Analisis de la organizacion del DNA de varias cepas y clonas de Entamoeba histolytica y especies relacionadas

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(1)m.¿fl5.IN-D. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE IJNIVEHEIIIMI NMIIIINHL HIJTIINÍIMA HE MEXICO MEXIIIII. wlilnmnri' X120. *J «ff .fër C* '11fh. IZTACALA. ¿Ir. "` ..%=":"'-_." 3f. ESCUELA NACIONAL DE ESTUDIOS PROFESIONALES. "_ "“*-= 5-_;'gig-¦"5P|P|1~.ff _¦&1::. .-` ›« 5:* "ig§.1.'j-¡'H-1ub_=_*f ¡gr-w ~-:'ba 3 ;.". "% É@ I""“._'ë1!±`”. ':¦-Il¿lu'. r:--. 1. "ANALISIS “ANÁLISIS DE LA ORGANIZACION DEL DNA DE VARIAS CEPAS Entamoeba %Histuly_lì|:q Histolytica CEPA5 Y Y CLONAS DE Entamoebiul Y RELACIONADAS Y ESPECIES EsPEc|Es RELACIONÁDÄS. E. T QUE. PARA. sS OBTENER. l EL. TITULO. sS DE; DE¦. o L O G o B BIDLEJGCI P RESENTA PflEseu†A; JESUS RAMON OCADIZ QUINTANAR. REYES IZTACALA. 1989 ¡939.

(2) UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor..

(3) "~'”~nr.'~'1ì~1'.ift.r!r1~. I-11. r'›r'g¿1fiize.c;ífÉn r!*:¬-1. Dr-IF;. -:H: -r-:.fia'.'.. cunas. c1f.:m.\: me ¡__-'._:_1I.¿ |_g_±_g_;_:;;_g_ I_:__1._gl_.g_!,_)¿§._š._¿.'_fj|__ y napa 1-_-f.f:*.=. r 1:1 .acá-J: .1-.<.I..u "'. HI.:-mI:›*'r*¦. Hn "lo. H@ rl"'. I'. .. ..1r¬"ïa--= R.=un=c1r1 Dr šdi :' (Fu: ntan:-Ir'. cuEn†n¦ r:ur:-nt ·":. ?7¶7250“1 77-.:7 7- 50 - 1. 'l"r-1:1*'¬'I 1 H¬'.'i|¬11~¬.`-I. ¢'“- F*:-turlifï-*E PrI¬'l'r±±¬i. '.¬r1¬' ""'~ Tri M' 11 -'U ll... M. FI.. f\. fï.. "!. F1.. .. '.

(4) late trabajo fu• realizado en el DepartamentoDepartamento· de Gen•tica Inti trabaja fui un al dl Ganütica. 73 Biologia Molecular centr~ de 1nveetigaci6n Ioluculnr del uuntrm Investigación y de ~• sutudioe Polit,cnico Racional, tudinn Avanzados Avnnsaflna del 1111 Instituto· Inatitutu-Politicnslcn Iiaciunal, bajo la d1recci6n ~ether 01-anna Orozoo Orozco. 1:. dirección de la Dra. flnthur Drama..

(5) Beta tesis es TraneforEsta tenia en parte pa.:-tu del .t'royecto rruyectu "Conjugaci6n "ünnjugaciôn y Transforaaci6n mación por al el. Gen6tica en Entamoeba hietolytica", subvencionado Genética. Ent.-mecha. hiatn1¡ti.c.a", Consejo Nacional de Uiencia <.:iencia y¡r •recnologia. Tncnologia..

(6) AGRADECIMIENTOS AGRADEGIIIEHTDE A Dra. Esther A la DraEathar Orozco Dromoo por la d1recci6n diroooiån y3 colaborac16n oolaboraoiån en an la realizaci6n rflalimaoiön de ño esta tesis. toni!Al oruz Hernández asesoría, colaboraci6n, al Dr. Pidel Pidal de oa la Grua Hnrnånüon por su au.aaaaoría, colaboracion, que na me ha brindado para realizar al el propreconfianza 3y gran apoyo qua sente trabajo. alnto Ai Dr. Jesus colaboraci6n en A1 Jaaua Vald4s ïaldåa por •u lu asesoría aaaaoria y 1 oolaboraoifin un la ree.liz.! roalirg. c16n cion de da esta lata tesis. tania. A y Biología A todos los loa integrantes intograntoa del dll laboratorio 8 B de dl Gen&tioa Ganštioa 1. Molecular prestada para la elaboraoi6n Iolaoular del CINYESTAV GIHvESTaï por la ayuda proataoa alahoraoion del dal trabajo trahajo experimental. axporinantal. A de la L ais ¡ia aaestros ¡aaatroa da 1a B.N.•.P.I.B.H.E.P.I.- U.N.A.a. U.H.A.I. A amigos. A mis aio aaigoa..

(7) A mis padron padrea por oo su ayuda 'T3' .L lio cariflo que iapulsaron para cariño qua me nc ilpnlnaron lograr esta cota meta. mota-. Para a1 esposa Plra a1 li hijo Ra6n Rllfin 1I para li onpoon Liliin con olor ayuda, carif1o cariño Liliia amor por ao su &'TUda, 'T que ae varoa para 1 comprens16n conprcnoion con no moti motivaron. terminar coto este trabajo. torlinor. Coni cariño cariflo aa mis Gom nin heraanos; hcrnanoag Silvia, Isabel, Iaabcl, Miguel Ifiigncl Angel Juan, Pablo. A A li mi sobrino Bliuth. Angol. 'T 1 Joan|Pa`h1o. aohrino Jonathan Elioth..

(8) i .INfHCE. INDIEE.. t_i ~ta de tabl ai::.• --·---------------------------------Lista UE tflblüi-““”“*“-*“-**“”" “““““““““ "”“””“”““"“. iii. Li st. a de F i gur· e.s. ·-------··------------·------·-·----···-----Lista de FiquroS-~“* ““““““““““““““““““““““ ""“"*"“*”“'". iv. RESUMEN.--·---------------·----------------------···----aaauflau.-«-~~fi«~-~-~~~-~-«-~~--=------~------~----IIHTaooucc:oH.-~-~~-«-~--~~-~~---=--------------~--NTRODUCC ! ON. --·-······---· ---------------------------------. 'I .3. C i C l O de' i rt ·"- of rl C' f' n,\;_!t,!)'•_9.f;~.b tü...:~i.Ql_tlJJ;.fl . .. - ..... - -- - Cifllo oo Vviflo Ffiiaaoooo uiatalriiao-"~-af-ar. 3. ,¡1.. .;i) ai. El to. -----·-----------·-·-------------------E1 t~·cft:noi trnfniuiiu. ------ --~~---¬“~~----------- ~-¬--~~. 4. b> El quiste.-HH-a*-f~---+~-------¬¬~---*~fl-----~quiste.------------------------------------hi. 5 5. Patagonia du Patogenia d"' E, ~. Di :f *L E:--;.~;i† í sr', [·i~t:·::i,c::;"·.r;. biäLg¿ïLigå.~~~---¬ -----------b.t~!;~li.J;.ª-· -·-----------· ---------. ¿o._'r ¿fi ¿ai ;0 .. \,.é~~¿:l. 6à. 11? noi 5. -¬---~----~¬-----~----+'.lE· la amibì amibiasi!l.·--·-.. ·---·-·-------. 7T. Cl~sificacion taxonomica.-------------------------Clasificacion taaunnmica.-ar---~~*~-*---~~~* ------ --. 8E. Eri 'c Pr i 1:15 taxonomicos.----------------------------I:.a¦{ nnnmi gp; _ --------- --------------------------.-. Criterios. 9. C:ln ti dad di ds: SHE DN0. r.;or Cantidad par. t.r·o{ ozl.)i to En E!:'. :?1 gu:>c?""o hrúfuzuitu 21 guncru. ¦+¦"¡ t_~.1r.oe;;b; II; .¦=~__¡1;¦¦~§É =g_ -------------------------- -------·-·--·.----_-_-._-._-¬~ _-_-....._......... En .• ········· -·-·-···-.. -·· --··-----··--··--·-·· ...--...__.... -------. · 10. Cinmtica reaaociacion.-------------------------Einutica de raanuaiaciun.---~-----~~-«-~-~-+~-«----. 14. Íüüíifiiflfltê dr s0dlm?ntacion.---·------%wdim3nt¿çign,¬--»-~~-~~ ------------------ -----=o~ficiente d•. 16 lá. Rnfitricciun doi. DHH amihianu H hibridaarnr. mp1 5;-;;|_|_1 ar , -~---------- ---.----.-¬.-.-.-..._ ...... __..._...-_........,.-...._......-._.__._ mol r::cu 1 ar.-·---------·----·--------·-·-·---·----------·-·--------. 18 IE. Elactrnfuresia DHfi.~--fl-~--- ------+~---~-------Electroforesis del DNA.----------------------------. 21 21. E1ortrn+urEoia gradiflnto campuo puinadna El t>i:-tro-fore!'.i f ona r:r.ro un ur1 or·adi P.'lt<•· de e!<!! c::,mpt.'S pv.l 5adot> ------------------------------.__ca-____¢_“_a_____-a_ !{PFg1_-PFB) • ---·--·--·---·-·- "·--·---·-··· .. ----·------------·-·- --------. 22 'I'-J 'I-J. al HI'. Cromosomas de 1E"u'B.flLH"a.. levadura,------------------------CT' DI'I'IDE›ül'I'IñE› GE* -'f--~-------------------------*---. 24 24. bi. DNA crnmuaumal dc Igïggfigggmå.~¬~--~~~¬«~~-~~¬. 29. 2: `*. ""!.l"~¦*'7`-. 1111 32. '_'=' _'-ff=f-.P-.' nf". '_if'- '___-;-_-_jL¿i¬¿_,j;_;_g1¿¿¿_¿_¿,. -. -. -----------------¬. 1.- 4.-'-.

(9) OBJETIVO.-----------------------------------------oaoeïlvo. ----------------------------------------~-. 36 Ià. Faran†ac:a.-~-~»--~-"~~~¬----~~~¬~~~»~~---~-----FC::TRf\TEG ~A. - -- --·· - . --- ·---··-- - . - - -··· ---·--· - --·---·------. 36 Sá. MATERIAi. METODOS. -·---·----------·-----------------HHTERIHL Y HETÚDD5------------------------“r *****-". 3? 37. fi55UL†ggg5 «¬_--__ ..........h__-__-__ P.E:SUL TADOS ·····--· · -····“-"_-."-__--....... - ·-- - · ·---···- - --- ····-------·-·--···---------. '51 El. D t SCUS ION.. otocusrou. ····· ~~~~~~~~~~~---------~---------------------------~------·-··- ·· -·----- --·------- ---------···-·-------. F5 75. coflcaualoaes. --------------------------------------CONCUJS IONES. ------·----·----------------------------. Pfi 96. g151_:|ju¶=;p|F1A.~-~BIBL!DQ!":AFIA. ·- -·--. 98 99. - - - - ----------------------------------¬----.

(10) Ui iii. L!ST~ DE D~ TnBLns. LIETQ THBLHS.. THRLH I-. Prnpindadcc del DHH dc Entampcbg gg.. TnBLA I. THBLH III.. Numero d::: i::vadur <i resuëltuo resw~l tor; rn* ,..,.,~ "'' dc c:rcmosomas crumunflmac dL? du 1levadura ni. Si!"tt>ma nictcma PFG. PFB.. TílPL" III. JYI. Coriütlpü Cariotlp'.:l mol~c:ular df.! Trvp<.\nosorr.<1 TfiPLfi mnlficular de ][ï2onunnEn obtc>11ido Dbtnfliflu :-011 tuu el 5istem3. al nlatema Pr-"G. PFB.. "!'"I?'--'' Tñfliñ. JV. IV.. í:ar!ntipt:' Carintipn ml")\ecular molecular de do l.1dshmania Lrichganig bgaziilegoio. ~ra::~is.. Tñfllñ T"Pl A V.. Cariotipc:>n mnlrcularss molrcl1lar!!!!s efe> org.,nis"'n~. Carintipnfi do varioi:; varios nrganiamns re!'óuP.ltoo:; el renuoltun ron run al. TAPLA TAFLA VI.. sistoma PFG. sistema. FP.not.ipos clonas de t,. Fenntipca df? de las clnnan E.. cepa HHI¦IH55. HMJ:IMSS. capa. histolyt.ica Qigtnlgtica.

(11) tv. LI!?TA FIGURAS. LIETH DF DE FIÉUHS. Fi.gur-n l1 Figura. Cinetica de rnanuciacinn r~a~ociacion Einetica. DNn Ho d~ del HHH. Entamneho '.!E!.• gg. Enli1111ne'1"'. Figura 2. Migracion del DNn el síntoma 5istem~ PFG. Higracinn Dflfl un El. Figura 3. !J!.,ilgram:t Diagrama dP.l dnl. sist:t?ma PFG <:on elr?ctrh:rs Giotoma PFH tun r:-.'\mpo-a cnmpnc elflctricfln. h r•!'lO;J eneo-het er ogcneo. hnmcgcnoc-hotcrcgrncn. Figura 4. Di_agrt1l"a PFG r.on el,.,r:trir-<:>'3 Diagrama del sistE''l'i!'. siotroa PFE con ca111poc, campna olrctriroo. heterc•geno;;>os. hetorngefloun. Fii,;ura 5 5 Figura. Lisis ill ~y Linin Lg QLLQ y electroforesis olcctrnfurosin del DMA HHH amibiano en geles verticales verticales de d~ agurosa amihiann En aqarnan !Eckhardt >. ¦Echhardt1.. Figura l> b. Fluorogr-afia do de lun los patrones patron!"s electrofo1 elic:us Flunrngrafia alectrnfu1cticun de DNA obtenidos las tt?cnicas de li!:is do Dhlfi obtenidas con cun laa tmzcnicaa dc licis in ig_ situ ~· Eloctrbfúrecin electrofor-e!:.is estilo Ec:khardt en §¿Lg_f Ectiln Eckhardt cn gele~ verticalas d2 ag~r053 goloc verticales d: agcruoa. Figura. 'É'. nn.:-li!'i.~- -Ir! ·lrl EHf""| C~!"l do ~- b_i_';_=_I;_;ç_l__~¡;_L_í¿g¿, !:LL~~?b:i.it:!7,., CPPé'. I'-"tnr.lic.i*:. dc E, cepa. L.ire:Jo ~. Lar Edu 1,~ E,. l.tiva~cmª-Fºr!it•i~ in ;;j._J;~ ¿_;¿1._:¿c'_t¿;_:§_ pair lìfii-J Lil ;;_i__l_:_g. ag~1ro::~. f)' i;:\ect:rofc·t·csis clcctroforcoin t'tl cn g:::le:; galas de dc agnrccc.. figura G. l'k.al:~.io: d2l c!ifc::~·t::1te:s capa: cep~c::; du de~. ñtalìüii dal DMA HHH de difcrfinkcc ã.. bi EtgJ_y___tj__L.]_. ti±.&ii›1.r_1=_ifr~1:Í"ig|.*_f i gL'.( ::.'\ J.. H '7 1'. l'lrwl i ~is dcil NIA de r: 1 on<:1s dc d~ ¡kudicifi dal Dflñ clnnas E_.hi~\:t)lyti_ci\ pro·1c:-ni!:'ntes ce>pc E.hìctpl†ti;g pruvcnicntcs de le la copa. HM!: HH1 ¦ I!!'IS~. Håfì..

(12) V. Figura 10. Aislamlento DNn amih amibi~10 Aislamiento y migracion del doi PHH «vo. total y el de la'.i al do las difP.renta'.:. diforontos pobli:lc.!.o;in!; publac*o¬flc. oloctroforoticas obtenidas por. Jlrct ofnfr_±. horizontal en gcl<:'s do d~ agaroe;v. En golos agoro¬o. f'ig\.\ra Figura 11 ll. nnalisis oloctroforotico DNA dc Anal i sis e!. oc t.:1· o·f orct i co doi del ONA de 1laa ropa c:cp•\ HM3B e1:tr-aido din!!ctCcrnente in~cr·los con HHEB ontraido directamente de do inscrLos. 6à X trofozcitos. I to• 10* trofocoitos. Figura 12. An~llsis del d~l DNA arnibiano por medio de la ñnalisis DHQ amihiano mrdao do. tecn!ca c~mpos Electricos electrice~ tocnica PFG con campos homogeneo-het: er D';)P.l'!"tJ. homogonoo-hotorogonro. Figura 13. Analisis del DNA DHH amibiano amihiano por med!o medio de do la ter:l"lica PFG tocnica PFE con campo!:> camos elE>ctrico!:. oloctricoc hr.tcrogEncos. hr+orogcnooc.. Figura 14 IA. Analisis del DNA arnibiar.o amihiano por medio de la t.E'c:nic~ PFB PFG con ca-r.pos electrico~; hotcrogcnoos hetcrogc:nco:;. tecnica campos electricos. Fiyura 15 Figura. C;.u·iotipcs molacular~s do de lg_. Cariotipos moleculares § lj. E·. Pigura 16 figura. i?warfen~ y Lgïgggjg. gis1gl3¿§1_1_:___z¿. hi!'.:tolyt!ca.. •odeloe moleculares de loocloa para loe loa cariotipoe cariotipoc nolccularca dc !• § hietolrtica .!• invadena. hifltfilltifil 7 I En inraocna r.

(13) RESUMEN. El. fué objetivo de este trabajo Fué. ~. §.. analizar el ONA DNH de. higgglggica comparando su organización en cepas histolytica ceµas patógenas no. ,. patógenas patógenos. así as1. como. con. otras. de lisis !J:l Lg_. Entamoeba. Egtamgeba. Por técnicas. vertical yv horizontal de DNA se obser ·varon dos observaron. una,. electroforétíca y electroiorética v. por. una. de aayor mayor. situ y g¿;g_v. del. DN,f\ DNH <mayores (mayores. banda bandtt. de. al!plitud e amplitud e. género. electrofor-ésis electroforesis. amibìano en geles de amibíélllO. poblacio1111s poblaciones de. represe11tada representada. especies. agarosa, agaro!'..a,. 50 de SD. mavor mayor. Kb> Kbl;1. migraciñn mi graci é.n. intensid~d1 v y intensidad;. banda de menor migr·aci6n migracion eleclroforética, electroforética, de menor e intensidad. Este e Esta patr6n patrfin. y. otra. amplitud. electroforético electroiorêtico fué Fué observado. en. E. hit;tolytica higgolgticg yv en la cepa Laredo. cepas y clonas de &. Lan~do. En. 5. b•. invadens igvadnng se. de. observó observo la. presencia da de. una banda. ancha,. igual migración a la banda mavoritaria mayoritaria de g. ~migracion electroforética electroêorítica a histolytica, histoiggicg,. yv. además. un. electroforética. electroforética. Cuando. dobleta doblete. •stos catoa. incorporando ª<H>-timidina 'IHi-timidina. da. escasa. eKperimentos experimentos. se. observ6 HM38, de ~· histolytica, observó la presencia •n en la cepa HHBB. §. flistglggica,. de. bò. bandas. de. DNA Dflñ de dl. diferente diferente. los. repitieron. trofozoítos. hasta. al. se. migración migracion. intEmsidad, intensidad,. colocación. y v. histolytica QLELQLILLQQ también. 5e se. Amplitud. amplitud. La Drganitacifin organizaci6n. del DNA de. ~· E.. estudió .:ir·osa estudio con la técnica de dl electroforésis electroforesis en geles de ~g agarosa con un gradiente de campos pul!lados pulsados <PFG.> IPFBII1 a> al. Con Bon. el. sistema. homogéneo-heterogéneo homogéneo-heterogéneo. PFG PFB. los. distribuyeron distribuyeron en 5 zonatu sonas:. con. campos. cromosomas. eléctricos. amibianos. que corresponden a cuatro corresponden a. se. bandas.

(14) 2 d• ¿Í DNA DNÑ. qu• que entraron. al gel. yv. DNA DHH que. quedo en. el. pozo poco. posiblemente por la complejidad de su estructura. b> Con el sistema PFB con campos eléctricos heterogéneos bl heterogëneos. se. observaron. de. los. cariotipos. tripanosoma y y levadura.. moleculares. El DHH DNA de. ya. reportados. !;_. E, histolytica 111or,tró mostró. s6. DNA y el de !;_. invadens mostro mostró 4 bandas que entran bandas de DNQ E, Lflvadeng al gel. En todas la& izadas se observ6 DNA las muestras anal analizadas observó UNQ. qu~ que. pozo del gel. El análisis densitométrico de queda en In el poso. las. -lotografia& fotografias. DNA Dflfl. obtenidos con. de. los. patrones. el sistema. bandas con moléculas de. electroforéticos. PFG confirmo confirmó FFE. de. la presencia. de. cromosoma! que conforman tamaño cromosomal. cariotipo molecular da de ¡;_. §. histolytica. h¿sLgL1§ig¿.. 6 o. E>l el.

(15) 3 INTRODUCCION. Entamoeba. bistoiytica es el histolytica. protozoario parásito. que. produce en el hombre. la amibiasis, amlbiasis, enfermedad entérica entërica. que. puede. diversos. eKtenderse extenderse. parásito. se. a. aloja. en. lesiones necróticas lesiones_necr6ticas menor frecuencia. el. con. órganos. ñrganos.. intestino. poca. grueso. reacción reacciön. los parásitos parãsitos. hfgado higado yv con mucha. Generalmente. produciendo. inflamatoria,. se pueden. menor frecuencia en. éste Este. con. localizar en iocalirar. el. la piel, cerebro. yv. <Biagi, 1982). otros órganos organos de importancia ifliagi, 1952).. CICLO DE VIDA DE Engpmoebg Entamoeba histolytica. CIDLD histolytigg. La infección empieza con la. humano por ~. E,. de un huisped huésped. ingestión de quistes ingeatiñn. histolytica Qiggglxgiga. maduros del. parásito,. presentes en alimentos contaminados. En el aparato digestivo presenten del huisped huP.aped se lleva a cabo el desenquistamiento, durante el. al nucleo núcleo cual el meta qufsticol, qufstico>,. se divide para sl divido a. lo que. <estado iestado. formar ocho nucleos. sigue. una serie. de. divisiones. citoplásmicas, trofozoítos uninucleados citoplismicas, originando ocho trofozoftos emergen del quiste. <Martínez-Palomo, lflartfnes-Palomo, 1982>. l?E2i.. los trofozoftos trofozo{tos. se reproducen. adhieren. mucosa. a a. la. por. Posteriormente. divisi6n binaria divisiãn. intestinal. donde. pueden. ulceraciones. En condiciones de tránsito trãnsito intestinal algunos trofozoítos trofozoïtos. inician la. reproducción reproduccion. enquistandose. El enquistamiento sólo solo colon y el parásito. pasa por· por una. que. yv. se. producir. normal,. esquizogónica esquizogãnica. ocurre en la luz. etapa de prequiste, prequi ste,. del cuya.

(16) 4 morfología es. esferoidal, de. pared gruesa. yv con. un. sólo sñlo. nGcleo, frecuentemente el prequiste es difícil de distinguir nücleo, y se distingue del quiste dehido debido de un trofozofto trofozoíto inmóvil inmüvil v. que iste Éste último tiene un proceso. hasta formar. a. cuatro núcleos. nficleos. El enquistamiento. activo una. vez iniciado, ve:. un total. de cuatro. el núcleo nücleo. núcleos ,. divisiones ocurre ocurr•. glucÓlisis anaerobia glucålisil. <Barker y Swales, iflarker v Smales,. 1971>. 19711. Una vez ve:. se. divide. durante. y síntesis v sintesis. es. estas de. DNA BNG. for-mados os quistes, formados 1los. se. cree que estos no pueden pasar a la fase de trofozo{to troiosofto en el mismo huisped, huësped, sino. que tienen que. empezar un heces para empesar Los quiates quistes. no. nuevo ciclo iflartines-Palomo, <Mart!nez-Palomo,. tienen. 6rgano de* de iijaciñn fijación Erqano. expulsados con la mat•ria materia. fecal, _Fecal,. excretan cerca de 45 111illones encretan millones Swales, Emales,. 1971). i??li.. Se. ser expulsados con. ha. resistentes al calor, calor·,. las. 1982>. 19521.. pronto. y Y. los individuos. son. infectadas infectados. quiste& por par· dfa día (Barker <Barker· de quistes. observado y la sequía v. que. los. quistes. sobrevivir· pueden sobrevivir. yv son. fuera. del huésped por semanas o meses iflohle <Noble yv Noble, 1976>. läïel.. a> al EL TROFOZOITO. TRDFUZDITD. El. trofozoíto troiozoito es la fase móvil mñvil. introducirse al huésped. yv activa la cual. invadiendo l'a la. puedP puede. mucosa intestinal. y v. otros organos Órganos de importancia dehido debido a su propia motilidad. yv. gracias aI sus enzimas proteolfticas <Biagi, ensimas proteoiiticas lfliagi, 1982>. 19821. J-lm de diámetro, es El trofozoíto trofozofto mide en promedio 25 25¿pm forma elongada con lobopodos. yv uroide v y. es muy sensible. cambios medioambientales como: temperatura, pH,. de a. osmolaridad.

(17) 5 yv potencial de Enido-reduccion. 6xido-reducci6n. El citoplasma del trofozo!to dll trofozofto. se divide en dos porciones: porciones1 el ectoplasma o zona externa, aKtarna, la pseudopodos, Y el cual es clara yV da lugar a los psaudopodos, y al. endoplasma andoplasma. o :ona zona interna, int~·na, la cual tiene apariencia finamente granulosa qranulosa y trofozoftos aislados y con muchas vacuolas. vac1.1olas. El endoplasma de trofozoítos. de un. hospedero nospedero presenta. eritrocitos, 19821. l?B2}.. Por. organelos. leucocitos, otra. bacterias, etc,. parte,. típicos. de. vacuolas alimenticias. el trofozo(to troiozoito cilulas celulas. llenas. de. <Mart(nez-Palomo, (Hartfne2¬Pa1omo, carece. eucariótas1 eucariñtasl. de. algunos algunoi. mitocondrias, mitncondrial,. aparato de Eolgi, Golgi, retfculo retículo endoplismico endoplásmico rugoso P y perosisomas peroKi&omas <Martínez-Palomo, iflartinez-Palomo,. 1982>. 1982?.. Una. celular de la amiba la ocupa. quinta. del parte -del. volumen. el nucleo, núcle_o, que mide mida de 3-5. ).lm ,pm. de diámetro y aparece como una esfera central rodeada de una mttmbrana di11opu1Psta en membrana delgada, con cromatina granular dispuesta. masas. irreguliH"es observar· troiozoitos tr-ofozoftos binuclaados. binucleados, irregulares y es Fác:il Fácil observar ár-ea area entnr entre. el. n(1cleo y nucleo Y. la. membrana nuclear. es. clara. El yY. muestra fibrillas acromáticas iBrandt <Brandt y Perez-Tamayo, 1970>. iibrillas acromåticas l9?0). El nucleolo nuclE<L)ln E1. r-eprF,sentil una ~ma representa. área area de. condensación cündehsaciån. de. microscop(a aparece como un cromatina que en los cortes para microscopfa. punto obscuro yv es común com~n ~unque aunque. encontrarlo al centro del. núcleo, n~cl•o,. suele ser ser- mas o menos excéntrico. escintrico.. b> EL QUISTE. bi U11a Una part12 par te. imrior·tante de11tro inioortante de-ntro. del ciclo de. vida de. E,. E.. 1Jistolytic4ª es el quiste, el cual participa en la dispersión dispersi6n g¿¡;Qlx;¿§¿_es. del parásito en el medio. ambiente. Los quistes son. capaces.

(18) 6 de resistir en el medio ambiente hasta que son ingeridos por. huésped. El quiste de i· E. hi~tolytica hifitolgtica tiene en otro hu,&ped. 12 µm de diámetro, es de forma i2_um Forma redonda u oval y v maduret tiene de su estado de d• madurez. col, 1979>. l??9l.. dependiendo. nucleos, de uno aa cuatro núcleos,. morfolÓgicamente morioldgicamente son similares al núcleo nucleo de los <Smith yv iãmith. promedio. Cuando las. que. trofozoítos trofosoítos. preparaciones de. quistes. amibianos son tefiidas teñidas adecuadamente, se pueden observar. los. núcleos, limitados. con. condensaciones de. por una. delicada membrana. cromatina agregadas. interna yv con un nuclefilo n~1clP.6lo. nuclear. sobre la. superficie. central formado por uno o. vario• varios. gránulos dipuestos cm Órgano compacto. Los q~istes grânulos en un organo quistes de hilitolytica, nisgolgtiga, al igual. que los d• de. amoebidae, amoehidaa,. cuerpos. presentan. cil{ndricas con, co~ estructuras cilindricas los presentes en. otros miembro& miembros del. cromatoide& cromatoides. puntas romas,. sntampebj G..Q.l.i. §g;amggba_ggLL. <Svhla, iEvhla,. orden 1961>, l9all,. aa diferencia. cuyos cuerpos. !;_. E.. de. cromatoide• cromatoides. tienen estremos extremos puntiagudos <Brandt y Perez-Tamayo, Pérez-Tamayo, 1970>. (Brandt v l9?Úl.. PATOGENIA PHTUEEHIH DE ~. E- h&stolytica. hisìnlxiisaf L.a amibial!.is La amibiasis intestinal puede ocurrir en doa dos forma&• formas:. a> al. amibiasis aguda o disentería amibiana, caracteriaada caracterizada por una disenteria amihiana,. diarrea. intensa. caracterizada caracteriiada por. yv. b) bi. amibiasis. vagos. disturbios. musculares, perdida pirdida de peso, etc.. crónica cronica. o. latente,. intestinales,. dolores. La amibiasis aguda es. un. importante problema de salud en varias regiones del mundo en donde se combinan condiciones sanitarias inadecuadas,. con la. pobreza, pobresa,. la. ignorancia yv. la. presencia. de. junto cepas.

(19) 7 altamente virulentas. produciendo. una. alta. incid•nc.ia incidencia. d• de. amibiasis intestinal en niños yv absceso hepático hep~tico en •n adultos, mayor frecuencia envarone& con mavor en varones CMartlnez-Palomo, iflartinea-Palomo, 1982>. l?E2l.. DISTRIBUCION MUNDIAL. DISTRIBUEIUN HUNDInL OE DE LA LH AMIBIASIS. aHIBIñ5IE.. La. amiba como comensal. mundo, •in sin. embargo,. en. está diatribuida esti distribuida. A•i•, Africa asia, africa. yv. por todo. •l el. Latinaamerica Latinoamerica. •• se. observan ~reas areas de alta incidencia de amibiasi• amibiasis inva•iva invasiva se. por. caracterizan caracterican. presencia. principalmente. extrainteatinales, estraintestinales, CMart!nez-Palomo (Martina:-Palomo. la. yv. enc:uentran casos de d?. encuentran. por. la. oficina. individ1..1os individuos que. mueren. y v. en. P~rez-Tamayo, Pdraz-Tamayo,. En. el pais pa{a. hepático hepatico México Hisico. de. latinoamérica a a latinoamerica. Esta. 1964 l9o4. cada. causa. prevalencia asi ••Í. tres. de. reir.ide en la ciudad de reside. 1970>. isïdi.. se. CSepulveda, lsepulveda,. 1los os años de 1962 l9e2 aa. Panamericana,. enfermedad uno es me-xicano eniermedad mexicano yv <Brandt ¡Brandt. 1983). 1?E3l.. amihiasis amibiasis en t.odo todo. Sanitaria. letoion•• lesiones. absceso• absceso*. Mart!nez-Baez, Hartinez-Baez,. 1975> str·ados en 19751 y según segun datos regí registrados. de. que. ista esta México Mexico. de. la. como. la. variabilidad en el potencial pntenci~l patog,nico parAsito no patogenico del parisito. han. amibiasis amibiasi•. invasiva. en. ciertas. podido explicarse. hasta. hi1tolytic1 se ha flL§LgL1LL;¿_se. estudiado desde varios. qu& que. incluven incluyen. MartCnez-Palamo, Hartines¬Palomo,. el. el. é'.reas, areas,. momento, a. ultraestructural. 19831, l?E3l,. petsar pesar. puntas de puntos. que. yv col,. E_. E,. vista,. CGonz,lez-Robles iüoneålessflobles. bioquímica ifluñoc CMu"oz bioqufmico. inmunológico <De Simone yv col, 1984>. inmunologico iüe 1954).. de. 1982) l9E21. yv. • e.

(20) ª" CLASIFICACION TAIDNDHICH. TAXONOMICA. CLASIFICñClüN Comunmente la clasificación clasificacion. ••ta esta basada en la. parásito& paråoitoo. morfología, especificidad de hospedero hoepedero. patogenicidad. Este ha resultado que hay. de organismos. diferencias pocas diferenciae. un sistema inadecuado,. morfológicas morfologicas consistente• consistente:. y ya. entre. los miembros mismo pasa con la especificidad miembroa de un grupo, lo miemo de hospedera hoipldero y la patogenicidad, que son factores Factoria varleblee. genero vari abl t~s. El 9É?nf>rc:o. §gt¿mggg§_ee ~n.tamoe>ba. f>P. divide di vi de. mayores en. número de. base. al. <1961> denignå designó quistes. Levine fläell. nucleos. en cuatro CLtatro. presentes presenten. <quistP. (quiste. uninucleadol, uninucleadol.. tetranucleadol, tetranucleadoì, coli. grupo! grupo•. en. a éstos ietoe cuatro grupos I-. bovis. altamenta lltamlnti. los loa comoa como:. F I. histolytica hietolytica. <quiste (quinto. <quiste octanucleadol octanucleado> y ginuivalifl gingivalis <•in (quiste (sin. estado conocido>• sin embargo la identificación notado quístico quíotico conocidol; identificacion eotoe grupos grupo! ee estos es. diffcil. Por estos eetoe difícil.. buscar buacar criterios adicionales adicionalee. para la. Entamoeba especies del género Egtamoepfl una manera. rápida rípida. yv. motivon, •• lo motivos,. importante. clasificaci~n claeificacion de. través. de. confiable. Avances. estudiar. las. identificarlas para poder identificarlaa recientes recientei. biología del genero género ~ntamoeba, conocimiento de la biologia gn¿¿mQ¡Q¿, a. de. organismos. cultivados. de. en un. el ol. obtenido• ohtenidon axénica axånica. y. monoxénicam1mte, bioqu{micas, monouãnicamente, sugieren eugieren el uso de propiedades bioqufmical, metabólicas yy metabolical. fisiol6gicas fiaiolñgicas. de la. amiba amiha. para. desarrollar. eiqnificativoe de clasiiicación, sistemas mae mai; ~i9riific:ativos; clasific.ación, como ya se. ha h•. hecho con. La. bacterias. <Moore, (Moore,. clasiiicaciãn taxonómica clasificación taxon6mica cantidad de hospedero, ho1>pedero,. ideal. propiedades coma como metabolismo. n1etabol i smo,. características. i??4| debe. Sandereon, relacionar. una. gran. moriologfa, especificidad morfolog(a, P.!ipecif icidad. requerimientos. inmunológicas, inmunolågicas,. 1976>. 19?bl.. isoenzimas ieoenzimas. de. de. crecimiento, específicas,. y.

(21) composiciôn y organización organìaaciñn del DNA. DNH. Sin Bin embargo, aigunaa afgunaa composición. istas estas. caracteristicas características. condiciones. pueden. ambientales,. variar. induciendo induciendo. a a. al. cambiar. que que. e1 el. dp de. las la•. grg¡n¡¡mp prg&níamo. exprese diferentes secuencias de su DNA. DNH. En cambio el tam&ño tamaño yv. la. composicion c:omposi c i Ón. constantes. de de. bases. biológicas. c&r&cterísticas caracteristicas. del dwl. que. útiles. Dflñ DNA. pueden. para. la. cualquier. notable• notables. cambio. ~n en. <Gelderman fGe1derman. en. histolytic:a Qistglvtiga se. yy. tomada• tomadas. son •on colllO como. de. la. debido. lo• los ne no. aa. que. compoaición composicion. de. 7 a a 10* ~o• pares con 10 10'. col,. 1971>. l9?ll. Dentro de. reconocen cepas. grados de virulencia CSargeaunt iåargeaunt yy. celula célula. de la misma e•pecie especie. nucleótidos del DNA DNH de un orgamismo. especie E. ~·. ser. e~ta5 constantes, estas. significativo. bases debe ser letal. una. clasific&ción clasiiicaciån. organismos, ya va que entre individ1.10• individuos hay cambios cambio~. de de. con. de. la. diferente• diferentes. col, 1978) l??El pero ha•ta hasta. la. fecha aún rápidamente por aün no es posible reconocerla• reconocerlas fácil ficil yv ripidamente lo que serfa sería mu muvy importante desarrollar un m~todo método •encillo sencillo y preciso.de identificación de preciso_de identiticaciün. las diferentes cepa• y cepas V. clona& clones. amibianus. amibianas.. CRITERIOS CRI TER IDS TAXONOMICOS. TFiXDHDH1I:'-D'5. Dos criterios criter·ios biogufmicos bioqu{mico!>. principales se han. aplic•do aplicado. para detectar diferencias yy similitudes entre las cepas grupo Ent•moeb@. EflìameghfiBischoff Hischoff 1980). yv. El. primero. 119681 Clfiofll yv seguido seguido c:rinsi ~. t . e consiste. en. fué propL1~tr.to tuå propuesto. por. por col, por Sargeaunt Sargeaunt yy col, la. observación,. por. Reevea Reeves. del y y. (1978,1979, {l?7B,1979,. medio. de. electroforésis, isoanzimas. electroforesis, de diferencias moleculares entre isoenzimaev. 9.

(22) 10 E•ta• diferencia• Estas diterencias pueden ser en la carga, estructura yY molecular de las enzimas analizadas.. para. prop6sitos propósitos. de. complejo. fidemås, Además,. diagn6•tico diagnostico. se detectan. ya va. peso. Este método no se que. es. usa. tecnicamente. variaciones fenotípicas fenotfpicas. aún aün. dentro del grupo tipo de ~. histolytica. Sin embargo, con el E. nigtolgticg. !le dP.muestra se demuestra. que due. grupo. el. Ent. ª.moeb.ªEgtgmggga. esta. compuesto. de. especies biol6gicamente bioiñgicamente distintas <Martfnez-Palomo, mnartinsifeaioms, 1982>. iesei. Por otra parte, el DNA ~· hi1tolytica ae ha estudiado DHH de E, g¿§;gLï;1g¿_se principalmente taaonñmico y v cada dfa aumenta más mía princ:ipalmf"nte con interes int.erC?s taxonómico. la informacion información. que existe. sobre la. biología biologia molecular. da de. éste parAsito (Martinez-Palomo, <Martínez-Palomo, 1982>. Éste parisito l?B2l.. CANTIDAD DNA POR POR TRDFÚIUITD TROFOZOITO EN EN EL EL EENERÚ GENERO Entamgeba. CHHTIDÉD DE DNQ EQLQQQQQQ. La cantidad de ONA célL1la, la proporción Dflñ por celula, proporciön de pares de bas~s <G-C yy H-T) A-T> bases ¿G-C. vy la secuencia. relativamente constantes v y viviente <Gelderman (Gelderman. y col,. de bases son. propiedades. caracter!sticas de cada caracteristicas 197lbl. le?lhl. Estas. especie. propiedades. son. y taxonómico& comunmente empleadas en estudios filoger-.Gt.ico• filogenëticos v taaonñmicos. de las. bacterias. principio podría. <Moore, tHoore,_ ser. usado. 1974¡ 19?4¦ Sander-son, Eanderson, con. propósito• propösitos. y amibas <Gelderman ifielderman v. col, 197lb). Gelderman l9?lbl. Eelderman. hi~o un hiso. el cual. estudio en. midi6 midiå la. ~. histol¡ticgJ histolytica, varias cepas de Q.. HB-30i:NIH HB-3011 NIH yY. 200¦NIH. 2001 NIH.. El autor aL1tor. homogéneos en l<'l la cantidad de. 1976> i9?o). aimilares similares y col,. DNA DNQ. entre ellas la HK-9, valores val ores. en. <1971bl il9?1bl. cantidad de. observo observ6. éste Este. yv. de. F-22,. bastante baw.tante. DNA Dfln por célula, con una. media.

(23) de 5. I. 10-il. gƒciìula. <Tabla (Tabla. I>. Ii.. Comparativamente, Cdmparativamente,. eetl•diar perteneci.entes al género estudiar ot.r·as dtras especies pertenecientes genere. al el. Entamoeba, Efligmgggg,. s• dhtuvieren obtuvieron les los siguientes resultados: E, ~. histolytica cepa se Qig1gL1L15g_cepa 9 X g/célula, E, ~. I 10-•• 1ü“'* qƒcélula,. Laredo Llredu tuvo tuve un valor valer de. moshkovskii QQQQLQEELLL. 3 2 g/célula y~· <FIC> 11 IX 10-• 3.7 X KFICI 1D-I* qƒcëlula y E, invaden! Lflïagggg 3.? K 10-• 1ú“*=. g/célula qƒcälula. IGelderman col, 1971b> iüeìdernan y cpl, 1??1b1. difieren. los dlscritee d•&critos de lei. !Tabla I>. Estos :Tabla 11. Estes valores vaipres. posteriormente per por pdsteriurmente. LÓpez-Revilla Låpe:*Revi11I y. 11978>, 119151, quienes reportaron repertaren valores valeres entre 8B X I 10-•• 10-i*. G6mez Efimet. g/célula gƒcelula. a 9 X g/c,lula para varias cepas de ~. hiat9lytica, X 10-•~ lü"1* qfcålula E. fiigjglggigg, ~· para E.. X g/c&:lula I 10-a:s iü“*3 gƒcëlula. para~. moshkgvskii. para E, mg§fl5gg¡LLL.. X I 10-•• 1Ú***. invadens yy ?.3 7.3. Además ñdemis L6pez-Revilla Lñpe:-Revilla. de. ONA HHH. en. los les. trofozoí't.os trpfezditds. de. cepas. g/célula gƒcålula. G6mez y Eñmez. encontraron dos tipos claros de variaciones al encentraren des tipus clarps variacienes en el. 9. 11978>, iläïül, contenido cdntenidp de. ~. E,. obs•rvó ehiervã. un. a:<enizadas aaenixadal. hi stol yti ca1 gigtpìgtigai 1> 11 En. un derivado derivada. pequefio incremento pedueñe incremente. clonal de clenal de. la cepa. la cantidad. HK-9 HH-? se ee. de. DNA respecto DNH respecta. a. la. mases meses. un. observada inicialmente. cantidad dhservada 2) Ei En. la. decremento decremente. cepa. HM2 HH2. se. significativo. Para •xplicar explicar estas. observó dhlervñ. del. después denpuis. contenido cpntenidp. da de. 6 e. inicial. de. DNA. DHH.. variaciones variaciefles L6pez-Revilla Lñpez-Revilla y. GÓmez Båme:. (1978> prepueiernn propu&ieron lle las siguientes hipãteeiil hipótesis1 {19?B1 11 Cambios Cambies 1>. en. la. pleidia ¡aumente ploidÍa <aumento. e o. dismiflucifin disminución. en. el. cemplementu genitico genëticu de la especie! trpfezpitp. complemento e~pecie> en cada trofozoíto. 21 Heterogeneidad Heterpgeneidad genätica cambies en la 2) genética ies <es decir, cambios. solamente en una fracción de la poblaci6n>, oD selamente ia peblacifinl, 3) ñmhds Ambos aspecto~. 31 aspectos.. pleidfe ploidÍa.

(24) 12. TAEILA THBLH 1 I PROPIEDADES DEL DNA DE Egjgggggg Entamoeba EEH!.· FRÚPIEDRDEB í - í fl ï í í l - - ì í j í í - j í ï í j - ì í j 11%-±ifiúfl|-i-1--r íí -II-IIIQI--Í-I-u__n. Pg/celula Pqfcelula. ííííík-L-í-tí. Densidad madi da medida. Tmt Tel. an en CsCl Esfll. 'Y. G-C K Befl. 1 1;. --I_±¿11±í í í í í l ì k l í í l l l í fl fl í l í í. !i_. histolyticu Eüisteixtisal HK9 Hue. HM3B HHSB F22 200:NIH 2ü0¦HlH HM2 HH2. . !i_. E-. PZ PI. invadans: Ldsldldas. IP IP. l aredoa Ef Lacldel. ~.. moshkgywki i 1 E- ad1hknx1fii1J. ~.. FlC Fic. 0.40 1. 50 1.50 2.21 2.21 3. 48 3.49 9.95 9.95 O.b Ú.b 0.5. 8.8b. 3. 2?” PPP 04. o. 84 o.a4. (1) ill (21 <2> (2) (4) (4) (1> (1) (fl) 1> (2) l2ì (2). 78.5 il) (1). 22.4. (1) il). l. 6882 {3l (3) 1.&BB2. 27.6 (3). 78. 5 ((1) 1> 78.5 80. 5 (1 ( 1) 30.5. 22. 4 ((11 1) 22.4 27. 3 (11 ( 1) 27.3. 83. o ((1) 1> 83.0 80. o ((li 1> 90.0. 26. ( 11 2à.11 lll. 1. 6911 (3) l.b9l1 (SI 1. 6897 (31 <3> 1.eB97. (2). 0.37 0.37 0.32 0.32. (1) il). o. 09 d.oe o. 08 d.os 2. 30 2.20. (ill l) ((1) 1) (11) (43. 0.07 0.0? 1. 00 1.00. (2) ii? 'i). ( i) (1). íïI'_'I-Í.-HHIII-¡I-_í_-'ìíïíííí'-I'=í_¡rI'_íl'I. 33. 4 33.4. ((11 1). so.o B0.Ú. 85.0 <1) B5.Ú (1). 38. 3 38.3. ( l) 11). 26.1 2ò.l. (1) (11 <1> (11. 82. 3 82.3. í(11>. 31.7. (1) 11). 1. 6913 1.à913. (3) (31. 1.6912 l.&9l2 (3) (31. -.g.1.ï_.-_-.gi í - I - i l - ì l ï l ì 1!-Uiifi-ví-I__'ï'--ìXl_DII--I'í'Ú-Úfií '. 1> Galdarman y y col, Parasitol. åli ~z: 912. 11 Geìderman cel, 1971. IQT1. J. Parasitel. 2l 44: 243. 241. 21 L6pez-Revilla L5ez~Revi1la y GÓmoz, Eåmez, 1978. 1973. Exp. Parsitol. Parsitel. 11; 3) Reeves yy cel, col, 19/l. Si 1971. J. Parasitol. Perasitul. 57: §1: 939. 4l Hernández, 1985. Tesis Tes~.·¡ de Haestría. Mae9tría. 41 Tn: Temperatura media desnaturalizaciåh¬ en °C. =C. ~t Tm: owdiil de dc::~naturalizac.:ión,.

(25) Estos aL1tores d• fluctuaci6n autores Sltgieren sugieren que el fen6meno fenomeno de fluctuaciãn •n en contenido de DNA DHH. por célula puede. ser frecuent• frecuente •n en. estado. natural y que podria podr{a además ademís estar relacionado relacionado con •l el proc••o proceso de diferenciación diferenciaciån hacia el enquistamiento.. En. un estL1dio estudio. posterior· Hernández posterior Hernândez. <198!5)", iiäfloï,. ai". •ncontr6 'encontro. valore• trofozo!to en las cepas c•P•• HK? HK9 v y valores d• de cantidad de DNA Dfln por trofoaofto Laredo. los. cuales. son. análogos analoqos. a a. los. r•portados reportados. por. L6pez - Revilla yv G6 me z 119781. Lope:~Revi1la Gomez 11978). E~tos Estos valores son alrededor de ddfez Í ez veces mairo mas. altos que los. Gelderman yv col,. 11971a), (i9?1al.. ormente reportados ant•ri anteriormente. Estas diferencia• diferencial pu•d•n pueden. por. deberse deberee. a: af 1) Cuestiones metodológicas, va 11 met.odol6gicas, '>'ª. técnica diferente tecnica. en el. que cada autor utilizó. aislamiento yv. una. cuantif1cac16n cuantificación. del. nun. oe bién, bién. DNA, 2 21l. Las. c~lulas células. rr. en. ccultivo ul ti vD. presentaron. fenfimenos fenómenos. de. modificación modificacion de ploid{a, ploidfa. Además, fidemis, Hernández Herníndez. #1985) encontró encontrã t198!5>. trofozofto cantidad de DNA por trofozo{to cepas usadas c1tpas y clonas Lt¡; a da!.>. cantidad de. DNH DNA. entre. yv virulencia, va ya que de. en su tr· trabajo, en !>L< abajo,. son muy. correlación correlaci6n. virulentas,. las que que tienen tienen las. las que. las mayor mayor. tienen. una. intermedia de DNA Dflà son m&dianament• medianamente virulentas y las cantidad intermedi~ cantidad clonas yv cenas can~s con menor c a ntidad. virulentail. viruientas.. cilula •en son de DNA por c'lula. no.

(26) 14. ciwericn CINETICA ns DE eeasocincidn REASOCIACION DEL DEL ona. ONA. La cinética de reasociacion ícidos nucleicos reasociaci6n de ácidos conocer la proporcion proporción de pares secuencias. repetidas. (Gelderman iüelderman. vy. velocidad. de. col,. yv. de nucleotidos, el prado grado. el. tamaño. 197la). i9?1al.. Estot> Estos. reasociaci6n reasociacion. desnaturalieado.. La. permite parmtta. del. DNH DNA. estudios. de da. analizado. coparan comparan. fragmentos. re¿o.soci ación reasociacion. se. de da. la. de da. registra. DN DNA en. un. espectrofotómetro a Eaú 260 nm <D. espectrofotometro (D. O. D. 260). 2oül. La temperatura de la mezcla de incubacion incubación. la concentracion concantraci6n vy 1a. de c•tiones cationes en. solución amortiguadora influyen influyan fuertemente en la solucion le. reacción. reaccion.. La tasa de cito reasociacion r-ear.oci.;lción depende de ele la c:oncentr;aci6n concentracion del yv el tiempo. requerí do para requerido. relac:i6n relacion entre. la. la reaccion. reacción.. concer1tr;aci6n concentracion. de DNH DNA. que. se. define. como:. asociadosflitro X seg. Su Eu asociados/litro X datos de de expll'rimentos experimentos en datos. la. reasoeiado reasociado. al el. varias. uso. del. cepa Laredo. de. y V. término tormino. nuclefitidoe nucla6tidoa. comparacion comparaci6n. de reasociaci6n reasociacion ~tamoeba Efltamgggg. género gonero. condiciones. sa se. del DNA DNH. mostró mostro un valor. io'7 10. da Cot de. 293 lo. de nuclaÓtidos nucleotidos de pares de. due que tiene ti~ne aproximadamente. 2000 el cual. ~. de E.. Cot Úflt. 7 · • pares 107-10. moshkovskii presentó mosfikovggii presento. corresponde a 10• io*. El. qua que. secuencias unicas. El DNA histolytica PFEIIHÍÚ presantd un DHH de ~· É. QLgLgL11i5¿ Ufl. nucleÓtidos. nucleotidos. El DNA DNQ. de. observaran observaron. <G&lderman y col, 1971al. (Belderman v. indica que posee aproximadamente. de 813 indicando. de da. 1971a>. 19?ial.. dif~·rencias en loi> Cot diferencias los valores Bot. ONA DNA de la. moles. permite la. cinotica la cinética. especies. =. _los cuales cuales varian las .los va.rían las. del ensayo (GP.lderman iüelderman y col, ñl estudiar Al. Bot Cot. DNA DNH. Para a>cpras•r expresar. tiempo en que se lleva a cabo la reaccion reacción se usa el Bot Cot. l• la. un Bot Cot. pares de nucle6tidos nucleotidos. de da de. (f ig. (fio..

(27) 15. Pilg. de ruaflncianíbn reaaociaci6n del ll"A Entamoeba !E• Ping- l. 1. Ointtioa Ginótiøll dl Illà de Entmneba ¿E1. cinñtion do :tel HU. especias do EutanaLa oin•tioa de ruaanuinción reasociaci6n del rnA de 33 especie• de EntamoE un registró eupautufotnmitrinauunt-I nn. ( (---) Entuoubn .U ae regiatr6 eapectototom6tricamente a 260 nm. - ) Bntamoeba hiatolggca capa Laredo: Ii...-.J E. histol1tioa hiatolïtica. cepa HX-9; HK-9; ( (_-_) histol1tica cepa Laredo; ( • ... ) !• -) _§. moshltovslc11 noahkovsfli capa irunadu- de Gelfiernan ami, 1971. !• cepa PIC. Tomado Geldel'llan 1 y coi,.

(28) CINETICA DE REASOCIACION DEL DNA EN VARIAS ESPECIES DE Entomoeba Entumoebfl. 20. ""¬.. -.E. ¬-__. -. \ ¬-. .E. ~. -. -._. É-É. .g. ------- E. histolrt ica ((tarado) laredo) E.histnhtiou ........... E. histolrtica (HK-9) -------- histolfticu. "'-.¬~.`. -IäC). E. moshkovskii ([F F IC) ---Emnoshknvskii IC!. H. \`. \. \___ ¬-¿\. zx '-. 66. 'L\. \\ \`. o. ,E. 1\ 1.\. o..... LL RF eorsaoccicìodoa% n ). \. . l'-. \. `\. 80 ao. \\ \.R. I -I. ...'_... ·.. \\. I 'II I I. \~. \, \. \. l ll. E- ¬†. '. 11. 10 lo. " 1. 10'. 'I-. \“. -3. lo'. '. 10 motil.seg lo*4 m.-mm.

(29) 16 11. li. En En. t~abajo trabaje. dicho dicha. se ee. encontraron encontraran. diferencias diferencias. en en. la le. estabilidad del DNA los diferentee diferenteio erganiemefi ori~anismos eetabilidad térmica térmica del HHH de de lee. lo ID. cual impidi6 grado d• impidiñ la determinaci6n determinaciån segura del Qfflflfl dl. homología hflm°¡°Uf¡. del DNH DNA entre las diferentes especies. Las diferencial diferencias en la estabilidad. térmica. hize hizo. imppeible imposible. buecar buscar. cundiciunee condi~ionas. adecuadae para la reasociación, reaepciaciñn, de esta manera li adecuadas lA DNA del DHH. entre las. diferentes. espacies se eepeciee ae. hpmplpgfa homología. consider6 cdneiderfi. como :eme. aproximada. aprüeimada.. Dichpe Dichos L•rado, Llreflfle. reeultadpe demdetrarpn que resl•l tados demostraron. E~-. mgshkovskii .. yi'. DHH el DNA. E~-. de la. cepa cep•. histglytica I:Li.I$.el.¬r_t.LGa. aignificativamente difl!!rentes diferentes en cada und significativan1ente uno de lee los cualitativos y. cuantitativos investigados, cuantitativas investigadas,. que cada grupo grupp. cpnetituye una constituye. IDH. parãmetrpe parámetros. lo ln que. especie claramente. sugiera eugìere. eeparada separada. <Galdarman iüelderman y col, cel, 1971al. l9?lai.. CDEFICIEHTE DE EEDIHEHTHCIÚN DHH. COEFICIENTE SEDIMENTACION DEL DNA. El coeficiente cneficiente. las mueetree muestras organismo nrganiemu. de. y. de eedimentaciün sedimentación y el peeu peso molecul•r mdlecular HHH DNA. inn son. pueden. cpnetantee constantes. para. determinarse determinaree. por ppr. Elda cada. tipd tipo. métodos mitddpe. da de de. de d•. ultracentrifugaci6n. ultrecentrifugaciñn. La eedimentatiñn si;-dimtmtac:i6n emplea para. al equilibrie t~quilibrio en gradiente de CaCl Efiül. determinar. la. mplåculae de Dflfi. mcléc:ulas ONA. Si hay de dicho dichp. se gradiente ee. densidad de. flotaci6n flptacifin. presente DNA DHH durante durant• la concentra en. una banda. de. •• IB laa lan. fprmaciãn formación estable eetable. en. aquella pdeiciñn posición del dl?l tubo flotaci6n ea tube en que su eu densidad de flbtaciån el exactamente igual a la de. la solución CsCl. La apluciãn de Beül.. densidad deneidad.

(30) del .ONA se puede calcular di rectamel')te con un refractfimetro, refractómetro, del.DNH directamente o por comparaci6n comparacifin. con la densidad. patrón d1t de DNA, DNA. centrifugada es. po!!ible posible. obtener· obtener. conocida de una. muestra. en el mismo gradiente. e1 mi!imo gradient•.. Además,. valicJsa valiosa. infor·maci6n información. mol1tcular de una ~ma determinada deter·minada muestra molecular comportamiento. en. un. gradiente. sobre. el. peso. de DNQ DNA a partir de. de. CsCl. Csül.. Dadp Dado. moleculas grandes grandeos difunden mas lentamente que las. que. su las. pequeñas, pequeña•,. delimitadas. forman bandas delgadas vy bien delimitadae. A partir de las medidas de densidad densid•d di!! A de flotaci6n flotación t•mbi•n tambifin se puede calcular la composición composici6n da de bases de una muestra DNA. DNH. Puesto que. lo!> pares los. tres tree enlace• enlaces de. hidrógeno, son mas. que los parea pares de bases A-T, Q-T, hidrógeno. Esto determina. ur.a muestra de>terminads. una determinada CsCl es una función Csfll. de bases G·-C, Eflü,. astan estan unidos. compactos y mãs más. por. densos. unidos aélo sålo por dos puentes que la densidad. de DNH DNA. medida en. lineal de la. de. de. de flotaci6n dl flotación. de. un gradiente. de. relación entre los relación_entre. pares. G-C v y A-T (Lehninger, B-c <Lehninger, 1978>. ieïei. La técnica de gradiente en CsCl Ceci también tambien ha revelado bién delimitadas, bien. que e.l el. DNA de lo& DHH los. mientras que. cilulas celulas de animales superiores superiores entre límites amplios lfmites muy amplioe_ tamaño variedad en tama~o. de las. forma virus íorma. los fragmentos. del DNA Dflñ. rinden varia• banda• varias bandas. de densidad lo que. moleculas del molécula•. bandas. de. anchas. lilt debe a se. la. DNQ DNA presentes pr•••ntes. In en. ¡stes organismos. 6sto•. en En del. CsCl Csül. ei cian E. el caso ae de ~.. DNA Dflñ se analizó pnr por CReev•• (Reeves. vy col,. nigtgivgiefi la la aeneiaau au histolytica denaidad de. fiatación fiotaci6n. medio de gradientes preparativos 1971> i9?1J. en 13. cepas. de amibas,. 8 B. da de d• de. a 37-G 37•C v y S temp•ratura del crecimiento a 5 de crecimiento a baja temperatura. 17.

(31) I8 tipo Los valores extremo• de denaidad tipn de Laredo. Lee valdree eatremdl densidad y contenido centenidn g/ml Wy 2?.5 27.5 2, Y., respnctivqnlntl, respectivamente, plrl para de G-C B-C fueron šuernn de 1.6881 i.àBBi gfml. la cepa NES 1.d?13 g/ml gfml con cen un cuntenidn NBS y de 1.6913 contenido de G-C de 30.5 30.B. Y.2 para la cepa Laredo. Un data dato representativa representativo parc par& una de E. ~. Qigtulggigà histolytica "el é.sica" es "clåsica". cepa. el ei de Ht<-9 HH-9 que pr.esent6 phpaentö. una. densidad de 1.6882 de G-C <Reevas 1.bB82 g/ml g/mi yy 27.6 2?.b Y. 1 de contenido cuntenidu di ifliivll y cdi, col,. 1971>. 1971). En éste. entre la densidad rangos de rangnfi. trabajo no hubo diferencias trabaje nu diferencia!. del DNA DHH. densidades. temperatura astan estan. en los las. exhibidas. por. sobrelapados idhrelapadei. grupos de baja temperatura y. dos dns grupos,. ae. los ¡nn. los. notables notable;. ya que. grupos grupal. de di. exhibidos exhihidnt. por lo tanto nu le no se. las alia lltl. por. los ini. ubservnron observaron. diferencias significativas específicas para cada especie. edpec[Fic¡¡_paru. HEETRICCIÚN DEL DNA HHIBIHND E HIBRIOACION HIBRIDfiCIüN MOLECULAR. HULECULAR. RESTRICCION AMIBIANO E La digestión del DNA DNQ cun restricción con enzimas de restricción pdr por un lado,. estudiar lei loa. qenei y su nu genes. permite. drqaniznciån en un organiz&ci6n. drganinmul dtru lada ie cdmilnzc utilitlr can cen organismos y per por otro lado se comienza 1 a utilizar de diagnóstico, diagn6stir.o, airven para sirven. entre. que que permite. nbeervnr observar. establecer relacione: relaciones. lineas !!neas. iflugier <Bogler y. ya. cul, col,. de. prdtnacnricl protozoio.rios. 1983; 19831. antecedente• Hernindez antecedentes Hernåndez. Hcüienaqhan McClenaghan. <1985> E1995). ONA de [. para digerir el DNQ §.. ~t•Ó und. y. no na. y cni,19B41. col,1984>.. enzimas eniimnn. fin-1 fin-•. diferencias. taxunômical y taxonómicas y. patågenne patÓ'ilenos. les loa. de. que. discernir. pctågennl pat6genos Can Con. iltnl éstas. restricción. ti.Lstolytica clona A, con lo QL§LgL1LL;¿ clnnl :nn ID. observó la separación restricci6n observé ¡eparaciãn de los inc produttoa prnductun de 1& in restricción. cual cull en In. notando la preiencil presencia una gran variedad de µesos pesas moleculares, mulecuiaren, nntandn de bandas. discretas, discretae, las. cuales probablemente. indican. la.

(32) 19 prew•ncia presencia de algunas poblaciones de ONA Dfln repetitivo, lo. cual. Rfita Gelderman y esta d& de ac:u&rdo acuerdo con los resultados obtenidos por Belderman col. (1971a) t197iai al ai analizar las. de varios miembros. curvas de da raasociactón reasociaciãn del. del g'nero género Entamoeba gntamogpa. DNA. <Beld&rman iüelderman y. col,. 1971a). 197ia).. En. un trabajo. reciente. Hahttacharva v. restricci6n utilizaron enzimas de restricción. de variafi varias e~peci~s especies que mostraron. amibianas. Los. mayor mavor. utilidad. de.. col,. (ii?BB) 1988). para cortar el DNA. total. patrones de. restricci6n restricción. diagn6stico diagnóstico. fu•ron fueron. los. la presencia i.-resencia obtenidos con la enzima EcoRI ya que revel6 reveló ia. d• de. DNA altamente repetido qu& RNA•rtbosomal, y gue codifica codiíica para al el Rflñ-ribosomal, ademi~ la distribucion distribuci6n además. de los sitios. de restricción restrtcci6n en. el. DNA repetido de Entamoeba Engamgggg fué fuí altamente polimÓrftca, poiimãrfica, lo cual. permitió distinguir entre cepas c~pas de E. ~. flL¡Lg1111gl_con bi1tolytica con laa ias de otras especies. del g~nero dei género. ~nt!m~. Con Eggàflggga.. este trabajo. demostr6 edo son demostrå que E_. §. histolvtiq1 hLgtgLytLg¿ yv la cepa Lar· Laredo suficientemente suficientemente diferentes. como para. . . se. organismo• organismos. colocarlos en. Qrupos grupos. aparte. ¡partefldemâs, los los fragmentos Adem/\s, f1 ·a ~¡mento11>. de Ecofll HHH repetido EcoRl del DNA r•petido de. hh1tolytica <cepa HH1¦IHSS) HMl: IMSS> fueron fl¿jggL1L1;¿_icepa. clonados en al cionados Il. plÁsmido plísmido. vector pTZ1BR. aubfragmentos obt•nidoa pTZiBR. Uno de loa ios subiragmentos obtenidos con. probó por hibridación hibridaciän molecular su utilidad para prob6 H~. Qigtgiïiiga bl..!12.lvtica de. las demás especies. dei del género. E. E... EcoRl EcoR1. distinguir di•tinQuir Egtgmggga Entamoeba. iãahttacharva yv col, 1988>. 19551. CBahttacharya Para an~lizar analizar Para diierentes diferentes. la exiatencia existencia de de secuencias secuencias homólogas homãiogas la. organismos. se se. realizan realizan. experimenta;. en en ¿¡ de. hibridación molecular, moiecuiar, los los cuales cuales aprovechan ia :pn¡¡rv¡¢¡¿h hibridación aprovechan la conaervación.

(33) 20 evoluci6n en la evolucifin. de diferentes. secuencias como. las de. DNA HHH. rihosomal. actinn yv las de tubulina, para detectar su ribosomal, las de actina. presencia en. el. hiatolyti..(.A, nj¡¦glïti5¿,. cepa. ª"'. secuencias sacuenc i. DNA HHH. de. HMI1IMSS, HHI¦IHEE,. homdiogas homóloga•;. a. m.elanofIA?te.r üfllšflflååàlšå Fy tubulina de experimentos de. diferentes. afirma. se. 1las as. organismos.. de. haber. actina. &.. E.. Para. reconocido Drosophila Q§g¡ggQLL¿. de. I.a.Qanospma, grucei por medio Trggandfipma bruggL_por. hibridación molecular. del DNA HHH. con. de. sondas. específicas especfiicas mCArc:adas marcadas r·adiactivamente radiactivamente <P1frez·-Mutul, (Pérez-Hutul, 1986>. ififlol. En un estudie estudio una familia de. m¡s reciente se comprobó la presencia mas. genes de actina. en un banco. de cDNfl cDNA de. de ~. E.. histolytica cepa 200:NIH, Q¿¡§gL¡;15g_cepa 2ü0¦NIH, construido en el fago Fago .vector vlctflf XgtlO 19110 <Hubert ¡Hubert yv col,. 1987). i9E?l.. Uno. df, 1 os genes observados ob1u1rvado11 de los. codifica coditica. para un tipo raro de actina, que hasta el momento sfilo s6lo se ha encontrado. en. &_, E.. histolyti.ccl\. nistolggica.. residuo de glicina en la. Dicha. molécula. tiene. N-terminal, el cual le la parte N-terminal,. dif&ren\e aa las secuencias conocidas de actina. diferente. un hac• hace.

(34) 21 ELECTROFORESIS DEL DNA. ELECTRDFBRESIS Moléculas Holéculas. de DNA. cromosonoal intacto cromosomal. grandes de DNA cr-rJmosomal cromosoma! se estudio!> eatudioa genéticos. o dEi' de. Kb Hb d~ de ONA DNfi. porpor medio de. ppoco o co sati •; i a <: t.or·: o s satímëactoriua Modo;los Modelos. del. fragmentos. farant•• tipos usan para di diferentei. recombinacion. trabajos se ha intentado. o de d•. del ONA. DNQ.. En. de. estos estoi. separar moliculaa moléculas sup•rior•s euperiorea a electrofor,sis electroforêaia teniendo. <F <mgnian, (Fanqman,. 1978;. c:omµortan1iento comportamiento. predicen que en la electrofcrésis, electroforåiis,. Serwer, de. la. 50. resultados renultadoa. 1981>. l?Bll.. molécula molecula. de. está ee e.a un evlllo oville. ONA DHR. libr• libre. protecci6n molecular cuando el que cuenta con poca o ninguna protecciön solvente penetra en el gel. IHermans, Este implica que (Hermana, 1955>. 1955). Esto. la moví l idad electroforética movilidad electroforêtica del DNA debe ser· ser. del peso grande. molecular, se ae. sujeta. lo cual a. se. independiente. comprueba cuando. electroforisis electroforëaia. en. un. el. DNA DHH. gradiente. de. <Oliv•r• y cul, col, densidad carente de cualquier soporte deporte s6lido eãlldo iflllvirl. 1?a41. 1964>.. electroforêais en gel de agaroaa La electroforésis agarosa o acrilamida. en la práctica,. la principal pr,ncipal herramienta. tratrnjar trabajar el DNA. de tam<Año tamaño. menor de 50. través travel de la matriz. del gel gracias a. el,ctrico eléctrico producido. por la. reali2a la realiza. resoluci6n reaolución de. les gel~s los geles. moléculas de DNA DNH. son muy. (Cantor y <Cantor. de. superior a 50 menores al 2 ~ Z. Kb.. El. Schimel, Schimmel,. agarosa disminuye agarofia. anñmalas an6malas. para r~studiar estudiar·. en lo§ los geles. {Fanqman, CFangman,. moléculas de. Kb se utilizaron. DNA pa!óa DNR paaa. 19781 1979;. a. campo. cuando. se le. 19801. 1980>.. Li La. cuando. las lle. •n en el. gel. l?7Bl. 1978>.. ONA Dflã de. concentraciones de. <Fangman, (Fengman,. para. la fuerza del. grandes, obaervandone observando&•. movilidadea electroforiticas electroíorëticaä movilidades. oti-c:is tr.~bajos, otros trabajos,. de análisis lnfililll. corriente aplicada. aplicada,. electrofor6sis electroforêsifl. ea,. Serwer, Berwer,. En. tamaño. agaroia agaro•a 19511 1981>.

(35) 22 pero per·o en. este éste. caso. fragilidad fragilidad del. surgieron problemas sL1r·9ieron los tiempos. gel,. de. tecnicos técnico•. como. corrida largos. incapacidad para resolver rR&olver moleculas mol¡culas de. la. y. la. tamaño tamano mayor a. 750. Kb. Hb.. El.ECTROFORE"BIS ELECTRDFDRESIS CON CDN UN. GRADIENTE DE GHHDIENTE. CAMPOS CHHPUS PULSADOS PULSHDDS. <PFG>. (PFGl.. 1. Recientemente. y v. Schwartz. Cantor. <Schwartz ISchwart:_. y. Cantor,. 1983;Schwartz y Cantor, 1984> aiatema l9E3¦SchHartz V 19541 desarrollaron desarrollaron un nuevo sistema c.ampos pulsados pul!lados de electrofor·ésis electroforesis en gel con un gradiente de campos {PFB}, <PFG>, con capacidad de separar. mayor a. 2000. Kb v y. electroforesis electroforésis preparado pr·eparado. con. una. resolución que. convencional.. directamente direct~mente. en. moléculas de DNA Dflfi de. En una. traccionado por por tamaño, tamaño, aa través través fni.ccionado la. aplicacion aplicaci6n. de. dos. campos. aplicados alternadamente, uno une de. va que esta compuesto ya serle completa de serie los. campos. de sólo solo un. esta ésta. se. de de. a. el al. la. DNQ, DNA,. agaroaa, agarosa,. oa as. de un gel agarosa, de un gel de de agarosa,. por por. elictricos eléctricos. perpendiculares parpandicularas. los cuales es. heterogíneo heterog,neo. electrodo positivo y. electrodos negativos.. perpendiculares. supera. técnica técnica. matriz matriz. tamaño. realizó realizo. una. La alternancia aplicando. de. pulsos. electrices duración de 11 a äü 90 segundos para separaciones electricos con duracion optimas de moléculas de DNA a 2000 Kb. DHH can con tamaño._ tamaños de 30 a piensa que. la separación separacion. entre las. moléculas result• moleculas resulta. tiempo que. necesitan las. hebras heoras de. DNA m's Dflfi mas. responder a cambios cambies en mayor comparado pequeñas (fig. (fio.. con. 2>. 21.. la direcci6n direccion del el. Por. que necesitan éstos. motivos. gr.andes grandes. campo, el cual. las la. moléculas moleculas separación separaciãn. Se dal del para es. más mas ea es.

(36) 23. :rilg. M1graoi6a del IIIA IlfA en el sistema Hg. 2. ligraciônf alistan; P1G. PN.. a) moUculas da de IlfA debid<r> al enoendidO' n) 08111.no Quino que qui siguen las lu moléculas 111.1 debida unnendidcr 13 apagadOJ los campos npugndw de loa uampoa el6otricos eléctricos perpendiculares. pnrpenúiuularu. b) Esquema muestra como se efecto: du de loa Eaquona que quo muuatrl. su aeparam separan por ufautu. los caapoa campos -.lectricoa diferente tmaflw. tamaflo. ---+ -.lontricos dos dan aol•oui.aa lulieulau de lJIA IIIA d• de ditorentu ----D aol6cula •• ...-••• _. aol6cula molécula i, 1,-1--fu-Q nalôcula. 2..

(37) \¿\%\/ A. ._\ H __B _;. B. ______ ____________ _ \_,FA) K. ____I_________ _______ ____ __«_____`_______¡. I-IIII IIII|]_|I|¿_J|I-I. ._N_______ ___†____ ______¿____ _ _ _ _ _ ._. "/ ____`__ ____. iIAI _. \H “N :___ \_ I,. I_.

(38) 24 dependiente. de. la. frecuencia. con cen. la. cual. campos campus. los lui. eli2ctricos. ee se elternen. alte::·r·nP.r,. electricas. La. técnica t6cnica. de. electroforesis elactroforisis. PFG. ii se. deserrellu desarrollo. aplicandola.ül los cromosomas levadura, dnndi donde enlíc¡ndnla_e1 análisis anãliìls de lus crumusumae de llvnduri, ligamiento genético era ya bién conücidn. conocido. fiif Asf fui fué el mapa de ligamientu posible mostrar mostr·ar que qL<t.? la.;; ele DNA de alta alto pese peso mnlecullr molecular peeihle lee bandas de separadas per por. el. sistema. PFG. intactos intactas <Schwartz (Schwartz y Cantor, Cantar, Ploeg yy Pleeg. col, cel,. frdccionarfracciunar. (1984> con (19941 cen. tamaño temañn. por per. I!:.tl!ano1oma brucei Igïggggggmg Qçqcgi Cantor, Center,. 1984). 19841.. ésta. otros otras. cromosomas crumuennnn. fueron técnica fueren. cromosomas crnmusumai. Iggggggggmg, de. más mii. DNA. la. d• di. CSchwartz (Schwartz. per por. antígeno antfgenu. variable. de. superficie, supirfìcie,. a•f alf. PFE PFG. como. fuí fué. gene gane. por pnr. reprodut?ibilidad patrones de bandeo <Van dir der Ploeg reprudueibilìdad de los patrnnefi bnndeu (Vin Plneq c:ol, cel.. 1984a; Va.11 der d<'.·•· Plneg Ploe9 y y cul, col, lfiüãag Van. y y. entre. demostrada por el uso DNA específicas demnetrade per eee de sondas de DNH específica: del del. de. p•qu•ños piquifiui. identidad. reeueltai resueltas. d•r dir. capaces. trypanosomatidos trypaneeematìdoe. IJ:y~~.. bandae b11nda~. real mente realmente. 1984) Posteriorm•nt• Van l9B4l¬•. Posteriormente. los lee. Para. llee ª''. rrnmuenmae c:r-nmosomaG y. y. er·an eran. la le y V. 19B4b; Ploeg yy col, l9B4b¡ Van Ven der Plueg cul,. 1984c:l. 1984:).. a> al. CROMOSOMAS DE LE'it'.'DURA, CHUHUSÚHQE LEVÑDUHH.. Con la le ayuda <1984) {l9B4l. hicieron hicieran. Estos 1<L1tor·es Eetee auìuree han condiciones cundicxunee. de. _. y de la elec:troforésis electroforesis PFG Schwartz Schwarti y. un c:ariotipo cariutlpn. molecular para. ob!;E"Yv.!ldo qL<I? ubeervadn que corrida. la ll. son necesarias sun necesarìafi. electroforética, electrufurëtíca,. para pari. C•ntor Center. levadura. diferentes dìferefltefi rlnulvflr resolver. completamente las DNA crnmueumll cromosomal d• cempletamente lan 17 moleculas de DNQ de l•vadura llvndurl ya que se reeuelven resuelven 11 m&ximo, para un juega juego ll bandas como :emm máxime, cenfiicìenee condiciones eeperimentelee. exper im1n1tales.. d• dl. Pur ll han pndidu Por utra otra parte. par·te, nn no ae podido.

(39) 25 identificar todas las bandas electroforëticamente electrofor~ticamente identlficar. resueltas. con r1l ele· lfgemiento J, gr.~mi<~nto i;¡c•nÉ·t1co Es por el mélpa mapa de genético de 1E"v,:1dura. levadura. Ea. que se ha cuestionado mucho mol~culas moleculas. de DNA DHH. acerca de la integridad de. cromosoma! cromosomal de. los loa geles por bandas. ésto este. representadas levadura, representada!. de diferente intensidad y. las en. colocaci6n. colocacion.. E•tas banda~ varian var i an en tamaño de 300 Kb a al rededor de, de. Estas bandas alrededor. 1800 IBOQ. DNA son lineales, Kb, asumiendo que las moléculas de DNH. dichos. tamaños efitan t?w.tan de acuerdo con determinaciones determinaciones previas. usando. sedi mentac i 6r1 sedimentacion. íPetes. Fangman,. y y. viscoel6stica viecoelãetica ILauer iLauer y col,. 1972> 19721. relajación. yy. 1977). Las intensidades intensidades de. las. bandas resueltas en los geles de agarosa, agaroea, incrementaron. con. el aumento <H1mc;.nto d1..> tamólño molecular. mol.ecL1lar·. La forma y discreción las de tamaño diacreciñn de laa. bandas indican una .::olecci6n colección de alto peso molecular. la. 1985), 19853. correspondencia entre corTespondencia entr·e las moleculas moléculas. DNA observadas con la técnica. mapa de ligamiento gen~tico genético tamaños esperados oi>sperados c:on~,idet-ando considerando. de. (Schwartz yv Cantor, 1984; Darle Dleon, <Schwartz Carie y Olson,. 1994; 1984; Carle yV Olson, Dlson, Para hacer h«cc'r. moléculas unic:as de DNQ DNA moleculas unicas. par.-1 para. PFG con las previstas por. de levadura, se ee calcularon. lañ las. le• siguir;-ntt' lcsi guie-nte. moléculas moleculas. de. DNA DHQ. de el. los. cromosoma! cromoeomal. (Scllwtwlz ¡Schwartz-: yy Cantor, 1984>: 19941:. al Cada grupo de ligamiento es una sola molécula,. b> Las bl. distancia• distancias en. proporcionales proporcionales al <Dutcher, (Dutcher,. el mapa. lam~~o f [aico tamaño fisico. de ligamiento. genitico genético. de ese grupo de. son. ligamiento. 1981 l. 1991).. el y.egmentos más peqL1eños DNA no estan cl Los segmentos pequenos de DNH. representados. gr·upos de ligdmierito en los grupos liqamiento comunmente conocidos..

(40) estas pr-emi premisas Con éHtaH ~:.<:~;. es po!i-ible posible. calcular el. E'!ó. molécula de DNA molãcula Dflñ cr-omosomal cromosomal como del tamaño. del. grllpo grupo de. tamaño de. el producto de la. ligamiento. en el. cada. fracción. mapa. g1tniítico qenitico. completo, multiplicado haploid• multiplicado por el tamaño del genoma haploide lavadura. LO• levadura. Los tarnARoH tamaños calclllados calculados estan en el rango de 300 1800 Kb. y astan v estan. en buen. molécula!S molåculas observada!\ observadas cada banda del gel. acuerdo con. los tamaños tamaño!. las laa. au!jliere sugiere. que. mas molécula• molficulae de. DNA. Esto Eato. cromosomal intacto. Sin todo$ lo~ argumento• ãin embargo todos los argumentos. mencionados son indirectos.. mencionado~. de la integridad utilizaron utilizaron. una. de las sr~r-ic:> serie. Para proveer evidencia. mol.É!cL1las c:romosomale• moléculas cromosomalea de. sondas. g•n'ticamente qenfiticamente para asignar aa grupo de 1994; 1984:. ligamiento. Carle. yv. mol ec~1l ar molecular. 1985>. 19851.. de. directa. de DNA DNQ. mutaciones mutacionle. corre&pondient• correspondiente. Olson, ülson,. arriba. <Schwartz iächwarta. Con. las. •• ee. mapeadas mapeadaa. cada banda electrofor9tic:a electroforitica. é:onsid&raciones e:<puef;tas consideraciones expuestas se cariotipo. yv. a a. d• de. experimentalmente. experimentalmente. consiste de una o. de. y. el. Cantor,. observaciones. y. ha construido parcialmente. al el. levadura,. identificando. los loa. siguientes cromosomas <tabla II>1 (tabla II): Cromo~oma Cromoeoma. I: E1 El mapM 1: mapa. de ligamiento gen6tico genético construido conatruido. reciente e~ Mortimer es el de de Hortimer. yv Schild. <1982> que predice (1982). m~s más. qua que. GI. el cromo,;oma pequeño, con alr•d•dor cromosoma I debe ser el mas pequeno, alrededor de 300 Hb. Esto se hB ha corrobor corroborado Kb. ·ado al estudiar varias cepas donde dond• ee se. observ6 tama~o es de alrededor de 300 Kb ohservô qu~ que realmente SLI su tamaño. y v. se resuelve electroforéticamente electroiorêticamente como una banda di•cret&. discreta. l ! : Eromosoma IIll:. El. análisis ariál isis. cromosoma III lll sugiere que debe. del. mapa. de. liqamiento li~amiento. del. ser de alrededor de 390. kb.. 26.

(41) 27. TAet.A Tfiflƒi I JI NUMERO DE CROMOSOMAS HUHERÚ CHDHDEDHHE PFG. PFE. BÉHDHI BANDA*. DE LEVADURA RESUELTOS LEUHDURH REEUELTDE CRDHDEÚHHÍÍ CROMOSOMA**. CON EL CDN. SISTEMA EIETEHH. Khlll l<bU*. 1--1--ïínïïííí.lïíjïqíjii-11.1.. 12 12. 11 11 10 1o ¢9 9a 7 6 5 4 3 2 1I- H -l~LI¦'*¬-I. *. IV y y XII Iv 111 VII y ul: y XV xv XIII XVI 11:: yy xv: 11 II :ru XIV 1X XI xl V VIII U Yy vil: IX lx. 11 IIII VI II. 1900 1300. 775 TTS 725 125 àäfi 635 575 475 325 275 ETS 200. Bandai Bandas resueltas per por PFG. Definido como grupo Según Deïinidn genéticamente camu grupn de ligamiento. ligamìentu Segun Cantor <1984>1 <1995>. Schwartz yf Cantar ll?E4}¡ Carle Darle yy Olson Dlsun (19551. *** Tama~os col ilïübì <1986). III Tamañui moleculares tomados tumadus de Gardiner Eardiner y cul. I ** ll.