INSTITUTO TECNOLÓGICO
DE CD. ALTAMIRANO
Laboratorio de Biotecnología Aplicada
Manual de Practicas de Laboratorio de Cultivo
de Tejidos Vegetales
Luis Alfonso R´guez-Páez
http://larguez.km6.net
[email protected]
Profesor
Los Diez Mandamientos
de la conservación de los resultados*
1. Cíñete a los hechos. No divagues ni editorialices.
2. Emplea un cuaderno de laboratorio de lomo pegado para impedir que se puedan arrancar o poner hojas.
3. Haz dos copias de todos los apuntes, uno de ellos debería conservarse en un lugar separado y seguro.
4. Incluye los datos e informaciones directamente en el cuaderno de laboratorio tan pronto como sean generados. Puedes firmar y fechar cada página del cuaderno (la firma es un procedimiento requerido en cuadernos de investigación industrial). No confíes en la memoria ni escribas en hojas sueltas con la intención de pasarlas más tarde al cuaderno.
5. Utiliza tinta permanente, preferentemente negra, que se reproducirá satisfactoriamente en la fotocopiadora.
6. Identifica cualquier equivocación o error, y explícalos.
7. Pega los registros en el cuaderno o consérvalos, tras identificarlos y clasificarlos correctamente, de modo que se puedan recuperar rápida-mente.
8. Utiliza términos aceptados universalmente; si es posible evita las abreviaturas, los nombres codificados o los códigos de números.
9. Mantén el cuaderno de laboratorio limpio; evita las manchas y los vertidos. 10. Elabora una tabla de contenidos y un índice del cuaderno de laboratorio tan
pronto como esté lleno.
1. Prepara cada sesión de trabajo leyendo cada experimento hasta familiarizarte con los principios y métodos implicados. Al conocer el experimento disminuyes la posibilidad de que ocurran accidentes. Además, esta programación previa te permite emplear el tiempo en el laboratorio de una manera más eficaz.
2. En el laboratorio está prohibido comer, beber y fumar.
3. En el laboratorio debes llevar en todo momento la bata o el mandil de laboratorio. Esto garantiza que ningún material de cultivo te caiga accidentalmente sobre las ropas o la piel, y además protege la piel o la ropa de manchas o vertidos de sustancias químicas.
4. Al lugar de trabajo en el laboratorio sólo debes llevar aquellos materiales estrictamente necesarios para el trabajo, como son los manuales del laboratorio y tus cuadernos de laboratorio, entre otros. El resto de objetos, como serían abrigos, libros, o bolsos, debes dejarlos fuera del área de trabajo.
5. Comienza cada jornada desinfectando el área de trabajo. Satura la zona con desinfectante, extiende el desinfectante con una toalla de papel, y deja que se seque. Repite este procedimiento después de que hayas terminado de trabajar para asegurar que cualquier material depositado en el área de trabajo es desinfectado de una forma adecuada.
6. Todos los cultivos y sustancias químicas deberían estar adecuadamente etiquetadas con tu nombre, clase, fecha y experimento. El etiquetado es crucial para evitar usos o colocaciones indebidos.
7. Sé muy cuidadoso con los mecheros Bunsen. Para evitar quemaduras, apaga los mecheros cuando no los uses. Cuando trabajes, ten cuidado de no colocar las manos sobre la llama.
8. Todo material contaminado debe ser desinfectado antes de ser eliminado o reutilizado. Todo el material a autoclavar debería colocarse en un recipiente apropiado para su recolección. Debes colocar las pipetas usadas en una solución desinfectante.
9. Tras la sesión de trabajo, lávate las manos antes de abandonar el laboratorio para mantener unas buenas condiciones higiénicas.
10. En caso de accidente o lesión, avisa inmediatamente al profesor o al responsable del laboratorio para que pueda realizarse una acción rápida y apropiada.
Nota
FORMA DE ELABORAR LOS REPORTES
Los reportes deberán elaborarse en maquina de escribir o en computadora, respetando márgenes y cuidando la ortografía, deberán ajustarse al siguiente formato:
A. Carátula de presentación: (ver formato)
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO Nombre de la licenciatura
Titulo de la práctica Nombre completo del alumno, y
Fecha de entrega
B. El contenido se divide de la siguiente manera:
1. Introducción.
Como mínimo media cuartilla (una cuartilla es igual a una hoja tamaño carta), contendrá las bases científicas del tema de la practica, habrá que consultar libros o cualquier otro tipo de fuentes confiable de información como Internet, artículos, etc.
2. Objetivos.
Se especifican los objetivos de la práctica en turno, por lo general se encuentran impresos en la práctica. (Deben empezar con un verbo en infinitivo).
3. Materiales.
Enlistar todo el material, reactivos y equipo utilizado.
4. Métodos
Describir lo realizado en la practica, deberá ser escrito en pasado y en forma impersonal.
5. Resultados.
Se redactaran en pasado y de forma concisa, pudiendo hacer cuadros, dibujos, graficas, etc.
6. Discusión.
Esta parte de la práctica es de las más importantes ya que deberá explicar los resultados de la práctica en relación a las bases científicas encontradas en la literatura, lo cual indica el grado de comprensión de la practica.
7. Conclusión(es).
Deberá ser muy breve y concisa, ejemplo: al elevar la temperatura en la reacción se incrementa la velocidad de formación del producto.
8. Cuestionario.
Si se pide en la práctica correspondiente, se deberán contestar las preguntas.
9. Bibliografía.
Toda literatura deberá ser reportada de la siguiente manera.
Practica N° 1:
RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS
Duración: 1 hora.
El laboratorio de cultivo de tejidos vegetales esta divido en diferentes áreas de acuerdo a las actividades que se desarrollan en el, aunque los principios básicos son los mismos en todos los laboratorios de cultivos de tejidos vegetales, su aplicación puede presentar variaciones en magnitud y complejidad, dependiendo de los objetivos del laboratorio.
Las áreas o secciones principales son: Área de preparaci6n de medios, área de lavado y esterilización, área de transferencia y siembra, área de incubación, área de crecimiento, área de cuarentena y control sanitario y área de oficina (sala de conferencias).
Objetivos:
• Conocer las diferentes áreas y equipos básicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
• Conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio.
Procedimiento.
1. Organización de los estudiantes en grupos
2. Recorrido y descripción de las áreas del laboratorio y sus equipos respectivos:
3. Área de preparación de medios de cultivo; materiales de vidrio y plástico, reactivos químicos, potenciómetro, platos calientes con agitación y otros elementos, también debe incluir vitrinas, estanterías y equipo de refrigeración.
4. Área de lavado y esterilizaci6n: Lavadero grande con agua caliente y fría, fuente de agua de alta pureza, de preferencia doblemente destilada, basureros adecuados, autoclave, estufas, secadores, lavaderos.
5. Área de transferencia y siembra; cámaras de flujo laminar, microscopios y/o estereoscopios. 6. Área de incubaci6n y crecimiento; estanterías metálicas, luz, luxómetro, termómetros,
higrómetro, mesa para cultivos en agitación
7. Área de oficina; mobiliario de oficina, escritorios, archivos y almacenamiento de datos, 1ibros de referencia y control de laboratorio, catálogos y otros documentos, equipo de calculo y computaci6n.
8. Hacer énfasis en las funciones de los mismos así como el cuidado, manejo y mantenimiento. 9. Muestra de la organizaci6n de los reactivos químicos así como las áreas de su
almacenamiento.
PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Practica N° 2:
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES
Duración: 4 horas.
La célula vegetal para su metabolismo requiere elementos esenciales, los cuales le permiten completar su ciclo normal de vida; algunos los requieren en cantidades mayores, por lo que se llama macroelementos, ellos son: C, H, O, N, P, K, Ca, Mg y S; y los que requiere en menores cantidades, llamados microelementos; como son; Fe, Mn, Cu B, Mo, Zn, y Cl. En el cultivo de tejidos vegetales estos elementos se agrupan en compuestos orgánicos e inorgánicos con un grado de reactivo especifico, los cuales deben ser disueltos en agua. En ocasiones se requieren concentraciones muy bajas de alguno de ellos, por lo que es necesario preparar soluciones a una elevada concentración y a partir de esta diluirla hasta la concentración requerida. Para facilitar la preparación es necesario tener estándares de concentración conocida, soluciones madres. Existen varias formas de expresar la cantidad de los compuestos en una solución. Los principales son: porcentaje (%), molaridad (M) y partes por millón (PPM). Para que los tejidos establecidos in vitro respondan a la diferenciación (callo, organogénesis) se requiere que el medió de cultivo los contenga. Algunos de las presentaciones que contienen estos elementos son incompatibles químicamente (reaccionan entre si) y no se solubilizan, por lo que es necesario agruparlos por afinidad química. En esta practica realizaremos la preparación de las soluciones madre, patrón o estándar.
Objetivos:
• Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza bioquímica.
• Manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos.
• Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo.
Procedimiento.
Se organizaran los estudiantes en seis grupos de trabajo, cada grupo prepara una solución madre stock de Murashige & Skoog MS.
El grupo No 1 prepara la solución de Nitratos, que consiste en pesar:
41.25 g de NH4NO3 y 47.5g de KNO3, se disuelven las sales en un matraz volumetrico usando cerca
de 150 ml y luego se afora a 250 ml, para esto se usa agua destilada y desionizada (Sln. 100X).
El grupo No 2 prepara la solución de sulfatos, que consiste en pesar:
9.25 g de MgSO47H2O, 0.5575 g de MnSO44H2O, 0,215 g de ZnSO47H2O y 0.6 mg de CuSO45H2O,
se disuelven las sales en un matraz volurnetrico usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml, para esto se usa agua destilada y desionizada. (Sln. 100X). Estas soluciones deben guardarse congeladas.
El grupo No. 3 Prepara la solución de Halógenos, que consiste en pesar:
11 g de CaC122H2O, 0.02 g de KI y 0.0006 g de CoCl26H2O, se disuelven en un matraz volumétrico
usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml. Se usa agua destilada y desionizada (Sln. 100X).
El grupo No. 4 prepara la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos, que consiste en pesar:
volumétrico usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml. Se usa agua destilada y desionizada (Sln. 100X).
El grupo No. 5 prepara la solución de Quelatos, que consiste en pesar.
0.6962 g de FeSO47H2O y 1.0324 g de Na2EDTA2H2O, se disuelve primero el FeSO47H2O en
50 ml de agua; separadamente se disuelve el Na2EDTA2H2O en 50 ml de agua, calentando un poco
a baño de Maria; se mezclan ambas soluciones; agitan bien y se dejan enfriar. Se completan con agua destilada hasta obtener 250 ml, Esta soluci6n se mantiene en la oscuridad, (Sln. 100X); Además pesar 10 gr. de Miomositol y disolverlo en un matraz volumétrico
El grupo No. 6 prepara la solución de Orgánicos, que consiste en pesar.
100 g de Myo-inositol, 0.0025 de Tiamina, 0.125 g de Piridoxina, 0.05 g de glicina y 0.0125 g de ácido nicotínico, se disuelven en un matraz volumétrico usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml. Se usa agua destilada y desionizada (Sln. 100X).
PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Practica No. 3
“PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES”
OBJETIVO:
Conocer la forma de preparación de los medios de Murasshine y Skoog y B5 ( o de Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales.
MATERIAL DE LABORATORIO:
Balanza, Vasos de precipitados, matraces aforados, agitador magnético, y magnetos, potenciómetros, frascos limpios para almacenar soluciones, recipientes de cultivo.
REACTIVOS:
Sales y reactivos para preparar las soluciones concentradas y el medio MS, phytagel, agua destilada, hidróxido de sodio y Ácido Clorhídrico para ajustar el pH.
Parte 1. Preparación de las soluciones concentradas para el medio MS
Preparar las siguientes soluciones por equipo (2 personas)
Sol. A 10ml
Sol. B 10ml
Sol. C 10ml
Sol. D 10ml
Sol. E 10ml
Sol. F 10ml
SOLUCIÓN A. Concentración: 1000 X. Volumen: 50ml
Cloruro de calcio CaCl2 – 2H2O 22.00 g
SOLUCIÓN B. Concentración: 1000 X. Volumen: 50ml
Yoduro de potasio KI 0.0415 g
Cloruro de cobalto Co Cl2 - 6 H2O 0.00125 g
SOLUCIÓN C. Concentración: 400 X. Volumen: 125ml
Fosfato monobásico de potasio KH2PO4 8.50 g
Ac. borico H3BO3 0.31 g
Molibdato de sodio NaMoO4 0.0125 g
SOLUCIÓN D. Concentración: 400 X. Volumen: 125ml
Sulfato de magnesio MgSO4 – 7 H2O 18.50 g
Sulfato de manganeso Mn SO4 – 4 H2O 1.115 g
Sulfato de Zinc Zn SO4 - 7 H2O 0.43 g
Sulfato de cobre Cu SO4 - 5 H2O 0.00125 g
SOLUCIÓN E. Concentración: 200 X. Volumen: 250ml
Sulfato ferroso Fe SO4 – 7H2O 1.3925 g
Disolver ambos componentes por separado, para lo cual puede requerirse calentar. Agregar poco a poco la solución de Fe a la de EDTA y aforar. Debe de quedar de color amarillo sin precipitados.
SOLUCIÓN F. Concentración: 100 X. Volumen: 250ml
Glicina 0.05 g
Piridoxina HCl 0.0125 g
Ac. Nicotínico 0.0125 g
Tiamina HCl 0.0025 g
Mio inositol 2.5 g
Almacenar estas soluciones en frascos limpios ( lavados y enjuagados con agua destilada) y en refrigeración
Parte 2. Preparación del medio de cultivo (MS)
A. Tomar un vaso de precipitados de 11 con unos 850ml de agua destiladas y agregar la cantidad indicada de las soluciones concentradas.
SOLUCIÓN VOLUMEN ml
A 1
B 1
C 2.5
D 2.5
E 5
F 10
B. Pesar, añadir y agitar hasta disolver, los siguientes compuestos:
Sacarosa 30.00 g
Nitrato de potasio 1.90 g
Nitrato de amonio 1.65 g
C. Ajustar el pH del medio a 5.7 con NaOH o CHl 0.1 N. Aforar a 11 con agua destilada D. Añadir 3g/l de phytagel o Gelrite como gelificante
E. Disolver el gelificante calentando el medio en horno de microondas y agitando posteriormente (debe hacerse en varios ciclos)
F. Distribuir el medio en 9 recipientes de cultivo Phytacon, taparlos adecuadamente y esterilizar a 121° C por 20 min.
G. Sellar los recipientes con el medio estéril y almacenarlos hasta su uso
Para facilitar el trabajo en la preparación de soluciones madres se ha ideado esta formula:
Formula Expresado en: Sigla Significado
CCP = ( CPMS . [ ] . VM ) . 10-3 mgr CCP: Cantidad del producto a pesar
PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Practica N° 3:
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS.
Duración: 5 horas.
En la actualidad existen innumerables formulaciones cada una de las cuales contiene entre 15 y 35 compuestos químicos que suministran: carbono, nutrientes, vitaminas, agente gelificante (en el caso de medios sólidos y semisólido), sustancias reguladoras del crecimiento y otros compuestos, en esta practica manejaremos el propuesto por Murashige & Skoog en 1962 (MS-62). Una vez preparado el medio de cultivo se procede a esterilizarlo, Uno de los factores más limitantes y de alta importancia es la asepsia, para conseguir esta, se emplean varios métodos y su utilizaci6n depende de muchos factores, Los mas usados son calor seco, vapor bajo presión (autoclave) y filtración.
La autoclave es muy eficiente para destruir todas las formas de bacteria y hongos y sus esporas y es la forma mas utilizada para esterilizar diferentes materiales incluyendo medios de cultivo, siempre y cuando no contenga componentes termolábiles.
Objetivos:
Conocer los diferentes medios de cultivo y su aplicabilidad.
Manejar las técnicas instrumentales ella preparaci6n de medios de cultivo. Aprensi6n de habilidades en la preparación de medios de cultivos.
Procedimiento:
1. Tomar 10 ml de la solución 1, 2, 3, 4, 5 y 6 agregarla en un matraz de 1000 ml 2. Llevar el matraz: a aproximadamente 300 ml
3. Pesar en la balanza 30 g de Sacarosa y agregarlos al matraz 4. Aforar el matraz: hasta 1000 ml
5. Ajustar el pH a 5.8, con ayuda de HCl y KOH 1N y un medidor digital de pH. 6. Pesar 6 g de Agar-Agar
7. En una plancha de calentamiento y agitación Se calienta el medio, cuanto tenga aproximadamente una temperatura de 68-700C se le agrega el agar. Cuando empiece a ebullir Se deja por dos minutos mas, luego Se baja, Se deja enfriar y antes que polimerice Se sirve en los frascos Gerber con un volumen aproximado de 20 ml
8. Los frascos se tapan y se empacan para su esterilización.
9. Para la esterilización hay que cerciorarse que el agua se encuentra en el nivel adecuado, en caso de filtrar se debe agregar hasta el nivel indicado. Colocar dentro las cosas que se esterilizan, checar que todo este correcto, cerrar la escotilla, establecer el tiempo y temperatura de esterilización, se conecta a la fuente de energía para iniciar su funcionamiento.
Practica N° 4:
SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
Duraci6n: 3 horas
En la actualidad, la micropropagaci6n se practica con éxito en especies hortícola, ornamentales y mas recientemente en especies leñosas. Una vez instalado el explante en el medio de cultivo y luego de que logre crecer y generar explantes, estos se extraen y se cultivan nuevamente in vitro para producir explantes adicionales.
Objetivos:
• Conocer el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo (Ñame: Dioscorea alata, Yuca: Manihot esculenta, Tabaco: Nicotiana tabacum, y otros).
• Asimilación de habilidades en la siembra.
Procedimiento
1. Preparar cámara de flujo laminar, encender la cámara, desinfectar con alcohol al 70 % el interior de la cámara, las cosas esterilizadas se colocan dentro, si hay un tubo desinfectante (luz UV), se pone a funcionar durante 30 minutos.
2. Los materiales vegetales y los medios preparados se introducen en la cámara, las manos se desinfectan con alcohol al 70 %.
3. Después de secarlas completamente, se inicia el trabajo dentro de la cámara, la superficie de los recipientes con medio de cultivo se limpian con gasa impregnada con alcohol (normalmente no se utiliza algodón, puesto que se llena de polvo fácilmente). Quemar alrededor de la tapa de los recipientes que contienen las plantas con la llama del mechero con un movimiento circular.
4. Quitar la tapa con la pinza ó con la mano desinfectada.
5. Flamear la punta de la pinza suficientemente y dejarla enfriar, también flamear y dejar enfriar el bisturí, esto con el fin de desinfectarlos.
6. Sacar las plantas del recipiente y colocarlas sobre una caja de petri.
7. Dividir las plantas con ayuda de pinza y bisturi, en la caja de petri ( Se puede cambiar una nueva caja de petri con cada recipiente que se subcultive, para prevenir el riesgo de contaminación).
8. Transferirlas al nuevo recipiente.
9. Después de tapar, cubrir con parafilm el borde entre la tapa y el frasco.
PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Practica N° 6:
ADAPTACIÓN DEL MATERIAL IN - VITRO A CAMPO.
Duraci6n: 6 horas.
El medio ambiente artificial del laboratorio es diferente al que esta en el exterior (humedad, temperatura, gases, nutrimentos, intensidad de luz). Por consiguiente las plántulas se deben adaptar del medio ambiente artificial al medio ambiente natural, existen varias técnicas para lograr la aclimataci6n de las plántulas del laboratorio, al invernadero y de este al campo.
Objetivos:
• Conocer los factores más influyentes en la aclimatizaci6n del material in - vitro
• Conocer las diferentes técnicas de aclimatación.
• Aprensión de habilidades en manejo de invernadero tendientes a la aclimatización.
Procedimiento
Para aclimatar las plantas en el invernadero se deben de controlar 3 condiciones;
Oscuridad
Humedad relativa y humedad de sustrato
Temperatura (20-25°C)
1. Los recipientes que contiene las plantas ya desarrolladas y enraizadas se trasladan al invernadero.
2. Se sacan las plantas y se lava el agar adherido a las raíces (se debe lavar cada planta separadamente, para prevenir una infecci6n con virus, aunque no se puede garantizar que todas las plantas producidas estén libres de virus).
3. Considerar la aplicación de una solución de fungicida (2 mg/l)
4. En los primeros de 3 a 4 días, mantener la humedad al 100% así como bloquear la luz con tela negra para invernadero para que no sea muy intensa y de varios calibres paulatinamente (50%).
5. Después de unos días, se reduce la humedad gradualmente y, después de dos semanas, se cultivan bajo condiciones normales.
Practica N° 7:
Extracción de DNA Método de extracción de DNA (04/03/00) Modificado LS.
Duraci6n: 3 horas.
Objetivos:
Conocer y preparar las soluciones madres necesarias para la extracción de DNA Extraer de DNA de tejido vegetal
Procedimiento
1. Molida (Fractura de pared Celular).
1.1. Tomar tejido para cuatro tubos eppendorf, y en nitrógeno liquido, moler con mortero y pistilo (hacer una serie de seis muestras, 6 muestras x 4 tubos = 24 tubos).
2. Extracción (lisis de membranas).
2.1. En tubo eppendorf con 500 µl de buffer de extracción a temperatura de cuatro (Tris-HCl 0.05 M, EDTA 0.02 M, NaCl 0.35 M, Urea 7.0, Mercaptoetanol 14 M 0.1% y LS 1%), colocar unos 0.5 g del polvo (tres puntas de espátula), y agitar.
2.2. Incubar por 10 min. con agitación esporádica.
3. Separación de Proteínas-Carbohidratos.
3.1. Añadir 500 µl de fenol/cloroformo/isoamilico (50:50:1) frió, agitar en vortex por 30 seg. y dejar a temperatura de cuatro por min.
3.2. Centrifugar en microcentrífuga (fría) por 10 min. Y extraer, en otro eppendorf, la fase acuosa (baba).
4. Precipitación de DNA.
4.1. Precipitar con 75 µl de acetato de sodio 3 M y 500 µl de isopropanol frió, mezclar por inversión y dejar a –20°C por más de 1 hora, hasta formar madej a (pausa para hacer una nueva serie de
seis muestras).
4.2. Centrifugar en microcentrífuga por 2 min. Y eliminar el sobrenadante. 4.3. Añadir 500 µl de buffer de lavado (etanol 76% y acetato de amonio 10 mM).
4.4. Centrifugar en microcentrifuga por 2 min. y eliminar el sobrenadante. Reunir dos (o las cuatro pastillas en un solo tubo y escurrir (puede usarse papel absorbente).
4.5. Reextraer desde el paso 2.1. o fijar a la membrana (estos son métodos opcionales).
5. Lavado.
5.1. Lavar las pastillas con 500 µl de etanol 70%, agitar por inversión y dejar 5 min. Centrifugar en microcentrifuga por 2 min. Eliminar el sobrenadante.
5.2. Repetir el paso 5.1. y secar a 65°C (pausa).
6. Resuspensión.
6.1. Resuspender el DNA en 100 µl de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM) Caliente y equilibrar por 20 seg. a 65°C.
6.2. Añadir 1 µl de RNAasa e incubar a 37°C por 1 hora. 6.3. Centrifugar en microcentrifuga por 2 min.(pausa).
7. Purificación (GLASSMAX).
7.1. Precalentar 100 µl de TE a 65°C. Esta solución se utilizara para elu ir el DNA.
7.2. Añadir por 50 µl de DNA, otros 50 µl de buffer (tris-HCl ph 8.0 50 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM) y agitar con vortex.
7.4. Ensamblar y marcar adecuadamente un tubo/cartucho de (GLASSMAX). Transferir la muestra al cartucho. Centrifugar en microcentrifuga por 20 seg. Separar el cartucho, desechar el liquido del tubo y usar el mismo tubo.
7.5. Reensamblar el cartucho en el tubo y añadir 400 µl de buffer de lavado frió (etanol 76 %, acetato de amonio 10 mM), centrifugar en microcentrifuga por 1 min. Separar el cartucho, desechar el liquido.
7.6. Repetir el paso 7.5. otras dos veces. Repetir otras dos veces mas, pero usando etanol 70% frio en lugar de buffer de lavado (la ultima centrífugada debe ser de 2 min para eliminar trazas de etanol y se desecha el tubo).
7.7. Marcar un tubo nuevo, ensamblar el cartucho y añadir 50 µl del TE caliente del paso 7.1. colocar el tubo/cartucho a 65°C por 2 min. Para asegurar eq uilibrio. Centrifugar en microcentrifuga por 20 seg. Para eluir el DNA. Desechar el cartucho y almacenar el DNA a 4°C.
Preparación de soluciones Stock para extracción de DNA
Buffer de extracción
LS (0.50 ml):
Tris-HCl 1M pH 8.0 [50 mM] 5 ml 25 ml
EDTA 0.5 M pH 8.0 [20 mM] 4 ml 20 ml
NaCl 5 M [350 mM] 7 ml 35 ml
Mercaptoetanol 14 M [0.1%] 100 µl 500 µl
Urea [7 M] 42.042 g 210.21 g
LS [1%] 1 g 5 g
Total (agua desion. est.) 100 ml 500 ml
Fenol/Cloroformo/Isoamilico [[[[50:50:1]]]] (0.5ml): (frió a 4°C)
Fenol 24.8 ml 49.5 ml
Cloroformo 24.7 ml 49.5 ml
Alcohol isoamilico 0.5 ml 1 ml
Total 50 ml 100 ml
Acetato de sodio 3 M (0.075 ml) (estéril)
Isopropanol (0.5 ml) (frio a –20°C)
Buffer de lavado (0.5 ml + 1.2 ml) (frio a –20°C)
Etanol 100% [76%] 38 ml 76 ml
Acetato de amonio 7.5 M [10 mM] 67 µl 133 µl
Total 50 ml 100 ml
Etanol 70% (0.5 ml + 1.2 ml) (frio a –20°C)
TE (0.2 ml + 0.05 ml) (estéril)
Tris-HCl 1M pH 8.0 [10 mM] 0.5 ml 1 ml
EDTA 0.5 M pH 8.0 [1 mM] 0.1 ml 0.2 ml
Total (agua desion. est.) 50 ml 100 ml
RNAasa [10 µg/ml] (4 µl) (frio a –20°C)
Buffer para Glassmax (0.05 ml): (estéril)
Tris-HCl 1M pH 8.0 [50 mM] 2.5 ml 5 ml
NaCl 5 M [50 mM] 0.5 ml 1 ml
MgCl2 1 M [10 mM] 0.5 ml 1 ml
Total (agua desion. est.) 50 ml 100 ml
NaI 6 M (0.45 ml) (estéril)
Referencias.
Dellaporta, S.L., J. Wood, and J.B. Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant mol. Biol.. Rep. 1:19-21. Doyle, J.J., J.L Doyle, and L.H. Bailey. 1989. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12(1): 13-15.
Shure.
Life & Technologies 1998.Recombinant DNA techniques. Training center Workshop. Workshop january 1998, Mexico, D.F.
EQUIPO Y MATERIALES DE APOYO REQUERIDO
Equipo requerido Cantidad (unidades) Cámara de Flujo Laminar
Autoclave
Agitadores y calentador magnético Potenciómetro o pHmetro
Micropipeta 1000 l EPPENDORF, GILSON, SIGMA Micropipeta 100 ó 200 l EPPENDORF, GILSON, SIGMA Micropipeta 20 l GILSON, SIGMA
Micropipeta 10 µL Micropipeta 1 µL
Mortero chico con pistilo RCM, LAB-TECH
Punta para micropipeta 100 ó 200-1000 l SIGMA pqte. 500 Punta para micropipeta 10 ó 20-200 l SIGMA pqte. 500 Punta para micropipeta <1-20 l SIGMA pqte. 500 Reloj de alarma digital
Termociclador Microcentrifuga Vortex
Baño de Maria Espectrofotómetro Campana de electroforsis
Fuentes de Poder para electroforesis Sistema Documentador de Geles
1 1 2 1 2 2 2 1 100 100 100 100 100 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Materiales de apoyo Cantidad
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 100 g Thiadiazuron 50 g
6-bencil aminopurina 25 g Nitrato de amonio 500 g Nitrato de potasio 500 g
Sulfato cuprico pentahidratado 250 g Sulfato ferroso heptahidratado 500 g Sulfato de magnesio heptahidrarado 500 g Sulfato de manganeso monohidratado 500 g Sulfato de cinc 500 g
Cloruro de calcio dihidrato 500 g
Cloruro de cobalto hexahidratado 250 g Yoduro de potasio 500 g
Fosfato monobásico de potasio 500 g Molibdato de sodio dihidratado 500 g Ácido bórico 500 g
Na2EDTA (Acido etilendiaminotetraacético disódico) 500 g
Myo - inositol 500 g Glicina 100 g
Piridoxina 100 g Tiamina – HCl 100 g
Ácido Nicotínico 100 g Antibioticos
Fungicida (Kg)
Frascos para cultivar in vitro (Gerber) Cubeta 20 lt para desechos y tapas
Detergente biodegradable líquido y en polvo Embudo plástico
Detergente
Agua desionizada 20 lt Sacarosa 1 kg
Hidróxido de sodio 500 g Etanol 96% 2 l
Dimetil sulfóxido (DMSO) 500 ml Sanitas Caja de 1000 unidades Nitrógeno liquido (cargas de 20 lts) Termo grande y chico
Guantes de latex (4 por cada día de extracción). Tubos eppendorf en frascos con tapa (estériles) (8 tubos por muestra)
Gradillas para tubos eppendorf
10 gr 50 gr 2 Kg
1000 unidades 4
2 lts 5 4 kg 5 4 1 4 1 6 2 1 8 cajas 1000 tubos
Medio de cultivo Murashige and Skoog 1962 (MS-62)
Soluciones y su Composición. Cantidad del compuesto en mg/l Solución N° 1. Nitratos
KNO3 1900
(NH4)NO3 1650
Solución N° 2. Sulfatos
MgSO4 180.6971
MgSO4.7H2O** 370
MnSO4.4H2O 22.3
MnSO4.H2O** 16.8969
ZnSO4.7H2O 8.6
CuSO4.5H2O 0.025
Solución N° 3. Halógenos
CaCl2.2H2O 440
KI 0.83
CoCl2.6H2O 0.025
Solución N° 4. PO4 - BO3 - MoO4
KH2PO4 170
H3BO3 6.2
Na2MoO4.2H2O 0.25
Solución N° 5. EDTA.Fe
Na2EDTA 37.3
Na2EDTA.2H2O** 41.2973
FeSO4.7H2O 27.8
Solución N° 6. Orgánicos
Myo-inositol 100
Tiamina - HCl 0.1
Piridoxina - HCl 0.5
Glicina 2
Acido nicotinico 0.5
Azucar 30 g/l
Agar 6 g/l
pH 5.7
