Por l o que la-X<A t i e n e f u n c i ó n de a n t i c u e r p o para-

(1)

4 Nombre: Juana Herndndez Hernándcz

T e l é f o n o :

5-33-46-47

M a t r í c u l a :

75117787

Clave:

85-S-O46

I

/Carrera : I n g e n i e r o Bioquími co Indu

; t r i a l

T r i m e s t r e : P a s a n t e

,,

Horas semana : Tiempo completo

Lugar: H o s p i t a l de P e d i a t r í a d e l Centro Médico N a c i o n a l IMSS

Fecha de i n i c i o :

6

de Marzo de

1985

/Fe cha de t e r m i n a c i ó n :

4

de Septiembre de

1985

>

./

Nombre d e l t u t o r : D r : S a l v a d o r M a r t i n e z - C a i r o Cue 3

J e f e d e l Departamento de Inmtinología Reumatología y A l e r g i a d e l H o s p i t e l de P e d i a t r í a d e l C.M.N. IMSS

/Título: P r o t e a e a de EndamoeUa h i n f o é y t i c n _can _{e c t i v i d a d} s o b r e I g A _humana.

,_--

(2)

I .

P R O T E A S A DE €ndcmnrBn

hidtolutica

CON C A T I V I D A C

SOPEE I g A HUMANA

(3)

I . ) I N T R O D U C C I O N :

~i sistema inmune s e c r e t o r humano se l o c a l i z a en:

-

g l á n d u l a s mamarias l a c t a n t e s , i n t e s t i n o delgado, á r b o l r e g p i r a t o r i o , v í a s u r o g e n i t a l e s , g l á n d u l a s l a c r i m a l e s y sal&- v a l e s

I

1 , 2 , 3 ) ( F i g .

1 )

La mucosa d e l i n t e s t i n o y pulmón c o n t i e n e d npdulos

-

l i n f o i d e s s o l o s o agregados; e s t o s nodulos ( c o n t i e n e n

ma

L

c r o f a g o s (fió), i o e c u a l e s son c é l u l a s que poseen i a c a p a c i

dad d e s e l e c c i o n a r

y

t r a n s p o r t a r a n t i g e n o s y materia p a r t i c u l a d a ) e s t a n a s o c i a d o s a l a s mucosas.

Los

l f n f o b l a s t o s

-

d e l o s nódulos l i n f o i d e s t i e n e n l a t e n d e n c i a de 1 o c a l i a a ~ - s e como p a r t e d e l sistema inmune s e c r e t o r ( F i g .

2).

Se ha

demostrado que l a r e t e n c i ó n d e l o s l i n f o c i t o s en l o s nÓdg-

los

l i n f o i d e s e s t á a s o c i a d o con e l metabolismo d e l á c i d o

-

a r a q u i d ó n i c o ( 4 )

E s t u d i o s en modelos murinos, en donde e s t o s son cog- taminados con gérmemes; i n d i c a que e l c r e c i m i e n t o m i c r o b i a no e s t i m u l a e l d e s a r r o l l o y maduración de l a s c á l u l a s

inmg

nocompetentes de l a lámina p r o p r i a d e l i n t e s t i n o .

Como s e ha señalado en r e c i e n t e s r e v i s i o n e s d e l sís- tema inmune s e c r e t o r , l o s a n t i c u e r p o s que s e l o c a l i z a n en l o s l í q u i d o s de l a s mucosas son d e n a t u r a l e z a I g A y son producidos p o r c é l u l a s p l a s m á t i c a s que s e encuentran b a j o l a membrana e p i t e l i a l de l a s mucosas. é s t a s c é l u l a s respon

-

den a

l a

p r o d u c c i ó n de a n t i c u e r p o s a v a r i o s a n t f g e n o s bas- t e r i a n o s y macromoléculas p r e s e n t e s en l a s u p e r f i c i e de

-

l a s mucosas (1.2,3)

-

Por

l o que la-X<A t i e n e f u n c i ó n de a n t i c u e r p o para

-

a n t f g e n o s de: b a c t e r i a s , virus, t ó x i n a s y macromoléculas

-

(4)

I .

._

de _{l a}d i e t a

í

5

I

, .

I .

I

..

I..

..

i ,. I . I

*-

.

a

La s í n t e s i s d e l a I g A p o r b l a s t o s de l o s nódulos

lig-

f o i d e s a s o c i a d o s a mucosas d e g l á n d u l a s mamarias, pueden

-

i n d u c i r s e mediante un t r a t a m i e n t o con estrógenos, p r o g e s t c rona y p r o l a c t i n a

í

4 )

-

f E l h í g a d o p a r e c e tener un p a p e l muy importante en l a

v í a de eiiminacpón de l a I g A . _Ya ha s i d o demostrado que l a IgA p o l i m é r i c a (dímero. t r i m e r 0 y t e t r á m e r o ) e s t r a n s p o r t a da r á p i d a y a c t i v a m e n t e c o n t r a g r a d i e n t e de concentración

I en l a b i l i s : en donde e l componente s e c r e t o r actúa como

r e

c e p t o r en l a s u p e r f i c i e sinuosa d e l h e p á t o c i t o , l a IgA e s

endocitada y t r a n s p o r t a d a d e n t r o de v e s í c u l a s que s e f u s i g nan en l a membrana c a n i c u l a r b i l i a r , en donde l a IgA e s

-

descargada

I

6 )

I

E s t u d i o s r e c i e n t e s i n d i c a n que l o s a n t i c u e r p o s de l a c l a s e IgA p r e v i e n e n e l a c o p l a m i e n t o de microorganismos pa- tógenos a d h e r e n t e s en l a s c é l u l a s e p i t e l i a l e s d e l huésped. Esta i n h i b i c i ó n d e _{l a}a d h e r e n c i a d e

los

microorganismos a

l a s c á l u l a s e p i t e l i a l e s puede s e r d e gran importancia en

-

l a d e f e n s a inmune; a l e v i t a r que l o s patógenos adherentes puedan c o l o n i z a r a

l o s

t e j i d o s d e l huésped. i n v a d i r l o s y

-

causar enfermedad I

I

7 . 8

I

Las inmunoglobulinas westán compuestas p o r cadenas p o l i p é p t i d i c a s que s e r e p l i e g a n para formar dos r e g i o n e s

-

g l o g u l a r e s ; l a r e g i ó n F a S , o p o r c i ó n de l a molécula que se une a l a n t í g e n o , y l a r e g i ó n T c , o p o r c i ó n responsable d e l a s f u n c i o n e s b i o l ó g i c a s t a l e s como: ? ¿ j a c ¿ 6 n d e C o m p í e m e E t o y a c o p L a m i e n f o Q l a b c h l u l a b f a g o c ¿ L ¿ c a b ( 9 , 7 0

I.

l a s inmunoglobulinas con enzimas p r o t e o l í t i c a s , t a l e s como Estas dos r e g i o n e s pueden s e r separadas a l t r a t a r a

(5)

I

*-

-

_I

1

i

I

4

papafna, t r i p s i n a y q u i m i o t r i p s i n a .

Por

e l l o son de c o n s i

,

d e r a b l e i n t e r é s l o s h a l l a z g o s d e l e f e c t o de

las

enzimas de

microorganismos patógenos adherentes capaces de degradar a l a I g A en f r a g m e n t o s Full

/-)

y F c

(-I:

en v i s t a de l a i m

- -

' ,

1

~

1

p o r t a n t e f u n c i ó n de l a I g A s e c r e t o r a en l o s mecanismos de inmunidad.

f

L a s p r o t e a s a s de I g A fueron d e s c u b i e r t a s después de l a o b s e r v a c i ó n de fragmentos 7 c

(-0

en m a t e r i a f e c a l ( 1 1 3 La i d e n t i f i c a c i ó n de fragmentos F c

(&I

en e l moco d e l c g

-

l o n s u g i r i ó l a p r e s e n c i a de una proteasa capaz de romper a l a molécula d e I g A ; p e r o incapaz de continuar degradando L a l fragmento Fc 1-C) de l a misma

f

11

I

La p r o t e a s a de I g A , e s una endopéptidasa metalode

- -

p e n d i e n t e e l a b o r a d a p o r c i e r t a s b a c t e r i a s e e r ó b i c a s l o c a l i

-

zadas en l a c a v i d a d o r a l , t r a c t o g a s t r o i n t e s t i n a l y genL- t o u r i n a r i o humano. Esta enzima rompe a l a I g A humana sé-

ca y s e c r e t o r a e n l a r e g i ó n s e n s i b l e ( l a r e g i ó n de l a b i s g g r a ) produciéndo fragmentos

7 u B

í*)

y ' F c / d ) : y e s i n a c t i -

-

va c o n t r a o t r a c l a s e de inmunoglobulina. Su a c t i v i d a d p r g t e o l í t i c a ha s i d o evaluada con o t r a s p r o t e í n a s y p é p t i d o s como: c a s e í n a , g e l a t i n a , colágena de tendón bovino, en dog de ha s i d o n e g a t i v a

I

12

I

La e s t r u c t u r a p r i m a r i a de l a r e g i ó n de l a b i s a g r a de p r o t e í n a s de I g A humana p r o c e d e n t e s de mieloma muestran un contenido poco usual en cantidades de: p r o l i n a , s e r i n a y

-

t r e o n i n a ;

que

son l o s aminoácidos s e n s i b l e s a l e f e c t o h i

-

d r o l í t i c o d e l a p r o t e a s a de I g A ( 12 )

Aunque l a I g A humana puede también s e r h i d r o l i z a d a

-

p o r algunas enzimas p r o t e o l í t i c a s elaboradas p o r m i c r o o r g g nismos: p r o t e a s a n e u t r a l de d n c i l l u n n u l l t i l i b . t e r m o l i s i n a

I

(6)

4

_ -

y

pronasa; e s t a s enzimas rompen a

l a

IgA pero s o l o en e l

-

fragmento T U B ( 4 ) puede s e r recuperado i n t a c t o , en t a n t o

-

que e l fragmento ? c (a) e s enzimáticamente degradado a péE t i d o s

,más

pequeños ( e s t o o c u r r e b a j o l a s mismas c o n d i c i g

-

nes de p r o t e ó l i s i s de l a p r o t e a s a e s p e c í f i c a de I g A ) ( 7 7 )

-

Observaciones s i m i l a r e s en l a a c t i v i d a d h i d r o l f t i c a de la' I g A o c u r r i e r o n en l a s a l i v a humana y en e l t r a c t o d& g e s t i v o . en l a s qud s e s u g i r i ó que e l o r i g e n de l a enzima era b a c t e r i a n o 1 9

I

r _{P o s t e r i o r m e n t e s e demostró que}

_los

_{patógenos adhere2}

t e s : S t a e p t o c o c c u h h U n g u ¿ h , #e¿hhen¿a g o n o a n h o n e , 1. m e n ¿ &

g i t i d i h , Pheudomonn o u a u g i n o n a , H u e n , o p h ¿ h b ¿ n f ! l u e n r a e ,

-

H . a e g y p t i u a y S. p n e w n o n i a e s i n t e t i z a n una proteasa para l a IgA ( 12-20).

Muchas o t r a s e s p e c i e s b a c t e r i a n a s no producen e s t a

-

p r o t e a s a para l a I g A . L a s p r o t e a s a s de S ~ ~ Q ~ ~ O C O C C U A A Q ~

-

gu¿h y N e i h h e n i a gonoaahoae s e han p u r i f i c a d o p a r c i a l m e n t e de sobrenadantes de medio de c u l t i v o b a c t e r i a n o , mostrando una gran e s p e c i f i c i d a d para l a I g A ; e s t a s p r o t e a s a s son ca paces de fragmentar e s p e c i f i c a m e n t e a l a IgA s é r i c a humana ( p u r i f i c a d a de p a c i e n t e s con mieloma) y a l a I g A s e c r e t o r a

,

i !

Dos

t i p o s de IgA ( I g A 7 - e I g A 2 ) s e han p u r i f i c a d o d e l suero humano y en s e c r e c i ó n ( 27

1.

Las p r o t e í n a s de I g A 7

e I g A 2 exhiben muchas r e a c c i o n e s e n t i g é n i c a s cruzadas, e - t o i n d i c a que hay una d i f e r e n c i a e s t r u c t u r a l s i g n i f i c a t i v a

La p r o t e a s a de I g A es e s p e c í f i c a para e l t i p o I g A 7

-

produciéndo fragmentos F a & f e ) y F c (4 en t a n t o que l a

-

I g A Z e s r e s i s t e n t e ; aún con t r a t a m i e n t o enzimático p r o l o n g a do ( 2 7

I

(7)

4

El

e n l a c e p é p t i d i c o s u c e p t i b l e

a

l a p r o t e ó l i s i s e s :

La r e s i s t e n c i a a l a p r o t e ó l i s i s de l a I g A 2 s e p r o l i n a

-

t r e o n i n a l o c a l i z a d a en l a r e g i ó n de l a b i s a g r a

-

de l a I g A .

debe

a :

un p l e g a m i e n t o de doce aminoácidos en l a regi6h-1

-

de l a b i s a g r a d e l a cadena pesada ( l a c u a l i n i c i a con e l

-

aminoácido t r e o n i n a d e l e n l a c e p r o l i n a - t r e o n i n a ) y

a

l a d i

f e r e n c i a en c u a n t o a l contenido de c a r b o h i d r a t o s . E l gra-

-

do de p l e g a m i e n t o de l a cadena pesada e s t á determinado p o r

l a e s t r u c t u r a p r i m a r i a ,

l a s

r e g i o n e s de p l i e g e de l a I g A l

e I g A 2 d i f i e r e n s u s t a n c i a l m e n t e en conformación y además

-

en s u c e p t i b i l i d a d a l a t a q u e e n z i m á t i c o . O t r o f a c t o r no mg

nos i m p o r t a n t e e s l a p r e s e n c i a o a u s e n c i a de e n l a c e s d i s u 2

f u r o i n t e r c a d e n a ( e n t r e cadenas pesadas y l i g e r a s ) ; e l hc- l o t i p o A m 2 ( - ) c o n t i e n e cadenas l i g e r a s con e n l a c e s d i s u l f g

ro, p o r e l l o e s también r e s i s t e n t e

a

l a p r o t e ó l i s i s .

I

-

En e l s u e r o y c a l o s t r o humano, e l 10% de l a I g A y e l 50% r e s p e c t i v a m e n t e son de n a t u r a l e z a I g A 2 . é s t e d a t o ha

-

s e r v i d o p a r a s u g e r i r que e l e n r r i q u e c i m i e n t o de l a s s e c r g - c i o n e s con l a I g A 2

l e

dá una v e n t a j a s e l e c t i v a mediante rg s i s t e n c i a a l a p r o t e a s a

í

2 2

I

La p r o t e a s a de I g A e s

activa

en un rango de pH de

-

6.5

a 8.0 y e s t a b l e

a

5 5 O C d u r a n t e una hora

í

I 1

I

,

su a2

t i v i d a d p r o t e o l f t i c a e s suspendida p o r a d i c i ó n d e á c i d o

-

e t i l é n diamino t e t r a c é t i c o

(EDTA)

en c o n c e n t r a c i o n e s de

-

50 m M ; l a e l i m i n a c i ó n d e l

EDTA

( a g e n t e q u e l a n t e ) median t e d i á l i s i s y l a a d i c i ó n de MnC12. ZnC12 y CoC12 en

una

-

c o n c e n t r a c i ó n d e

5

mM r e s t a u r a n l a a c t i v i d a d , m i e n t r a s que e l CaC12 y e l MgC12 en c o n c e n t r a c i o n e s 'de 50 mM r e s t a u r a n

s o l o p a r c i a l m e n t e l a a c t i v i d a d . O t r o s c a t i o n e s d i v a l e n t e s como: F e t 2 y Cut2 causan d e s n a t u r a l i z a c i ó n i r r e v e r s i b l e

--

d e l s u s t r a t o d e l a p r o t e a s a

I

1 2 . 7 5

).

La producción de p r o t e a s a p a r a l a I g A de S i n e p t o c o c c u h h a n q u i h puede s e r e s

(8)

t í m u l a d a mediante l a a d i c i ó n de I g A _{s e c r e t o r a e s t é r i l , p r g} c e d e n t e de p a r ó t i d a en una r e l a c i ó n d e l 10% ( 13 )

La d e g r a d a c i ó n de l a I g A i n d u c e l a f o r m a c i ó n de moni meros

F a g

( ) c u y a s c a p a c i d a d e s d e u n i ó n

a

l o s

a n t í g e n o s y

más

a ú n ;

c é l u l a s , e s t á n .reducidas.

l a f i j a c i ó n de complemento y a c o p l a m i e n t o a l a s

I

Ya

se

demostró una c o r r e l a c i ó n e n t r e v i r u l e n c i a y l a

p r e s e n c i a de l a p r o t e a s a e s p e c í f i c a p a r a l a I g A ( 1 3 . 1 9 J

En

l a

amYDiasis i n v a s o r a , l o s t r o f o z o i t o s de Endamog

&a

h¿Atolytica

a l c a n z a n e l i n t e s t i n o g r u e s o ( 23 ) y pene-

t r a n a t r a v é s de l a mucosa i n d u c i e n d o l a s í n t e s i s de a n t l - c u e r p o s s é r i c o s ( 24-27 ). Del 80 a l 100% de p a c i e n t e s

-

con a b c e s o d h e p á t i c o o d e s i n t e r i a a m i b i a n a , muestran

titi-

l o s s i g n i f i c a t i v o s de a n t i c u e r p o s s é r i c o s . l o s que se han .demostrado p o r p r u e b a s de: h e m a g l u t i n a c i ó n , i n m u n o f l u o r e s -

c e n c i a , p r e c i p i t a c i ó n en g e l e i n m u n o e l e c t r o f o r é s i s c r u z a -

da ( 24-27 )

En a l g u n o s p a c i e n t e s p o r t a d o r e s de q u i s t e s de Endamg ~ Q Q

hiAtotyt¿ca,

e l p a r á s i t o puede cambiar de comenzal a

-

p a r á s i t o , e i n v a d i r l a mucosa i n d u c i é n d o l a p r o d u c c i ó n l o

-

c a l de I g A _en e l i n t e s t i n o , e s t o ha s i d o demostrado p o r l a

p r e s e n c i a de c o p r o a n t i c u e r p o s a n t i a m i b i a n o s ( 28-32 ) y

-

también l a s í n t e s i s de a n t i c u e r p o s s é r i c o s .

L o s f a c t o r e s que cambian

e s t e

cambio s ú b i t o en l a c o g d u c t a d e l p a r á s i t o son c o m p l e j o s , p e r o es p o s i b l e que i n v g l u c r e mecánismos e n z i m á t i c o s de a c t i v i d a d de una p r o t e a s a

excretada p o r l a Endamoega

hihtolytica

específica para l a I g A . _{Como o c u r r e con o t r o s p a t ó g e n o s a d h e r e n t e s ,} _{l a}_{p r g}

_-

d u c c i ó n de una p r o t e a s a e s p e c í f i c a c o n t r a I g A p o d r í a cons=

(9)

t i t u i r un f a c t o r i n p o r t a n t e en l a v i r u l e n c i a de l a endamog

fla

h i n t o e y a i c a , r e l a c i o n a d o ccn l a adhesión y c o l o n i z a c i ó n d e l i n s t a s t i n o p o r l a s amibas.

E l c o n t a c t o con l a mucosa o l a p r e s e n c i a da t r o f c z o i t o s de Endamoefla h ¿ c t c e y t ¿ c a en l h l u z i n t e s t i n e l , induce l a producción l o c a l de I g A y a n t i c u e r p o s E é r i c o s , que no

-

son capaces ~e e l i m i n a r 21 p a r á s i t o

Itid

v i v o " .

Con e s t o s a n t e c e d e n t e s , nos i n t e r e s ó i n v e s t i g a r l a

-

p r e s e n c i a de una F r o t e a s a e s p e c í f i c a pare

l e

I g A en t r o f g -

z o i t o s y sobrenadante d e l ci,lt,ivo de, &damoafla h i h t o t y t i c a

083ETI V O S :

Demostrar I t i n v i t r o " l a e x f s t e n c j s da m a p r o t e a s a

-

e s p e c i f i c a c o n t r a I g A producida p o r l o s t r o f o z o i t o s y e l 1 medio de c u l t i v o d e ¿ndamoe8a h i n t a l y t i c a .

H a l l a r los! u g t c d o s adecuados de F c r i f j c a c i Ó n d e í l a

-

I g A p r o c e d e n t e d e t r e s f u e n t e s :

Suero

normal humano, suero

de p a c i e n t e con M e l o m a y C a l o s t r o humano.

P r o b a r métodoe Ce p u r i f i a c i ó n p a r c i a l de l a p r o t e a s e en e l medio de c u l t i v o de o n d a a o e h h i n f o e y t i c a .

i

(10)

1 1 . ) M A T E R I A L Y METODOS

1.-

Obtención de I g A s é r i c a y de mieloma.

( T h c n i c n 1

I

A ) P r e c i p i t a c i ó n con s u l f a t o de amonio

E l suero normal s e obtuvo a p a r t i r de una unidad de I

sangre p e r i f é r i c a ; de un i n d i v i d u o sano, donador d e l Banco C e n t r a l de Sangre d e l

C.M.N,

c e n t r í f u g a n d o a 1,000 X g du-'

-

r a n t e 20 minutos. E l plasma d e mieloma t i p o 1,914 f u é o b t e -

-

n i d o d e un p a c i e n t e d e l H o s p i t a l de Oncología d e l C.M.N

me

d i a n t e p l a s m a f é r e s i s . A l sobrenadante se ñ e c u a n t i f i c a su volumen en una p r o b e t a y s e l e añade 1.0 m l de CaC12 1.0

M

p o r cada 100 m l d e plasma ( para e l i m i n a r e l f i b r i n ó g e n o )

y/Ó 0.4 m l de d e x t r á n s u l f a t o de s o d i o a l 1 0 % p o r cada 100 m l de suero ( p a r a e l i m i n a r l i p o p r o t e í n a s ) . E l plasma Ó

-

suero (según sea e l caso) e s almacenado a 4 O C durante toda

l a noche en p l a n o h o r i z o n t a l (para incrementar l a super-- c i e de c o n t a c t o e h t r e e l suero Ó plasma con: e l CaC12 y e l

dextrán s u l f a t o d e s o d i o ) , l a muestra es c e n t r i f u g a d a a

-

1,000 X g p o r 20 minutos para e l i m i n a r e l sedimento: e l

-

c u a l e s t á c o n s t i t u í d o p o r f i b r i n ó g e n o y l i p o p r o t e í n a s . E l suero s i n l i p o p r o t e í n a s s e l e determina su c o n t e n i d o p r o

-

t e f c o p o r e l método de Lowry ( T h c n i c n 2 ) y se procede a

s a t u r a r con s u l f a t o d e amonio hasta l o g r a r una c o n c e n t r s

-

ciÓn de 1.8 M (que e q u i v a l e a una s a t u r a c i ó n d e l

34%).

La s a t u r a c i ó n puede r e a l i z a r s e con e l r e a c t i v o s ó l i d o como

-

con una s o l u c i ó n saturada: en e l primer caso s e hace uso

-

de l a t a b l a d e s a t u r a c i ó n ( T u B ~ Q I

I

Ó d e l Nomograma d e

-

DixÓn T u B h 2

I

.

En

e l segundo caso, s e añade 1/3 d e l

volumen d e l suero d e s o l u c i ó n saturada de s u l f a t o de amo

-

n i o p o r 2/3 p a r t e s d e suero: ~ l a a d i c i ó n d e l s u l f a t o de amo n i o ( s ó l i d o O en s o l u c i ó n )

f u é

l e n t a y con a g i t a c i ó n magné

-

tics c o n s t a n t e , se a j u s t ó e l pH a 7.8 mediante l a a d i c i ó n

-

(11)

*-

.

.s

de NaOH 2 N.

do p o r un l a p s o e n t r e 30 y 60 minutos. La s u s p e n d ó n f u é c e n t r í f u g a d a a 1.000 X g durante 30 minutos a temperatura ambiente. E l sedimento ( p a q u e t e de gamma g l o b u l i n a s ) se

-

resuspendió en B u f f e r de Tris-HC1 15 mM pH 8.0 hasta r e c g p e r a r e l volumen i n i c i a l . E l p r o c e s o de s a t u r a c i ó n se rea l i z ó t r e s v e c e s , para e l i m i n a r c a n t i d a d e s a p r e c i a b l e s de -. albúmina. E l t e r c e r sedimento además de s e r resuspendido f u é d i a l i z a d o _f T é c n i c a 3

I

exhaustivamente c o n t r a e l

mis-

m o B u f f e r usando una membrana de "Espectrapor 2" y en una r e l a c i ó n V:V 1:50-100 durante 1 8 horas a

4

C y con f r e c u e n t e s recambios hasta que l a prueba de s u l f a t o s _f PnueBa 7

I ,

f u é n e g a t i v a . E l sobrenadante se sometio a l a s s i g u i e n t e s pruebas: c u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s , inmunodifusión en

-

c u a n t i f i c a c i ó n de gamma g l o b u l i n a s p o r inmunodifusión ra

-

Después d e a j u s t a r e l pH

se

continuo a g i t a n -

r

O

g e l

í

T h c n i c a 4

I *

i n m u n o e i e c t r o f o r é s i s

í

T é c n i c a 5

I ,

-

d i a l .

B ) P u r i f i c a c i ó n d e I g A s é r i c a y de mieloma por: C r o m a t o g r a f í a de I n t e r c a m b i o I Ó n i c o

I

T é c n i c a 6

I

Una muestra de 1-2 g de p r o t e í n a f u é cromatografiada

DEAE-Sephadex A-50 y eluada con un g r a d i e n t e l í n e a 1 de

-

NaCl de 0.0 a 3.0

M

en B u f f e r de Tris-HC1 15 mM pH 8.0 y

-

un f l u j o de 0.5 a 1.5 ml/min ( i n i c i a l y f i n a l r e s p e c t i v a

-

mente). E l eluado se c o l e c t ó en f r a c c i o n e s de 10.0 m l ob-

t e n i é n d o s e l a g r á f i c a c o r r e s p o n d i e n t e mediante una c e l d a

-

de 1.0 m l y una densidad Ó p t i c a a 280 nm.

A

cada f r a c c i ó n obtenida se l e h i z o inmunodifusión contra a n t i s u e r o e s p e c i f i c o para I g A . Las f r a c c i o n e s o b t e n i d a s de I g A

se

conceE- t r a r o n p o r u l t r a f i l t r a c i ó n

í

T h c n i c a 7

I

con una membrana de "Amicon

XM-lOO",

b a j o una p r e s i ó n de

3.5

Kg/cm

.

E l

--

en una columna de v i d r i o d e 3.0 X 40 cm; empacada con

-

2

(12)

c

concentrado

s e

d i a l i z ó en membrana "Espectrapor 2" contra agua d e s t i l a d a en una r e l a c i ó n V:V 1:50 durante 18 horas

-

con c o n s t a n t e s recambios, l a f i n a l i d a d de é s t a d i á l i s i s e s

l a e l i m i n a c i ó n d e l NaCl p o r _{l o}que s e dá como concluída

-

P o s t e r i o r m e n t e de l a d i á l i s i s s e p r o c e d i ó a l i o f i l i z a r

-

( T h c n i c u 8

I

cuando l a prueba d e c l o r u r o s

e s

n e g a t i v a

I

PaueBn 2 ).

-

2.- Obtención de IgA s e c r e t o r a p r o c e d e n t e de c a l o s

-

t r o humano

A )

P o r

f i l t r a c i ó n e n g e l

L a s muestras de c a l o s t r o humano f u e r o n c o l e c t a d a s

-

de p a c i e n t e s p o s t - p a r t o d e l H o s p i t a l d e G i n e c o o b s t e t r i c i a d e l C.M.N; l a c o l e c c i ó n

s e

r e a l i z ó manualmente con un

"ti-

r a l e c h e " e s t é r i l . E l p o o l r e s u l t a n t e

se

d i l u y ó 1:2 con

-

NaCl 0.15 M ( s o l u c i ó n .salina i s o t ó n i c a ) y s e c e n t r í f u g o a

15.000 rpm durante una hora a 2OC para e l i m i n a r l f p i d o s y l i p o p r o t e i n a s . Después d e haber c e n t r í f u g a d o s e o b t u v i e

-

ron t r e s capas: un sobrenadante, un sedimrhto y una capa

-

de g r a s a ( c o n t e n i d o p r o t e i c o , c é l u l a s - c a s e í n a y l f p i d o s

-

l i p o p r o t e i n a s r e s p e c t i v a m e n t e ) . Tanto l a capa de grasa c g mo e l sedimento f u e r o n e l i m i n a d o s . E l sobrenadante f u é

re

movido para s e r d i a l i z a d o exhaustivamente en Buffer de

-

Tris-HC1 20 mM con NaCl a l 2% y pH de 8.2 en una r e l a c i ó n V:V 1:lOO con c o n s t a n t e s recambios, durante 18 horas y a

-

4 O C . La muestra de c a l o s t r o d i a l i z a d a

se

l e c u a n t i f i c ó : c o n t e n i d o p r o t e í c o , c o n t e n i d o de c a r b o h i d r a t o s ( T é c n i c a 9 )

y c o n c e n t r a c i ó n d e gamma g l o b u l i n a s .

En una columna de v i d r i o de 3.0 X 40 cm empacada con Sephadex C-200. se a p l i c ó una muestra de c a l o s t r o c l a r i f - cado c o r r e s p o n d i e n t e a l

4%

d e l volumen t o t a l de l a columna

Ó b i e n en una c o n c e n t r a c i ó n d e 100 a 200 m g de p r o t e í n a .

I

(13)

< .

. I

I .

.

1.

1 g e l f u é e q u i l i b r a d o con B u f f e r de Tris-HC1 20 mM con NaCl a l 2% y pH de 8.2

baño maría a 50°C curante

5

horas en agua d e s t i l a d a , p a r a e l i m i n a r d e x t r a n a s s o l u b l e s y poder e q u i l i b r a r con e l Bg

-

f f e r . La muestra f u é e l u i d a con e l mísmo B u f f e r obtenién- do f r a c c i o n e s de 5.0

ml.

L a s f r a c c i o n e s r i c a s en I g A fue-

-

ron determinadas p o r inm.unodifusiÓn en agarosa a l 1 % en

-

B u f f e r de B a r b i t a l pH 8.6

$

f u e r z a i ó n i c a de 0.05, y a n t i - sur0 e s p e c í f i c o para I g A s e c r e t o r a ( * ) : de l a s c u a l e s s e

-

h i z o un p o o l que se c o n c e n t r ó p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en meg

-

brana "Amicon XM-50" y una p r e s i ó n de

3.5

Kg/cm

.

E l coz- centrado s e d i a l i z ó c o n t r a agua d e s t i l a d a a LoC durante 18 horas con recambios c o n s t a n t e s , p o r Último l a muestra

f u é

l i o f i l i zada.

-

E l Sephadex G-200 s e p r e p a r ó en

-

2

( * ) E l a n t i s u e r o e s p e c í f i c o p a r a l a IgA, s e c r e t o r a

-

f u é donado p o r e l

Dr:

Gustavo A c o s t a d e l Departamento de I n v e s t i g a c i ó n d e l C.M.N.

B ) Obtención d e l componente s e c r e t o r p o r cromg- t o g r a f í a d e Inmunoadsorción

I

T é c n i c a 10 )

D e l t e r c e r p i c o de l a f i l t r a c i ó n d e l c a l o s t r o en Se- phadex G-200 y con una r e a c c i ó n p o s i t i v a de inmunodifusión en g e l c o n t r a I g A s e c r e t o r a ; s e concentró a 1/10 d e su v o lumen o r i g i n a ñ p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en una membrana de "Ami con XM-3OIt b a j o una p r e s i ó n de

3.5

Kg/cm

.

La muestra c o g centrada s e d i a l i z ó c o n t r a B u f f e r de f o s f a t o s a l i n o (PBS) 0.25 M y pH 7.2 con NaN3 a l 0.03% en una membrana "Espec

-

t r a p o r 2" en una r e l a c i ó n

V:V

1: 100 y a g i t a c i ó n magnética

E l inmunoadsorvente (Anti'' 2gh s e c r e t o r a acoplada a

-

2

-

Sepharosa LE) s e empacó p o r gravedad en una columna de 1 0

(14)

'0

m l ( j e r i n g a ) . Se e q u i l i b r ó con 50

m l

d e PBS f r i o .

L a muestra d i a l i z a d a s e a p l i c ó a l a columna de inmu- noadsorción. se l a v o con Pbs r e c i c l a n d O l a s primeras t r e s f r a c c i o n e s ( p a r a i n c r e m e n t a r l a c a n t i d a d de componente

se-

c r e t o r pegado a l a n t i c u e r p o a n t i I g A s e c r e t o r a de l a c o

-

lumna. con t i o c i a n a -

-

t o de amonio

(NH

SCN) 1.5 M en B u f f e r de PBS pH d e

6.8,

c o

-

l e c t a n d o f r a c c i o n e s de 2.0 m l .

l a e l u s i ó n de l a muestra se r e a l i z ó

4

L a s f r a c c i o n e s con componente s e c r e t o r ( d e t g a c t a d a s por inmunodifusión con a n t i I g A s é r i c a y s e c r e t o r a ) f u e r o n concentradas p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en membrana "Amicon XM50tt

2

y una p r e s i ó n de

3.5

Kg/cm

:

e l concentrado se d i a l i z ó con t r a PBS 0.15 M y pH 7.2 en una r e l a c i ó n V:V 1 : l O O y se guardo en c o n g e l a c i ó n .

-

3.-

Organismos

Se u t i l i z a r o n t r o f o z o i t o s d e endantoela h i n t o e y t i c a

-

de l a cepa H K - 9 ; l o s c u a l e s f u e r o n c u l t i v a d a s axénicamente

en medio TPS ( * )

( * ) C u l t i v a d a s en e l Departamento de B i o l o g i a C é l u

- -

l a r d e l Cnetro de I n v e s t i g a c i ó n y E s t u d i o s Avanzados d e l 1.P.N

L a s amj-bas f u e r o n separadas d e l medio de c u l t i v o p o r c e n t r i f u g a c i ó n a ₄₀₀X g durante 20 minutos, ajustando su c0ncentraciÓn.a 1

X

l o 6 células/ml en medio de c u l t i v o .

-

Sometiéndolas a c o n g e l a c i ó n e n

N 2

l í q u i d o para su uso pos-

t e r i o r

.

-

Se tomaron a l í c u o t a s de 1.0 m l ; una de e l l a s se l e

-

t r a t ó con T r i t Ó n X-100 a l 1 % (en B u f f e r de Tris-HC1 50 mM

_I

(15)

pH 8.1) en baño maria a 3 7 O C durante 30,60,90 y 180 m i n u

- -

t o s , a l a o t r a s o l o se l e t r a t ó con B u f f e r b a j o l a s mísmas c o n d i c i o n e s . Se p r o c e d i ó a c e n t r í f u g a r a 400 X g durante- 20 minutos o b t e n i é n d o : un sedimento ( paquete c é l u l a r , trg tad0 y no t r a t a d o con T r i t Ó n X-100) y un sobrenadadnte (me

-

d i o de c u l t i v o t r a t a d o y no t r a t a d o )

I

4.-

P r e p a r a c i ó n de l a P r o t e a s a d e I g A

E l sobrenadante d e l medio d e c u l t i v o d e

las

amibas

-

se p r o c e s o p o r dos métodos:

A )

P o r

u l t r a f i l t r a c i ó n . ( E 11)

E l sobrenadante l i b r e de amibas, s e u l t r a f i l t r ó 2 en membrana "Amicon

XM-50"

b a j o una p r e s i ó n de 2.2 Kg/cm

reduciéndo a l a 1/10 p a r t e d e l volumen i n i c i a l : p o s t e r i o r - mente s e d i a l i z ó c o n t r a B u f f e r de Tris-HC1 50

m M

pH 8.1

B)

P o r

s a t u r a c i ó n . ( E I )

E l sobrenadante d e l medio de c u l t i v o 6e s a t u r ó a l 30% con s u l f a t o de amonio, p o s t e r i o r m e n t e a l 601, e l s e

-

dimento o b t e n i d o de a i s l ó p o r c e n t r i f u g a c i ó n a 1,000

X

g

-

durante 30 minutos. E l sedimento s e resuspendió en s o l ;

-

ciÓn s a l i n a i s o t ó n i c a hasta o b t e n e r 1/80 d e l volumen o r i g 2 n a l , p o s t e r i o r m e n t e f u é sometido a d i á l i s i s c o n t r a solu

- -

ciÓn i s o t ó n i c a hasta l o g r a r que l a prueba de s u l f a t o s fue-

-

r a n e g a t i v a . Después de l a d i á l i s i s l a muestra s e l l e v ó

-

a 1/20 d e l volumen o r i g i n a l con s o l u c i ó n s a l i n a i s o t ó n i c a y s e s a t u r ó a 70% con acetona a 4 O C en donde e l sedimento

f u é

resuspendido en B u f f e r de tris-HC1 50 m M pH 8.1

centésima d e l volumen i n i c i a l , d i a l i z a n d o en r e l a c i ó n V:V 1 : l O O

a una

d u r a n t e 18 horas a AoC c o n t r a e l mísmo B u f f e r .

(16)

5.- I g A como s u s t r a t o

Se prepararon p o r d u p l i c a d o s o l u c i o n e s de I g A proc- dentes de t r e s fuentes: sur0 normal humano, plasma de

mig-

loma y c s l o s t r o ; a una c o n c e n t r a c i ó n de 5.0 mg/ml en Bg

-

f f e r de 'Tris-HC1 ₅₀mM pH 8.1 La e s t a n d a r i z a c i ó n s e reg-

lid

p o r -inmunodifusiÓn r a d i a l y n e f e l o m e t r f a .

B

6.-

Determinación d e l a r e l a c i ó n Óptima Ag/Ab

( 7 h c n i c a 7 7

I

E l , o b j e t i v o de é s t a d e t e r m i n a c i ó n f u é e l e v i t a r e l

-

exceso d e a n t f g e n o o a n t i c u e r p o en l a e l e c t r o f o r é s i s .

I g A ' ( a n t í g e n o ) s e probó c o n t r a a n t í I g A s é r i c a (en e l caso de I g a p r o c e d e n t e de suero normal humano y de plasma de

-

mieloma), y a n t i I g A s e c r e t o r a para c a l o s t r o .

La

E l a n t i s u e r o a n t i I g A s é r i c a

f u é

o b t e n i d a de l o s Lg- b o r a t o r i o s Bohering.

En p l a c a s de l u c i t a en formade U

s e

h i z o una d i l u -

- -

c i ó n en s e r i e 1;2 de e l a n t í g e n o con B u f f e r de Tris-HC1 50

m M

pH

8.1, s e incubó a 37'C durante 60 minutos.

tiempo se h i z o una p l a c a d e a g a r o r a a l 1% en B u f f e r de Bar

b i t a 1 pH 8.6 y f u e r z a i ó n i c a de 0.01 con un e s p e z o r de 2

-

m m , a l a que s e l e h i c i e r o n p e r f o r a c i o n e s de 2 mm en l a

-

p a r t e c e n t r a l y dos c a n a l e s en l o s extremos ( p a r t e s u p e r k or e i n f e r i o r ) E n L o s o r i f i c i o s c e n t r a l e s s e d e p o s i t ó sobre

-

nadante de l a mezcla Ag/Ab incubado, e l canal s u p e r i o r s e i i e n o con a n t í g e n o y e i i n f e r i o r con e i a n t i c u e r p o y s e

-

contínuo incubando a temperatura ambiente durante 18 horas A l mismo

-7.- D i g e s t i ó n e n z i m á t i c a " i n u i t a o ' de I g A

( T é c n i c a 72 I

(17)

e - ,

E s t e p r o c e s o se e f e c t u ó con l a f i n a l i d a d d e t e n e r l a degradación d e l a molécula de I g A que p u d i e r a s e r v i r como r e f e r e n c i a d e l a a c t i v i d a d p r o t e o l í t i c a .

A 100 mg de I g A “se l e añadió 1.0 mg de t r i p s i n a ,

-

0.01 M de c i s t e í a n a en 10 m l de B u f f e r de f s o f a t p s 0.1 M

-

pH

7.6.

Se incubó en un baño a temperatura constante a

-

37OC durante 72 horas; ‘durante(i1as que s e tomaron muestras a 1

y

2 h o r a s , añadiéndo yodacetamida a l 0.1% como inhibL-

dor de l a p r o t e ó l i s i s ; l a s muestras o b t e n i d a s s e c o n g e l g

-

ron hasta e l momento de l a l e c t r o f o r é s i s .

I

8.- D e t e c c i ó n de l a a c t i v i d a d de p r o t e a s a contra I g A

Se incubaron volumenes i g u a l e s de l a s s o l u c i o n e s de I g A

(50111)

de l a s t r e s f u e n t e s ( s é r i c a , mieloma y c a l o s

-

t r o ) a una c o n c e n t r a c i ó n de 5.0 mg/ml con: A ) t r o f o z o i t o s de E n d u n o e t k h i n t o t y t i c n t r a t a d o s con T r i t Ó n X-100 a l 1%.

B)

t r o f o z o i t o s de EndurnoeBu h ¿ n t o @ y t i c a no t r a t a d o s con

-

TritÓn X-100 a l I % , C ) medio de c u l t i v o p r e c i p i t a d o con

-

s u l f a t o d e amonio

( E

I ) , 0 ) medio d e c u l t i v o concentrado

-

p o r u l t r a f i l t r a c i ó n

( E

1 1 ) . La inaubación s e r e a l i z ó en

baño maria

a

_37OCdurante _30.60. 120

y

180 minutos.

La a c t i v i d a d p r o t e o l í t i c a s e d e t e c t ó p o r inmunoelec-

-

t r o f o r é s i s en agarosa t i p o

I1

a l

1%

en B u f f e r de b a r b i t a l

pH 8.6 y f u e r z a i ó n i c a d e 0.1; y a n t i s u e r o e s p e c í f i c o pa

-

r a I g A s é r i c a y s e c r e t o r a . E l c o r r i m i e n t o e l e c t r o f o r é t i c o

se

h i z o b a j o l a s s i g u i e n t e s c o n d i c i o n e s : ₃₀ V o l t s , 12-18 miliampers; e l c o n t r o l f u é suero humano Ó c a l o s t r o mezclg-

do con una s o l u c i ó n de a z u l de bromofenol a l 0.01% en e l

-

’

B u f f e r de c o r r i m i e n t o . L a s p l a c a s o b t e n i d a s f u e r o n f i j a

-

das y t e ñ i d a s con a z u l b r i l l a n t e d e Cppmasie R-250.

(18)

1 1 1 .

-

RESULIADOS:

L a columna empacada ( a

3 I!

30 cm) con S e p k d e x A-50; y que f u é empleada p a r e l a p x r i f i c a c i ó n de l a I g A s é r i c a

-

procedmt.e Ce: suero n c r ~ a l humano y suero d e p a c i e n t e con Mieloma t,ipo !IbA t e n í a un volumeri vircic d e 50

ml.

d e t e r n i n a d o n e d i a n t e e x c l u s i ó n d e una muestra de A z u l DFx-

-

t r á n (pol.ímerc d e e!.cva¿c p e s o m o i é c u l a r ) a l 1% en B u f f e r d e corriulitatt> (Tris-ECI 15 mM pH 8) ( G r á f i c a 1 )

Este f u é

De l a muestra de: 1 ) s u e r o de p a c i e n t e con Kioloma

-

o b t e n i d o d e l Hospita.1 de Q n c o l o g í a d e l C.M.K.

IMSS

y

2 )

-

deüpugs d e t r e s p r e c i p i t a c i c n e s con su1fat.c Ce anonio a

-

cica m t u r a c i ó n _c1.e :.8

M ;

ai6

l o s s i g u i e n t e s r e s ~ l t a c o s .

-

a )

Por.

El.ef.trofor6si.5,

b)

Mediant.6 determinación de p r o t e i .

-

nas p o r e l uétCdO ¿e Lowry.

ns

P r G t e í n a s t o t s l e s AlbÚmir-a

G l o k u l i n a s A l f a - 1

A l f a - 2 B e t t a

Game. Ab a /mi 10.2 3.1 7 r

‘I

0.38 1.17

4.55

1

.o

0.44

1 2

b a b

mg/rr.l mg / m i ‘ 9 ;&l

4.54 2.8 2.68

0.36 2.54 0.02 0.16 2.02 0.34 0.10

V Comc s e .puede c k s e r v a r en 1.8 t.i<.i-Ia n e t e r i c - r . l a cog-

cerit,ración di: & , r o t e i n a s S E ve b a s t a n t e disminuido después

d e l p r o c e s o d e s a t c r a c i ó n cor el s u l f a t o ae arncnio; e s t e

-

decrsnieritc, e s causado p o r l a e l i m i r ( o c i 6 n $.E> p r c t r í n a s en

-

(19)

e l sobrens.dar~:e, l a s c u a 1 . e ~ no l l e g a n w punto I s o e l é c

-

t r i c o con e s t a c o n c e c i r a c i ó n d e se.1 y p o r

IC

tsnt,c nc I C

-

grsn p r e c i F i t , a r . Es menester hacer not,ar q u e ? e 1 ~ s PI'S- -. t.efnac: s t r i c a s ; l a s

n . 6 ~

abm&n+#ek< Ecn l a s que migran e n

-

l a reKi6n Ec?t;ta y e c t r e e l l a s

s e

encuent.:.a l a I g A .

I g A : I g G I 9 M

n>g/dl. nig/Gl m g i d l Suero d s Kieloma 520 . I 2,200 540

Suero

cor. C?C,E p r e c i p i t . . 3,000 1 , 6 C G 150

Suero _cont r e s p r e c . _3,000 7

4U

82

Consi,derando

EI

ccr,t&nj.cc p r c * t e í c o &e

1&

muestrq, se

a.plicÓ ur; volumen d e

4 m l

y u n e c.oncefitr&c:Ón de p r o t e i

-

nac < e 10.7 mg. Se ei.i;c cor, un grn?ier.te i í n s d cor,st;itci

d o por: t:C, ni.: de NaCl 0 . 3 b! en B u f f e r de Tris-HC1 1 5 mlii

-

F H

8 y 150 m l de B u f f e r d6

Tris-EC1

75 ml.; p€i

e.

E l c o r r i -

miento coricj.uy6 con cr- f l u j o de 7 8 m l / h .

Se obt.iivierei 5C f r a c c i o n e s con 100 g o t a s ccide ur.u

-

d t e l ? a s ; l a 4-8 f u é p c e i t j w . pir¿ IgG y d e Ir; IC-36 f u e r o n

p o s i t i v a s y n r h I g A ( F L g u r 6

3)

Se r e a d i z a r c n v a r i c r c o r r i m j ~ n t i - ~ s cbt.eni.éndose un'

-

rend?iriierit.o d e l ei.9

%

y u i x piireza d e l 8 4 % (aetermir.sd«

-

p o r N e f c l o m e t r í a ) .

(20)

S e soc!f;t.i.b a c r o m a t o g r e f í a 6 e I c t . e r c s m b i c I ó n i c o Una.

v!!!cc:?t.aI d e

7 ,

5 u81 d e s u e r o n a m a l . tumaie'c p r e c i p i t s c c

3X

C O L

s ü l f a t o d e amonio

(1.8M)

y una c o a c a t , r a c i Ó n de 1'2.5 i g de cor.t,t?n:dc F r o t e í c c . üsa.ndc. e l mfsnc; gra?cen<,e. l í n e a ) ,

ei

f r a c i o r a m i e n t o sc- r e a l i z o c c n un f l u j o i n i c i a l de

18mlÍk.-

Se x o l a c t a r o n

5s

f r a c c l o c e f i de I C 0 g o t a s c a 2 a una.

Al

i g u a l que e n l a : : ~ p e I a c j C n

d e l

Tuero 6 e p a r i e z t e

COK ~ ; i . e ~ o r n a ; si fra.ccic'nen;ici:.t,c. cie suero c o r m a i hurrario 6á

uan gI.áf2 c.a coli. tre:. m c : c c - t ~ s ( e n t r e m e z c l a d e s ) . En dcends

-

1 8 s dos p r i n t e i . ~ ~ . d i n p I i ; ~ b a 1 x s i t . i v a p a r 6 IgG ( f r a c c i o n e s

5-11 y 17-30) y en i n t e r c e r a S E er.c.~ent.ra

l a

I g H (deterroL

ricdp u.e?iantt? inmLrcd.ifUsiÓn r a d j . 8 1 ) en l a s f r a c c i o n e s

28

e. Ln,

Como e.x.Ferimer,tcs p ~ e l i m i n a r e s se e f e c t u a r o n ~ C E

t é 2

r i c a s 6 e p u r i l ; c a c i & i de l e I g A precedente de calcs:?.rc

hg-

mano; s í n i o g r s r okt.er,ei hi cric.:: r e c u i i a i o s . La,. t é c n i c a s

-

eirplcrics f u e r o n : 1 ) F i l t r a c i ó n en L c : p h a d t x C-20G oluenüo

-

con: a.) Ke.C1

O.'!.¿

K

pH

6..&

,

b) grai2Sent.e l í n e a ? ?.E. KECI

-

C- 0:!4 Ii. er. B u f f e i dri

PBS

_(1.:

M

p t 7.2

,

C.: i*Ci! p a d i e - -

t c s c:scslcnodas de Ma C.1 d e 0-2 M en P u f f e r de

Tri

V-BCI. 70

(21)

(22)

*-

.

(23)

T E C N I C A S

(24)

PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO ( 7 h c n i c a 7 )

INTRODUCCION :

Uno de l o s componentes d e l suero son l a s p r o t e í n a s , - l a s c u a l e s se encuentran en una c o n c e n t r a c i ó n d e l

6%.

De

I

acuerdo a su m o b i l i d a d en un campo e l é c t r i c o , e s t a s p r o t e i nas s e c l a s i f i c a n como: a l f a , b e t a y gamma.

Cuando e s t a s se encuentran e l e v a d a s causan h i p e r g s

-

mmaglobulimemia y puede s e r p a t o l ó g i c o . corn0 l o e s e l caso de mieloma m ú l t i p l e y l a macroglobulinemia de Waldestrom.

L a s inmunoglobulinas son un grupo de p r o t e í n a s con

-

p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s y c e r o l ó g i c a s que recientemente han s i d o e s t u d i a d a s extensamente.

C o n s t i t u y e n un grupo h e t e r o g é n e o en cuanto a carga.- masa y a c t i v i d a d , b i o l ó g i c a . Su a i s l a m i e n t o en e n t i d a d e s

-

f i s i c o q u í m i c a s d i s c r e t a s í m p l i c a una sel-ie de problemas y-

e s tema d e i n v e s t i g a c i ó n en a l g u n o s l a b o r a t o r i o s .

'

Los

a n t i c u e r p o s son inmunoglobulinas ( I g C , IgM, I g A I g E e I g D ) y s e encuentran en l a s f r a c c i o n e s b e t a y gamma d e l suero.

.

D e l t o t a l de g l o b u l i n a s s é r i c a s , l a cantidad de a n t i cuerpos es r e l a t i v a m e n t e pequeña, generalemente e s menor

-

a l

10%

d e l t o t a l de p r o t e í n a s de un animal hiperinmuniaado

.

, , ."

,,.,

Las inmunoglobulinas de d i f e r e n t e s e s p e c i e s pueden- mostrar p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s d i f e r e n t e s , p o r l o que e s i m p o r t a n t e c o n s i d e r a r l a f u e n t e d e l m a t e r i a l .

(25)

*-

.

cuerpo en l a f r a c c i ó n p u r i f i c a d a .

i

,

L a s inmunoglobulinas r e p r e s e n t a n a l a s p r o t e í n a s bá-

-

do punto i s o é l e c t r i c o y en e s t o se basan l a mayoría de l o s

I

I *I

s i a a s d e l suero. Sus s o l u b i l i d a d e s c o i n c i d e n con su e l e v a

I

métodos de separación.

Los

métodos de s e p a r a c i ó n y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e r

p o r se r e f i e r e n generalmente como e s p e c í f i c o a y no e s p e c i - I

f i c o s .

Aunque l a s g l o b u l i n a s t i e n e n algunas propiedades f i - s i c a s semejantes a l a s inmunoglobulinas, e l p o r c e n t a j e de

pureza ( 100 X g l o b u l i n a con f u n c i ó n de anticuerpo/ t o t a l

de g l o b u l i n a s ) d e l producto f i n a l depende d e l contenido de l a s f r a c c i o n e s c í r c u l a n t e s d e inmunoglobulinas s é r i c a s .

Generalmente l o s métodos no e s p e c í f i c o s dan a l t o s

-

rendimientos y b a j a pureza, en t a n t o i e n l o s e s p e c í f i c o s s e o b t i e n e b a j o rendimiento con mayor pureza.

E l a i s l a m i e n t o y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e r p o s p o r

mé-

-

t o d o s e s p e c í f i c o s t i e n e n un fundamento simple y c o n s i s t e

-

en l a propiedad que t i e n e n los a n t i c u e r p o s de p r e c i p i t a r .

.

En cada caso m e t o d o l ó g i c o , e l complejo r e s u l t a n t e

-

puede s e r d i s o c i a d o a j u s t a n d o e l pH a 3.0, que es l a condi

ciÓn p r e f e r i b l e para l a mayoría d e sístemas antígeno-antL

-

cuerpo y a s í o b t e n e r e l a n t i c u e r p o .

-

(26)

e- 1

1

3

Los a n t í g e n o s s o l u b l e s t i e n e n p r o p i e d a d e s d i f e r e n t e s a l a s de l a s inmunoglobulinas, p o r l o que e l complejo a n t i geno-anticuerpo, ambos pueden s e r removidos mediante p r e c 2 p i t a c i ó n Ó c e n t r i f u g a c i ó n d i f e r e n c i a l . Cuando el a n t í g e n o e s t á en forma i n s o l u b l e , s o l o

se

r e q u i e r e de r e n o v e r p o r c e n t r i f u g a c i ó n .

~ I

L a d i s o c i a c i ó n d e l complejo a n t í g e n o - a n t i s u e r p o acg-

r r e también a pH cercanhs a

9.5;

p e r o , l a d e s n a t u r a l i z g

-

c i ó n en l a s , s o l u c i o n e s a l c á l i n a s , o c u r r e rápidamente, p o r l o que é s t e método t i e n e poco v a l o r .

Aunque e l p r e c i p i t a d o e s p e c í f i c o ( c o m p l e j o i n s o l g

-

b l e ) c o n s i s t e p r i n c i p a l m e n t e d e a n t í g e n o y a n t i c u e r p o , una pequeña p e r o s i g n i f i c a t i v a c a n t i d a d de m a t e r i a l no e s p e c - f i c o también e s t a r á p r e s e n t e

si

no s e toman precauciones.

De p a r t i c u l a r i m p o r t a n c i a e s l a i n c l u c i ó n d e l comple-

mento, p o r e l l o e s n e c e s a r i o

el

"descomplementar" e l ant&-

suero a n t e s de que r e a c c i o n e con e l a n t í g e n o e s p e c í f i c o .

Aunque l a pureza de

los

a n t i c u e r p o s d e l t i p o de l a s

g l o b u l i n a s , generalmente

e s

e l e v a d a s i s e o b t i e n e p o r méto

-

dos e s p e c í f i c o s .

O t r a t é c n i c a para e l a i s l a m i e n t o de a n t i c u e r p o s espg

p r e p a r a c i ó n d e m a t r i c e s i n s o l u b l e s que cog- adecuado unido a e l l a ' c o o v a c í f i c o s

e s

l a

t i e n e n un a n t í g e n o e s p e c í f i c o l e n t em en t e .

E l uso de inmunoadsorventes f u é r e c i e n t e m e n t e a p l i c a

_-

da con e l nombre de C r o m a t o g r a f í a p o r A f i n i d a d .

E l a d s o r v e n t e que o r i g i n a l m e n t e f u é u t i l i z a d o f u é un

(27)

d e r i v a d o d e l a c e l u l o s a con un grupo p-amino b e n c í l , e l

c u a l e s f á c i l m e n t e d i a z o n i z a d o acoplando a l o s a n t í g e n o s p r o t e í c o s Ó haptenos.

-

P o s t e r i o r m e n t e se d e s c u b r i o que e l e n l a c e de l a s p r o

t e í n a s e r a un e n l a c e amido con l a c a r b o x i m e t í 1 c e l u l o s a .

I

Se d e s a r r o l l a r o n nuevas t é c n i c a s y su uso

más

exte"- s i v o con l a i n t r o d u c c i ó n de g e l e s de agarbsa y d e x t r a n cg- mo m a t r i c e s .

L a s m o l é c u l a s que ticenen grupos amido l i b r e s s e unen coovalentemente a l o s g e l e s mediante l a a c t i v a c i ó n con

rc-

d i c a l e s de bromuro de cianógeno que atacan a l g e l .

L o s avances t é c n i c o s de l a inmunología y Bioquímica han c o n t r i b u i d o a l entendimiento de l a e s t r u c t u r a de l a mo

-

l é c u l a d e l a n t i c u e r p o .

E l a i s l a m i e n t o y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e r p o s a pap

- -

t i r

de un a n t i s u e r o p o r métodos e s p e c í f i c o s . c o n s i s t e en

-

l a a d i s i ó n d e un a g e n t e p r e c i p i t a n t e d e l a n t f g e n o s o l u b l e

Ó b i e n l a a d s o r c i ó n

del

a n t í g e n o i n s o l u b l e e s p e c í f i c o .

En l a a c t u a l i d a d se cuenta con a g e n t e s p r e c i p i t a n t e s para l a s inmunoglobulinas t a l e s como: e t a n o l , s a l e s ne2

-

t r a s ( s u l f a t o d e amonio. s u l f a t o de s o d i o ) , p r e c i p i t a n t e s complejos ( r i v a n o l , s a l e s de aluminio, f o s f a t o s . sales de zinc).

La p r e c i p i t a c i ó n de l a f r a c c i ó n gamma d e l suero e s p o s i b l e d e b i d o a que e s t a s p r o t e í n a s t i e n e n puntos i s o e l é c tri cos r e l a t i v a m e n t e a l to s.

~~

(28)

e

Cuando l a f r a c c i ó n gamma s e t r a t a con p r e c i p i t a n t e s complejos, s e forman c o m p l e j o s c a t i ó n i c o s i n s o l u b l e s con

--

l a mayoría d e l a s o t r a s p r o t e í n a s s é r i c a s a v a l o r e s d e pH donde l a f r a c c i ó n gamma queda como a n t i g e n 0 soluble ( s i n

-

formar t a l e s c o m p l e j o s ) , p o r

io

que

e s

n e c e s a r i o precip'

-

t a r l a p o r o t r o método; p e r o p r e v i o a e s t o s e r e a l i z a

un

-

p r o c e s o de c l a r i f i c a c i ó n ; e s t e método I m p l i c a una s e r i e

-

de pasod y p o r l o t a n t o v a r i a s t é c n i c a s y en e l l o s e basa

su

poca a p l i c a c i ó n .

Las inmunoglobulinas d i f i e r e n unas de o t r a s , y a

su

v e z de l a s o t r a s p r o t e í n a s s é r i c a s en cuanto a su s o l u b i l i dad en s o l u c i o n e s acuosas, é s t a c a r a c t e r í s t i c a puede ser

-

empleada para f r a c c i o n a r l a s en c l a s e s .

Durante mas de 100 años, l a s s a l e s m i n e r a l e s

s e

han a p l i c a d o en l a p r e c i p i t a c i ó n y f r a c c i o n a m i e n t o de l a s p r g - t e í n a s .

Hammarsten y

Méhu

en 1878 f u e r o n l o s p r i m e r o s

en

i n -

-

v e s t i g a r e l e f e c t o de l a p r e c i p i t a c i ó n

n i o . H o f m e i s t e r en 1888 r e a i z ó i n t e r e s a n t e s i n v e s t i g a c i o -

-

nes a c e r c a de l a e f i c i e n c i a de

l o s

aniones y c a t i o n e s como

a g e n t e s : j p r e c i p i t a n t e s y l a s l e y e s f i s i c o q u í m i c a s que r i g e n t a l e s r e a c c i o n e s .

d e l s u l f a t o de amo

-

En

1937

K j e n d a l l f u é e l primero que p u b l i c ó e l méto-

-

do a s e g u i r para l a p r e c i p i t a c i ó n de l a f r a c c i ó n gamma sh- r i c a mediante e l uso d e l s u l f a t o de amonio.

I,.

S i se t r a t a n a l a s gamma g l o b u l i n a s con s a l e s

mine-

r a l e s n e u t r a s , a medida d e que s e incrementa l a concentra- ciÓn s a l i n a en e l medio, e x í s t e una i n t e r a c c i ó n de l a s

mg-

-

~

(29)

?

lécu'ias

de agua con l o s g r u p o s p o l a r e s de l a s moléculas

-

p r o t e í c a s h a c i é n d o l a s c a d a v e z

más

h i d r ó f o b a s l u b i l i e a r l a s .

h a s t a i n s o -

.

L a c o n c e n t r a c i ó n s a l i n a a l a q u e cada p r o t e í n a p r e c i p i t a e s d i f e r e n t e : aunque en e l caso de n o l é c u l a s e s t r e c h a monte r e l a c i o n a d a s como es e l caso ,de

Pa

s i n m u n o g l o b u l i n a s l a d i f e r e n c i a no e s l o s u f i c i e n t e m e n t e g r a n d e como p a r a

-

d a r un p r e c i p i t a d o de g r a n p u r e z a . P o r l o q u e é s t e

m é t -

do se emplea p a r a . c o n c e n t r a r i n m u n o g l o b u l i n a s ,

más

no s e p a

ra a c a d a una de e l l a s como e n t i d a d e s i n d i v i d u a l e s . I

S e ha i n v e s t i g a d o l a i n f l u e n c i a de una

s e r i e

de v a

-

r i a b l e s que i n t e r v i e n e n en l a p r e c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e i -

nas: s a l e s m i n e r a l e s ( c l o r u r o d e s o d i o . s u l f a t o de amonio) f u e r z a i ó n i c a , pH, c o n c e n t r a c i ó n de p F o t e í n a s

y

temperat&-

ra.

En c u a n b a s a l e s m i n e r a l e s . l o s i Ó n e s d i v a l e n t e s :

-

s u l f a t 0 , p r e c i p i t a n a l a hemoglobina

más

e f i c i e n t e m e n t e que e l iÓn monovalente c l o r u r o . E s t e e f e c t o s e l e a t r i b u y e a l a I 1 d e s h i d r a t a c i Ó n " de l a p r o t e í n a p o r l a s a l .

E l s u l f a t o de

amonio

t i n e l a v e n t a j a de que sus s o l u c i o n e s s a t u r a d a s c o n t i e n e n g r a n d e s c a n t i d a d e s de l a s a l y

su

s o l i b i l i d a d depende muy poco de l a t e m p e r a t u r a . S e

re-

comienda u s a r en r e a c t i v o l i b r e de c o n t a m i n a n t e s m e t á l i c o s . p u e s e s t o s i Ó n e s pueden f o r m a r enlaces con a l g u n a s p r o t e i

-

n a s , y a l g u n o s pueden c a t a l i z a r r e a c c i o n e s de o x i d a c i ó n .

E l s u l f a t o de s o d i o t i e n e una s o l u b i l i d a d l i m i t a d a a

b a j a s ~ t e m p e r a t u r a s

.

Algunos a u t o r e s recomiendan e l uso

-

de e s t a s a l a 370C. A _3OoC su a c t i v i d a d p r e c i p i t a n t e e s

-

(30)

u. .

comparable a l a d e l s u l f a t o de amonio. E l s u l f a t o de so

-

d i o p r e s e n t a l a v e n t a j a de no c o n t e n e r n i t r ó g e n o , p o r l o

-

que e v i t a l a d i s t o r c i ó n en l a c u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s .

E l s u l f a t o de magnecio p r e c i p i t a l a f r a c c i ó n de l a s gamma g l o b u l i n a s s é r i c a s . E l c l o r u r o de s o d i o e s usado

-

Únicamente para l a p r e c i p i t a c i ó n de f i b r i n ó g e n o .

I

E l c o n t r o l d e l pH e s un f a c t o r importante en l a prg- c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e í n a s ; no o b s t e n t e s e ha observado

-

I ** que su v a l o r , en e l suero no juega un p a p e l muy i m p o r t a n t e

I ,< en e l f r a c c i o n a m i e n t o con s a l e s mir)erales neutras, p e r o s i

,v* l o e s para e l f r a c c i o n a m i e n t o con e t a n o l .

I:::

1)'. ~ I//"

ip

1"

I.. I. ..

La c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a s en e l medio de precipi- t a c i ó n

,

t i e n e d o b l e e f e c t o : i n f l u y e en

l o s

l í m i t e s d e l a

p r e c i p i t a c i ó n y en l a c o p r e c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e í n a s '

-

acompañantes.

La temperatura no e s tan c r í t i c a para l a p r e c i p i t a

-

c i Ó n de l a s p r o t e í n a s con s a l e s m i n e r a l e s n e u t r a s

, como

l o e s cuando se usa e t a n o l . S i se usan s a l e s m i n e r a l e s no s e r e q u i e r e d e equipo de e n f r i a m i e n t o y puede r e a l i z a r s e

-

a temperatura ambiente.

Cuando s e t r a t a de p r o t e í n a s temosensibles o de r e a 2 c i o n e s e s z i m á t i c a s . es recomendable t r a b a j a r a b a j a s temps r a t u r a s .

Las p r o t e í n a s , t a l e s como: hemoglobina, miosina y

-

l a s s é r i c a s preeentan b a j a s s o l u b i l i d a d e s con calentamien- t o : e s menor a 25OC que a O°C. La mayoría de l a s p r o t e i

-

nas p r e c i p i t a n a temperaturas templadas o f r i a s . E l i n c r g

-

rq

I L..