Los resultados evidenciados en el presente estudio desde la separación proteica por HPLC, revelan la prescencia de una endoquitinasa y una gluconasa identificadas como T5 y T6 respectivamente, en cuatro cepas del género Trichoderma; siendo estas
T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum.
Numerosos procedimientos de purificación para las celulasas de Trichoderma, han sido desarrollados en distintos laboratorios, haciendo uso de combinaciones más o menos complejas de técnicas de separación convencionales (cromatografía en todas sus vertientes, electroforesis, isoelectroenfoque) (Bhikhabhai, et al., 1984; Enari y Niku-Paavola, 1987; Biely y Markovic, 1988).
Frente a la mayor o menor complejidad de estos procedimientos, el paso cromatográfico en un sistema de HPLC de fase reversa empleando una columna C-18 analítica de hidrofobicidad, diseñado en nuestro laboratorio para el fraccionamíento inicial del material de partida, supone una forma rápida y sencilla de separar eficazmente las principales proteínas de las cuatro cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum (Fig. 1 al 4), siendo la preparación final a través de la cromatografía de alta eficiencia (HPLC de fase reversa) empleada en este estudio es altamente homogénea como demuestran los análisis de pureza realizados (Fig. 1 al 4).
En nuestro trabajo, el proceso de separación de las endoquintinasa y gluconasa (T5 y T6) para las cuatro cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y
T. harzianum, se muestra como siendo el más optimizado toda vez que se trata de una cromatografía de alta eficiencia y la capacidad de separación de proteínas es con una alta resolución (HPLC de fase reversa), lo cual viene confirmando la electroforesis bidimensional.
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Por otro lado la electroforesis bidimensional 2D-PAGE nos permitió separar eficientemente las proteínas, ya que este sistema tiene la capacidad de separar hasta miles de proteínas en un solo experimento, y constituye actualmente el método más eficiente para la separación de mezclas muy complejas de proteínas al estar basada en una separación de proteínas en función de la carga, seguida de una separación de las proteínas en función de su masa molecular (Westermeier, R. And Naven, T. 2002).
Respecto al secuenciamento por espectrometría de masa MALDI TOF/TOF) (Fig. 6 y 7), en el presente trabajo, se utilizó apenas un péptido tríptico generado por hidrólisis enzimática para su respectivo. Esto se debe a que dicha técnica de espectrometría de masas mediante la cual las biomoléculas son ionizadas y su masa puede ser medida en función de su desplazamiento en un sistema de vacío, la cúal reemplazó a la degradación Edman, es más rápida y potente, y no tiene las limitaciones de la anteriormente mencionada (Steen y Mann, 2004).
Pese a que los espectrómetros de masas pueden medir la masa de proteínas intactas hay varias razones por las cuales es preferible realizar la secuenciación de péptidos de la misma y no de la proteína entera. Una de ellas es la dificultad de mantener la solubilidad de ciertas proteínas sin recurrir a detergentes (que interfieren con la espectrometría de masa) o la dificultad de predecir la secuencia a partir de la masa de proteínas enteras, pero sobre todo si la finalidad de la secuenciación es la identificación de la proteína, lo más importante es la información sobre la secuencia y la espectrometría de masa presenta su máxima sensibilidad obteniendo la secuencia de péptidos de hasta 20 aminoácidos (Steen y Mann, 2004).
En cualquier caso, el éxito de la secuenciación de “novo” obtenida en el estudio realizado depende de la calidad de los datos (en términos de precisión de la masa y resolución del instrumental) que a su vez está relacionada con la calidad de la muestra de partida. Es por este motivo por el que decidimos realizar una purificación de las proteínas por el sistema de HPLC de fase reversa, de cuatro cepas de Trichoderma: T. asperellum, T. viride, T. atrovoride y T. harzianum, previa a la espectrometría de
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masa pese a que esta técnica no requiere una purificación a homogeneidad de la proteína a identificar. Una mayor calidad de los datos va a resultar en un menor número de indeterminaciones en la secuenciación de péptidos internos, cuestión que es básica a la hora de identificar una proteína en función de cortos fragmentos de la misma.
Comparativamente en la última década, el análisis Proteómico en hongos biotecnológicamente importante se ha desarrollado significativamente, con relativamente pocos casos estudiados en comparación con las numerosas especies donde el genoma ha sido secuenciado. T. harzianum fue el primer hongo filamentoso para el cual se realizó espectrometría de masa [matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDITOF)] y cromatografía líquida de masas en tandem (LC-MS-MS)] para mejorar el método de identificación de proteínas después de realizar la clásica electroforesis bidimensional (Lorito y col., 2010).
Además, se han analizado proteínas mitocondriales MAPKs de T. harzianum
(Grinyer y col., 2004), secretomas de T. harzianum y T. atroviride (Suárez y col., 2005; Seidl y col., 2006), hidrofobinas de varias especies (Neuhof y col., 2007), el peptaibioma de T. virens, T. reesei y T. atroviride (Stoppacher, et al., 2008), y preparaciones comerciales de celulasa de T. reesei (Jeoh, et al., 2008; Nagendran, et al., 2009).
Por otro lado, las investigaciones centradas en el proteoma de cepas de biocontrol de Trichoderma, principalmente de T. harzianum y T. atroviride, ha permitido la identificación de muchos factores clave probablemente involucrados en la interacción hongo-Trichoderma o Trichoderma-planta. El análisis del proteoma de Trichoderma revela una serie de factores aparentemente involucrado en muchas de las diversas respuestas de estos hongos en la simbiosis, antagonismo, saprofitismo, etc. Algunas de estas proteínas como las ciclofilinas, hidrofobinas, los transportadores ABC y factores de estrés, así como enzimas (chitinasas, glucanasas, proteasas, xilanasas, celulasas, lipasas, poligalacturonasas, chitosanasas, etc.) o MAMPs (microbe-
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associated molecular patterns) son seleccionadas para aplicaciones biotecnológicas que incluyen la expresión transgénica (Lorito y col., 2010).
Se identificaron compuestos del tipo de las alquil-pironas (6-a-pentil-pirona), isonitrilos (isonitrina), poliquétidos (harzianolida), peptabioles (trichodermina, atroviridina, alameticina, suzucacilina y trichozianina), dicetopiperacinas (gliovirina y gliotoxina), sesquiterpenos (ácido heptelídico) y esteroides (viridina) (Howell C. 2003 y Sivasithamparam K, Ghisalberti L. 1998). Recientemente, Vinale et al. (2006) caracterizaron un grupo de metabolitos secundarios (azapilona, butenolide, 6-pentil-á- pirona, 1-hidroxi-3-metil-antraquinona, 1,8-dihidroxi-3-metil-antraquinona, koninginina, ácido heptelídico, trichoviridina, ácido harziánico, gliotoxina, gliovirina, viridina, viridiol) obtenidos de la interacción entre R. solani y dos cepas comerciales (T22 y T39) de T. harzianum.
Varios estudios han demostrado que la colonización de las raíces por las cepas de T. harzianum, conlleva a una expresión de un nivel mayor de enzimas de plantas relacionados con la defensa, incluyendo varias peroxidasa, quitinasa, beta-1,3- glucanasas, lipoxigenasa y la fenilalanina amonio liasa (Howell et al., 2000, Yedidia et al., 1999 y Evans et al., 2003).
Sharon et al. (2001), demostraron el parasitismo directo de T. harzianum (T-203) sobre M. javanica en condiciones in vitro. Ellos mostraron enzimas proteasas extracelulares secretada por el hongo.
Las quitinasas, es necesaria para el crecimiento de las hifas (Takaya y Yamazaki, 1998). Son un tipo de enzima que cataliza la quitina inducible que es uno de los componentes importantes de la pared celular de hongos, nematodos y cáscara de huevo de insectos y la cutícula del insecto. Papel de la quitinasa de huevos de nematodos que infectan se registraron en Paecilomyces y Pochonia spp aislado de huevos de nematodos infectados (. Khan et al, 2003; Tikhanov et al., 2002). Hemos
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demostrado que la proporción de huevos de nematodos infectados aumentó al mismo tiempo que mejora de la actividad quitinasa.
Hay poca información sobre los mecanismos de especies de Trichoderma contra los nematodos. Se cree que dos mecanismos de acción podrían ser responsables de la reducción de la infección por nematodos después del tratamiento de la raíz con
Trichoderma spp. El primero, un parasitismo directo sobre huevos y larvas a través del aumento en las actividades de quitinasa y proteasa, lo que sería indicadores de capacidad de infección de los huevos (Sharon et al, 2001 y Suarez et al, 2004). El segundo mecanismo inducido por los mecanismos de defensa de las plantas que conduce a la resistencia sistémica. Enzimas extracelulares tales como quitinasa y proteasa que muestran actividades antifúngicas parecen participar en interacción entre
Meloidogyne javanica por la acción de Trichoderma spp. (Sharon et al., 2001).
Suarez et al. (2004) caracterizó una proteasa similar a la tripsina, PRA1, desde filtrados de cultivo de T. harzianum CECT2413 crecido en medio líquido suplementado con pared celular fúngica o quitina. Mostraron que el número de huevos eclosionados del nematodo nodulador Meloidogyne incognita, se redujo después de la incubación con la preparación PRA1 puro.
Sobre la acción sobre otros hongos, se han purificado dos enzimas quitinóliticas (endoquitinasa y quitobiosdasa), obtenidas a partir de Trichoderma harzianum; se comprobó que el grado de inhibición del patógeno fue proporcional al nivel de quitina en la pared celular del hongo atacado, e igualmente se verificó que la combinación de las dos enzimas resultó ser sinergística (Shoresh M, Harman G, et al., 2010; Martínez C, et al., 2001, Brotman Y, et al., 2008), aunque la mezcla de estas dos enzimas no es requerida para la inhibición del hongo atacado (Martínez C, et al., 2001).
En el presente trabajo se han caracterizado desde una perspectiva de aproximación proteómica, 2 celulasas, una endoquitinasa denominada como T5 y una gluconasa denominada como T6, en cuatro cepas de Trichoderma: T. asperrellum, T. viride, T.
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atrovoride y T. harzianum. Los análisis bioinformáticos nos han permitido identificar estas dos enzimas presentes en las cepas estudiadas ubicadas geográficamente en el norte del Perú (Fig. 8 a la 15).
Estudios posteriores por aproximación proteómica, nos revelarán a través del secuenciamiento de estas enzimas y el análisis bioinformáticos, las regiones y/o dominios asociados con el efecto nematicida, a pesar de que sus mecanismos aún no están elucidados, creemos aún en la posibilidad de un nivel de sinergismo entre proteasas, como ya fue referido por la literatura, para desencadenar su efecto nematicida.