Caracterización estructural de proteínas expresadas por Trichoderma spp asociadas al efecto nematicida en los cultivos de Asparagus officinalis L y Vitis vinífera L por aproximación protéomica

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSTGRADO. SG RA. DO. SECCIÓN DE CIENCIAS AGROPECUARIAS. Caracterización estructural de proteínas expresadas por Trichoderma spp. asociadas al. PO. efecto nematicida en los cultivos de Asparagus officinalis L. y Vitis vinífera L. por. DE. Aproximación Protéomica.. CA. TESIS. IO TE. PARA OBTENER EL GRADO DE. MAESTRO EN CIENCIAS AGROPECUARIAS. MENCION EN MANEJO INTEGRADO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES EN. BI. BL. SISTEMAS AGROECOLOGICOS. Autor: Ing. Nadiezhda Esperanza Burgos Wilson Asesor: Prof. Luis Alberto Ponce Soto Ph.D.. Trujillo-Perú 2017 i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSTGRADO. PO. SG RA. DO. SECCIÓN DE CIENCIAS AGROPECUARIAS. Caracterización estructural de proteínas expresadas por Trichoderma spp. asociadas al efecto nematicida en los cultivos de Asparagus officinalis L. y Vitis vinífera L. por. BI. BL. IO TE. CA. DE. Aproximación Protéomica.. Autor: Ing. Nadiezhda Esperanza Burgos Wilson Asesor: Prof. Luis Alberto Ponce Soto Ph.D.. Trujillo-Perú 2017 i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. PO. Dedico este trabajo a mis padres David Burgos y Dora Wilson por su constante e incondicional apoyo en la realización de todos. DE. mis objetivos, a mi hermano José David esperando ser ejemplo y orgullo para él.. CA. Asimismo va dedicado a mi querida, nueva y pequeña familia; a Cesar Chavez mi compañero y constante impulsador en el. IO TE. cumplimiento de mis metas; y en especial a mi pequeña Antonella Suyay por constituirse en la principal fuente de motivación para. BI. BL. no detenerme y seguir siempre adelante. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. PO. A mis apreciados maestros, Juan Wilson Krugg y Luis Alberto Ponce Soto por las enseñanzas, orientación y apoyo brindado para la ejecución de la presente tesis, por sus. DE. consejos y guía para el logro de los objetivos planteados en la misma.. CA. A mis queridos familiares y amigos, por su permanente apoyo y colaboración en. BI. BL. IO TE. poder llevar a cabo el presente trabajo.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. DEDICATORIA .............................................................................................................................ii AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................. iii. DO. RESUMEN .................................................................................................................................... 1 ABSTRACT .................................................................................................................................. 2 INTRODUCCION............................................................................................................. 3. II.. MATERIAL Y METODOS ............................................................................................. 17. SG RA. I.. 2.1 Objeto de estudio ........................................................................................................... 17 2.2 Instrumentación ............................................................................................................. 17. PO. 2.3. Métodos y Técnicas ........................................................................................................ 18 2.3.1. Obtención de extracto crudo de cepas de Trichoderma. ......................................... 18 2.3.2 Cromatografía en HPLC de fase reversa .................................................................. 18. DE. 2.3.3 Electroforesis bidimensional (2D) ............................................................................ 19 2.3.4 Caracterización Estructural ................................................................................... 20 RESULTADOS ............................................................................................................... 21. CA. III.. IO TE. 3.1 Cromatografía de hidrofobicidad en HPLC de fase reversa de muestras procedentes de 4 cepas de Trichoderma: T. asperrellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum: ............... 21 3.2 Electroforesis bidimensional (2D) ................................................................................. 24 3.3 Caracterización de la estructura primaria de “novo” por espectrometría de masa MS/MS. 26. BL. 3.4 Estudio de homología secuencial (Analisis Bioinformático), a partir de 4 cepas de Trichoderma: T. asperrellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum. ............................. 28 DISCUSIÓN .................................................................................................................. 38. V.. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 43. VI.. BI. IV.. VII.. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .......................................................................... 44. VIII.. ANEXOS ........................................................................................................................ 48. RECOMENDACIONES................................................................................................ 44. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN En el presente trabajo, en forma preliminar, fue realizado un análisis estructural de dos hidrolasas: endoquitinasa (T5) y glucanasa (T6) por aproximación proteómica de 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum. denominados como T5 y T6.. DO. Ambas celulasas, fueron separadas por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC de fase reversa) usando una columna análitica C-18, con un alto grado de. SG RA. resolución. Se separaron para todas cepas nueve (9) picos protéicos denominados como T1 a T9 respectivamente. Posteriormente se seleccionaron las celulasas correpondientes a los picos T5 y T6 para las 4 cepas de Trichoderma estudiadas, por ser de importancia en el mecanismo de control de Meloidogyne incógnita.. PO. Posteriormente para corroborar el grado de pureza y homogeneidad molecular, fueron realizados una electroforesis bidimensional (2D), en el que se reveló un perfil de. DE. spots de proteínas semejantes para las 4 cepas en estudio, siendo identificadas las cepas T5 y T6 para su posterior estudio de aproximación proteómica. Cada uno de los picos correspondientes a las proteínas indentificadas como T5 y T6. CA. de las cuatro cepas de Trichoderma, fueron sometidas a una hidrólisis tríptica, con el. IO TE. objetivo de seleccionar uno de sus péptidos generados a fin de realizar un secuenciamiento de los mismos por espetrometría de masa MALDi TO/TOF y poder realizar la búsqueda de la identidad en la base de datos de UniProtKB/Swiss-Prot. Por Medio del Software PROTEINPILOT, se identificó que estas secuencias pertenecen a la que fueron. BL. identificadas en las familias endoquitinasas y gluconasas.. BI. El secuenciamiento de “novo”, contribuyó significativamente para poder establecer regiones consenso para todos los péptidos generados y estudiados en la homología secuencial, para las cuatro cepas de Trichoderma; T. asperrellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum.. Palabras clave: Aproximación proteómica, Trichoderma spp., Meloidogyne incognita, gluconasa y endoquitinasa.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT In the present work, preliminarily, it was conducted a structural analysis of two hydrolases : Endochitinase (T5) and glucanase (T6) by proteomic approach of four strains of Trichoderma: T. asperellum, T. viride, and T. atrovoride T. harzianum. referred to as T5 and T6.. DO. Both cellulases were separated by high performance liquid chromatography (HPLC reverse phase) using a C-18 analytical column, with a high degree of. SG RA. resolution. They separated for all strains nine (9) proteinaceous peaks referred to as T1 to T9 respectively. Subsequently cellulases caesarean to T5 and T6 were selected for the 4 strains of Trichoderma studied, being of importance in the control mechanism of Meloidogyne incognita.. PO. Afterwards in order to confirm the purity degree and molecular homogeneity was performed a two-dimensional electrophoresis (2D). In which a fellow men. DE. proteins spots profile was revealed for all 4 strains under study, being identified T5 and T6 strains for their subsequent proteomic approach study. Each of the peaks corresponding to the proteins indentificadas as T5 and T6 of. CA. the four strains of Trichoderma, were subjected to a tryptic hydrolysis, in order to. IO TE. select one of the peptides generated a view to make an sequencing of them by espetrometría of MALDI mass tO / TOF and to search for identity in the database UniProtKB / Swiss-Prot. Through The PROTEINPILOT Software it identifies that these sequences belong to which were identified in families endochitinases and. BL. glucanases.. BI. Sequencing of "novo", contributed significantly to establish consensus regions. for all peptides generated and studied in sequence homology for the four strains of Trichoderma; T. Asperrellum, T. viride, T. harzianum and T. atrovoride.. Key words: Proteomics approach Trichoderma spp., Meloidogyne incognita, gluconasa y endoquitinasa. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCION Aunque la disponibilidad de las secuencias del genoma y herramientas bioinformáticas haga posible, que la predicción de proteínas potencialmente secretadas sea relativamente sencilla, es interesante que este enfoque desde la perspectiva del control biológico sea evidenciado en la expresión de proteasas. DO. excretadas por hongos controladores como es el caso de Trichoderma, sobre Meloidogyne capaz de parasitar las raíces de diversos cultivos de importancia. SG RA. económica. Hasta el presente poco ha sido estudiado en la ecología de hongos (Grinyer et al., 2004).. Los estudios sobre la presencia de oligosacáridos y enzimas oxidativas durante el. PO. desarrollo o crecimiento de la celulosa de Trichoderma, ha sido bien estudiado, sin embargo la riqueza de su arsenal proteíco en términos de expresión diferencial sobre. DE. moléculas responsables así como las diferentes regiones o sitios dentro de la molécula con capacidad nematicida, se sabe muy poco. Probablemente el aspecto más destacable es la interacción de diferentes regiones o dominios en el mecanismo de. IO TE. CA. control por parte de Trichoderma sobre Meloidogyne (Grinyer et al., 2004).. Por otro lado el aspecto más destacable es conocimiento pleno de las proteínas desconocidas y aisladas, que en conjunto pudieran representar aproximadamente el 50% del secretoma de Trichoderma. Tales proteínas podrían incluir efectores claves. BL. que controlen el reconocimiento de macromoléculas de organismos patógenos como. BI. es el caso de Meloidogyne en su hábitat natural (Cook y Baker, 1989). El hecho de que estas proteínas o enzimas aún no se hayan descrito en lo análisis proteómicos de filtrados de Trichoderma, podría ser debido al tamaño que escapan a una escala de la electroforesis uni o bidimensional. Teniendo en cuenta el hecho, sería de extrema importancia el conocimiento de la acción y propiedades de estas proteínas y enzimas presentes en Trichoderma (Neuhof et al., 2007). 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el presente trabajo, hemos demostrado caracterizado parcialmente dos enzimas una endoquinasa y glucanasa las cuales podrían estar involucradas en el papel de control sobre Melodoygine presentes en las raíces de Asparagus officinalis L. y Vitis vinífera L.. En la Proteomica Funcional, los proyectos de secuenciación a gran escala están. DO. proporcionando una ingente cantidad de secuencias de DNA. Sin embargo, aún se desconoce la función biológica de la mayoría de las proteínas codificadas por los. SG RA. genes detectados. Así pues, el siguiente paso en la era post-genómica debe ser el estudio funcional de todos estos genes.. Se puede decir que hubo tres factores decisivos para el desarrollo de la proteómica: - La secuenciación de genomas a gran escala y el desarrollo de bases de datos de. PO. proteínas.. - El desarrollo de técnicas de espectrometría de masas para analizar proteínas y. DE. péptidos.. CA. - Los avances realizados en la separación de proteínas mediante 2D-PAGE.. La proteómica es uno de los campos que puede ayudar a establecer una conexión. IO TE. entre las secuencias genómicas y su comportamiento biológico, constituyendo una herramienta importante en el análisis funcional de genes de función desconocida. El término Proteoma fue usado por vez primera en 1995 para describir el conjunto de. BL. proteínas de un genoma, en una célula o un tejido. De forma imperceptible, la palabra proteoma dio lugar a una nueva disciplina, la Proteómica (Westermeier y Naven,. BI. 2002).. Proteómica es el estudio a gran escala de los productos génicos de un genoma mediante métodos bioquímicos, con el fin de obtener una visión global integrada de los procesos celulares. El término proteómica se ha asociado tradicionalmente con la separación de un gran número de proteínas de una célula u organismo mediante 2DPAGE. Según esto, la proteómica comienzo en los años setenta cuando se empezaron a construir bases de datos de proteínas utilizando la electroforesis bidimensional. Sin 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. embargo, la identificación de las proteínas era difícil debido a la falta de métodos analíticos rápidos y sensibles para la caracterización de las proteínas. (Lorito et al., 2010).. En los años noventa la espectrometría de masas surge como un método analítico muy poderoso, ya que limita la mayoría de las limitaciones del análisis de proteínas.. DO. Este desarrollo, junto con la disponibilidad de los genomas secuenciados marca el comienzo de una nueva era. Actualmente muchas áreas de estudio han sido agrupadas. SG RA. dentro de la proteómica. Se pueden incluir, entre otros, los estudios de interacciones de proteínas, de modificaciones pos-traduccionales, el análisis funcional de las proteínas y estudios de localización (Westermeier y Naven, 2002).. PO. Se puede hablar de dos tipos de proteómica: proteómica de expresión y proteómica del mapa celular. La proteómica de expresión es el estudio cuantitativo de. DE. la expresión de proteínas entre muestras que difieren en alguna variable. En esta estrategia se compara la expresión del proteoma total o de subproteómas entre. CA. diferentes muestras. La información obtenida puede permitir la identificación de nuevas proteínas implicadas. La proteómica del mapa celular o estructural es el. IO TE. estudio de la localización subcelular de las proteínas y de las interacciones proteínaproteína, mediante la purificación de orgánulos o complejos y la posterior identificación de sus componentes mediante espectrometría de masas. También se. BL. utiliza el término de proteómica funcional para referirse a diversas aproximaciones proteómicas que permiten el estudio y caracterización de un grupo de proteínas. BI. determinado proporcionando información importante sobre señalización, mecanismos de la enfermedad o interacciones proteína-fármaco (Westermeier y Naven, 2002).. El desarrollo de la proteómica se debe en parte a los avances importantes realizados en la tecnología de proteínas. Sin embargo, la metodología disponible tiene sus limitaciones y actualmente todavía no es posible realizar muchos tipos de proteómica. Es necesario mejorar algunas de estas limitaciones y desarrollar nuevas. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. tecnologías para conseguir el máximo partido. Las cuatro plataformas de la tecnología proteómica son: - Preparación y manejo de la muestra - Determinación de la información de la secuencia parcial de aminoácidos - Identificación y cuantificación de proteínas. DO. - Mapeo celular (Westermeier y Naven, 2002).. La tecnología más usada para la separación de proteínas es la electroforesis en. SG RA. geles de poliacrilamida. Esta técnica es la más eficaz para resolver mezclas complejas de proteínas. Para muchas aplicaciones proteómicas, la electroforesis en una dimensión es el método de elección. Las proteínas se separan de acuerdo a su masa y como las proteínas son solubilizadas en dodecil sulfato sódico (SDS), no suele haber. PO. problemas de solubilización. Es una técnica sencilla, reproducible y permite la separación de proteínas de 10-300 KDa. Una de las aplicaciones más comunes de la. CA. previa (Castellanos, 2004).. DE. 1-DE es la caracterización de proteínas después de realizar algún tipo de purificación. La electroforesis bidimensional 2D-PAGE permite separar hasta miles de. IO TE. proteínas en un solo experimento, y constituye actualmente el método más eficiente para la separación de mezclas muy complejas de proteínas. Está basada en una separación de proteínas en función de la carga, seguida de una separación de las. BL. proteínas en función de su masa molecular. La separación de la primera dimensión se realiza mediante isoelectroenfoque, durante el cual las proteínas son separadas en un. BI. gradiente de pH hasta alcanzar una posición en la que su carga neta es cero, es decir, su punto isoeléctrico. En una segunda dimensión, las proteínas son separadas mediante electroforesis en presencia de SDS. La alta resolución de la técnica se basa en que las dos separaciones se basan en parámetros independientes. La innovación clave para la 2D-PAGE fue el desarrollo de geles con un gradiente de pH inmovilizado (IPG) (Westermeier y Naven, 2002).. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El gradiente de pH inmovilizado elimina los problemas de inestabilidad del gradiente y baja capacidad de carga que iban asociados a los gradientes de pH preparados con anfolitos acarreadores. En los geles IPG, el gradiente es generado por las llamadas inmobilinas y está copolimerizado con la matriz de acrilamida del gel. Este sistema ha permitido mejorar la resolución y reproducibilidad de los geles así como aumentar la cantidad de proteína que puede ser cargada. La reproducibilidad. DO. conseguida con los IPGs ha hecho posible la comparación de mapas entre distintos. SG RA. laboratorios, facilitando así el intercambio de información (Simpson, 2003).. En cuanto a la detección de proteínas, tradicionalmente se ha venido empleando el marcaje radioactivo o la tinción con azul de de Coomassie, o con plata, para conseguir mayor sensibilidad. También se ha desarrollado un método de tinción de. PO. plata superficial compatible con la digestión proteica y la espectrometría de masas, aunque el umbral de detección no es tan sensible como el seguido con los protocolos. DE. de tinción de plata más utilizados. Así mismo, se han comenzado a utilizar tinciones y marcajes fluorescentes (Sypro-Ruby, Cy3, Cy5) que presentan un sensibilidad. CA. comparable a la plata y también permiten el análisis posterior de las proteínas mediante espectrometría de masas. También se han desarrollado programas para. IO TE. comparar las imágenes de 2D-PAGE y facilitar la identificación y cuantificación de manchas de proteínas entre diferentes muestras (Rabilloud, 2000).. BL. La aplicación principal de la 2D-PAGE es la proteómica de expresión. En esta aproximación, la expresión de proteínas de dos muestras se puede comparar de forma. BI. cuantitativa. La aparición o desaparición de manchas proporciona información sobre la expresión diferenciadle proteínas y la intensidad de las manchas permite conocer los niveles de expresión. Para realizar estos estudios se pueden utilizar organismos completos, líneas celulares o fluidos biológicos. Se pueden comprar tejidos normales con tejidos enfermos, o células tratadas con drogas o diferentes estímulos. Otra aplicación importante de la proteómica del mapa celular, donde la 2DPAGE se utiliza para hacer mapas de proteínas de microorganismos, orgánulos celulares y complejos de proteínas. También se puede utilizar para caracterizar proteínas en subproteomas 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. que se han obtenido mediante alguna forma de purificación del proteoma (Westermeier y Naven, 2002).. La 2D-PAGE también presenta muchas limitaciones. Es una técnica muy laboriosa que requiere bastante tiempo, y difícil de automatizar. La 2D-PAGE está limitada por el número y el tipo de proteínas a resolver. Las proteínas muy grandes o. DO. hidrofóbicas no entran en el gel durante la primera dimensión y las proteínas muy ácidas o muy básicas no se resuelven bien. Algunos de estos problemas se pueden. SG RA. resolver mediante fraccionamiento, la utilización de IPGs con diferentes rangos de pH. Otra limitación importante de la 2D-PAGE es la detección de proteínas poco abundantes, algunas de ellas se consideran muy importantes (proteínas regulatorias, proteínas implicadas en la transducción de señales, receptores). En estos estudios es. PO. necesario realizar un fraccionamiento de la muestra para reducir la complejidad de los extractos. Debido a estas limitaciones, la mayor aplicación de esta técnica en el futuro. DE. será el análisis y caracterización de sub-proteomas y de complejos proteicos. CA. (Simpson, 2003).. Las limitaciones de la 2D-PAGE han impulsado el desarrollo de otras. IO TE. metodologías. Una estrategia desarrollada consiste en digerir con tripsina una mezcla de proteínas para después purificar y analizar los péptidos mediante MS. Los péptidos se pueden purificar mediante cromatografía liquida, electroforesis capilar o mediante. BL. una combinación de técnicas como cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de fase reversa. La ventaja de este procedimiento es que se dispone de. BI. una gran cantidad de proteínas. Sin embargo, el análisis de los datos requiere una enorme cantidad de tiempo y ordenadores muy potentes. Además se puede perder mucho tiempo y esfuerzo en el análisis de proteínas que no tienen interés (Rabilloud, 2000).. En los proyectos proteómicos la identificación de proteínas es esencial; es el primer paso para otros estudios que suponen en última instancia la caracterización funcional. Además, en el caso de los geles bidimensionales, la identificación de las 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. manchas conduce a la creación de mapas de referencia, que definen las proteínas expresadas por unos organismos o tejido en unas condiciones determinadas. Las proteínas pueden ser identificadas por diversos procedimientos, entre los que se incluyen la secuenciación del extremo N-terminal, detección con anticuerpos específicos, composición de aminoácidos, co-migración con proteínas conocidas, y sobre-expresión y deleción de genes. Todos estos métodos generalmente son lentos,. DO. laboriosos, o caros, y por tanto no resultan apropiados para su utilización como. SG RA. estrategias a gran escala (Simpson, 2003).. Debido a su rapidez y elevada sensibilidad, la espectrometría de masas se ha convertido en el método de detección para la identificación de proteínas a gran escala, el primer paso para el estudio de proteoma de distintos organismos. También permite. PO. la caracterización de modificaciones post-traduccionales que presentan relevancia fisiológica, tales como la glicosilación y la fosforilación. La estrategia general. DE. empleada para la identificación a gran escala de proteínas mediante espectrometría de. BI. BL. IO TE. CA. masas se muestra en la Figura.1.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura.1 Estrategia para la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas (Pitarch et al, 2003).. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El análisis de las proteínas mediante espectrometría de masas ha sido posible gracias al desarrollo de varios métodos de ionización suave para convertir biomoléculas grandes, polares y no volátiles en iones en fase gaseosa. Los espectrómetros de masa están formados al menos por una fuente de iones, un analizador de masas y un detector que mide la relación masa/carga (m/z) de los iones en fase gaseosa.. 1.. DO. Esta técnica tan robusta implica: La conversión de los péptidos en iones en fase gaseosa mediante técnicas de. SG RA. ionización suave, como ionización desorción con láser asistida con matriz (MALDI) a partir de una muestra en estado sólido, o la ionización mediante electrospray (ESI) de una muestra en solución. 2.. Separación de los iones según su m/z en un analizador de masas (por ejemplo. PO. un analizador tipo ToF (Time of Flight), cuadrupolo, trampa iónica, etc.) Fragmentación opcional de los iones peptídicos.. 4.. Medida de las masas en un detector obteniendo un espectro de masas que. DE. 3.. CA. refleja la abundancia de los iones frente a su valor m/z. (Gil, 2003).. Recientemente se han desarrollado también fuentes de MALDI que se acopan a. IO TE. un analizador QToF o a dos analizadores ToF en tándem (MALDI-ToF/ToF). Para la identificación de proteínas se han desarrollado diversas estrategias. -. Identificación mediante huella peptídica (PMF: peptide mass finger printing) o. -. BL. mapeo peptídico utilizando un espectrómetro tipo MALDI-TOF. Identificación mediante fragmentación de péptidos obteniendo la secuencia. BI. total o parcial de los aminoácidos (etiqueta de secuencia) utilizando un espectrómetro de masas en tándem (Gil, 2003).. La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional (Rabilloud, 2000).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer también mediante estas técnicas, las características ácido-básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación. DO. cromatográfica basada en diferencias de carga. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas. SG RA. polipeptídicas de las proteínas (Rabilloud, 2000).. La electroforesis bidimensional es una sucesión de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones) realizadas sobre una misma muestra. En la primera de ellas. PO. (primera dimensión) se separan los componentes de la muestra según un criterio (carga, tamaño o pI), y en la segunda (segunda dimensión) según un parámetro. DE. distinto del anterior. De esta manera, se combinan dos modos de separación diferentes y se consigue el máximo de resolución posible mediante técnicas. CA. electroforéticas (Gaal et al., 1984).. IO TE. La primera dimensión puede llevarse a cabo, por ejemplo, en condiciones no desnaturalizantes y la segunda en condiciones desnaturalizantes; las proteínas ribosomales se separan en un gel discontinuo en la primera dimensión, seguido por. BL. otro continuo en la segunda, y ambos en presencia de urea; las histonas se separan en geles con urea y ácido en la primera dimensión y utilizando tritón/ácido/urea en la. BI. segunda (Rabilloud, 2000).. Sin embargo, normalmente, la idea de electroforesis bidimensional suele referirse a la combinación de los dos tipos de electroforesis más resolutivos: electro enfoque (primera dimensión) y SDS-PAGE (segunda dimensión). La electroforesis bidimensional puede considerarse como un criterio de pureza positivo debido a su gran poder de resolución, aceptándose que la aparición de una sola mancha indica una muestra homogénea (Westermeier y Naven, 2002). 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La proteína de interés se recupera del gel cortando la banda manualmente, aunque existen también sistemas automatizados. Antes de añadir la enzima al fragmento de gel con la proteína de interés, éste se deshidrata mediante lavados sucesivos con acetonitrilo y posteriormente se seca al vacío. Este paso favorece que la enzima se incorpore eficientemente por difusión cuando el gel es rehidratado con el buffer de digestión. Una vez llevada a cabo la reacción enzimática los péptidos. DO. producidos se extraen de la matriz del gel por difusión utilizando solventes orgánicos y ácidos, entre ellos el ácido trifluoroacético y el acetonitrilo. Para eliminar. SG RA. eficientemente sales, buffers y contaminantes de los péptidos extraídos de la matriz del gel se utilizan columnas de cromatografía en fase reversa (RP-HPLC). Una vez eliminados los contaminantes, las muestras están listas para ser analizadas por MS si se encuentran en la concentración requerida por el método. Las proteínas resueltas en. PO. geles de poliacrilamida pueden también ser transferidas por electroblotting a membranas con tripsina inmovilizada donde se lleva a cabo su fragmentación (Graves. DE. y Haystead, 2002).. CA. Mediante espectrometría de masas es posible obtener información estructural de las proteínas tal como secuencia de aminoácidos y la masa de los péptidos. Esta. IO TE. información puede utilizarse para identificar proteínas comparando los resultados con bases de datos. La espectrometría de masas también resulta útil para identificar y localizar modificaciones post-traduccionales en las proteínas (Westermeier y Naven,. BL. 2002). La recolección de información por medio de MS se podría dividir en las 3. BI. etapas que se mencionan a continuación.. Como se mencionó previamente, la proteína se resuelve de una mezcla proteica. empleando generalmente técnicas electroforéticas. Debido a que la conversión de la proteína en sus constituyentes peptídicos proporciona mayor información que la obtenida con la proteína completa es necesario llevar a cabo una fragmentación de la misma. Una vez obtenidos los constituyentes peptídicos estos pueden ser purificados por RP-HPLC, utilizando ZipTips (Millipore) o material de perfusión Poros R2 (PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass) (Westermeier y Naven, 2002). 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Para el análisis de muestras biológicas por MS es necesario que las moléculas estén cargadas eléctricamente y secas. Este requisito se cumple convirtiendo las moléculas en iones desolvatados. Han sido varias las técnicas que se han desarrollado con este fin, las primeras de ellas se basaron en el impacto de electrones y en la ionización química. Estas técnicas resultaron efectivas para ionizar moléculas pequeñas pero no para la ionización de moléculas de alto peso molecular, como las. DO. biomoléculas. La espectrometría de masas se revolucionó en 1981 gracias a la introducción del bombardeo rápido de átomos (FAB, fastatombombardment) por. SG RA. Barber. Esta técnica posibilitó la ionización y detección de biomoléculas con relativamente buena sensibilidad. Hoy en día, los métodos más comúnmente empleados para generar iones desolvatados son el MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) y el ESI (electrosprayionization), estos han reemplazado por. PO. completo al FAB. Tanto el MALDI como el ESI son métodos de ionización suaves donde se mantiene relativamente la integridad de la muestra (Westermeier y Naven,. DE. 2002).. CA. Este método fue introducido en 1988 por Karas y Hillenkamp. En el MALDI la muestra se incorpora en una matriz de moléculas y posteriormente es sometida a. IO TE. radiación con un láser. El láser promueve la formación de iones moleculares. La matriz, capaz de absorber luz de la longitud de onda emitida por el láser, está constituida por una molécula pequeña tal como el ácido 2,5-dihidroxibenzóico, el. BL. ácido α-ciano-4-hidroxicinámico o el ácido sinapínico. Tanto la muestra como la matriz se colocan en una placa de metal y se dejan evaporar, propiciando la. BI. formación de cristales. La placa de metal se coloca en el espectrómetro y el láser es dirigido automáticamente a sitios específicos de la placa. La luz emitida por el láser, generalmente con una longitud de onda de 337 nm, causa la desorción y la ionización de la muestra tanto por protonación como por desprotonación generando iones predominantemente monovalentes. Los iones producidos son posteriormente acelerados hasta el analizador (Westermeier y Naven 2002).. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El proceso puede estar automatizado desde la aplicación de la muestra hasta la recolección y el análisis de los datos, lo que constituye la principal ventaja del MALDI. Adicionalmente, no siempre es necesario que las muestras a analizar sean sometidas procesos de purificación después de la digestión en gel, lo que constituye otra ventaja de este método sobre el ESI (Westermeier y Naven, 2002).. DO. Después de la conversión de proteínas o péptidos en iones moleculares, estos son acelerados desde la fuente de iones hacia el analizador de masa. En el analizador de. SG RA. masa los iones son separados de acuerdo a su relación carga-masa (m/z) en el vacío. El Analizador de tiempo de vuelo (ToF), es uno de los analizadores más simples. Mide la relación m/z de un ión determinando el tiempo requerido para recorrer la longitud de un tubo de vuelo desde que el ión abandona la fuente de iones; el ión es. PO. impulsado con una velocidad inicial, la cual depende directamente de su masa. El tiempo de vuelo del ión es proporcional a la raíz cuadrada de su relación m/z dada. DE. una aceleración constante provocada por el voltaje (Gil, 2003).. CA. Tiempo de vuelo= k √(m/z). IO TE. Algunos analizadores de masa de ToF incluyen un espejo de iones o reflectrón al final del tubo de vuelo, el cual repele los iones a través de este tubo y los dirige al detector. De esta forma, se ve incrementada la longitud del tubo de vuelo con lo que. BL. mejora la resolución. El reflectrón sirve también para corregir las pequeñas diferencias en la energía cinética (Ec) que existe entre iones de la misma masa. Estas. BI. diferencias se deben a la posición que guarda cada ión en la fuente de iones al momento de que son acelerados al aplicar una diferencia de potencial. Las diferencias en la energía cinética de los iones se reduce debido a que los iones con Ec mayor viajan más lejos en el reflectrón que los iones con Ec menor. Esto ocasiona que los iones con la misma masase enfoquen mejor en el detector mejorando considerablemente la resolución y la precisión del cálculo de masas (Westermeier y Naven, 2002).. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los datos generados en un espectrómetro de masas, son visualizados en forma de picos; a la representación gráfica de los datos se le denomina espectro de masas. Cada uno de los picos de un espectro de masas representa valores de m/z y la intensidad de cada señal. Definir la identidad o secuencia de una proteína a partir de su espectro de masa es un procedimiento común en estudios de proteómica. Utilizando la información contenida en bases de datos es posible la identificar rápidamente un gran. DO. número de proteínas con gran precisión (Simpson, 2003).. SG RA. La identificación exitosa de proteínas depende de la calidad de los datos generados en el espectrómetro de masas, de los datos contenidos en la base de datos y, del método empleado en la búsqueda de datos. En general, existen diversas estrategias para el manejo de datos obtenidos por MS, algunas de ellas se describen a. PO. continuación (Graves y Haystead, 2002).. DE. El secuenciamiento de novo tiene como objetivo el conocimiento real de la proteína al obtener secuencias completas de aminoácidos que se deduzcan de novo de. CA. los espectros MS/MS (bien mediante interpretación manual o con ayuda de algoritmos) y buscar homologías frente a proteínas presentes en bases de datos.. IO TE. La secuenciación de novo es necesaria cuando el análisis por MFP o MS/MS no interpretado no produce resultados confiables. Esto es común en casos en que el genoma del organismo del cual procede la proteína no ha sido caracterizado. BL. completamente. Aunque la proteína de interés pueda no ser identificada o sea una proteína desconocida, la información de la secuencia puede ser utilizada para clonar. BI. el gen correspondiente (Westermeier y Naven, 2002).En condiciones de baja energía, el ión precursor se fragmenta para producir iones -b y -y de longitudes variadas. La secuencia de los iones de ambas series es complementaria, de manera que es posible obtener una secuencia completa aun cuando existan gaps en la secuencia de una u otra serie.. Cuando los péptidos son obtenidos por digestión con tripsina, el extremo Cterminal de los mismos es arginina o lisina. En un espectro MS/MS, el residuo C16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. terminal se puede observar en el fragmento correspondiente al ión-y1. Por tanto, el punto de inicio de la serie y siempre será conocido. A la masa observada del ión-y1 hay que añadir la masa de una molécula de agua y de un protón. Si la masa del ión y1 es de 175 Da, entonces el residuo es arginina; en cambio, si la masa es de 147 Da el residuo es lisina. Una vez identificado el ión y1 en el espectro, la secuencia de la serie. MATERIAL Y METODOS 2.1. SG RA. II.. DO. puede iniciarse a partir de ese punto ( Gil, 2003).. Objeto de estudio. Las cepas de Trichoderma spp fueron proporcionadas por el Prof. Juan Wilson Krugg de la Universidad Nacional de Trujillo. Dichas cepas provinieron de una. PO. selección realizada por el grupo de investigación del proyecto “Aproximación al proteoma de aislados nativos de Trichoderma spp., para caracterizar su efecto. DE. biocontrolador sobre nemátodos noduladores que afectan cultivos de Asparagus officinalis y Vitis vinífera”, el proceso de obtención y selección de las cepas a. Instrumentación. IO TE. 2.2. CA. detalle se indica en las tesis citadas (Cox, 2015; Rojas, 2015).. La infraestructura, y equipos utilizados en la presente investigación, fueron compartidos, entre Laboratorio del Prof. Juan Wilson Krugg de la Escuela. BL. Acádemica y profesional de Biología de la Universidad de Trujillo y el Instituto de Biología de la Universidad del Estado de Campinas-SP BRASIL, bajo la. BI. supervisión y colaboración Prof. Luis Alberto Ponce Soto Ph.D. Todos los solventes, productos químicos y reactivos químicos a utilizar fueron de un alto grado de pureza, procedentes de Aldrich (Aldrich Chemical Co, Inc. Wisconsin, U.S.A.), Applied Biosystems (Applied Biosystems - Perkin Elmer Division, U.S.A.), Bio-Rad (Bio Rad Laboratories - California, U.S.A.), Merck (Merck - Darmstadt, Germany), Sigma (Sigma Chemical Co - St. Louis, U.S.A.),.Pierce (Pierce Chemical Company - Illinois, U.S.A).. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.3. Métodos y Técnicas 2.3.1. Obtención de extracto crudo de cepas de Trichoderma.. A partir de los. cultivos jóvenes de T. asperrellum, T. viride, T.. atrovoride y T. harzianum nativos, se realizó una siembra por suspensión en. DO. frascos planos de vidrio conteniendo Agar Papa Dextrosa (PDA), los cuales fueron incubados a 25 °C durante 7 días. Posteriormente se obtuvo una. de. polipropileno. conteniendo. SG RA. suspensión de conidias de estos cultivos, lo que se inocularon en bolsas arroz,. las. cuales fueron incubadas a. temperatura ambiente (27°C) por dos semanas. Una vez obtenidos los cultivos de los hongos se procedió con la producción de biomasa en frascos de vidrio. PO. de 1L. a modo de biodigestores, en cada frasco se colocó 500 ml. de caldo papa más antibiótico y se dejó enfriar para inocular con 4ml de una. DE. suspensión de conidias de Trichoderma en cada frasco.. Realizada la inoculación se procedió a conectar el sistema de aireación. CA. a cada uno de los frascos para la multiplicación de los cultivos de. IO TE. Trichoderma spp. durante 5 días para la obtención de micelio y una vez obtenida la biomasa los cultivos, se procedió a filtrar y centrifugar la muestras de para eliminar el medio líquido trabajando unicamente con el micelio. Este proceso se realizó a temperatura ambiente (27°C). Una vez filtrado, se colocó. BL. el micelio en placas de Petri, las cuales feron llevadas a la estufa durante 16. BI. horas a 60 °C ára eliminar la humedad residual y proceder a la pulverización con la ayuda de un mortero esterilizado hasta obtener un polvo fino.. 2.3.2 Cromatografía en HPLC de fase reversa. El extracto crudo de 4 cepas de Trichoderma: T. asperrellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum, fué sometido separadamente en una columna Bondapack C18 (0,78 X 30 cm) preparativa, previamente equilibrada con ácido 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. trifluoracético 0.1% pH= 3.5 (Tampón A) acoplada a un sistema de HPLC de fase reversa. El sistema cromatográfico usado es de HPLC-PDA 991 (waters), equipado con dos bombas (waters) modelo 510/B, un inyector automático de muestras U6K con un lazo o asa de 2,0 ml de capacidad. Inicialmente, la elusión de las muestras es realizada a través de un gradiente lineal con Acetonitrilo 66% (Tampón B), que puede ser modificado. DO. para la optimización de la purificación de las fracciones de interés. Las. 2.3.3 Electroforesis bidimensional (2D). SG RA. fracciones son monitoriadas a 280 nm.. La electroforesis en gel 2D es un método revolucionario para la. PO. evaluación del pI y masa molecular (MM) aparente de proteínas, sus dos dimensiones usan parámetros independientes para el cálculo de pI y MM. Los. DE. programas de análisis de imagem cren linias (“grids”) de pI y MM, posibilitan que los mismos puedan ser determinados (Westermeier y Naven, 2002).. CA. La primera dimensión de la 2D es la focalización isoelétrica (“IEF”),. IO TE. donde las proteínas son separadas en un gradiente de pH hasta alcanzar la posición estacionaria donde la carga total es cero. El pH en el cual la proteína tiene carga total cero es llamado de punto isoeléctrico (pI). En la segunda. BL. dimensión, las proteínas separadas por la IEF son nuevamente separadas por electroforesis del tipo SDS-PAGE. Esta separación es basada en la masa. BI. molecular (MM) de las proteínas (Westermeier y Naven, 2002). Los resultados de la separación es un perfil de puntos o “spots”. Según un sistema Cartesiano, de la izquierda para la derecha, hay un aumento del pI y de abajo para encima un aumento de la masa molecular. Estos mapas 2D ofrecen la mayor resolución de todos los métodos conocidos actualmente (Westermeier, 1997). La alta resolución de la 2D se debe al hecho de la primera y de la. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. segunda dimensión son embasadas en parámetros independientes (pI y masa molecular de las proteínas) (Westermeier y Naven, 2002).. 2.3.4. Caracterización Estructural. Los estudios necesarios para la caracterización estructural de la proteínas. DO. estudiadas, fueron realizadas en el LNLS (Laboratório Nacional de Luz Síncroton), a través del LNBio (Laboratório Nacional de Biociências) junto al. SG RA. Portal de Serviços del Laboratório de Espectrometría de Masas, UNCIAMP, Brasil.. La determinación de la masa total y el estudio de homología secuencial de. PO. los diferentes péptidos obtenidos por clivajes enzimáticos son analizados por espectrómetros acoplados a sistemas de cromatografía de alto desempeño y es. DE. utilizado con fuentes de ionización tipo Maldi (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) y nanoelectrospray (ESI). Para el estudio del. CA. alineamiento de los fragmentos peptídicos es utilizado bancos de datos, dentro. IO TE. de ellos el NCBI-BLAST (Altschul, 1990):. ExPASy Molecular Biology Server: http://www.expasy.ch/. BL. SWISS-2DPAGE: Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis database. BI. http://www.expasy.ch/ch2d/ SWISS-PROT: Annotated protein sequence database http://www.expasy.ch/sprot/ WORLD-2DPAGE: Index to 2-D PAGE databases and services http://www.proteome.com/comments.html. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS. 3.1 Cromatografía de hidrofobicidad en HPLC de fase reversa de muestras procedentes de 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum: El perfil cromatográfico para Trichioderma asperellum, evidenció la. DO. presencia de nueves picos proteícos, los cuales fueron denominados como T1 hasta T9 respectivamente (Figura 1). Fueron escogidos 2 picos representativos. SG RA. (*) teniendo en cuenta el tiempo de retención y concentración para los siguientes estudios de caracterización estructural, los mismos que presentaron una actividad endoquitinasa y gluconasa. El pico T5 fue eluído en 58  15% y. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. el pico T6 fue eluído en 72.20  25 % del tampón B.. Figura 1 Cromatografía de HPLC en fase reversa. Se obtuvieron los picos: T1 a T9 en una columna -Boundapack C-18 (0,78 X 30 cm preparativa), equilibrada con TFA 0.1% (Tampón A), y eluidos en acetonitrilo 66% en TFA 0,1 % (Tampón B). La muestra aplicada fue 8 mg de del extracto crudo de una muestra de Trichioderma asperellum. La actividad endoquitinasa y gluconasa fue registrada en los picos (*) T5 y T6. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El perfil cromatográfico para Trichioderma viride, evidenció la presencia de nueves picos proteícos, los cuales fueron denominados como T1 hasta T9 respectivamente (Figura 2). Fueron escogidos 2 picos representativos (*) considerando el tiempo de retención y concentración para los siguientes estudios de caracterización estructural, los mismos que presentaron una. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. pico T6 fue eluído en 77.81  13 % del tampón B.. DO. actividad endoquitinasa y gluconasa. El pico T5 fue eluído en 62  17% y el. BL. Figura 2 Cromatografía de HPLC en fase reversa. Se obtuvieron los picos: T1 a T9 en una columna -Boundapack C-18 (0,78 X 30 cm preparativa),. BI. equilibrada con TFA 0.1% (Tampón A), y eluidos en acetonitrilo 66% en TFA 0,1 % (Tampón B). La muestra aplicada fue 8 mg de del extracto crudo de una muestra de Trichioderma viride. La actividad endoquitinasa y gluconasa fue registrada en los picos (*) T5 y T6.. El perfil cromatográfico para Trichioderma atrovoride, evidenció la presencia de nueves picos proteícos, los cuales fueron denominados como T1 hasta T9 respectivamente (Figura 3). Fueron escogidos 2 picos representativos 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. (*) tomando en cuenta su tiempo de retención y concentración para los siguientes estudios de caracterización estructural, los mismos que presentaron una actividad endoquitinasa y gluconasa. El pico T5 fue eluído en 57  21% y. CA. DE. PO. SG RA. DO. el pico T6 fue eluído en 7.581  23 % del tampón B.. Figura 3 Cromatografía de HPLC en fase reversa. Se obtuvieron los picos: T1. IO TE. a T9 en una columna -Boundapack C-18 (0,78 X 30 cm preparativa), equilibrada con TFA 0.1% (Tampón A), y eluidos en acetonitrilo 66% en TFA 0,1 % (Tampón B). La muestra aplicada fue 8 mg de del extracto crudo de una. BL. muestra de Trichioderma atrovoride. La actividad endoquitinasa y gluconasa. BI. fue registrada en los picos (*) T5 y T6.. El perfil cromatográfico para Trichioderma harzianum, evidenció la. presencia de nueves picos proteícos, los cuales fueron denominados como T1 hasta T9 respectivamente (Figura 4). Fueron escogidos 2 picos representativos (*) considerando el tiempo de retención y concentración para los siguientes estudios de caracterización estructural, los mismos que presentaron una actividad endoquitinasa y gluconasa. El pico T5 fue eluído en 57  21% y el pico T6 fue eluído en 7.581  23 % del tampón B. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PO. Figura 4 Cromatografía de HPLC en fase reversa. Se obtuvieron los picos: T1 a T9 en una columna -Boundapack C-18 (0,78 X 30 cm preparativa),. DE. equilibrada con TFA 0.1% (Tampón A), y eluidos en acetonitrilo 66% en TFA 0,1 % (Tampón B). La muestra aplicada fue 8 mg de del extracto crudo de una. CA. muestra de Trichioderma harzianum. La actividad endoquitinasa y gluconasa. IO TE. fue registrada en los picos (*) T5 y T6.. 3.2 Electroforesis bidimensional (2D). BL. Fueron realizados varios electroforesis bidimensionales a partir del. extracto crudo obtenido de 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T.. BI. atrovoride y T. harzianum. El mismo que fue utilizado en la purificación por HPLC de fase reversa.. La electroforesis bidimensional reveló varias diferencias significativas al compararse con la purificación en HPLC de fase reversa. Así, se puede apreciar una mayor cantidad de spots protéicos en el gel bidimensional (2D), para las 4 cepas de Trichoderma (Figura 5). Para todos los casos fueron identificados los spots T5 y T6 para las 4 cepas como aquellas que corresponden a la 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. endoquitinasa y gluconasa respectivamente. Para las 4 cepas mostraron ser proteínas con masas moleculares y pI semejantes. Así para el caso de T5, su masa molecular relativa estuvo en torno de ~34 kDa y su pI ~7.3 y para T6 su masa esta en torno de ~33 kDa y su pI ~7.6 aproximadamente. Los spots T5 y T6 fueron seleccionados por ser los más densos y comunes para todas las cepas. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. de Trichoderma.. Figura 5 Electroforesis bidimensional (2D) en SDS-PAGE de 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum. En círculo encerrado indica los “spots” analizados T5 y T6 correspondientes a la endoquitinasa y gluconasa. Los valores correspondientes a masa molecular como punto isoeléctrico (pI) en el gel coloreado con comassie blue, son calculados con la ayuda de un software para análisis de imagen. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.3. Caracterización de la estructura primaria de “novo” por espectrometría de masa MS/MS. La proteína (T5 y T6) procedentes de 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum, fueron digeridas con tripsina bovina y los péptidos trípticos resultantes fueron secuenciados por espectrometría de masa MS/MS. La tabla 1 y 2 muestran la masa observada de. DO. un péptido tríptico, así como la secuencia del mismo y su posición en la secuencia deducida.. SG RA. El péptido secuenciado fue utilizado para hacer la búsqueda en la base de datos del NCBI (BLAST) y fue suficiente para identificar a la familia de proteínas a la que pertenece, con alto match de identidad, perteneciendo a la familia de las. PO. endoquitinasas (T5) y gluconasas (T6) respectivamente (Figura 6 y 7).. Tabla 1. Secuencia de aminoácidos del péptido cricial obtenido por hidrolisis. DE. tríptica a partir de la proteína T5 de cada una de las 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum. La metionina fue. IO TE. CA. modificada por oxidación.. Cepa. Pico. Secuencia. Masa (kDa). T. asperellum. T5. …ANRNLKVMLSIGGWTWSTNFP. 3393.80. BI. BL. T. viride. T. atrovoride. T. harzianum. T5. SAASTDANRK… …AYINGGVPASKIVLGMPIYGR. 2175.60. … T5. …NWGIYGRNFQPQDLVASDITH. 2893.19. VIYS… T5. …IVLGMPIYGRSFESTNSIGQTY. 4197.63. NGIGSGSWENGIWDYK…. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 2. Secuencia de aminoácidos del péptido cricial obtenido por hidrolisis tríptica a partir de la proteína T6 de cada una de las 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum. La metionina fue modificada por oxidación. Cepa. Pico. Secuencia. Masa (kDa). T. asperellum. T6. SVRVTSQQQFTHGLFIADIAHMPGS. 5185.88. T. viride. T6. DO. ICGVWPAFWMVGPDWPNSGEID. …TTDNQNYGDGFNAIGGGVYATE. SG RA. WTSSHIAVWFFPR…. 3879.15. T. atrovoride. T6. …DFFSEADPTHGFVQYVDAR…. 2200.33. T. harzianum. T6. …DWPNSGEIDIIEGYSTQTTNAITL. 3798.11. BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. HTAPGLNINNK…. Figura 6. Espetro MS/MS mostrando la masa real del ion crucial y su respectiva secuencia correspondiente a la proteína T5 de 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum respectivamente. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DE. Figura 7. Espetro MS/MS mostrando la masa real del ion crucial y su respectiva secuencia correspondiente a la proteína T5 de 4 cepas de. 3.4. IO TE. respectivamente.. CA. Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum. Estudio de homología secuencial (Analisis Bioinformático), a partir de 4. BL. cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum.. La figura 8 muestra los estudios de homología secuencial, por un análisis. BI. Bioinformático, usando el software DNAStar (Ver 5.0), de la proteína T5 procedente de 4 cepas de Trichoderma: T. asperrellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum.. La secuencia del péptido tríptico generado del pico 5 de la cromatografía por el sistema HPLC de fase reversa, de las 4 cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianu, es sometido a un análisis de homología secuencial en la base de datos SWISS-PROT: Annotated protein 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. sequence database: http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl revela que se trata de una enzima correspondiente a la familia de las endoquitinasas disponibles en la base de datos consultada, con la que guarda una alto match o grado de homología secuencial con el péptido tríptico secuenciado por espectrometría de masa (MS/MS) (Figura 8, 9, 10 y 11).. DO. De otro lado la secuencia de los péptidos trípticos generados del pico 6 de la cromatografía por el sistema HPLC de fase reversa, de las 4 cepas de. SG RA. Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianu, también es sometido a un análisis de homología secuencial en la base de datos SWISSPROT: Annotated protein sequence database: http://www.expasy.org./cgibin/blast.pl revela que se trata de una enzima correspondiente a la familia de las. PO. gluconasas, disponibles en la base de datos consultada, con la que guarda una alto match o grado de homología secuencial con el péptido tríptico secuenciado. DE. por espectrometría de masa (MS/MS) (Figura 12, 13, 14 y 15).. CA. Los trazos ( - ), observados corresponden a los generados por el software. BI. BL. IO TE. para el proceso de alineamiento.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) BL IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 8. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína correspondiente al picoT5, de la cepa Trichoderma. BI. asperellum respectivamente, con otras endoquitinasas pertenecientes a varias especies, en especial procedentes de hongos: Trichoderma harzianum, (Garcia,I., et al., 1994; P48827), Metarhizium robertsii ARSEF 23 (Gao,Q., Jin,K., et al., 2011; E9ERT9) y Aphanocladium álbum Blaiseau,P.L. and Lafay,J.F. 1992; P32470). http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) BL IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 9. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína correspondiente al picoT5, de la cepa Trichoderma. BI. atroviridi respectivamente, con otras endoquitinasas pertenecientes a varias especies, en especial procedentes de hongos: Trichoderma harzianum, (Garcia,I., et al., 1994; P48827), Metarhizium robertsii ARSEF 23 (Gao,Q., Jin,K., et al., 2011; E9ERT9) y Aphanocladium álbum Blaiseau,P.L. and Lafay,J.F. 1992; P32470). http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) BL IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 10. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína correspondiente al picoT5, de la cepa Trichoderma. BI. viridi respectivamente, con otras endoquitinasas pertenecientes a varias especies, en especial procedentes de hongos: Trichoderma harzianum, (Garcia,I., et al., 1994; P48827), Metarhizium robertsii ARSEF 23 (Gao,Q., Jin,K., et al., 2011; E9ERT9) y Aphanocladium álbum Blaiseau,P.L. and Lafay,J.F. 1992; P32470). http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) BL IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 11. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína correspondiente al picoT5, de la cepa Trichoderma. BI. harzianum respectivamente, con otras endoquitinasas pertenecientes a varias especies, en especial procedentes de hongos: Trichoderma harzianum, (Garcia,I., et al., 1994; P48827), Metarhizium robertsii ARSEF 23 (Gao,Q., Jin,K., et al., 2011; E9ERT9) y Aphanocladium. álbum. Blaiseau,P.L.. and. Lafay,J.F.. 1992;. P32470).. http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 12. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína correspondiente al picoT6, de la cepa Trichoderma asperellum respectivamente, con otras gluconasas pertenecientes a varias especies, en especial procedentes de hongos: Aspergillus nidulans FGSC A4 (Galagan,J.E., et al., 2005; Q5BAP5 ), Aspergillus clavatus NRRL 1, Fedorova,N.D., et al., 2008; A1C7B5) y Aspergillus fischeri NRRL 181, Fedorova,N.D., et al., 2008; A1DHY9). http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 13. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína correspondiente al picoT6, de la cepa Trichoderma atroviride respectivamente, con otras gluconasas pertenecientes a varias especies, en especial procedentes de hongos: Aspergillus nidulans FGSC A4 (Galagan,J.E., et al., 2005; Q5BAP5 ), Aspergillus clavatus NRRL 1, Fedorova,N.D., et al., 2008; A1C7B5) y Aspergillus fischeri NRRL 181, Fedorova,N.D., et al., 2008; A1DHY9). http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) BI. BL. IO TE. CA. DE. PO. SG RA. DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 14. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína correspondiente al picoT6, de la cepa Trichoderma viride respectivamente, con otras gluconasas pertenecientes a varias especies, en especial procedentes de hongos: Aspergillus nidulans FGSC A4 (Galagan,J.E., et al., 2005; Q5BAP5 ), Aspergillus clavatus NRRL 1, Fedorova,N.D., et al., 2008; A1C7B5) y Aspergillus fischeri NRRL 181, Fedorova,N.D., et al., 2008; A1DHY9). http://www.expasy.org./cgi-bin/blast.pl 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.