Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Q. UI. M. IC. A. ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Y. BI. O. TESIS II. AC. IA. Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las. RM. hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada”. DE. FA. frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. A. PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE. BL. IO. TE C. BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA. BI. Autores:. Asesora:. ARANGURI CAMACHO, Danitza Wendy RAMOS VILLANUEVA, Rebeca Lizbeth. Mg. SOTO VÁSQUEZ, Marilú Roxana. Co asesora: Dr. MEJÍA DELGADO, Elva Manuela TRUJILLO – PERÚ 2017. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A Dios, por ser el amigo que nunca falla, por haber estado en todo momento con nosotras, porque guiaste nuestros pasos por el camino seguro y preciso, por permitirnos llevar a cabo y concluir con éxito nuestra tesis.. IC. A. De: Danitza y Rebeca. BI O. Q. UI M. A Paco Daniel Arangurí Llerena, por tu ejemplo de perseverancia, tu constante estímulo y esfuerzo. Porque implantaste en mí el espíritu de superación.. FA. RM AC. IA. Y. De: Danitza. BI B. LI. De: Danitza. O TE CA. DE. A mi madre, por tu inmenso amor, tu enorme paciencia y comprensión además de contar con tu constante apoyo, por ser esa madre maravillosa que tengo.. A todos mis familiares quienes de una u otra forma hicieron posible la culminación de este trabajo De: Danitza. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A Víctor, por tu apoyo incondicional, por tu paciencia y por enseñarme que el amor existe. De: Danitza. IC. A. A mi amada hija Luana Valentina por ser mi fuente de motivación e inspiración para poder superarme cada día más y así poder luchar para que la vida nos depare un futuro mejor.. BI O. Q. UI M. De: Rebeca.. RM AC. IA. Y. A mi amada madre Anita Villanueva por su sacrificio y esfuerzo, por darme una carrera para mi futuro y creer en mi capacidad, por ser la mujer luchadora que es y brindarme siempre su apoyo, comprensión y cariño.. O TE CA. DE. FA. De: Rebeca.. BI B. LI. A mi hermanita Ximena, por alentarme siempre con sus palabras para seguir adelante; aunque la mayoría de veces parece que estuviéramos en una batalla, siempre hay momentos en los que la lucha cesa y nos unimos para lograr cosas juntas. De: Rebeca. A mi mejor amiga Candy, por ser como una hermana para mí, por acompañarme en todo momento y demostrarme que puedo confiar y contar con ella siempre. De: Rebeca. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. A la Mg. Q.F. Marilú Roxana Soto Vásquez por su completa disposición y gran. BI B. LI. O TE CA. DE. FA. RM AC. IA. Y. BI O. Q. UI M. IC. A. capacidad profesional para guiarnos a lo largo del presente trabajo de investigación.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. De conformidad con las disposiciones legales y vigentes del Reglamento de Grados y. IC. A. Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo. UI M. – La Libertad, sometemos a vuestro elevado criterio el presente informe de. Y. BI O. Q. investigación titulado:. RM AC. IA. Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor. O TE CA. DE. FA. “campanilla morada” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. BI B. LI. Dejamos a su consideración la calificación del presente informe.. Trujillo, Octubre del 2017. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. Dr. QF Abanto Zamora Francisco Moisés. RM AC. IA. Y. BI O. Q. UI M. IC. A. (Presidente). Mg. QF Rengifo Penadillos Roger Antonio. BI B. LI. O TE CA. DE. FA. (Miembro). Mg. QF Soto Vásquez Marilú Roxana (Miembro). v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El presente trabajo de investigación, estuvo orientado a determinar las características fisicoquímicas, los metabolitos secundarios y la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus, así como evaluar el efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada”. IC. A. frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus; procedente centro poblado de Cachur. UI M. Alto, del distrito de Marcabal, provincia de Sánchez Carrión. El extracto. BI O. Q. hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor presentó las siguientes características fisicoquímicas: densidad de 0,949 g/mL, índice de refracción de 1,369,. IA. Y. pH de 5,1, solidos totales de 0,297 g/mL. Se identificaron cualitativamente. RM AC. triterpenoides y/o esteroides, lípidos, flavonoides, taninos, antocianidinas, alcaloides, azúcares reductores, saponinas y aminoácidos. Finalmente se determinó el efecto. FA. antibacteriano del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor. O TE CA. DE. “campanilla morada” a las concentraciones de 5, 10 y 15 mg/mL con concentración mínima inhibitoria (CMI) de 10 mg/mL frente a Staphylococcus aureus.. BI B. LI. Palabras claves: extracto hidroalcohólico, Gentianella bicolor, in vitro. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. The present research was aimed at determining the physicochemical characteristics, the secondary metabolites and the minimal inhibitory concentration (MIC) of the hydroalcoholic extract of the leaves of Gentianella bicolor "campanilla morada" against Escherichia coli and Staphylococcus aureus, as well as to evaluate the effect in vitro of the hydroalcoholic extract of the leaves of Gentianella bicolor "purple bell" against. IC. A. Escherichia coli and Staphylococcus aureus; from the town center of Cachur Alto, in the. UI M. district of Marcabal, province of Sánchez Carrión. The hydroalcoholic extract of. BI O. Q. Gentianella bicolor leaves had the following physicochemical characteristics: density of. Y. 0.949 g / ml, refractive index of 1.369, pH of 5.1, total solids of 0.277 g / ml.. RM AC. IA. Qualitative triterpenoids and / or steroids, lipids, flavonoids, tannins, anthocyanidins, alkaloids, reducing sugars, saponins and amino acids were identified. Finally, the. FA. antibacterial effect of the hydroalcoholic extract of the leaves of Gentianella bicolor. DE. "campanilla morada" was determined at concentrations of 5, 10 and 15 mg / ml with. O TE CA. minimum inhibitory concentration (MIC) of 10 mg / ml against Staphylococcus aureus.. BI B. LI. Key words: hydroalcoholic extract, Gentianella bicolor, in vitro. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE Pág.. DEDICATORIA……………………………………………………………….i AGRADECIMIENTO………………………………………………………..iii. A. PRESENTACIÓN……………………………………………………………iv. UI M. IC. JURADO DICTAMINADOR………………………………………………...v. BI O. Q. RESUMEN…………………………………………………………………...vi. Y. ABSTRACT………………………………….……………………………...vii INTRODUCCIÓN……………………….…………….……………….01. II.. MATERIAL Y MÉTODO………………………………………..…….09. III.. RESULTADOS……………………..………………………………….26. DE. FA. RM AC. IA. I.. CONCLUSIONES……………………………………………………..38. LI. V.. O TE CA. IV. DISCUSIÓN…………………………………………………………...33. BI B. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………39 ANEXOS. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. La resistencia frente a los antimicrobianos es un problemática de carácter mundial que afecta a todos los grupos poblacionales, especialmente a los niños. El uso inadecuado de medicamentos para infecciones bacterianas ha terminado en la propagación y propagación de bacterias resistentes a medicamentos que se utilizan como primera línea,. IC. A. efectivos y baratos. Las enfermedades principales que causan estas bacterias son las. BI O. Q. de transmisión sexual e infecciones intrahospitalarias1.. UI M. enfermedades diarreicas, meningitis, problemas en el tracto respiratorio, enfermedades. Y. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados. RM AC. IA. Unidos de Norteamérica, estiman que el rechazo al tratamiento farmacológico a los antibióticos es responsable de más de 2 millones de infecciones y 23 000 muertes cada. FA. año, solo en el país de los Estados Unidos, con un costo directo de 20 000 millones de. DE. dólares, pérdidas adicionales de rendimiento de 35 000 millones de dólares. Así mismo,. O TE CA. en Europa se estima que unas 25 000 muertes son atribuibles a infecciones resistentes a los antibióticos, que cuestan 1 500 millones de euros anuales en costos de forma directa. LI. e indirecta. Aunque las estimaciones fiables de las pérdidas económicas en los estados. BI B. en vías de desarrollo no están disponibles, se calcula que 50 000 muertes por sepsis neonatal son atribuibles únicamente en la India. Estudios de Tanzania y Mozambique indican que el efecto de infecciones resistentes está en aumento lo que concierne a la valoración de neonatos que fallecieron e infantes con menos de cinco años2. Dentro del país de Inglaterra, el 95% del consumo de antimicrobianos se da en la comunidad, mientras que, en el país de Estados Unidos, este consumo constituye el 75% del total. A su vez, gran parte de este consumo está dirigido al manejo de las enfermedades. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. respiratorias agudas, de las cuales el 80% son bronquitis, faringitis, laringitis y amigdalitis; todas ellas enfermedades concurrentes en la infancia, que generalmente son de causa viral y por tanto no necesitan tratamiento con antimicrobianos. Esto muestra que el grupo de pobladores que se encuentran más expuestos a hacer uso de antimicrobianos son los niños menores de cinco años. Los factores infecciosos más relevantes en las infecciones dentro de hospitales son el Staphylococcus aureus, S. negativo,. Pseudomonas. aeruginosa,. Enterococcus,. Enterobacter,. A. coagulasa. UI M. IC. Escherichia coli, Candida albicans, Klebsiella y otros. También está comprobado que. Q. las infecciones que se adquieren en la Unidad de Cuidados Intensivos, son causadas por. BI O. bacterias resistentes a los antibióticos. Las consecuencias de estas infecciones se deben. Y. a fallas en como el paciente responde al tratamiento farmacológico (enfermedad. RM AC. IA. prolongada y alto riesgo de muerte), periodos más largos de infectividad y rotación a medicamentos de segunda o tercera línea que son más caras y más tóxicas3,4.. FA. Las infecciones por Staphylococcus aureus meticilinoresistente (SAMR) ocurren. DE. generalmente en pacientes con factores que se relacionan a los diferentes servicios de salud. O TE CA. (cirugía previa, hospitalización, cateterismo endovenoso, paciente en diálisis, etc.)5.. LI. El 50% del S. aureus separado en hemocultivos de diversos centros hospitalarios de Lima. BI B. durante el 2008-2009 presentaron Resistencia frente a meticilina. Estos aislamientos comparten las características moleculares del llamado clon brasileño/cordobés que es el predominante en la mayoría de los países de Sudamérica6,7,8. Por otro lado, desde los 90´s se empezaron a describir problemas de salud por SAMR en grupos de personas sin los factores clásicos arriba mencionados, empezándose a reconocerse como problemas de salud por SAMR que se contagiaron en la comunidad, como una forma de diferenciarlos de aquellos adquiridos en el hospital. Estas infecciones. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. típicamente comprometen la piel y partes blandas, pero eventualmente pueden producir neumonía y bacteremia9,10. En referencia al tratamiento farmacológico, las infecciones por SAMR adquiridas en hospitales son además resistentes a diferentes antibioticos como quinolonas, macrólidos y clindamicina, siendo vancomicina el fármaco de elección. Otros antibióticos como linezolid y daptomicina son tomados en cuenta como opción de tratamiento en. IC. A. determinados escenarios clínicos. También aislamientos de S. aureus han sido. UI M. interpretados con baja susceptibilidad a vancomicina, sin embargo, aparentemente esta. BI O. Q. es una condición todavía poco frecuente en países de Latinoamérica11,12,13.. Y. En las infecciones purulentas por SAMR que son adquiridas en la comunidad,. IA. adicionalmente de la selección respectiva, pueden utilizarse como terapia farmacológica. RM AC. por vía oral: clindamicina, cotrimoxazol, tetracilicina (doxiciclina o minociclina) y. FA. linezolid. En caso de celulitis no purulenta, en la que posiblemente también haya. DE. sospecha de una infección por streptococo - hemolítico y se intente cubrir ambas. indicado14,15,16.. O TE CA. opciones, clindamicina sola o cotrimoxazol/tetracilicina asociada a un lactámico sería lo. BI B. LI. De otra forma, en estos últimos años la resistencia de Escherichia coli a cefalosporinas ha ido incrementando. La generación de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) es el principal mecanismo que explica la resistencia a las cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación, así como también frente a aztreonam (monobactámico). La valoración de producción de BLEE por las enterobacterias en países de Latinoamérica es más alta que en otras regiones del mundo17,18. Aislamientos de Escherichia coli en el 2008 de establecimientos de América Latina, determinó una valoración de producción de 26,8% de BLEE. En una publicación de. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Michalopoulos A, se evidenció que la formación de BLEE en Klebsiella y Escherichia coli aisladas de hemocultivos de nueve centros hospitalarios de la ciudad de Lima durante el 2008-2009 fue de 75,1% y 76,8 %, respectivamente. Ningún aislamiento fue resistente a carbapemenes19. En contagios serios por enterobacterias productoras de BLEE, el tratamiento farmacológico de primera línea son los carbapemenes. Muy a pesar de que se han. IC. A. identificado diversos mecanismos de resistencia contra los carbapenems, en nuestro. UI M. entorno no se han reportado aislamientos de enterobacterias resistentes a éstos. En. Q. infecciones no severas, podrían ser prescritos el uso de aminoglucósidos o quinolonas si. BI O. el aislamiento es susceptible a alguno de estos medicamentos antimicrobianos. Por otro. IA. Y. lado, las alternativas terapéuticas no son ilimitadas por razones que las enterobacterias. RM AC. productoras de BLEE generalmente poseen mayor resistencia a las quinolonas y. FA. aminoglicósidos20,21.. DE. Si bien las BLEEs son inhibidas in vitro por los que bloquean las ß- lactamasas como el. O TE CA. ácido clavulánico, la conjugación de un ß- lactámico con un inhibidor de lactamasas no serían de elección para infecciones serias, ya que la hiperproducción de ß - lactamasas y. LI. la pérdida de las porinas pueden producir una disminución en la actividad de los que. BI B. bloquean las ß- lactamasas y en consecuencia la falla terapéutica. Contemplando que E. coli es el agente que causa con más frecuencia infecciones del tracto urinario y que éstas son una de los motivos más comunes en la consulta ambulatoria, es importante el desarrollo de investigaciones locales para determinar la valoración de producción de BLEE en infecciones del tracto urinario en nuestro medio22,23. La resistencia antimicrobiana es responsable de una mayor morbimortalidad, asimismo un incremento en los costos de salud, por tal razón es considerada un problema serio a. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. nivel mundial. Los estados en desarrollo generalmente muestran mayores niveles de resistencia que en países industrializados, asimismo cuentan con menos recursos para el desarrollo de estrategias para su contención. Por lo tanto, aunque es un problema global, tiene mayores consecuencias en los estados que poseen menos recursos. Por esta razón se da la búsqueda de un producto antibacterial de origen natural23. En los últimos años, existe una alta preferencia por el uso de la medicina tradicional. En. IC. A. algunos países latinoamericanos y asiáticos en desarrollo, más de la mitad de la población. UI M. está usando medicina tradicional en atención primaria. En la gran mayoría de estos casos, el. Q. uso de la medicina tradicional es la vía más accesible para la cura del problema de salud. En. BI O. los países desarrollados, ha habido un uso creciente de la medicina tradicional y alternativa,. RM AC. IA. Y. a pesar de que la medicina occidental está fácilmente disponible23.. Por miles de años, las plantas se han utilizado en la práctica de la medicina tradicional. FA. peruana. Específicamente, en la parte norte de la costa de Perú se ha observado por estar. DE. en el centro del eje de la salud de la antigua zona de cultura andina central debido a la. O TE CA. diversa colección de plantas medicinales que crecen en los departamentos del norte. Como resultado, algunos gobiernos nacionales han tratado de integrar la medicina de. LI. uso tradicional como un componente vital de la asistencia sanitaria y el tratamiento.. BI B. Rica en fauna y gran variedad de plantas, Perú se está conociendo como un lugar en el cual se realiza una extensa investigación etnobotánica, en un esfuerzo por preservar las propiedades únicas de las especies vegetales y para obtener una comprensión científica más profunda de cómo estas especies vegetales pueden curar ciertas enfermedades. Un área de concentración es el estudio de las características antibacterianas de ciertas plantas, que son probadas usando bioensayos. En su mayoría, las pruebas y estudios han tenido lugar en la parte norte de Perú, sobre todo en el Callejón de Huaylas24.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Dentro del Perú existen plantas de diferentes especies que son conocidas y empleadas desde los antiguos peruanos por sus propiedades antibacterianas en infecciones, tales como Alchornea castaneifolia, Ambrosia peruviana, Bixa orellana, Cestrum strigillatum, Gentianella bicolor, entre otras24. La Gentianella bicolor (Wedd.) Fabris ex J.S. Pringle conocida comúnmente como: “corpus huay”, “campanilla”, “shashacuma”, “campanilla morada”; es un espécimen. IC. A. vegetal que taxonómicamente pertenece a la familia Gentianaceae, orden de las. UI M. Gentianelas, clase Dycotyledoneae, división Angiospermae. Crece entre los 3 000 y 4. Q. 500 m.s.n.m., que se ha dado a conocer en el departamento de La Libertad y Cajamarca. BI O. en Perú y también en Bolivia. Entre los usos etnomedicinales que posee sale a resaltar. IA. Y. su uso terapéutico como antianémico, antidiabético, antipirético, purificador de la. RM AC. sangre y para alteraciones hepáticas, efecto hipocolesterolémico, se ha empleado en el tratamiento farmacológico de la gastritis, artritis, diabetes y reumatismo. También se le. DE. FA. ha reportado efecto antibacterial in vitro24,25.. O TE CA. No se dispone de mucha información respecto al uso antibacteriano de esta planta, existen pocos estudios, en el documento titulado: “Las plantas peruanas ‘canchalagua’ Schkuhria. LI. pinnata (Lam.) Kuntze, ‘hercampuri’ Gentianella alborosea (Gilg.) Fabris y ‘corpus way’. BI B. Gentianella bicolor (Wedd.) J. Pringle eficaces en el tratamiento del acné”, Bussmann R, Sharon D, Díaz D y Barocio (2008), evaluaron la actividad terapéutica de algunas plantas tradicionalmente usadas contra el acné en la parte norte del Perú, frente a bacterias como Propioniobacterium acnes y Staphylococcus aureus, dentro de las cuales se usó un extracto etanólico de cada una de las especies vegetales estudiadas en pruebas de evaluación de las características antimicrobianas y antiinflamatorias mediante bioensayos, con cepas de bacterias presentes en muestras de orina, piel y de garganta. Se determinó la actividad antimicrobiana de la especie vegetal por un método in vitro, donde 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. se pudo demostrar que Corpus way y las otras plantas ensayadas tienen fuerte actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus, lo que podría explicar su eficacia en el tratamiento farmacológico del acné tradicional. Sin embargo, los mecanismos se desconocen26. Este proyecto se justifica en base a que existen pocos estudios publicados sobre la identificación de los metabolitos bioactivos presentes en las especies Gentianella, una. IC. A. de las causas es en gran medida que la mayoría de estas plantas son endémicas del Perú;. UI M. por otra lado, se han hallado escasas investigaciones publicadas anteriores en las cuales. BI O. Q. se reafirme los usos etnomedicinales y las propiedades terapéuticas de G. bicolor; esto sumado a que actualmente se presentan problemas bacterianos de gran amplitud y con. IA. Y. ello la resistencia bacteriana, los cuales advierten la creciente diseminación. RM AC. intrahospitalaria de Escherichia coli y Staphylococcus aureus resistentes a los antibióticos existentes. Con el fin de extender la disposición de nuevas fuentes de. DE. FA. principios activos, que tengan eficacia terapéutica y a los cuales los microorganismos no. O TE CA. desarrollen mecanismos de resistencia, contrarrestando de esta forma algunos de los problemas más importantes en salud pública.. BI B. LI. Por lo expuesto se plantea el siguiente problema: ¿Presentará efecto antibacteriano in vitro el extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus? Postulándose la siguiente hipótesis: El extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor presenta efecto antibacteriano in vitro frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Objetivos Objetivo general: Determinar el efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. Determinar características organolépticas y fisicoquímicas del extracto. IC. -. A. Objetivos específicos:. Identificar metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de. BI O. -. Q. UI M. hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada”.. -. RM AC. IA. Y. las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada”.. Determinar concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Escherichia. BI B. LI. O TE CA. DE. FA. coli y Staphylococcus aureus.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL Y MÉTODO. 2.1.MATERIAL 2.1.1. Material microbiológico: a) Cepas bacterianas: -. Escherichia coli ATCC 25218. -. Staphylococcus aureus ATCC 13071. A. Proporcionadas por el departamento de Bacteriología de la Facultad de. Q. UI M. IC. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.. Y. 5 Kg de hojas de Gentianella bicolor procedentes del centro poblado. IA. -. BI O. 2.1.2. Material botánico:. RM AC. de Cachur Alto coordenadas geográficas, 7°36´56´´S 77°48´48´´O, del distrito de Marcabal, provincia de Sánchez Carrión, recolectadas. FA. en Junio del 2017.. DE. 2.1.3. Material farmacológico:. O TE CA. a) Discos de sensibilidad: Ciprofloxacino 5 µg para bacterias Gram(-).. -. Penicilina 10 U.I. para bacterias Gram(+). BI B. LI. -. 2.1.4. Material de laboratorio: Los de uso común en el laboratorio de Farmacognosia de la Universidad Nacional de Trujillo.. 2.1.4.1 Medios de cultivo -. Agar Mueller-Hinton 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.1.4.2 Solventes: -. Agua destilada estéril. -. Etanol 96° G.L.. 2.1.4.3 Equipos de laboratorio: Estufa Eléctrica MEMMERT TY U40. -. Baño María MEMMERT SERIE DIN 12877-K1. -. Refrigeradora ELECTROLUX. -. Balanza analítica OHAUS GA 200. -. Balanza común TRIPLE BEAM 700/800 marca OHAUS. -. Autoclave. -. Cocina eléctrica Finely. -. Horno de esterilización. -. Rotavapor HEIDOLPH. -. Turbidímetro MICROSAN. -. Refractómetro Abbe. O TE CA. DE. FA. RM AC. IA. Y. BI O. Q. UI M. IC. A. -. 2.1.4.4 Otros:. Algodón. -. Asa bacteriológica. -. Baguetas de vidrio pyrex. -. Papel de filtro Whatman N°2. -. Pizetas de plástico. -. Placas Petri de vidrio. -. Hisopo. -. Caja de guantes esteriles. BI B. LI. -. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Mascarillas. -. Gradillas de tubos. -. Regla milimetrada. -. Trípode. -. Alcohol. -. Mechero de bunsen. -. Jeringas de 1 y 5 mL. UI M. IC. A. -. BI O. Q. 2.2.MÉTODO. RM AC. Recolección del material vegetal:. IA. Y. A. Análisis Fitoquímico. Se recolectó 1Kg de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada”. FA. del centro poblado de Cachur Alto, del distrito de Marcabal, provincia de. O TE CA. DE. Sánchez Carrión, región La Libertad, durante el mes de Junio del 2017. Identificación taxonómica de la especie vegetal:. LI. Un ejemplar completo de la planta se llevó al Herbarium Truxillense (HUT). BI B. de la Universidad Nacional de Trujillo para su identificación y determinación taxonómica. Preparación del material vegetal26 Selección: Se seleccionó las hojas en mejor estado, que no presentaron ataque por hongos, insectos o que estuvieran decoloradas. Lavado y desinfectado: Luego se procedió a lavar las hojas con agua destilada, seguido de una desinfección, utilizando hipoclorito de sodio al 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 0,5 %. Posteriormente se realizó un enjuague con suficiente agua destilada estéril, esto para retirar los residuos de hipoclorito. Secado: Las hojas se colocaron en papel Kraft, y se llevaron a secar en una estufa a 40 oC por 48 h. Molienda: Las hojas se molieron en el mortero de porcelana hasta reducir. a polvo.. IC. A. Tamizado: El polvo de las hojas se pasó por un tamiz de número de malla. UI M. Nº 0,75.. BI O. Q. Almacenamiento: El polvo tamizado, se guardó en un frasco de vidrio. RM AC. IA. Y. de color ámbar de boca ancha.. Preparación del extracto hidroalcohólico de hoja de Gentianella bicolor. FA. “campanilla morada”27. DE. .  Se pesó con exactitud 30g de polvo de hojas de Gentianella bicolor.  . O TE CA. “campanilla morada” previamente pulverizadas y tamizadas. Luego se vertió en un cartucho de papel de filtro y se colocó en el extractor. LI. del equipo de soxhlet y se extrajo con 250 mL de etanol de 70°. BI B. G.L, usando cocina con termostato para mantener la temperatura de 60oC a 80oC durante 4 horas.. .  El producto se filtró 3 veces, primero con papel filtro Whatman N° 41, un segundo filtrado se realizó con papel filtro Whatman N°4 y por último un tercer filtrado con papel Whatman N°2; obteniéndose un extracto purificado libre de partículas.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . La solución resultante se llevó a sequedad en un rotavapor a presión reducida y a una temperatura de 40 °C; luego se pesó el residuo seco y se guardó en refrigeración a 4°C en frasco de vidrio de color ámbar estéril. De este residuo seco, se prepararon las concentraciones de 5, 10 y 15 mg/mL disueltas en etanol 70° GL. respectivamente. Finalmente, los extractos se guardaron en frascos de vidrio de color ámbar estériles y en. IC. A. refrigeración (4-8C) hasta su utilización en el ensayo antibacteriano.. UI M. Características organolépticas y fisicoquímicas del extracto. BI O. Q. hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor. Y. a) Organoléptico: Los caracteres organolépticos incluyen olor, color,. RM AC. IA. sabor y textura.. Determinación de olor: Se cogió una tira de papel secante de. FA. aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de largo y se introdujo. DE. en un extremo en la muestra de ensayo. Luego se procedió a oler y. O TE CA. se determinó si corresponde con la característica del producto. Determinación del color: En un tubo de ensayo limpio y seco, se. BI B. LI. llenó hasta las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se observó el color, la transparencia, la presencia de partículas y la separación en capas. Determinación del sabor: Se tomó una pequeña alícuota y se saboreó la muestra. Determinación de textura: Se tomó una alícuota y se percibió con el tacto la textura y consistencia.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. b) Fisicoquímico: pH: Se ajustó el equipo con la solución reguladora de pH adecuada al rango en que se realizó la determinación. Posteriormente se determinó el valor del pH de la muestra por triplicado. Los resultados se aproximaron a la décima.. A. Índice de refracción:. UI M. IC. Se colocó sobre el prisma de medición una gota de agua destilada,. Q. utilizando para ello una varilla de vidrio sin cantos agudos, se. BI O. ajustó el equipo, seleccionando a la zona del espectro visible que. Y. aparece en la línea límite del campo visual, moviendo el. RM AC. IA. compensador cromático y colocando la intersección del retículo sobre la línea límite de los campos claro y oscuro. Una vez. FA. calibrado el equipo, se colocó I gota de la muestra y se procedió. O TE CA. DE. como lo antes mencionado por triplicado.. Densidad relativa:. BI B. LI. Se pesó el picnómetro vacío y seco a 25°C y se llenó con la porción de ensayo, manteniendo la temperatura a 25°C (±1° ) durante 15 minutos y luego se ajustó el líquido al nivel empleado. Se pesó cuidadosamente el picnómetro con la porción de ensayo y se repetió la operación con el agua destilada a 25°C. La densidad relativa a 25°C se calculó por la siguiente fórmula: ρ= ( 1 2−− ) ρ2 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde: M: peso del picnómetro vacío (g) M1: peso del picnómetro con la muestra (g) M2: peso del picnómetro con el agua (g) ρ2: densidad del agua a temperatura experimental. Todo el procedimiento se realizó por triplicado. Los resultados se. UI M. IC. A. aproximaron hasta la tercera cifra.. Q. Sólidos totales:. BI O. 5 mL del producto se llevó a una cápsula previamente tarada a 105. IA. Y. ºC, se evaporó sobre baño de agua hasta que el residuo quedó. RM AC. aparentemente seco. Se pasó hacia una estufa y se dejó hasta peso constante (aproximadamente 3 horas). Se retiró la cápsula de la. FA. estufa y se colocó en una desecadora hasta que alcanzó la. DE. temperatura ambiente. Para obtener la masa constante entre una. O TE CA. pesada y otra se mantuvo un tiempo de secado de 60 minutos. La cantidad de sólidos totales, expresado en porcentaje, se calculó. BI B. LI. con la siguiente fórmula: p. (%. v. −. )=. 100. Dónde: Pr: masa de la cápsula más el residuo (g) P: masa de la cápsula vacía (g) V: volumen de la porción de ensayo 100: factor matemático para el cálculo. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Marcha fitoquímica26: Luego de la preparación del extracto hidroalcohólico, este se llevó a sequedad en baño maría y se fraccionó con solventes de polaridad creciente (diclorometano etanolico 70° GL y acuoso), después se realizó el tamizaje fitoquímico a través de reacciones químicas de identificación, mediante cambios de color o formación de. A. precipitados, destinados a determinar la presencia de metabolitos. UI M. IC. secundarios: flavonoides (Shinoda), compuestos fenólicos (cloruro. (Liebermann-Buchard),. BI O. esteroides. Q. férrico), alcaloides (Dragendorff, Mayer y Wagner), triterpenos y quinonas. (Bortranger),. Y. antocianinas (Rosemhein), lípidos (Sudan III), taninos (gelatina) y. RM AC. IA. azucares reductores (Fehling), presentes en el extracto. Ensayo de catequinas: para ello se tomó I gota de la solución. FA. hidroalcohólica, con la ayuda de un capilar y aplicó sobre papel. DE. filtro. Sobre la mancha se aplicó solución de carbonato de sodio. La. O TE CA. aparición de una mancha verde carmelita a la luz UV, indica un ensayo positivo.. BI B. LI. Ensayo de resinas: para detectar este tipo de compuesto, se añadió a 2 mL de la solución hidroalcohólica, 10 mL de agua destilada. La aparición de un precipitado indica un ensayo positivo. Ensayo de la gelatina: sobre el extracto hidroalcohólico se añadió solución de gelatina (1%) que contiene además NaCl (10%). De esta forma precipitan todos los taninos e incluso los pseudotaninos a altas concentraciones.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Enyado. de. Fehling:. permite. reconocer. en. el. extracto. hidroalcohólico la presencia de azúcares reductores. Para ello, si la alícuota del extracto no se encontrase en agua, deberá evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 a 2 mL de agua. Se adicionaron 2 mL del reactivo y se calentó en baño de agua 5 a 10 min. El ensayo se consideró positivo si la solución se. A. colorea de rojo o aparece precipitado rojo.. UI M. IC. Ensayo de Baljet: permite reconocer en el extracto hidroalcohólico. Q. la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, en. BI O. particular cumarinas, aunque otros compuestos lactónicos pueden. IA. Y. dar positivo al ensayo.. RM AC. Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño de agua y redisolverse en la menor. FA. cantidad de alcohol (1 mL). En estas condiciones se adicionó 1mL del. DE. reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración. O TE CA. o precipitado rojo (++ y +++) respectivamente.. BI B. LI. Ensayo de Liebermann-Burchard: permite reconocer en el. extracto hidroalcohólico la presencia de triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos de productos posee un núcleo del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, el solvente debe evaporarse en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo. Se adiciona 1mL de anhídrido acético y se. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo se deja resbalar II a III gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo debe reconocerse por un cambio rápido de coloración: 1) Rosado-azul muy rápido. 2) Verde intenso-visible, rápido.. A. 3) Verde oscuro-negro-final de la reacción.. UI M. IC. Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer. Q. cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene. BI O. cantidades importantes de estos compuestos.. Y. Importante: Para realizar este ensayo no puede haber agua en el. RM AC. IA. medio de reacción, pues ésta con el ácido sulfúrico reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente.. FA. La reacción de Liebermann-Burchard se emplea también para. DE. diferenciar las estructuras esteroidales de los triterpenoides, las. O TE CA. primeras producen coloración azul o azul verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo, rosado o púrpura. Estas coloraciones. BI B. LI. pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas y esteroides saturados que puedan estar presentes.. Ensayo de espuma: permite reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que, si la alícuota se encontrase en alcohol, se ha de diluir con cinco veces su volumen en agua y se agitará, dicha mezcla, fuertemente durante 5 a 10 min.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El ensayo se considera positivo si apareciese espuma en la superficie del líquido de más de 2mm de altura y persistente por más de 2 min. Ensayo de cloruro férrico: permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. Si el extracto de la planta se realiza con alcohol, el ensayo determinará tanto fenoles como taninos. A una alícuota del extracto hidroalcohólico se le añade. A. III gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina. UI M. IC. fisiológica. Si el extracto es acuoso, el ensayo determina. Q. fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añade. BI O. acetato de sodio para neutralizar y III gotas de una solución de. Y. tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica, un ensayo. . RM AC. IA. positivo puede dar la siguiente información general:. Desarrollo de una coloración rojo-vino: compuestos. . Desarrollo de una coloración verde intensa: taninos del tipo. DE. . FA. fenólicos en general.. . Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos.. BI B. LI. . O TE CA. pirocatecólicos.. Ensayo de ninhidrina: permite reconocer en los extractos vegetales la presencia de aminoácidos libres o de aminas en general. Se toma una alícuota del extracto en alcohol, o el residuo de la concentración en baño de agua, si el extracto se encontrase en otro solvente orgánico, se mezcla con 2 mL de solución al 2% de ninhidrina en. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. agua. La mezcla se calienta 5 a 10 min en baño de agua. Este ensayo se considera positivo cuando desarrolla un color azul violáceo. Ensayo de Kedde: permite reconocer en un extracto la presencia de glucósidos cardiotónicos. Una alícuota del extracto en etanol se mezcló con 1mL del reactivo y se dejó reposar durante 5 a 10 min. En un ensayo positivo se desarrolla una coloración. IC. A. violácea, persistente durante 1 a 2 h.. UI M. Ensayo de Borntranger: permite reconocer en un extracto la. BI O. Q. presencia de quinonas. Para ello si la alícuota del extracto no se encontrase en cloroformo, el solvente debe evaporarse en baño de. IA. Y. agua y el residuo redisolverse en 1mL de cloroformo. Se agrega. RM AC. 1mL de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5%. Se agita, mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior. DE. FA. separación. Si la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de. O TE CA. rosado o rojo, el ensayo se considera positivo. Coloración rosada (++), coloración roja (+++).. BI B. LI. Ensayo Shinoda: permite reconocer la presencia de flavonoides en el extracto de un vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1mL de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5 min, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen. Si la alícuota del extracto se encuentra en agua, se procede de igual forma, a partir de la adición del ácido clorhídrico concentrado.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amílico se coloree de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos en todos los casos.. Ensayo de antocianidinas: permite reconocer en los extractos vegetales la presencia de estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. Se calienta 2 mL del extracto etanólico 10 min. con 1 mL de HClcc., se deja enfriar y se añade 1 mL de agua y. IC. A. 2mL de alcohol amílico. Se agita y se deja separar las dos fases. La. UI M. aparición de color rojo a marrón en la fase amílica es indicativa de. BI O. Q. un ensayo positivo.. Y. Ensayo de Dragendorff: Permite reconocer en un extracto la. RM AC. IA. presencia de alcaloides, para ello, si la alícuota del extracto se encuentra disuelta en un solvente orgánico, este se ha de evaporar. FA. en baño de agua y el residuo se redisuelve en 1 mL de ácido. DE. clorhídrico al 1%. Si el extracto es acuoso, a la alícuota se le añade. O TE CA. I gota de ácido clorhídrico concentrado, (calentar suavemente y dejar enfriar). Con la solución acuosa ácida se realiza el ensayo, se. BI B. LI. añade III gotas del reactivo de Dragendorff, si existe: opalescencia se considera (+), turbidez definida (++), precipitado (+++). Ensayo de Mayer: Se realiza según la forma descrita anteriormente, hasta obtener una solución ácida. Se añade luego, una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agita y filtra. Se añade II o III gotas de la solución reactiva de Mayer, y si observa: opalescencia (+), turbidez definida (++), precipitado coposo (+++).. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Observación: En el caso de alcaloides cuaternarios y los aminoácidos libres, éstos solo se encuentran en el extracto acuoso y para considerar su presencia la reacción debe ser (++) ó (+++), que un resultado (+) puede provenir de una extracción incompleta de bases primarias, secundarias o terciarias. Ensayos microbiológicos25:. A. B.. UI M. IC. Determinación del efecto antibacteriano. BI O. Q. Se realizó por el método de Difusión en discos – Método de Kirby – Bauer Fundamento:. IA. Y. Este método se fundamenta en la difusión de un antibiótico o extracto a través. RM AC. de una capa de agar solidificado, en una extensión tal que el crecimiento de. FA. microorganismos sensibles es inhibido en “zonas” alrededor de un disco que. DE. tiene una conocida concentración o dosis del antibiótico o extracto.. O TE CA. Preparación y estandarización del Inóculo bacteriano: Se obtuvo 2 cultivos puros de los siguientes microorganismos, Escherichia. BI B. LI. coli y Staphylococcus aureus; de cada microorganismo se prepararon inóculos en caldos nutritivos. Todos ellos se incubaron a 37°C por 24 horas, luego utilizando caldo Mueller-Hinton, se prepararon suspensiones de cada microorganismo hasta alcanzar una densidad bacteriana similar a la turbidez del nefelómetro de Mac Farland 0.5 (1,5 x 109 UFC/mL). Preparación del medio Se utilizó como medio el caldo Mueller-Hinton, luego se vertió 20 mL en placas Petri hasta obtener un grosor homogéneo de aproximadamente 4 mm. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Las placas luego se llevaron a 37°C en estufa durante 30 a 60 minutos con la finalidad de eliminar la humedad de la superficie de la placa. Inoculación de las placas Se sumergió un hisopo de algodón estéril en la suspensión ajustada. Se roto el hisopo varias veces y se presionó firmemente por las paredes internas del tubo por encima del nivel del líquido. Este procedimiento eliminó el exceso. UI M. IC. A. de líquido del hisopo.. Q. Se inoculó la superficie seca de una placa de agar Mueller-Hinton estriando. BI O. con el hisopo toda la superficie del agar estéril. Se repitió este. Y. procedimiento estriando dos veces más el hisopo, rotando la placa. RM AC. IA. aproximadamente 60º cada vez para asegurar una distribución homogénea del inóculo. Como paso final, se estrió el hisopo por el borde del agar.. FA. La tapa se dejó entreabierta durante tres a cinco minutos, pero no más de 15. DE. minutos, para permitir que el exceso de humedad de la superficie se absorba. O TE CA. antes de aplicar los discos impregnados con el antibiótico y el extracto.. LI. Preparación de los discos. BI B. Los discos se prepararon con papel filtro Whatman N°2 de 5-6 mm de diámetro. Se llevó a esterilizar a la autoclave a 120°C por 15 minutos en una placa Petri. Los discos de papel de filtro estériles se sumergieron dentro de 2mL de cada concentración de 5 mg/mL, 10 mg/mL y 15mg/mL por el periodo de 1 hora.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Aplicación de los discos Sobre las placas sembradas se colocaron los discos con las distintas dosis de 5 mg/mL, 10 mg/mL y 15mg/mL del extracto presionándolos con suavidad sobre la superficie del agar con una pinza estéril; como control se colocó el disco del antibiótico. Transcurridos 30 minutos, las placas se invirtieron e incubaron a 37°C por 24 horas. Todo el procedimiento se llevó a cabo. IC. A. dentro del diámetro de 10 cm de la llama de un mechero.. Q. UI M. Medida de los halos de inhibición. BI O. Se llevó a cabo después de las 24 horas, mediante la inspección visual de. Y. cada placa. Se efectuó tomando el registro en milímetro de los halos de. RM AC. IA. inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Determinación del Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) por. FA. turbidimetría:. DE. Se preparó un set de 24 tubos luego se esterilizaron en autoclave.. O TE CA. Una vez esterilizados, se añadió a cada uno de los tubos 0,8 mL del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor, esto se realizó para las. BI B. LI. concentraciones de 5, 10 y 15mg/mL respectivamente. A todos los tubos se les añadió posteriormente 0,2 mL de suspensión bacteriana semejante al tubo 0,5 del nefelómetro de Mac Farland. Luego se llevó a incubar a 37°C por 24 horas. Este procedimiento se repite por cada cepa bacteriana. Se observaron los resultados y se consideró como CMI a la concentración menor del extracto hidroalcohólico de Gentianella bicolor en el cual. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. comienza a inhibirse el desarrollo por completo, es decir, donde ya no se presenta turbidez.. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) de un factor, utilizando un nivel de significancia del 95% (p<0,05). Este análisis. A. de varianza se obtuvo utilizando el programa estadístico para ciencias. BI B. LI. O TE CA. DE. FA. RM AC. IA. Y. BI O. Q. UI M. IC. (SPSS) 20.0 versión en español.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. Tabla 1. Características organolépticas y fisicoquímicas del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor. RESULTADOS. A. CARACTERÍSTICAS. IC. Organolépticas. Verde oscuro. UI M. Color. Suigeneris. Q. Olor. BI O. Sabor. IA. Fisicoquímicas. RM AC. Densidad Índice de refracción. FA. pH. 0,949 g/mL ± 0,36 1,369 ± 0,50 5,1 ± 0,07 0,297 g/mL ± 0,05. BI B. LI. O TE CA. DE. Sólidos totales. Líquida. Y. Textura. Amargo. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 2. Tamizaje Fitoquímico del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor METABOLITO. ENSAYOS. RESULTADOS. OBSERVACIONES. Baljet. -. No hay cambio de color. Quinonas. Borntrager. -. No hay cambio de color. Triterpenos y/o. Lieberman-. +. Coloración verde azulado. Coloración roja. Lactonas y cumarinas. Burchard. Lípidos. Sudan III. +. Cloruro férrico. +++. Shinoda. ++. Antocianidinas. ++. Dragendorff. ++. Alcaloides. Mayer. Saponinas. Espuma. O TE CA. DE. Gelatina. FA. Wagner Taninos. LI. Aminoácidos. BI B. Azúcares reductores Leyenda: Resultado positivo: + Resultado negativo: –. Q BI O Y. Antocianidinas. Coloración anaranjado Coloración marrón. Precipitado anaranjado. IA. Flavonoides. Coloración verde petróleo. RM AC. Compuestos fenólicos. UI M. IC. A. esteroides. ++. Precipitado blanco. ++. Precipitado marrón. +. Precipitado blanco. +. Si hay formación de espuma y perdura en el tiempo. Ninhidrina. +. Coloración azul violáceo. Fehling. +. Precipitado rojo ladrillo. Intensidad:. + ++ +++. Baja Moderada Alta. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 3. Medida de los halos de inhibición producidos por exposición del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor y los discos de sensibilidad de Ciprofloxacino 5 µg, frente a Escherichia coli.. Halo de inhibición (mm) discos de 6 mm de diámetro Concentración del extracto hidroalcohólico N° de repeticiones. Control negativo. Etanol 70°. 10 mg/mL. 15 mg/mL. Ciprofloxacino 5 µg. -. -. -. 33 30 30 35 30 30 30 30 32 30 35 30 30 30 30 35 31,25 ± 2,05. IC. UI M. Q BI O. Y. IA RM AC. FA DE. A. 5 mg/mL. O TE CA. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 X ± D.E.. Control positivo. -. BI B. LI. Leyenda: X ± D.E.: Promedio y desviación estándar. - : No hay presencia de halo.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 4. Medida de los halos de inhibición producidos por exposición del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor y los discos de sensibilidad de Penicilina 10 U.I., frente a Staphylococcus aureus.. Halo de inhibición (mm) discos de 6 mm de diámetro Concentración del extracto hidroalcohólico. 10 mg/mL. 15 mg/mL. 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 15 15 15 10 9,69 ± 4,27. 20 10 10 20 15 15 20 20 15 15 15 10 15 15 20 20 15,94 ± 3,75. 20 20 20 20 15 15 20 20 15 20 20 20 20 20 20 15 18,75 ± 2,24. Penicilina 10 U.I.. Etanol 70°. A. 5 mg/mL. Control negativo. Q. BI O. Y. IA. RM AC. FA. DE. O TE CA. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 X ± D.E.. UI M. IC. N° de repeticio nes. Control positivo. 20 25 20 25 20 20 20 25 20 20 20 25 25 20 20 20 21,07 ± 2,12. -. BI B. LI. Leyenda: X ± D.E.: Promedio y desviación estándar. - : No hay presencia de halo.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 5. Análisis de Varianza para determinar el efecto del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Staphylococcus aureus. SC. GL. CM. Tratamientos. 6.885. 2. 3.443. Error. 5.594. 45. 0.124. Total. 12.479. 47. Fo 27.696. P 0.0000. BI O. Q. UI M. IC. A. Fuente de variación. Y. Tabla 6. Prueba de Duncan para determinar el efecto del extracto hidroalcohólico de las. RM AC. IA. hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Staphylococcus aureus ni. Concentraciones. 16. 10 mg/mL. 16. Leyenda:. G3. 15.94. O TE CA. 15 mg/mL. G2. 9.69. DE. 5 mg/mL. FA. G1. Grupos para alfa = 0.05. 16. 18.75. BI B. LI. Ni: número de repeticiones.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 20. 18,75 18. 15,94. 16. UI M. IC. A. 14. Q. 12. IA. Y. BI O. 9,69. 10. RM AC. 8 5. 10. FA. 15. O TE CA. DE. Concentraciones (mg/mL). Figura 1. Promedio de halo de inhibición del crecimiento de la bacteria Staphylococcus. LI. aureus con diferentes concentraciones del extracto hidroalcohólico de las hojas de. BI B. Gentianella bicolor “campanilla morada”.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 7. Concentración mínima inhibitoria del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Escherichia coli. UFC Control N° de repeticiones. Concentración del extracto hidroalcohólico Escherichia coli 15 mg/mL. 10334 10337 10336 10333 10335 ± 1,82. -. -. UI M. IC. A. 10 mg/mL. 41798 41802 41799 41801 41800 ± 1,82. Q. 1 2 3 4 X ± D.E.. 5 mg/mL. IA. Y. BI O. Leyenda: UFC: unidades formadoras de colonias. - : No hay presencia de halo.. RM AC. Tabla 8. Concentracion minima inhibitoria del extracto hidroalcohólico de las hojas de. FA. Gentianella bicolor “campanilla morada” frente a Staphylococcus aureus. DE. BI B. LI. 5 mg/mL. 1 2 3 4 X ± D.E.. Control. Concentración del extracto hidroalcohólico. O TE CA. N° de repeticiones. UFC. 29250 29252 29248 29249 29250 ± 1,70. 10 mg/mL. 15 mg/mL. Staphylococcus aureus. -. -. 51799 51798 51802 51801 51800 ± 1,82. Leyenda: UFC: unidades formadoras de colonias. - : No hay presencia de halo.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. En el actual estudio, fue evaluado el efecto antibacteriano in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Una elevada cantidad de los metabolitos activos de especies vegetales se encuentra comprendido en los llamados productos naturales o metabolitos secundarios, que. IC. A. son componentes químicos de estructura diversamente compleja y de restringida. UI M. distribución y más características de orígenes botánicas determinados, que los. BI O. Q. llamados metabolitos primarios29.. Y. Como parte de la respuesta de la defensa química al daño ocasionado en las heridas. IA. y la invasión de microorganismos patógenos en especies vegetales superiores, se. RM AC. induce la formación y aumento de metabolitos secundarios. Durante la reacción. FA. hipersensible, determinados compuestos que son parte de los grupos de los. DE. alcaloides, los terpenoides y los fenilpropanoides, son participe de forma activa. O TE CA. matando directamente al microorganismo patógeno o restringiendo su invasión al resto de la planta30.. BI B. LI. Con respecto a las características organolépticas y fisicoquímicas; en la tabla 1 se muestran los resultados organolépticos del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor, como se observa presentó una coloración verde oscuro, atribuido a la clorofila que es un pigmento natural de color verde, el olor fue suigeneris a un extracto hidroalcohólico, la textura fue liquida y el sabor amargo por la presencia de alcaloides, triterpenos, esteroides, saponinas, flavonoides y taninos31. En relación a las características fisicoquímicas, el extracto hidroalcohólico mostró una densidad de 0,949g/mL, un índice de refracción de 1,369; un pH de 5,1, el carácter. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ácido del extracto ratifica la presencia de compuestos químicos con características ácidas débiles, tales como: flavonoides, taninos, saponinas, entre otros. La cantidad de sólidos totales en 1 mL es de 0,297 g, este resultado permitió preparar muestras del extracto a diferentes concentraciones. No se dispone de trabajos anteriores en los que pueda corroborarse los resultados obtenidos. En los resultados de las características fisicoquímica de una especie vegetal intervienen varios factores, tanto. A. externos, como internos, entre ellos se encuentran: el clima, el cual siempre incluye. UI M. IC. la temperatura, régimen de lluvias, luz, humedad, altitud, latitud, tipo de suelo, entre. Q. otros; además la humedad, que varía según la altitud, puede producir perdidas de. BI O. sustancias solubles de hojas y raíces32.. IA. Y. Los resultados de identificación en la tabla 2, de los compuestos fitoquímicos del. triterpenos. y/o. esteroides,. RM AC. extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor, mostró la presencia de lípidos,. compuestos. fenólicos,. flavonoides,. DE. FA. antocianidinas, alcaloides, taninos, saponinas, aminoácidos y azúcares reductores33.. O TE CA. En la tabla 3 se presentan los diámetros de los halos de inhibición de las diferentes concentraciones del extracto hidroalcohólico frente a Escherichia coli; así tenemos,. LI. el extracto hidroalcohólico de 5 mg/mL, 10 mg/mL y 15 mg/mL no inhibieron a. BI B. Escherichia coli. En la tabla 4 se presentan los diámetros de los halos de inhibición de las diferentes concentraciones del extracto hidroalcohólico de la especie frente a Staphylococcus aureus; así tenemos, para el extracto hidroalcohólico de 5 mg/mL, una media de 9,69 mm, para el extracto hidroalcohólico de 10 mg/mL una media de 15,94 mm, el extracto de mayor concentración (15 mg/mL) expuso una media de 18,75 mm.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Al comparar las medias de los halos de inhibición frente a Staphylococcus aureus de las diferentes concentraciones, mediante el análisis de varianza, se obtuvo un p-valor menor de 0,05; esto significa que hay diferencia estadística entre los resultados de los grupos de intervención y al hacer la prueba de Duncan, tabla 6 se observó que hay diferencia de inhibición entre las tres concentraciones. Este resultado indica que el efecto antibacteriano, observado mediante los diámetros de los halos de. A. inhibición, se debe al extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella bicolor;. UI M. IC. además el efecto fue dosis dependiente, debido a que la concentración de 15 mg/mL. Q. tiene un efecto mayor que la concentración 10 mg/mL, y esta última es mayor que la. BI O. de 5 mg/mL, figura 1.. IA. Y. El efecto antibacteriano, del extracto hidroalcohólico de las hojas de Gentianella. RM AC. bicolor, se explicaría por la existencia de constituyentes fitoquímicos con poder antimicrobiano; tales estructuras, son los fenoles; los cuales constan de un anillo. FA. fenólico sustituido y son los compuestos fitoquímicos más simples. Entre ellos se. DE. encuentran el catecol, pirogalol y los ácidos cinámicos y cafeico. Las posiciones y el. O TE CA. diverso número de grupos hidroxilo (-OH) en el anillo tienden a estar relacionados directamente con el poder tóxico frente a los microorganismos, de forma que un. BI B. LI. aumento en la hidroxilación está relacionado a un elevado grado de toxicidad. El mecanismo parece estar vinculado con la inhibición enzimática por los compuestos oxidados, probablemente a través de reacciones de grupos sulfhidrilo o por interacciones no especificas con proteínas34. Los flavonoides son estructuras fenólicas; éstos son formados por las plantas en consecuencia al ataque microbiano y su efecto sobre las bacterias probablemente se debe a su gran poder de producir complejos con proteínas extracelulares y proteínas solubles, del mismo modo también una función sobre la pared celular parecida a la de 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.