activa en condiciones normales y se encuentra en tejidos maduros; sin embargo, esta actividad enzimática se da en pequeña proporción por lo cual las pérdidas atribuidas a este factor son poco significativas (Pulido et al., 1977).
29 2.2.3 Contaminación microbiológica
Desde el momento que se corta la caña hasta que se clarifica el jugo extraído a altas temperaturas, la sacarosa está expuesta a la acción enzimática de una multitud de microorganismos que pueden provenir del suelo que se adhiere a tallos y hojas de la caña o del aire contaminante, y que se ven favorecidos por factores como las operaciones de quema, corte, condiciones de temperatura, humedad alta y tiempos entre corte y molienda (Cerutti de Guglielmone et al., 2000; Van der Poel, 1998).
Cuando la caña entra en el molino, sus jugos circulan a través de los mismos y entran en contacto con los microorganismos que se encuentran adheridos a las superficies de concreto y metal; sin embargo, la presencia de éstos en cualquier azúcar particular o producto intermedio de su fabricación, no significa necesariamente que se estén produciendo cambios perjudiciales, ni tendrán significado desde el punto de vista económico, a menos que factores del medio, como temperatura, agua, O2 y elementos
nutritivos sean favorables para el rápido crecimiento (Anónimo, 1993; Honig, 1969).
Entre estos microorganismos, que encuentran el medio ideal para su crecimiento en el jugo de caña, se han identificado 3 grupos principales de bacterias: productoras de exopolisacáridos, donde se encuentra Leuconostoc sp.; aerobios esporo-formadores, como Bacillus sp., y aerobios no esporo-formadores, como Escherichia coli; las levaduras son igualmente importantes , sobre todo las osmofílicas capaces de desarrollarse en medios muy concentrados por su resistencia a elevadas presiones osmóticas, como las mieles y el azúcar; también se encuentran, en menor proporción ciertas especies de mohos (Duarte et al., 1982; Honig, 1969; Van der Poel, 1998).
Las principales especies identificadas en caña de azúcar y sus jugos son:
30
mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Escherichia coli, Enterobacter
aerógenes, Citrobacter freundii, Pseudomonas sp., Klebsiella sp.,
Corynebacterium sp., Micrococcus luteus, Staphilococcus fragilis y Clostridium sp. En este grupo se destacan los bacilos que tienen la capacidad de formar endosporas y sobrevivir cuando las condiciones del medio no son favorables, y son importantes productores de levanos y otros heteropolisacáridos. Skole y colaboradores en 1977, reconocieron 2 vías de degradación de sacarosa por especies de Bacillus: forman levano y azúcares reductores o forman ácidos (Honig, 1969; Hernández et al., 1978).
• Levaduras: Saccharomyces cereviseae, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces pombe, Candida tropicalis, Candida mycoderma, C. Intermedia, Kloeckera
apiculata, Pichia membranofaciens, P. farinosa, Kluyvoromyces fragilis y
Hansenula anomala.
• Mohos: Penicillium citrovorus, Penicillium funiculosum, Aspergillus variatum, Aspergillus niger, Trichoderma viride y Monilia sitophila. (Sais, 1977; Duarte et al., 1982; Tallgren et al., 1999).
31
Otras especies notables debido a los productos a los que dan lugar hallados en los azúcares son levaduras de la especie Sacharomyces sp., que produce etanol, y
Clostridium thermosaccharolyticum, productora de ácido butírico (Clarke et al., 1996).
2.2.4 Determinación de pérdidas por contaminación microbiológica y sus implicaciones
Los principales productos de la actividad microbiológica, además de la masa celular y los polisacáridos, son los azúcares reductores como productos intermedios, el manitol, ácidos orgánicos como el ácido láctico que sirve como indicador de la pérdida de azúcar, ácido acético, etanol, nitrito, H2 y CO2, dependiendo de la
composición microbiana determinada por condiciones de diseño y operación de las plantas, así como de ciertas propiedades de la materia prima; estos productos metabólicos disminuyen el pH, producen componentes coloreados y permanecen en el proceso afectando la calidad de subproductos posteriores teniendo todos ellos un efecto “melazogénico”, es decir, que arrastran sacarosa con ellos a las melazas, disminuyendo la cantidad de sacarosa recuperada (Honig, 1969; Van der Poel, 1998).
32
pérdidas por inversión microbiana (Duarte et al., 1982; Hollaus, 1978).
Los métodos para determinar actividad microbiológica pueden ser directos, mediante análisis polarimétrico y cromatográfico de la sacarosa, o indirectos como el recuento de microorganismos capaces de reproducirse generalmente en cultivos en placa en diferentes medios con pH y temperatura variables, la formación de subproductos metabólicos como el incremento de dextranas, ácidos y la formación de nitritos, concentración de manitol y cambios en los valores de pH o potencial redox en los jugos de caña; el objetivo principal de estas mediciones es monitorear las pérdidas de azúcar (Duarte et al., 1982; Van der Poel, 1998; Appling et al., 1959; Eggleston, 2001).
2.2.5 Polisacáridos Bacterianos
Los polisacáridos en el jugo, especialmente de dextranos y levanos, afectan el proceso de producción de azúcar bloqueando lo equipos
33
Van der Poel, 1998). En menor proporción se producen también otros polisacáridos compuestos de moléculas de glucosa, galactosa, fucosa y manosa como monosacáridos estructurales (Tallgren et al., 1999).
2.2.5.1 Dextranos
[image:33.612.253.389.416.591.2]“Dextrano” es el nombre genérico para los polisacáridos que son polímeros de glucosa; químicamente, son polímeros homólogos de D-glucopiranosa (glucanos) y, a pesar de que cada bacteria produce un único glucano, éstos contienen predominantemente enlaces α 1,6 glucosídicos (>95%) con menor proporción de enlaces α1,2, α 1,3 o α1,4. Se forman extracelularmente por la acción de la enzima dextrano-sucrasa, una glucosiltransferasa que cataliza la transferencia de residuos glucosídicos obtenidos de la hidrólisis de la sacarosa a un polímero de dextrano, liberando D-fructosa. Esta es una enzima inducible por su propio sustrato, capaz de catalizar la formación de muchos tipos de enlaces permitiendo la formación de polímeros ramificados (Figura 1)(Dols et al., 1998).
Fig 1. Estructura del dextrano.
Fuente: www.offer21.com/.../ 20050701152600855451.jpg
34
bacterias ácido lácticas entre las que se encuentran Lactobacillus sp., Leuconostoc sp.
y Streptococcus sp., dentro de los cuales Leuconostoc mesenteroides y L. dextranicum son los más conocidos; en este género se agrupan microorganismos anaerobios facultativos que tienen su hábitat natural en el cañaveral y que, al producirse cualquier fisura en la superficie externa de la caña, la invaden y se reproducen rápidamente formando fácilmente polisacáridos bajo las condiciones de temperatura (20°C - 40°C), pH (5 - 6) y concentración de sacarosa (10% - 15%) encontrada en la caña de azúcar cosechada (Van der Poel, 1998; Zhennai, 2000).
2.2.5.2 Levanos
Los levanos son polifructosanos unidos por enlaces β (2,6) de alto peso molecular, solubles en agua con rotación óptica negativa, formados por la acción de la enzima levano-sacarasa que hidroliza la sacarosa y transfiere la D-fructosa a cadenas crecientes de fructanos para formar levanos producidos por microorganismos como
[image:34.612.130.514.502.588.2]Pseudomonas fluorecens, Corynebacterium beticola y especies de Bacillus sp. (B. subtilis, B. mesentericus, B. vulgatus),entre otros. Son polímeros que se originan en fábrica más que en campo, a diferencia de los dextranos que se originan en ambos ambientes (Figura 2),(Honig, 1969; Tallgren, 1999; Zhennai, 2000).
Figura 2: Estructura del levano.
35 2.3 Control de la actividad microbiológica
La formación de polisacáridos es fácilmente encontrada en molinos de caña donde se da poca atención a la limpieza, pues es este un factor fundamental para controlar las pérdidas de azúcar en los tándem de molinos, que deben lavarse con vapor a intervalos regulares y ser totalmente sanitizados cuando la molienda se detenga para evitar la acumulación de bagazo que permita la proliferación de los microorganismos (Van der Poel, 1998).
La limpieza frecuente y minuciosa del equipo de molienda permite reducir la fuente de inóculo de microorganismos por medio de limpiezas con vapor, que ayuda a controlar las poblaciones mientras está en contacto con ellos; sin embargo, el jugo permanece desprotegido durante el proceso de molienda (Pulido et al., 1977). Por esta razón, se han llevado a cabo numerosos estudios con el fin de encontrar compuestos que puedan emplearse en ingenios azucareros y que posean actividad bacteriostática o bactericida ante los grupos microbiológicos con mayor incidencia en el proceso de extracción, teniendo en cuenta la relación costo-efectividad.
36 2.3.1 Agentes biocida
Los agentes biocidas aplicados en ingenios azucareros en el mundo deben cumplir con 3 especificaciones:
- Estar aprobados por la normatividad vigente de regulación en alimentos.
- Ser relativamente económicos y de fácil aplicación
- No deben ser volátiles y funcionar a las temperaturas que se presenten en el proceso (Ravnö, 2001).
La aplicación debe ser adaptada a las condiciones de la fábrica, para que tenga impacto sobre los grupos de microorganismos que muestren tendencia a desarrollarse en lugares específicos del proceso; para la aplicación de un agente biocida económicamente viable es necesario determinar el punto más apropiado de aplicación y la dosis más apropiada con el fin de optimizar la actividad (Antier, 1996; Hollaus, 1978), así como tener en cuenta la forma de aplicación, temperaturas del proceso y diseño de la planta de extracción (Van der Poel et al., 1998).
El más clásico y probablemente el más efectivo de los agentes biocida que afectan la actividad microbiológica es la formalina, aplicada en una solución de 30% a 50% con metanol formando formaldehído. Este compuesto es el más simple de los aldehídos y altamente reactivo ya que se combina fácilmente con compuestos orgánicos reduciendo ciertos grupos básicos como los amino e imidazol de las enzimas y ácidos nucleicos, esenciales para su actividad (Van der Poel et al., 1998; Rincón et al., 1996). Sin embargo, su uso se ve limitado porque forma uniones irreversibles con los aminoácidos presentes en el jugo, se evapora como metanol durante la purificación del jugo y se precipita como formato en las melazas, aumentando la proporción de no azúcares en las mismas. Además, se cree que la formalina gaseosa tiene efecto carcinogénico (Van der Poel et al., 1998; Saye, 1993).
37
sanitizante químico en la industria alimenticia (Cerutti et al., 1999). Se cree que el cloro es capaz de producir reacciones letales en o cerca de la membrana celular microbiana, causando mutaciones en las células vivas, remueve proteínas y altera la permeabilidad de la cubierta de las esporas, ocasionando pérdidas de iones calcio, ácido dipicolínico, RNA y DNA (Cerutti et al., 1999).
Entre otros compuestos utilizados en la industria azucarera se encuentran el dióxido de azufre, compuestos de amonio cuaternario, sustancias catiónicas, tiocarbamatos, anfóteros, iodóforos, glutaraldehido y peróxido de hidrógeno, sólo este último con resultados similares a los obtenidos con formalina.
2.3.1.1 Busan 881 ® (Buckman Labs)
En 1957 en Cuba se introdujo un nuevo bactericida, Busan 881®, para reducir la inversión de sacarosa en los jugos; luego se introdujo en grandes ingenios en los Estados Unidos y más tarde se implementó en México, Perú y Brasil (Appling y Ugarte, 1959). Es un bactericida de amplio espectro compuesto por cianoditiocarbamato disodio y N-metilditiocarbamato de potasio, corrosivo a los ojos y la piel por lo que debe manejarse con precaución (Anónimo, 1993).
38 2.3.1.2 Lipesa 106C® (Glutaraldehído)
El glutaraldehido (1,5-pentadial) ha sido empleado exitosamente como desinfectante o agente esterilizante en aplicaciones industriales, clínicas y en agricultura (Anónimo, 1992). Las propiedades antimicrobianas de este compuesto están bien establecidas por sus reacciones de oxidación, reducción y condensación; en condiciones normales, el glutaraldehido reacciona con grupos amino y residuos de lisina de las proteínas, haciendo un entrecruzamiento de las proteínas localizadas en la superficie de las bacterias, desnaturalizándolas y ocasionando la muerte celular. Es un producto estable a altas temperaturas y bajos pH, condiciones que fácilmente se pueden encontrar en las fábricas de azúcar. Se ha utilizado en industrias azucareras de remolacha a concentraciones de 250ppm de ingrediente activo, con base en las toneladas de materia prima molidas por unidad de tiempo (Saye, 1993).
2.3.1.3 Nalco 5581® (Ditiocarbamato)
Los tiocarbamatos son compuestos pertenecientes al grupo de los organosulfurados, soluble en agua y solventes polares, y su mecanismo de acción se basa en la sustitución y/o copulación de grupos enzimáticos claves del metabolismo microbiano; son considerados compuestos de baja toxicidad, bactericidas y fungicidas de amplio espectro (Widmer et al., 1993 citado por Cerutti et al., 2000). El componente activo de este biocida es el etileno ditiocarbamato de sodio (8%) y sus dosis pueden variar de acuerdo a la severidad de la contaminación entre 10 y 30 ppm, aplicado en forma continua y en lugares donde se homogenice fácilmente.
2.3.2 Beneficios en los subproductos
39
40
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Los análisis de rutina realizados al jugo de caña extraído en el Ingenio Manuelita S.A. muestran aumento en las concentraciones de subproductos del metabolismo microbiano como dextranas y porcentaje de azúcares reductores , caídas de pureza de dos puntos o mayores y concentraciones altas de ácidos orgánicos, lo cual disminuye la calidad de los subproductos del proceso de producción de azúcar. Esto indica que se requieren medidas de sanitización más efectivas a las actualmente empleadas para el control de la contaminación microbiológica presente en la fábrica.
Mediante la cuantificación y clasificación por tinción de Gram de los microorganismos presentes en los jugos de caña se determinó qué tipo de microorganismos se encuentran durante el proceso de molienda, qué factores tienen mayor influencia en la variación sus poblaciones y se obtuvo la información necesaria para establecer puntos en los que la limpieza debe ser más minuciosa y es necesario utilizar agentes químicos para controlar las cargas bacterianas que implican pérdidas económicas.
41
4. OBJETIVOS
4.1 General
Determinar las poblaciones microbiológicas presentes en el proceso de extracción de jugos de caña de azúcar, y así establecer criterios reales que permitan tomar medidas para controlar las pérdidas microbiológicas de sacarosa en el Ingenio Manuelita S.A.
4.2 Específicos
• Cuantificar la carga microbiológica con que ingresa la caña del campo al molino en cuanto a: bacterias mesófilas, bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos, mohos, levaduras y bacterias termófilas aerobios esporuladas mediante la evaluación de muestra directa de la caña (DAC).
• Determinar la variación de las poblaciones de microorganismos durante el recorrido de los jugos de caña en diversos puntos del molino mediante muestreos puntuales de los mismos.
42
• Determinar parámetros físico-químicos de los jugos evaluados como son valores de pH, concentración de dextranos (ppm) / ºbrix, % de azúcares reductores /ºbrix y % de pureza de los jugos para establecer correlaciones con los resultados microbiológicos.
• Focalizar los puntos críticos de acuerdo a las cargas microbiológicas encontradas en los diferentes puntos de muestreo del proceso de extracción, para sugerir procedimientos de limpieza y desinfección más minuciosos en estos sitios que permitan controlar dichas cargas.
43
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Lugar de muestreo
Este estudio se realizó en el Ingenio Manuelita, ubicado al sur-occidente del país, en jurisdicción del municipio de Palmira, en el departamento del Valle del Cauca (Km. 7 vía Palmira-Buga). La fábrica cuenta con 2 series de molinos agrupados en tándem; el estudio se centra específicamente en el tándem N°2 compuesto por una serie de 6 molinos consecutivos, en donde el 1er molino aporta la mayor proporción de jugo, mientras los 5 restantes continúan la extracción de jugo de la caña con adición de agua de maceración a 70°C.
5.2. Población de estudio y muestra
[image:43.612.139.530.448.665.2]Se tomaron 6 muestras en diferentes puntos del proceso de extracción (figuras 3 y 4).
29
30 5.2.1 Análisis Directo de Caña (DAC)
La muestra de DAC se obtuvo en los patios de caña del ingenio donde un muestreador mecánico tomó una muestra representativa de la caña que ingresa en tracto-mulas o dumper; se llevó la muestra a un molino experimental previamente desinfectado con hipoclorito de sodio al 2.6% (v/v) y lavado con agua. Después de pasar suficiente caña por este molino, se tomó la muestra de jugo en un frasco de polipropileno previamente esterilizado y se llevó a refrigeración hasta el momento del análisis. En este punto se tomó la información de la caña muestreada: variedad, edad, procedencia, sistema de cosecha, tiempo de permanencia, etc.
5.2.2 Jugo de primera extracción
Después de 5 min, contabilizados desde el momento en que la caña muestreada fue colocada sobre la banda transportadora y entró a la molienda, se tomó la muestra de jugo de la primera extracción en frascos de polipropileno previamente esterilizados (Cerutti et al., 2000).
5.2.3 Jugo del 4º molino
El jugo del 4º molino es un punto intermedio que permitió determinar qué carga microbiológica se aporta en los 3 últimos molinos. La muestra se tomó del jugo que sale del 4º molino hacia el 3ero, en frascos plásticos estériles con un muestreador diseñado para tal fin.
31
En este punto se reúne todo el jugo obtenido de la extracción de los molinos posteriores y permitió determinar qué carga aporta todo el tándem de molinos al jugo. Se tomó a la salida del 2º molino, antes de pasar al tanque del colador, en frascos plásticos previamente esterilizados mediante un muestreador diseñado para tal fin.
5.2.5 Jugo del colador
Este punto de muestreo se tomó en el tanque del colador en frascos plásticos previamente esterilizados mediante un muestreador diseñado para tal fin.
5.2.6 Jugo diluido
En la descarga de la báscula al tanque de jugo mezclado se tomó el jugo diluido en frascos plásticos previamente esterilizados con un muestreador diseñado para tal fin. Esta muestra permitió determinar si las cargas se aumentaban en este trayecto en que el jugo está en contacto con diferentes superficies.
En el muestreo se tuvieron en cuenta dos factores: el tamaño de la muestra y la representatividad:
• Tamaño de Muestra: La muestra se tomó de manera puntual en cada uno de los puntos definidos anteriormente, durante 40 días de muestreo para asegurar normalidad en el análisis de los datos.
32 5.3 Unidad de muestreo
250 ml de jugo de cada punto de muestreo.
5.4 Muestreos
El muestreo se realizó en las horas de la mañana, entre 8 y 9 a.m., salvo en los días en que se presentaron irregularidades en el proceso de molienda en la fábrica; en esos casos se tomaron las muestras en la tarde.
Para la toma de muestras, se utilizó un muestreador que consiste en un tubo largo con un soporte de PVC en uno de sus extremos el cual rodea los frascos permitiendo el intercambio de los mismos entre las muestras, sin estar en contacto directo con ellas; de esta manera, se elimina la posibilidad de contaminación cruzada. Las muestras tomadas en cada sitio se conservaron en refrigeración hasta su análisis. Se tomaron muestras en los seis puntos del proceso de molienda: DAC, jugo de 1era extracción, 2º molino, 4º molino, jugo del colador y jugo diluido durante los meses de agosto a diciembre de 2005.
5.5 Variables del estudio
• Población de bacterias mesófilas
• Población de bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos • Población de levaduras
• Población de mohos
33 • pH
• Determinación de pureza
• Determinación de dextranos (ppm)
• Determinación de % de azúcares reductores
• % de inhibición del bactericida según la fòrmula sugerida por González en 1993:
UFC/ml inicial – UFC/ml final x 100 Fórmula (1) UFC/ml final
5.6 Variables respuesta y unidades de medida
• Carga microbiológica : UFC/ml • pH
• Purezas: Diferencias de pureza entre los jugos • Concentración de dextranas: Dext (ppm) • Azúcares reductores: % Azúcares Red • % de inhibición
5.7Variables independientes a tener en cuenta (Características de la caña que ingresa Tabla 1)
34
Tabla 1: Características de la caña que entró a la fábrica durante el estudio.
Variables Tipo Descripción % en el
estudio
Verde
Se refiere a la caña madura con todo su cuerpo foliar, que se corta sin ser quemada previamente.
37.5% Tipo de caña
Quemada
Es la caña en la que se hace una quema controlada antes de la cosecha para eliminar el follaje y facilitar el corte posterior.
62.5%
Manual
Los corteros de caña realizan la cosecha con machete en la base del tallo y los organizan en hileras llamadas chorras; posteriormente, se carga a los vehículos de transporte con alzadoras mecánicas.
52.5% Tipo de Cosecha
Mecánica
En la cosecha mecánica la caña es descogollada por las máquinas, cortada por la base y trozada en pedazos de 30 centímetros.
47.5%
CC 85-92 55.0%
PR 61-63 17.5%
CC 84-75 7.5%
V 71-51 10.0%
MZC 74-275 5.0%
RD 75-11 2.5%
Variedades de caña evaluadas
Mezcla 2.5%
Muestra directa de caña (DAC) 16.7%
Jugo de 1ª extracción 16.7%
Jugo del 2º molino 16.7%
Jugo del 4º molino 16.7%
Jugo del colador 16.7%
Puntos de muestreo
35 Tipo de caña
por punto
Se relacionaron todas las variables en caña verde y quemada por cada punto de muestreo.
Edad
Corresponde a la edad del cultivo. Actualmente, la caña se corta entre 12 a 14 meses de edad, dependiendo de la variedad. En estudio se presentó un rango de edad entre 10.4 y 16 meses de edad, con un promedio de 13.5.
Tiempo de permanencia
(TP)
Es el tiempo que permanece la caña en el campo, desde el momento en que se hace la cosecha, hasta que llega a la fábrica para ingresar a la molienda. En el estudio se determinó un rango de TP entre 1.8 y 104.5 horas, con un promedio de 28 h.
Porcentaje de materia extraña
(%ME)
La materia extraña es todo aquel material diferente a los tallos de caña que ingresan a la molienda, entre los que se encuentran los residuos verdes como cogollos, porciones de caña, hojas verdes y secas, y terrones de suelo. En el estudio se presentó un rango entre 0 y 15.6% de ME, con un promedio de 6.4%.
*El “% en el estudio” corresponde al % en que se presentó cada característica en las muestras tomadas para el estudio.
Fuente: Manuelita S.A; CENICAÑA.
5.8 Métodos
5.8.1 Recuento de microorganismos
5.8.1.1 Mesófilos
36
5.8.1.2 Bacterias ácido lácticas productoras de exopolisacáridos (BALPE)
Las muestras se diluyeron en agua peptonada al 0.1% (p/v), haciendo diluciones seriadas base 10 hasta 105; se sembraron 0.1ml de las dos últimas diluciones por duplicado en la superficie de agar Man Rogosa Sharpe (MRS) adicionado con 20% de sacarosa previamente solidificado (Anexo 5) y se incubaron las placas invertidas a 37°C durante 24 a 48 h. Posteriormente se realizaron los recuentos (Cerutti et al., 2000).
5.8.1.3 Mohos y levaduras
Las muestras se diluyeron en agua peptonada al 0.1% (p/v), haciendo diluciones seriadas base 10 hasta 105; se sembraron 0.1ml de las dos últimas diluciones por duplicado en la superficie de agar extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGC) previamente solidificado (Anexo 5) y se incubaron las placas invertidas a 30°C por 3 a 4 días. Posteriormente se hicieron los recuentos (Duarte, 1982; Cerutti et al., 2000).
5.8.1.4 Bacterias aerobias termófilas esporuladas
Se tomaron 50ml de la muestra y 50ml de agua estéril a pH 7, para un volumen final de 100ml. Mediante choque térmico se activaron las esporas de bacterias aerobias termófilas formadoras de esporas, llevando la dilución anterior a ebullición durante cinco minutos luego de los cuales, se completó el volumen restante de diluyente que se evaporó y se sembró por duplicado 0.1ml en la superficie del medio de cultivo glucosa-peptona de caseína (Anexo 5); se incubaron las placas invertidas a 55°C durante 24 - 48h después de las cuales se realizaron los recuentos (Duarte, 1982; Hoing, 1969).
5.8.2 Aislamiento y clasificación de microorganismos
37
frecuentemente encontradas, tomando un inóculo con asa estéril y trazando varias líneas rectas sobre el medio respectivo solidificado. Posteriormente se realizó coloración por tinción de Gram, para hacer la clasificación de las bacterias aisladas, y coloración con azul de lactofenol para observar las estructuras de hongos filamentosos y levaduras (Duarte, 1982).
5.8.3 Análisis físico-químico
5.8.3.1 pH
Se midieron aproximadamente 80ml de la muestra en un vaso, dejando enfriar a temperatura ambiente (dependiendo de la muestra); se esperó lectura estable del Peachímetro Fischer de electrodo combinado (Procedimiento muestreo y análisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A. 2003).
5.8.3.2 Temperatura (°C)
Se determinó la temperatura del jugo en el momento del muestreo mediante termómetro.
5.8.3.3 % de Pureza
Determinación de grados brix y POL mediante métodos estandarizados en laboratorio central.
5.8.3.3.1 Determinación de grados brix
Se midieron 100ml de la muestra, se agregaron 4g de tierra de infusoria (supercell). Se filtró, desechando los primeros ml del filtrado; se realizó la lectura de dos gotas de la muestra filtrada en el refractómetro y se registró el valor de los °brix (Procedimiento muestreo y análisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A. 2003).
38
Se midieron 150 ml de la muestra mezclando bien con 0.5g de cal apagada. Se adicionó un gramo de sulfato de aluminio y potasio (alumbre); se agregaron 5g de supercell, se filtró desechando los primeros ml de filtrado. Se cuadró el tubo del polarímetro a cero por ambos lados con agua destilada y luego se puso un poco de muestra filtrada a analizar. Luego se llenó el tubo con la muestra para lectura de la polarización en el sacarímetro. Se determinaron los valores de sacarosa según los valores de Brix y Polarización obtenidos utilizando las tablas de “Expansión de Schmitz”. Finalmente, la pureza se calculó mediante la siguiente fòrmula:
P = % sacarosa x 100 Fòrmula (2) ° Brix refractométrico
(Procedimiento muestreo y análisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A., 2003)
5.8.3.4 Determinación de azúcares reductores: Método de Eynon y Lane.
39
5.8.3.5 Determinación de dextranos: Método de Roberts (Precipitación con alcohol y Lectura en Espectrofotómetro a 720nm)
Se tomaron 15 ml de la muestra en un balón aforado de 100ml; se tomaron 20 ml de la dilución anterior y 20 ml de solución patrón (agua destilada). Se agregaron 0.5g de supercell y 4ml de ácido tricloroacético; se puso a filtrar la muestra en filtro No.1 eliminando las primeras gotas de filtrado. Se tomaron 10 ml de la muestra filtrada mezclada con 10 ml de alcohol al 95%. Se dejó en reposo durante 20 min., luego de los cuales se realizó la lectura en espectrofotómetro a 720nm, llevado a cero previamente con la solución patrón preparada con agua destilada. Finalmente se aplicó la siguiente fòrmula:
1179.77 x Abs x 6.67 = Dextranas (ppm) Fórmula (3)
(Procedimiento muestreo y análisis de jugos pspcca 25, Manuelita S.A., 2003).
5.8.4 Evaluación de los bactericidas
De acuerdo a los resultados obtenidos en los recuentos de microorganismos en los puntos de muestreo, se hizo un ensayo en el laboratorio para determinar la eficiencia de diferentes bactericidas sobre las poblaciones microbiológicas presentes en las muestras de jugo de la primera extracción, por presentar éstas una alta carga microbiológica procedente de la materia prima que ingresa a la fábrica. Para este experimento se tomaron 1000 ml de muestra puntual del jugo; se aplicaron los agentes biocida en 3 concentraciones: la recomendada por el proveedor, una menor y una mayor, y se establecieron tiempos de contacto de 5, 10 y 15 min., teniendo en cuenta el tiempo máximo que puede durar el recorrido del jugo en el proceso de extracción antes de entrar al proceso de clarificación a temperaturas elevadas, establecido mediante la rutina de muestreo empleada en el estudio (Tabla 2) (Cerutti
40
buscando simular las condiciones de aplicación en el molino.
Tabla 2: Bactericidas evaluados, sus concentraciones y los tiempos de contacto
Agentes biocida Volumen de jugo evaluado (ml)
Concentración (ppm)
Tiempos de Contacto (min.)*
Busan 881 ® 100 5, 10, 20 5, 10, 15
Lipesa 106C® 100 5, 10, 20 5, 10, 15
Nalco 5581® 100 10, 20, 30 5, 10, 15
Testigo sin biocida 100 Jugo puro 5, 10, 15
* Tiempo después del cual se realizaron las siembras.
Después de cumplido el tiempo de contacto, cada muestra se diluyó con agua peptonada estéril al 0.1% hasta 10-6 y se sembraron 0.1ml de cada una de las dos últimas diluciones en agar nutritivo para mesófilos, 0.1ml en agar MRS para bacterias ácido lácticas productoras de exopolisacárido, 0.1ml en agar YGC para hongos y levaduras y 0.1ml en agar glucosa-peptona de caseína para termófilos. Cada siembra se realizó por duplicado.
Finalmente, se compararon los recuentos obtenidos en los diferentes tratamientos y se evaluó el tiempo de acción y la concentración de cada compuesto de acuerdo al porcentaje de inhibición obtenido (Cerutti et al., 2000).
5.9 Recolección de la Información
41 5.10 Análisis de la Información
El estudio se clasifica como un estudio observacional dentro de las condiciones normales de funcionamiento del ingenio Manuelita S.A.
Los datos de sólidos solubles (ºBrix) del DAC se utilizaron como referencia para establecer un factor de dilución en los siguientes puntos y aplicar este factor en la corrección en las poblaciones de microorganismos mediante una relación entre cada punto de muestreo y la muestra directa de caña:
ºBrix Dac/ºBrix 1era Ext ºBrix Dac/ºBrix 2º molino ºBrix Dac/ºBrix 4º molino ºBrix Dac/ºBrix Colador ºBrix Dac/ºBrix diluido
Los datos de se sometieron a un análisis de varianza utilizando dos modelos lineales con el programa estadístico SAS, teniendo en cuenta el 10% de significancia.
Para determinar el efecto de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos del jugo de DAC, se aplicó el siguiente modelo lineal:
Yi : µ + Var + Tcaña + edad + % ME + TP + Error Fórmula (4)
Para la evaluación de los jugos en la fábrica, el modelo lineal aplicado fue:
Yi : µ + pto de muestreo + Error Fórmula (5)
Donde:
42 Var: Variedad de caña
Tcaña: Tipo de caña
%ME: % de materia extraña
TP: Tiempo de permanencia de la caña en el campo. Pto de muestreo: Punto de muestreo
Error: factores no considerados o no previsibles.
43
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Población de microorganismos
Los microorganismos mesófilos, es decir, aquellos cuya temperatura óptima está entre los 25°C y 40°C, representaron el grupo microbiano más abundante en el proceso, seguido de la población de bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos, las levaduras, los mohos y por último la población de bacterias termófilas (ver anexo 2).
6.2Análisis físico-químico
La determinación de las características físico-químicas de los jugos permitió establecer un factor de corrección para las poblaciones microbiológicas con respecto a los ºbrix de la muestra de DAC. Los factores aplicados para los recuentos en cada punto de muestreo fueron: 1.03 para el jugo de la 1era extracción, 2.3 para el jugo del 2º molino, 5.2 para el jugo del 4º molino, 1.5 para el jugo del colador y 1.5 para el jugo diluido.
44 6.2.1 Temperatura y pH
La tabla 3 muestra la temperatura y valores de pH evaluados en cada punto de muestreo.
La temperatura encontrada en las muestras de DAC, 1era Ext., 2º molino, jugo del colador y jugo diluido son ideales para el desarrollo de microorganismos sacarolíticos y no sacarolíticos; el jugo del 4º molino es menos susceptible a esta flora al presentar una temperatura más elevada como consecuencia del agua de maceración aplicada al sexto molino. No obstante, si se encuentran bacterias esporuladas, éstas pueden permanecer latentes hasta el momento en que encuentren las condiciones para su desarrollo; en este caso, al no existir un choque térmico fuerte, se da lugar a la germinación de las esporas y, en consecuencia, la aparición de células vegetativas que encuentran en el jugo del colador y diluido temperaturas adecuadas para desarrollarse, aumentando la población microbiana si el tiempo de retención es alto.
Tabla 3. Promedios de temperatura y pH en cada punto de muestro Punto de Muestreo Temp. (Cº) pH
DAC 25 + /-1.43 5.4 + /- 0.2 1era Ext. 25 + /-1.55 5.4 + / - 0.2 2° molino 42 + /- 4.14 5.7 + /- 0.3 4° molino 54 + /- 6.62 5.6 + /- 0.3 Colador 35 + /- 2.88 5.4 + /-0.2 Diluido 34 + /- 4.71 5.4 + /- 0.2
En el rango mesofílico encuentran su temperatura óptima de crecimiento muchas de las bacterias con capacidad de producir exopolisacáridos a partir de la sacarosa, entre ellas Leuconostoc sp. y otras bacterias ácido-lácticas como Lactobacillus sp. y
45
37ºC; normalmente estos microorganismos son eliminados en etapas posteriores del proceso cuando se alcanzan altas temperaturas, pero sus subproductos metabólicos permanecen en los jugos causando problemas posteriores. (Antier, 1996; Cerutti de Guglielmone, 1999; Cuddihy et al, 2001; Hoing, 1969).
En cuanto al pH, para cada especie microbiana existe un valor máximo y uno mínimo pero, en general, las bacterias encuentran un valor óptimo alrededor de 5.0 a 6.5; para las bacterias ácido lácticas, el pH ideal está entre 5.0 y 5.5, valores fácilmente encontrados en el jugo de la caña como lo muestra la tabla 3, donde se observa la poca variación de los valores entre los diferentes puntos.
Según los valores de temperatura y pH encontrados en el estudio, la mayor parte del proceso de extracción favorece el metabolismo de la sacarosa por parte de los microorganismos pues, normalmente, los jugos no alcanzan temperaturas ni valores de pH capaces de inhibir la actividad microbiológica y el movimiento constante del jugo en las caídas del molino a tanques y canales permiten la aireación del mismo, lo que favorece la proliferación de los microorganismos. Resultados similares son reportados por Sais et al., 1979, Hollaus, 1978 y Romani et al., 1991.
6.3 Variables de respuesta
6.3.1 Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos en la muestra de DAC.
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logarítmica para el análisis de varianza debido al alto coeficiente de variación inicial; se aplicó el modelo lineal planteado en la fórmula (4).
Como lo señala Antier (1996) y Cerutti de Guglielmone y colaboradores (2000), la variabilidad de los datos se debe a los numerosos factores que inciden en la calidad de la caña que entra a la fábrica. Por esta razón, para evaluar la influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos del jugo, se realizó un análisis de varianza entre los datos obtenidos en la muestra de DAC y los datos de trazabilidad de la caña a partir de la cual se tomó la muestra. La tabla 4 muestra las significancias obtenidas.
6.3.1.1 Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas en la muestra de DAC.
Cuando se tomaron muestras de cosecha manual, el tipo de caña (verde o quemada) influyó significativamente sobre la población de mesófilos; se observó el mismo efecto sobre la población de BALPE cuando la cosecha había sido mecánica e, independientemente de la cosecha, el tipo de caña influyó significativamente sobre la población de levaduras.
El test de Tukey que muestra la tabla 5, donde se comparan los valores medios de las poblaciones en cada tipo de cosecha (cosecha manual o mecánica) con tipo de caña (verde o quemada), muestra poblaciones mayores de mesófilos, BALPE y levaduras cuando la caña fué cosechada en verde, puesto que este tipo de caña llega a la molienda con todo el cuerpo foliar y las partículas de suelo; esta característica la convierte en la fuente más directa de contaminación con microorganismos, pues la flora epífita de la caña entra a formar parte de la flora en el proceso de extracción (figura 5) como lo reportan Van der Poel et al., (1998), Hernández (1978) y Cerutti de Guglielmone (1999).
47
Así mismo, el tiempo de permanencia de la caña en campo (TP) cuando la cosecha es manual, mostró influencia significativa sobre las poblaciones de mesófilos, BALPE y levaduras (tabla 4), pues cuando se corta la caña se generan tejidos expuestos fácilmente accesibles para los microorganismos presentes en todas las superficies con las que ésta entra en contacto, desde que es recogida del suelo hasta que llega a la fábrica. Estos microorganismos encuentran las condiciones óptimas para desarrollarse en las chorras en que se organiza la caña antes del alce, pues la temperatura del medio, las condiciones de humedad y la concentración de O2
favorecen su proliferación. Resultados similares reportaron Mora (1995) y Duarte y colaboradores (1982) quienes encontraron una marcada incidencia del tiempo de permanencia sobre las poblaciones microbiológicas.
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Tabla 4: Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos en la muestra de DAC. Análisis estadístico (SAS) (10% de significancia). n= 40
Factores Mesófilos BALPE Levaduras Mohos
Bacterias termófilas
aerobias Tipo de
Cosecha Man Mec Man Mec Man Mec Man Mec Man Mec Variedad NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS
Tipo de Caña S NS NS S S S NS NS NS NS
Edad NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS
TP S NS S NS S NS NS NS NS NS
%ME S NS S NS S NS NS NS NS NS
Factores ºBrix %Sacarosa %Pureza Dextranos (ppm)
%Azúcares reductores Tipo de
Cosecha Man Mec Man Mec Man Mec Man Mec Man Mec
Variedad NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS
Tipo de Caña NS NS NS NS NS NS S NS NS NS
Edad NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS
TP NS NS NS NS NS NS S NS NS NS
%ME NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS
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Tabla 5: Test de Tukey. Comparación de los valores medios de poblaciones microbiológicas y características físico-químicas de la muestra de DAC, por tipo de caña y tipo de cosecha, y sus diferencias. n = 40.
oblaciones microbiológicas Log UFC/ml
Cosecha manual Cosecha Mecánica Grupos
microbianos Verde Quemada Verde Quemada
Mesófilos 7.79ª 7.48ª 7.39 7.19
BALPE 5.28 4.92 5.45ª 4.99ª
Levaduras 5.90ª 5.15ª 5.54ª 5.18ª
Mohos 3.83 3.30 3.58 3.30
Bact. termófilas aerobias 2.30 1.62 2.20 2.24
Cosecha manual Cosecha Mecánica Características
físico-químicas
Verde Quemada Verde Quemada
ºBrix 21.10 20.07 19.88 19.83
%Sacarosa 19.11 18.11 18.04 17.86
Pureza 90.57 90.07 90.71 90.02
Dextranos (ppm) 51.00ª 72.76ª 75.69 86.62 % Azúcares reductores 0.54 0.61 0.40 0.58
ª : Valores con diferencias significativas
50
a)
[image:65.612.112.536.99.628.2]b)
Figura 5. Diferencias entre las poblaciones microbiológicas de acuerdo al tipo de caña:
a) Cosecha manual; b) Cosecha mecánica.
Cosecha manual 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Mesóf ilos Levaduras
Tipo de caña
L o g UF C/ m l
Caña larga verde Caña larga quemada
Cosecha mecánica 4,7 4,8 4,9 5 5,1 5,2 5,3 5,4 5,5 5,6 BALPE Levaduras
Tipo de caña
Lo g U F C /m l
