• No se han encontrado resultados

Por l o que la-X<A t i e n e f u n c i ó n de a n t i c u e r p o para-

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2018

Share "Por l o que la-X<A t i e n e f u n c i ó n de a n t i c u e r p o para-"

Copied!
139
0
0

Texto completo

(1)

4 Nombre: Juana Herndndez Hernándcz

T e l é f o n o :

5-33-46-47

M a t r í c u l a :

75117787

Clave:

85-S-O46

I

/Carrera : I n g e n i e r o Bioquími co Indu

; t r i a l

T r i m e s t r e : P a s a n t e

,,

Horas semana : Tiempo completo

Lugar: H o s p i t a l de P e d i a t r í a d e l Centro Médico N a c i o n a l IMSS

Fecha de i n i c i o :

6

de Marzo de

1985

/Fe cha de t e r m i n a c i ó n :

4

de Septiembre de

1985

>

./

Nombre d e l t u t o r : D r : S a l v a d o r M a r t i n e z - C a i r o Cue 3

J e f e d e l Departamento de Inmtinología Reumatología y A l e r g i a d e l H o s p i t e l de P e d i a t r í a d e l C.M.N. IMSS

/Título: P r o t e a e a de EndamoeUa h i n f o é y t i c n can e c t i v i d a d s o b r e I g A humana.

,_--

(2)

I .

P R O T E A S A DE €ndcmnrBn

hidtolutica

CON C A T I V I D A C

SOPEE I g A HUMANA

(3)

I . ) I N T R O D U C C I O N :

~i sistema inmune s e c r e t o r humano se l o c a l i z a en:

-

g l á n d u l a s mamarias l a c t a n t e s , i n t e s t i n o delgado, á r b o l r e g p i r a t o r i o , v í a s u r o g e n i t a l e s , g l á n d u l a s l a c r i m a l e s y sal&- v a l e s

I

1 , 2 , 3 ) ( F i g .

1 )

La mucosa d e l i n t e s t i n o y pulmón c o n t i e n e d npdulos

-

l i n f o i d e s s o l o s o agregados; e s t o s nodulos ( c o n t i e n e n

ma

L

c r o f a g o s (fió), i o e c u a l e s son c é l u l a s que poseen i a c a p a c i

dad d e s e l e c c i o n a r

y

t r a n s p o r t a r a n t i g e n o s y materia p a r t i c u l a d a ) e s t a n a s o c i a d o s a l a s mucosas.

Los

l f n f o b l a s t o s

-

d e l o s nódulos l i n f o i d e s t i e n e n l a t e n d e n c i a de 1 o c a l i a a ~ - s e como p a r t e d e l sistema inmune s e c r e t o r ( F i g .

2).

Se ha

demostrado que l a r e t e n c i ó n d e l o s l i n f o c i t o s en l o s nÓdg-

los

l i n f o i d e s e s t á a s o c i a d o con e l metabolismo d e l á c i d o

-

a r a q u i d ó n i c o ( 4 )

E s t u d i o s en modelos murinos, en donde e s t o s son cog- taminados con gérmemes; i n d i c a que e l c r e c i m i e n t o m i c r o b i a no e s t i m u l a e l d e s a r r o l l o y maduración de l a s c á l u l a s

inmg

nocompetentes de l a lámina p r o p r i a d e l i n t e s t i n o .

Como s e ha señalado en r e c i e n t e s r e v i s i o n e s d e l sís- tema inmune s e c r e t o r , l o s a n t i c u e r p o s que s e l o c a l i z a n en l o s l í q u i d o s de l a s mucosas son d e n a t u r a l e z a I g A y son producidos p o r c é l u l a s p l a s m á t i c a s que s e encuentran b a j o l a membrana e p i t e l i a l de l a s mucosas. é s t a s c é l u l a s respon

-

den a

l a

p r o d u c c i ó n de a n t i c u e r p o s a v a r i o s a n t f g e n o s bas- t e r i a n o s y macromoléculas p r e s e n t e s en l a s u p e r f i c i e de

-

l a s mucosas (1.2,3)

-

Por

l o que la-X<A t i e n e f u n c i ó n de a n t i c u e r p o para

-

a n t f g e n o s de: b a c t e r i a s , virus, t ó x i n a s y macromoléculas

-

(4)

I .

._

de l a d i e t a

í

5

I

, .

I .

I

..

..

I..

..

..

i ,. I . I

*-

.

a

La s í n t e s i s d e l a I g A p o r b l a s t o s de l o s nódulos

lig-

f o i d e s a s o c i a d o s a mucosas d e g l á n d u l a s mamarias, pueden

-

i n d u c i r s e mediante un t r a t a m i e n t o con estrógenos, p r o g e s t c rona y p r o l a c t i n a

í

4 )

-

f E l h í g a d o p a r e c e tener un p a p e l muy importante en l a

v í a de eiiminacpón de l a I g A . Ya ha s i d o demostrado que l a IgA p o l i m é r i c a (dímero. t r i m e r 0 y t e t r á m e r o ) e s t r a n s p o r t a da r á p i d a y a c t i v a m e n t e c o n t r a g r a d i e n t e de concentración

I en l a b i l i s : en donde e l componente s e c r e t o r actúa como

r e

c e p t o r en l a s u p e r f i c i e sinuosa d e l h e p á t o c i t o , l a IgA e s

endocitada y t r a n s p o r t a d a d e n t r o de v e s í c u l a s que s e f u s i g nan en l a membrana c a n i c u l a r b i l i a r , en donde l a IgA e s

-

descargada

I

6 )

I

E s t u d i o s r e c i e n t e s i n d i c a n que l o s a n t i c u e r p o s de l a c l a s e IgA p r e v i e n e n e l a c o p l a m i e n t o de microorganismos pa- tógenos a d h e r e n t e s en l a s c é l u l a s e p i t e l i a l e s d e l huésped. Esta i n h i b i c i ó n d e l a a d h e r e n c i a d e

los

microorganismos a

l a s c á l u l a s e p i t e l i a l e s puede s e r d e gran importancia en

-

l a d e f e n s a inmune; a l e v i t a r que l o s patógenos adherentes puedan c o l o n i z a r a

l o s

t e j i d o s d e l huésped. i n v a d i r l o s y

-

causar enfermedad I

I

7 . 8

I

Las inmunoglobulinas westán compuestas p o r cadenas p o l i p é p t i d i c a s que s e r e p l i e g a n para formar dos r e g i o n e s

-

g l o g u l a r e s ; l a r e g i ó n F a S , o p o r c i ó n de l a molécula que se une a l a n t í g e n o , y l a r e g i ó n T c , o p o r c i ó n responsable d e l a s f u n c i o n e s b i o l ó g i c a s t a l e s como: ? ¿ j a c ¿ 6 n d e C o m p í e m e E t o y a c o p L a m i e n f o Q l a b c h l u l a b f a g o c ¿ L ¿ c a b ( 9 , 7 0

I.

l a s inmunoglobulinas con enzimas p r o t e o l í t i c a s , t a l e s como Estas dos r e g i o n e s pueden s e r separadas a l t r a t a r a

(5)

I

*-

-

I

1

i

I

4

papafna, t r i p s i n a y q u i m i o t r i p s i n a .

Por

e l l o son de c o n s i

,

d e r a b l e i n t e r é s l o s h a l l a z g o s d e l e f e c t o de

las

enzimas de

microorganismos patógenos adherentes capaces de degradar a l a I g A en f r a g m e n t o s Full

/-)

y F c

(-I:

en v i s t a de l a i m

- -

' ,

1

~

1

p o r t a n t e f u n c i ó n de l a I g A s e c r e t o r a en l o s mecanismos de inmunidad.

f

L a s p r o t e a s a s de I g A fueron d e s c u b i e r t a s después de l a o b s e r v a c i ó n de fragmentos 7 c

(-0

en m a t e r i a f e c a l ( 1 1 3 La i d e n t i f i c a c i ó n de fragmentos F c

(&I

en e l moco d e l c g

-

l o n s u g i r i ó l a p r e s e n c i a de una proteasa capaz de romper a l a molécula d e I g A ; p e r o incapaz de continuar degradando L a l fragmento Fc 1-C) de l a misma

f

11

I

La p r o t e a s a de I g A , e s una endopéptidasa metalode

- -

p e n d i e n t e e l a b o r a d a p o r c i e r t a s b a c t e r i a s e e r ó b i c a s l o c a l i

-

zadas en l a c a v i d a d o r a l , t r a c t o g a s t r o i n t e s t i n a l y genL- t o u r i n a r i o humano. Esta enzima rompe a l a I g A humana sé-

ca y s e c r e t o r a e n l a r e g i ó n s e n s i b l e ( l a r e g i ó n de l a b i s g g r a ) produciéndo fragmentos

7 u B

í*)

y ' F c / d ) : y e s i n a c t i -

-

va c o n t r a o t r a c l a s e de inmunoglobulina. Su a c t i v i d a d p r g t e o l í t i c a ha s i d o evaluada con o t r a s p r o t e í n a s y p é p t i d o s como: c a s e í n a , g e l a t i n a , colágena de tendón bovino, en dog de ha s i d o n e g a t i v a

I

12

I

La e s t r u c t u r a p r i m a r i a de l a r e g i ó n de l a b i s a g r a de p r o t e í n a s de I g A humana p r o c e d e n t e s de mieloma muestran un contenido poco usual en cantidades de: p r o l i n a , s e r i n a y

-

t r e o n i n a ;

que

son l o s aminoácidos s e n s i b l e s a l e f e c t o h i

-

d r o l í t i c o d e l a p r o t e a s a de I g A ( 12 )

Aunque l a I g A humana puede también s e r h i d r o l i z a d a

-

p o r algunas enzimas p r o t e o l í t i c a s elaboradas p o r m i c r o o r g g nismos: p r o t e a s a n e u t r a l de d n c i l l u n n u l l t i l i b . t e r m o l i s i n a

I

(6)

4

_ -

y

pronasa; e s t a s enzimas rompen a

l a

IgA pero s o l o en e l

-

fragmento T U B ( 4 ) puede s e r recuperado i n t a c t o , en t a n t o

-

que e l fragmento ? c (a) e s enzimáticamente degradado a péE t i d o s

,más

pequeños ( e s t o o c u r r e b a j o l a s mismas c o n d i c i g

-

nes de p r o t e ó l i s i s de l a p r o t e a s a e s p e c í f i c a de I g A ) ( 7 7 )

-

Observaciones s i m i l a r e s en l a a c t i v i d a d h i d r o l f t i c a de la' I g A o c u r r i e r o n en l a s a l i v a humana y en e l t r a c t o d& g e s t i v o . en l a s qud s e s u g i r i ó que e l o r i g e n de l a enzima era b a c t e r i a n o 1 9

I

I

r P o s t e r i o r m e n t e s e demostró que

los

patógenos adhere2

t e s : S t a e p t o c o c c u h h U n g u ¿ h , #e¿hhen¿a g o n o a n h o n e , 1. m e n ¿ &

g i t i d i h , Pheudomonn o u a u g i n o n a , H u e n , o p h ¿ h b ¿ n f ! l u e n r a e ,

-

H . a e g y p t i u a y S. p n e w n o n i a e s i n t e t i z a n una proteasa para l a IgA ( 12-20).

Muchas o t r a s e s p e c i e s b a c t e r i a n a s no producen e s t a

-

p r o t e a s a para l a I g A . L a s p r o t e a s a s de S ~ ~ Q ~ ~ O C O C C U A A Q ~

-

gu¿h y N e i h h e n i a gonoaahoae s e han p u r i f i c a d o p a r c i a l m e n t e de sobrenadantes de medio de c u l t i v o b a c t e r i a n o , mostrando una gran e s p e c i f i c i d a d para l a I g A ; e s t a s p r o t e a s a s son ca paces de fragmentar e s p e c i f i c a m e n t e a l a IgA s é r i c a humana ( p u r i f i c a d a de p a c i e n t e s con mieloma) y a l a I g A s e c r e t o r a

,

i !

Dos

t i p o s de IgA ( I g A 7 - e I g A 2 ) s e han p u r i f i c a d o d e l suero humano y en s e c r e c i ó n ( 27

1.

Las p r o t e í n a s de I g A 7

e I g A 2 exhiben muchas r e a c c i o n e s e n t i g é n i c a s cruzadas, e - t o i n d i c a que hay una d i f e r e n c i a e s t r u c t u r a l s i g n i f i c a t i v a

La p r o t e a s a de I g A es e s p e c í f i c a para e l t i p o I g A 7

-

produciéndo fragmentos F a & f e ) y F c (4 en t a n t o que l a

-

I g A Z e s r e s i s t e n t e ; aún con t r a t a m i e n t o enzimático p r o l o n g a do ( 2 7

I

(7)

4

El

e n l a c e p é p t i d i c o s u c e p t i b l e

a

l a p r o t e ó l i s i s e s :

La r e s i s t e n c i a a l a p r o t e ó l i s i s de l a I g A 2 s e p r o l i n a

-

t r e o n i n a l o c a l i z a d a en l a r e g i ó n de l a b i s a g r a

-

de l a I g A .

debe

a :

un p l e g a m i e n t o de doce aminoácidos en l a regi6h-1

-

de l a b i s a g r a d e l a cadena pesada ( l a c u a l i n i c i a con e l

-

aminoácido t r e o n i n a d e l e n l a c e p r o l i n a - t r e o n i n a ) y

a

l a d i

f e r e n c i a en c u a n t o a l contenido de c a r b o h i d r a t o s . E l gra-

-

do de p l e g a m i e n t o de l a cadena pesada e s t á determinado p o r

l a e s t r u c t u r a p r i m a r i a ,

l a s

r e g i o n e s de p l i e g e de l a I g A l

e I g A 2 d i f i e r e n s u s t a n c i a l m e n t e en conformación y además

-

en s u c e p t i b i l i d a d a l a t a q u e e n z i m á t i c o . O t r o f a c t o r no mg

nos i m p o r t a n t e e s l a p r e s e n c i a o a u s e n c i a de e n l a c e s d i s u 2

f u r o i n t e r c a d e n a ( e n t r e cadenas pesadas y l i g e r a s ) ; e l hc- l o t i p o A m 2 ( - ) c o n t i e n e cadenas l i g e r a s con e n l a c e s d i s u l f g

ro, p o r e l l o e s también r e s i s t e n t e

a

l a p r o t e ó l i s i s .

I

-

En e l s u e r o y c a l o s t r o humano, e l 10% de l a I g A y e l 50% r e s p e c t i v a m e n t e son de n a t u r a l e z a I g A 2 . é s t e d a t o ha

-

s e r v i d o p a r a s u g e r i r que e l e n r r i q u e c i m i e n t o de l a s s e c r g - c i o n e s con l a I g A 2

l e

dá una v e n t a j a s e l e c t i v a mediante rg s i s t e n c i a a l a p r o t e a s a

í

2 2

I

La p r o t e a s a de I g A e s

activa

en un rango de pH de

-

6.5

a 8.0 y e s t a b l e

a

5 5 O C d u r a n t e una hora

í

I 1

I

,

su a2

t i v i d a d p r o t e o l f t i c a e s suspendida p o r a d i c i ó n d e á c i d o

-

e t i l é n diamino t e t r a c é t i c o

(EDTA)

en c o n c e n t r a c i o n e s de

-

50 m M ; l a e l i m i n a c i ó n d e l

EDTA

( a g e n t e q u e l a n t e ) median t e d i á l i s i s y l a a d i c i ó n de MnC12. ZnC12 y CoC12 en

una

-

c o n c e n t r a c i ó n d e

5

mM r e s t a u r a n l a a c t i v i d a d , m i e n t r a s que e l CaC12 y e l MgC12 en c o n c e n t r a c i o n e s 'de 50 mM r e s t a u r a n

s o l o p a r c i a l m e n t e l a a c t i v i d a d . O t r o s c a t i o n e s d i v a l e n t e s como: F e t 2 y Cut2 causan d e s n a t u r a l i z a c i ó n i r r e v e r s i b l e

--

d e l s u s t r a t o d e l a p r o t e a s a

I

1 2 . 7 5

).

La producción de p r o t e a s a p a r a l a I g A de S i n e p t o c o c c u h h a n q u i h puede s e r e s

(8)

t í m u l a d a mediante l a a d i c i ó n de I g A s e c r e t o r a e s t é r i l , p r g c e d e n t e de p a r ó t i d a en una r e l a c i ó n d e l 10% ( 13 )

La d e g r a d a c i ó n de l a I g A i n d u c e l a f o r m a c i ó n de moni meros

F a g

( ) c u y a s c a p a c i d a d e s d e u n i ó n

a

l o s

a n t í g e n o s y

más

a ú n ;

c é l u l a s , e s t á n .reducidas.

l a f i j a c i ó n de complemento y a c o p l a m i e n t o a l a s

I

Ya

se

demostró una c o r r e l a c i ó n e n t r e v i r u l e n c i a y l a

p r e s e n c i a de l a p r o t e a s a e s p e c í f i c a p a r a l a I g A ( 1 3 . 1 9 J

En

l a

amYDiasis i n v a s o r a , l o s t r o f o z o i t o s de Endamog

&a

h¿Atolytica

a l c a n z a n e l i n t e s t i n o g r u e s o ( 23 ) y pene-

t r a n a t r a v é s de l a mucosa i n d u c i e n d o l a s í n t e s i s de a n t l - c u e r p o s s é r i c o s ( 24-27 ). Del 80 a l 100% de p a c i e n t e s

-

con a b c e s o d h e p á t i c o o d e s i n t e r i a a m i b i a n a , muestran

titi-

l o s s i g n i f i c a t i v o s de a n t i c u e r p o s s é r i c o s . l o s que se han .demostrado p o r p r u e b a s de: h e m a g l u t i n a c i ó n , i n m u n o f l u o r e s -

c e n c i a , p r e c i p i t a c i ó n en g e l e i n m u n o e l e c t r o f o r é s i s c r u z a -

da ( 24-27 )

En a l g u n o s p a c i e n t e s p o r t a d o r e s de q u i s t e s de Endamg ~ Q Q

hiAtotyt¿ca,

e l p a r á s i t o puede cambiar de comenzal a

-

p a r á s i t o , e i n v a d i r l a mucosa i n d u c i é n d o l a p r o d u c c i ó n l o

-

c a l de I g A en e l i n t e s t i n o , e s t o ha s i d o demostrado p o r l a

p r e s e n c i a de c o p r o a n t i c u e r p o s a n t i a m i b i a n o s ( 28-32 ) y

-

también l a s í n t e s i s de a n t i c u e r p o s s é r i c o s .

L o s f a c t o r e s que cambian

e s t e

cambio s ú b i t o en l a c o g d u c t a d e l p a r á s i t o son c o m p l e j o s , p e r o es p o s i b l e que i n v g l u c r e mecánismos e n z i m á t i c o s de a c t i v i d a d de una p r o t e a s a

excretada p o r l a Endamoega

hihtolytica

específica para l a I g A . Como o c u r r e con o t r o s p a t ó g e n o s a d h e r e n t e s , l a p r g

-

d u c c i ó n de una p r o t e a s a e s p e c í f i c a c o n t r a I g A p o d r í a cons=

(9)

t i t u i r un f a c t o r i n p o r t a n t e en l a v i r u l e n c i a de l a endamog

fla

h i n t o e y a i c a , r e l a c i o n a d o ccn l a adhesión y c o l o n i z a c i ó n d e l i n s t a s t i n o p o r l a s amibas.

E l c o n t a c t o con l a mucosa o l a p r e s e n c i a da t r o f c z o i t o s de Endamoefla h ¿ c t c e y t ¿ c a en l h l u z i n t e s t i n e l , induce l a producción l o c a l de I g A y a n t i c u e r p o s E é r i c o s , que no

-

son capaces ~e e l i m i n a r 21 p a r á s i t o

Itid

v i v o " .

Con e s t o s a n t e c e d e n t e s , nos i n t e r e s ó i n v e s t i g a r l a

-

p r e s e n c i a de una F r o t e a s a e s p e c í f i c a pare

l e

I g A en t r o f g -

z o i t o s y sobrenadante d e l ci,lt,ivo de, &damoafla h i h t o t y t i c a

083ETI V O S :

Demostrar I t i n v i t r o " l a e x f s t e n c j s da m a p r o t e a s a

-

e s p e c i f i c a c o n t r a I g A producida p o r l o s t r o f o z o i t o s y e l 1 medio de c u l t i v o d e ¿ndamoe8a h i n t a l y t i c a .

H a l l a r los! u g t c d o s adecuados de F c r i f j c a c i Ó n d e í l a

-

I g A p r o c e d e n t e d e t r e s f u e n t e s :

Suero

normal humano, suero

de p a c i e n t e con M e l o m a y C a l o s t r o humano.

P r o b a r métodoe Ce p u r i f i a c i ó n p a r c i a l de l a p r o t e a s e en e l medio de c u l t i v o de o n d a a o e h h i n f o e y t i c a .

i

(10)

1 1 . ) M A T E R I A L Y METODOS

1.-

Obtención de I g A s é r i c a y de mieloma.

( T h c n i c n 1

I

A ) P r e c i p i t a c i ó n con s u l f a t o de amonio

E l suero normal s e obtuvo a p a r t i r de una unidad de I

sangre p e r i f é r i c a ; de un i n d i v i d u o sano, donador d e l Banco C e n t r a l de Sangre d e l

C.M.N,

c e n t r í f u g a n d o a 1,000 X g du-'

-

r a n t e 20 minutos. E l plasma d e mieloma t i p o 1,914 f u é o b t e -

-

n i d o d e un p a c i e n t e d e l H o s p i t a l de Oncología d e l C.M.N

me

d i a n t e p l a s m a f é r e s i s . A l sobrenadante se ñ e c u a n t i f i c a su volumen en una p r o b e t a y s e l e añade 1.0 m l de CaC12 1.0

M

p o r cada 100 m l d e plasma ( para e l i m i n a r e l f i b r i n ó g e n o )

y/Ó 0.4 m l de d e x t r á n s u l f a t o de s o d i o a l 1 0 % p o r cada 100 m l de suero ( p a r a e l i m i n a r l i p o p r o t e í n a s ) . E l plasma Ó

-

suero (según sea e l caso) e s almacenado a 4 O C durante toda

l a noche en p l a n o h o r i z o n t a l (para incrementar l a super-- c i e de c o n t a c t o e h t r e e l suero Ó plasma con: e l CaC12 y e l

dextrán s u l f a t o d e s o d i o ) , l a muestra es c e n t r i f u g a d a a

-

1,000 X g p o r 20 minutos para e l i m i n a r e l sedimento: e l

-

c u a l e s t á c o n s t i t u í d o p o r f i b r i n ó g e n o y l i p o p r o t e í n a s . E l suero s i n l i p o p r o t e í n a s s e l e determina su c o n t e n i d o p r o

-

-

t e f c o p o r e l método de Lowry ( T h c n i c n 2 ) y se procede a

s a t u r a r con s u l f a t o d e amonio hasta l o g r a r una c o n c e n t r s

-

ciÓn de 1.8 M (que e q u i v a l e a una s a t u r a c i ó n d e l

34%).

La s a t u r a c i ó n puede r e a l i z a r s e con e l r e a c t i v o s ó l i d o como

-

con una s o l u c i ó n saturada: en e l primer caso s e hace uso

-

de l a t a b l a d e s a t u r a c i ó n ( T u B ~ Q I

I

Ó d e l Nomograma d e

-

DixÓn T u B h 2

I

.

En

e l segundo caso, s e añade 1/3 d e l

volumen d e l suero d e s o l u c i ó n saturada de s u l f a t o de amo

-

n i o p o r 2/3 p a r t e s d e suero: ~ l a a d i c i ó n d e l s u l f a t o de amo n i o ( s ó l i d o O en s o l u c i ó n )

f u é

l e n t a y con a g i t a c i ó n magné

-

tics c o n s t a n t e , se a j u s t ó e l pH a 7.8 mediante l a a d i c i ó n

-

-

(11)

*-

.

.s

de NaOH 2 N.

do p o r un l a p s o e n t r e 30 y 60 minutos. La s u s p e n d ó n f u é c e n t r í f u g a d a a 1.000 X g durante 30 minutos a temperatura ambiente. E l sedimento ( p a q u e t e de gamma g l o b u l i n a s ) se

-

resuspendió en B u f f e r de Tris-HC1 15 mM pH 8.0 hasta r e c g p e r a r e l volumen i n i c i a l . E l p r o c e s o de s a t u r a c i ó n se rea l i z ó t r e s v e c e s , para e l i m i n a r c a n t i d a d e s a p r e c i a b l e s de -. albúmina. E l t e r c e r sedimento además de s e r resuspendido f u é d i a l i z a d o f T é c n i c a 3

I

exhaustivamente c o n t r a e l

mis-

m o B u f f e r usando una membrana de "Espectrapor 2" y en una r e l a c i ó n V:V 1:50-100 durante 1 8 horas a

4

C y con f r e c u e n t e s recambios hasta que l a prueba de s u l f a t o s f PnueBa 7

I ,

f u é n e g a t i v a . E l sobrenadante se sometio a l a s s i g u i e n t e s pruebas: c u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s , inmunodifusión en

-

c u a n t i f i c a c i ó n de gamma g l o b u l i n a s p o r inmunodifusión ra

-

-

Después d e a j u s t a r e l pH

se

continuo a g i t a n -

r

O

g e l

í

T h c n i c a 4

I *

i n m u n o e i e c t r o f o r é s i s

í

T é c n i c a 5

I ,

-

d i a l .

B ) P u r i f i c a c i ó n d e I g A s é r i c a y de mieloma por: C r o m a t o g r a f í a de I n t e r c a m b i o I Ó n i c o

I

T é c n i c a 6

I

Una muestra de 1-2 g de p r o t e í n a f u é cromatografiada

DEAE-Sephadex A-50 y eluada con un g r a d i e n t e l í n e a 1 de

-

NaCl de 0.0 a 3.0

M

en B u f f e r de Tris-HC1 15 mM pH 8.0 y

-

un f l u j o de 0.5 a 1.5 ml/min ( i n i c i a l y f i n a l r e s p e c t i v a

-

-

mente). E l eluado se c o l e c t ó en f r a c c i o n e s de 10.0 m l ob-

t e n i é n d o s e l a g r á f i c a c o r r e s p o n d i e n t e mediante una c e l d a

-

de 1.0 m l y una densidad Ó p t i c a a 280 nm.

A

cada f r a c c i ó n obtenida se l e h i z o inmunodifusión contra a n t i s u e r o e s p e c i f i c o para I g A . Las f r a c c i o n e s o b t e n i d a s de I g A

se

conceE- t r a r o n p o r u l t r a f i l t r a c i ó n

í

T h c n i c a 7

I

con una membrana de "Amicon

XM-lOO",

b a j o una p r e s i ó n de

3.5

Kg/cm

.

E l

--

en una columna de v i d r i o d e 3.0 X 40 cm; empacada con

-

-

2

(12)

c

concentrado

s e

d i a l i z ó en membrana "Espectrapor 2" contra agua d e s t i l a d a en una r e l a c i ó n V:V 1:50 durante 18 horas

-

con c o n s t a n t e s recambios, l a f i n a l i d a d de é s t a d i á l i s i s e s

l a e l i m i n a c i ó n d e l NaCl p o r l o que s e dá como concluída

-

P o s t e r i o r m e n t e de l a d i á l i s i s s e p r o c e d i ó a l i o f i l i z a r

-

( T h c n i c u 8

I

cuando l a prueba d e c l o r u r o s

e s

n e g a t i v a

I

PaueBn 2 ).

-

2.- Obtención de IgA s e c r e t o r a p r o c e d e n t e de c a l o s

-

t r o humano

A )

P o r

f i l t r a c i ó n e n g e l

L a s muestras de c a l o s t r o humano f u e r o n c o l e c t a d a s

-

de p a c i e n t e s p o s t - p a r t o d e l H o s p i t a l d e G i n e c o o b s t e t r i c i a d e l C.M.N; l a c o l e c c i ó n

s e

r e a l i z ó manualmente con un

"ti-

r a l e c h e " e s t é r i l . E l p o o l r e s u l t a n t e

se

d i l u y ó 1:2 con

-

NaCl 0.15 M ( s o l u c i ó n .salina i s o t ó n i c a ) y s e c e n t r í f u g o a

15.000 rpm durante una hora a 2OC para e l i m i n a r l f p i d o s y l i p o p r o t e i n a s . Después d e haber c e n t r í f u g a d o s e o b t u v i e

-

ron t r e s capas: un sobrenadante, un sedimrhto y una capa

-

de g r a s a ( c o n t e n i d o p r o t e i c o , c é l u l a s - c a s e í n a y l f p i d o s

-

l i p o p r o t e i n a s r e s p e c t i v a m e n t e ) . Tanto l a capa de grasa c g mo e l sedimento f u e r o n e l i m i n a d o s . E l sobrenadante f u é

re

movido para s e r d i a l i z a d o exhaustivamente en Buffer de

-

Tris-HC1 20 mM con NaCl a l 2% y pH de 8.2 en una r e l a c i ó n V:V 1:lOO con c o n s t a n t e s recambios, durante 18 horas y a

-

4 O C . La muestra de c a l o s t r o d i a l i z a d a

se

l e c u a n t i f i c ó : c o n t e n i d o p r o t e í c o , c o n t e n i d o de c a r b o h i d r a t o s ( T é c n i c a 9 )

y c o n c e n t r a c i ó n d e gamma g l o b u l i n a s .

En una columna de v i d r i o de 3.0 X 40 cm empacada con Sephadex C-200. se a p l i c ó una muestra de c a l o s t r o c l a r i f - cado c o r r e s p o n d i e n t e a l

4%

d e l volumen t o t a l de l a columna

Ó b i e n en una c o n c e n t r a c i ó n d e 100 a 200 m g de p r o t e í n a .

I

(13)

< .

. I

I .

I .

.

1.

1 g e l f u é e q u i l i b r a d o con B u f f e r de Tris-HC1 20 mM con NaCl a l 2% y pH de 8.2

baño maría a 50°C curante

5

horas en agua d e s t i l a d a , p a r a e l i m i n a r d e x t r a n a s s o l u b l e s y poder e q u i l i b r a r con e l Bg

-

f f e r . La muestra f u é e l u i d a con e l mísmo B u f f e r obtenién- do f r a c c i o n e s de 5.0

ml.

L a s f r a c c i o n e s r i c a s en I g A fue-

-

ron determinadas p o r inm.unodifusiÓn en agarosa a l 1 % en

-

B u f f e r de B a r b i t a l pH 8.6

$

f u e r z a i ó n i c a de 0.05, y a n t i - sur0 e s p e c í f i c o para I g A s e c r e t o r a ( * ) : de l a s c u a l e s s e

-

h i z o un p o o l que se c o n c e n t r ó p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en meg

-

brana "Amicon XM-50" y una p r e s i ó n de

3.5

Kg/cm

.

E l coz- centrado s e d i a l i z ó c o n t r a agua d e s t i l a d a a LoC durante 18 horas con recambios c o n s t a n t e s , p o r Último l a muestra

f u é

l i o f i l i zada.

-

E l Sephadex G-200 s e p r e p a r ó en

-

2

( * ) E l a n t i s u e r o e s p e c í f i c o p a r a l a IgA, s e c r e t o r a

-

f u é donado p o r e l

Dr:

Gustavo A c o s t a d e l Departamento de I n v e s t i g a c i ó n d e l C.M.N.

B ) Obtención d e l componente s e c r e t o r p o r cromg- t o g r a f í a d e Inmunoadsorción

I

T é c n i c a 10 )

D e l t e r c e r p i c o de l a f i l t r a c i ó n d e l c a l o s t r o en Se- phadex G-200 y con una r e a c c i ó n p o s i t i v a de inmunodifusión en g e l c o n t r a I g A s e c r e t o r a ; s e concentró a 1/10 d e su v o lumen o r i g i n a ñ p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en una membrana de "Ami con XM-3OIt b a j o una p r e s i ó n de

3.5

Kg/cm

.

La muestra c o g centrada s e d i a l i z ó c o n t r a B u f f e r de f o s f a t o s a l i n o (PBS) 0.25 M y pH 7.2 con NaN3 a l 0.03% en una membrana "Espec

-

t r a p o r 2" en una r e l a c i ó n

V:V

1: 100 y a g i t a c i ó n magnética

E l inmunoadsorvente (Anti'' 2gh s e c r e t o r a acoplada a

-

-

-

-

2

-

Sepharosa LE) s e empacó p o r gravedad en una columna de 1 0

(14)

'0

m l ( j e r i n g a ) . Se e q u i l i b r ó con 50

m l

d e PBS f r i o .

L a muestra d i a l i z a d a s e a p l i c ó a l a columna de inmu- noadsorción. se l a v o con Pbs r e c i c l a n d O l a s primeras t r e s f r a c c i o n e s ( p a r a i n c r e m e n t a r l a c a n t i d a d de componente

se-

c r e t o r pegado a l a n t i c u e r p o a n t i I g A s e c r e t o r a de l a c o

-

lumna. con t i o c i a n a -

-

t o de amonio

(NH

SCN) 1.5 M en B u f f e r de PBS pH d e

6.8,

c o

-

l e c t a n d o f r a c c i o n e s de 2.0 m l .

l a e l u s i ó n de l a muestra se r e a l i z ó

4

L a s f r a c c i o n e s con componente s e c r e t o r ( d e t g a c t a d a s por inmunodifusión con a n t i I g A s é r i c a y s e c r e t o r a ) f u e r o n concentradas p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en membrana "Amicon XM50tt

2

y una p r e s i ó n de

3.5

Kg/cm

:

e l concentrado se d i a l i z ó con t r a PBS 0.15 M y pH 7.2 en una r e l a c i ó n V:V 1 : l O O y se guardo en c o n g e l a c i ó n .

-

3.-

Organismos

Se u t i l i z a r o n t r o f o z o i t o s d e endantoela h i n t o e y t i c a

-

de l a cepa H K - 9 ; l o s c u a l e s f u e r o n c u l t i v a d a s axénicamente

en medio TPS ( * )

( * ) C u l t i v a d a s en e l Departamento de B i o l o g i a C é l u

- -

l a r d e l Cnetro de I n v e s t i g a c i ó n y E s t u d i o s Avanzados d e l 1.P.N

L a s amj-bas f u e r o n separadas d e l medio de c u l t i v o p o r c e n t r i f u g a c i ó n a 400 X g durante 20 minutos, ajustando su c0ncentraciÓn.a 1

X

l o 6 células/ml en medio de c u l t i v o .

-

Sometiéndolas a c o n g e l a c i ó n e n

N 2

l í q u i d o para su uso pos-

t e r i o r

.

-

Se tomaron a l í c u o t a s de 1.0 m l ; una de e l l a s se l e

-

t r a t ó con T r i t Ó n X-100 a l 1 % (en B u f f e r de Tris-HC1 50 mM

_I

(15)

pH 8.1) en baño maria a 3 7 O C durante 30,60,90 y 180 m i n u

- -

t o s , a l a o t r a s o l o se l e t r a t ó con B u f f e r b a j o l a s mísmas c o n d i c i o n e s . Se p r o c e d i ó a c e n t r í f u g a r a 400 X g durante- 20 minutos o b t e n i é n d o : un sedimento ( paquete c é l u l a r , trg tad0 y no t r a t a d o con T r i t Ó n X-100) y un sobrenadadnte (me

-

d i o de c u l t i v o t r a t a d o y no t r a t a d o )

I

4.-

P r e p a r a c i ó n de l a P r o t e a s a d e I g A

E l sobrenadante d e l medio d e c u l t i v o d e

las

amibas

-

se p r o c e s o p o r dos métodos:

A )

P o r

u l t r a f i l t r a c i ó n . ( E 11)

E l sobrenadante l i b r e de amibas, s e u l t r a f i l t r ó 2 en membrana "Amicon

XM-50"

b a j o una p r e s i ó n de 2.2 Kg/cm

reduciéndo a l a 1/10 p a r t e d e l volumen i n i c i a l : p o s t e r i o r - mente s e d i a l i z ó c o n t r a B u f f e r de Tris-HC1 50

m M

pH 8.1

B)

P o r

s a t u r a c i ó n . ( E I )

E l sobrenadante d e l medio de c u l t i v o 6e s a t u r ó a l 30% con s u l f a t o de amonio, p o s t e r i o r m e n t e a l 601, e l s e

-

dimento o b t e n i d o de a i s l ó p o r c e n t r i f u g a c i ó n a 1,000

X

g

-

durante 30 minutos. E l sedimento s e resuspendió en s o l ;

-

ciÓn s a l i n a i s o t ó n i c a hasta o b t e n e r 1/80 d e l volumen o r i g 2 n a l , p o s t e r i o r m e n t e f u é sometido a d i á l i s i s c o n t r a solu

- -

ciÓn i s o t ó n i c a hasta l o g r a r que l a prueba de s u l f a t o s fue-

-

r a n e g a t i v a . Después de l a d i á l i s i s l a muestra s e l l e v ó

-

a 1/20 d e l volumen o r i g i n a l con s o l u c i ó n s a l i n a i s o t ó n i c a y s e s a t u r ó a 70% con acetona a 4 O C en donde e l sedimento

f u é

resuspendido en B u f f e r de tris-HC1 50 m M pH 8.1

centésima d e l volumen i n i c i a l , d i a l i z a n d o en r e l a c i ó n V:V 1 : l O O

a una

d u r a n t e 18 horas a AoC c o n t r a e l mísmo B u f f e r .

(16)

5.- I g A como s u s t r a t o

Se prepararon p o r d u p l i c a d o s o l u c i o n e s de I g A proc- dentes de t r e s fuentes: sur0 normal humano, plasma de

mig-

loma y c s l o s t r o ; a una c o n c e n t r a c i ó n de 5.0 mg/ml en Bg

-

f f e r de 'Tris-HC1 50 mM pH 8.1 La e s t a n d a r i z a c i ó n s e reg-

lid

p o r -inmunodifusiÓn r a d i a l y n e f e l o m e t r f a .

B

6.-

Determinación d e l a r e l a c i ó n Óptima Ag/Ab

( 7 h c n i c a 7 7

I

E l , o b j e t i v o de é s t a d e t e r m i n a c i ó n f u é e l e v i t a r e l

-

exceso d e a n t f g e n o o a n t i c u e r p o en l a e l e c t r o f o r é s i s .

I g A ' ( a n t í g e n o ) s e probó c o n t r a a n t í I g A s é r i c a (en e l caso de I g a p r o c e d e n t e de suero normal humano y de plasma de

-

mieloma), y a n t i I g A s e c r e t o r a para c a l o s t r o .

La

E l a n t i s u e r o a n t i I g A s é r i c a

f u é

o b t e n i d a de l o s Lg- b o r a t o r i o s Bohering.

En p l a c a s de l u c i t a en formade U

s e

h i z o una d i l u -

- -

c i ó n en s e r i e 1;2 de e l a n t í g e n o con B u f f e r de Tris-HC1 50

m M

pH

8.1, s e incubó a 37'C durante 60 minutos.

tiempo se h i z o una p l a c a d e a g a r o r a a l 1% en B u f f e r de Bar

b i t a 1 pH 8.6 y f u e r z a i ó n i c a de 0.01 con un e s p e z o r de 2

-

m m , a l a que s e l e h i c i e r o n p e r f o r a c i o n e s de 2 mm en l a

-

p a r t e c e n t r a l y dos c a n a l e s en l o s extremos ( p a r t e s u p e r k or e i n f e r i o r ) E n L o s o r i f i c i o s c e n t r a l e s s e d e p o s i t ó sobre

-

nadante de l a mezcla Ag/Ab incubado, e l canal s u p e r i o r s e i i e n o con a n t í g e n o y e i i n f e r i o r con e i a n t i c u e r p o y s e

-

contínuo incubando a temperatura ambiente durante 18 horas A l mismo

-7.- D i g e s t i ó n e n z i m á t i c a " i n u i t a o ' de I g A

( T é c n i c a 72 I

(17)

e - ,

E s t e p r o c e s o se e f e c t u ó con l a f i n a l i d a d d e t e n e r l a degradación d e l a molécula de I g A que p u d i e r a s e r v i r como r e f e r e n c i a d e l a a c t i v i d a d p r o t e o l í t i c a .

A 100 mg de I g A “se l e añadió 1.0 mg de t r i p s i n a ,

-

0.01 M de c i s t e í a n a en 10 m l de B u f f e r de f s o f a t p s 0.1 M

-

pH

7.6.

Se incubó en un baño a temperatura constante a

-

37OC durante 72 horas; ‘durante(i1as que s e tomaron muestras a 1

y

2 h o r a s , añadiéndo yodacetamida a l 0.1% como inhibL-

dor de l a p r o t e ó l i s i s ; l a s muestras o b t e n i d a s s e c o n g e l g

-

ron hasta e l momento de l a l e c t r o f o r é s i s .

I

8.- D e t e c c i ó n de l a a c t i v i d a d de p r o t e a s a contra I g A

Se incubaron volumenes i g u a l e s de l a s s o l u c i o n e s de I g A

(50111)

de l a s t r e s f u e n t e s ( s é r i c a , mieloma y c a l o s

-

t r o ) a una c o n c e n t r a c i ó n de 5.0 mg/ml con: A ) t r o f o z o i t o s de E n d u n o e t k h i n t o t y t i c n t r a t a d o s con T r i t Ó n X-100 a l 1%.

B)

t r o f o z o i t o s de EndurnoeBu h ¿ n t o @ y t i c a no t r a t a d o s con

-

TritÓn X-100 a l I % , C ) medio de c u l t i v o p r e c i p i t a d o con

-

s u l f a t o d e amonio

( E

I ) , 0 ) medio d e c u l t i v o concentrado

-

p o r u l t r a f i l t r a c i ó n

( E

1 1 ) . La inaubación s e r e a l i z ó en

baño maria

a

37OC durante 30.60. 120

y

180 minutos.

La a c t i v i d a d p r o t e o l í t i c a s e d e t e c t ó p o r inmunoelec-

-

t r o f o r é s i s en agarosa t i p o

I1

a l

1%

en B u f f e r de b a r b i t a l

pH 8.6 y f u e r z a i ó n i c a d e 0.1; y a n t i s u e r o e s p e c í f i c o pa

-

r a I g A s é r i c a y s e c r e t o r a . E l c o r r i m i e n t o e l e c t r o f o r é t i c o

se

h i z o b a j o l a s s i g u i e n t e s c o n d i c i o n e s : 30 V o l t s , 12-18 miliampers; e l c o n t r o l f u é suero humano Ó c a l o s t r o mezclg-

do con una s o l u c i ó n de a z u l de bromofenol a l 0.01% en e l

-

B u f f e r de c o r r i m i e n t o . L a s p l a c a s o b t e n i d a s f u e r o n f i j a

-

-

das y t e ñ i d a s con a z u l b r i l l a n t e d e Cppmasie R-250.

(18)

1 1 1 .

-

RESULIADOS:

L a columna empacada ( a

3

I!

30 cm) con S e p k d e x A-50; y que f u é empleada p a r e l a p x r i f i c a c i ó n de l a I g A s é r i c a

-

procedmt.e Ce: suero n c r ~ a l humano y suero d e p a c i e n t e con Mieloma t,ipo !IbA t e n í a un volumeri vircic d e 50

ml.

d e t e r n i n a d o n e d i a n t e e x c l u s i ó n d e una muestra de A z u l DFx-

-

t r á n (pol.ímerc d e e!.cva¿c p e s o m o i é c u l a r ) a l 1% en B u f f e r d e corriulitatt> (Tris-ECI 15 mM pH 8) ( G r á f i c a 1 )

Este f u é

De l a muestra de: 1 ) s u e r o de p a c i e n t e con Kioloma

-

o b t e n i d o d e l Hospita.1 de Q n c o l o g í a d e l C.M.K.

IMSS

y

2 )

-

deüpugs d e t r e s p r e c i p i t a c i c n e s con su1fat.c Ce anonio a

-

cica m t u r a c i ó n c1.e :.8

M ;

ai6

l o s s i g u i e n t e s r e s ~ l t a c o s .

-

a )

Por.

El.ef.trofor6si.5,

b)

Mediant.6 determinación de p r o t e i .

-

nas p o r e l uétCdO ¿e Lowry.

ns

P r G t e í n a s t o t s l e s AlbÚmir-a

G l o k u l i n a s A l f a - 1

A l f a - 2 B e t t a

Game. Ab a /mi 10.2 3.1 7 r

‘I

0.38 1.17

4.55

1

.o

0.44

1 2

b a b

mg/rr.l mg / m i ‘ 9 ;&l

4.54 2.8 2.68

0.36 2.54 0.02 0.16 2.02 0.34 0.10

V Comc s e .puede c k s e r v a r en 1.8 t.i<.i-Ia n e t e r i c - r . l a cog-

cerit,ración di: & , r o t e i n a s S E ve b a s t a n t e disminuido después

d e l p r o c e s o d e s a t c r a c i ó n cor el s u l f a t o ae arncnio; e s t e

-

decrsnieritc, e s causado p o r l a e l i m i r ( o c i 6 n $.E> p r c t r í n a s en

-

(19)

e l sobrens.dar~:e, l a s c u a 1 . e ~ no l l e g a n w punto I s o e l é c

-

t r i c o con e s t a c o n c e c i r a c i ó n d e se.1 y p o r

IC

tsnt,c nc I C

-

grsn p r e c i F i t , a r . Es menester hacer not,ar q u e ? e 1 ~ s PI'S- -. t.efnac: s t r i c a s ; l a s

n . 6 ~

abm&n+#ek< Ecn l a s que migran e n

-

l a reKi6n Ec?t;ta y e c t r e e l l a s

s e

encuent.:.a l a I g A .

I g A : I g G I 9 M

n>g/dl. nig/Gl m g i d l Suero d s Kieloma 520 . I 2,200 540

Suero

cor. C?C,E p r e c i p i t . . 3,000 1 , 6 C G 150

Suero con t r e s p r e c . 3,000 7

4U

82

Consi,derando

EI

ccr,t&nj.cc p r c * t e í c o &e

1&

muestrq, se

a.plicÓ ur; volumen d e

4

m l

y u n e c.oncefitr&c:Ón de p r o t e i

-

nac < e 10.7 mg. Se ei.i;c cor, un grn?ier.te i í n s d cor,st;itci

d o por: t:C, ni.: de NaCl 0 . 3 b! en B u f f e r de Tris-HC1 1 5 mlii

-

F H

8 y 150 m l de B u f f e r d6

Tris-EC1

75 ml.; p€i

e.

E l c o r r i -

miento coricj.uy6 con cr- f l u j o de 7 8 m l / h .

Se obt.iivierei 5C f r a c c i o n e s con 100 g o t a s ccide ur.u

-

d t e l ? a s ; l a 4-8 f u é p c e i t j w . pir¿ IgG y d e Ir; IC-36 f u e r o n

p o s i t i v a s y n r h I g A ( F L g u r 6

3)

Se r e a d i z a r c n v a r i c r c o r r i m j ~ n t i - ~ s cbt.eni.éndose un'

-

rend?iriierit.o d e l ei.9

%

y u i x piireza d e l 8 4 % (aetermir.sd«

-

p o r N e f c l o m e t r í a ) .

(20)

S e soc!f;t.i.b a c r o m a t o g r e f í a 6 e I c t . e r c s m b i c I ó n i c o Una.

v!!!cc:?t.aI d e

7 ,

5 u81 d e s u e r o n a m a l . tumaie'c p r e c i p i t s c c

3X

C O L

s ü l f a t o d e amonio

(1.8M)

y una c o a c a t , r a c i Ó n de 1'2.5 i g de cor.t,t?n:dc F r o t e í c c . üsa.ndc. e l mfsnc; gra?cen<,e. l í n e a ) ,

ei

f r a c i o r a m i e n t o sc- r e a l i z o c c n un f l u j o i n i c i a l de

18mlÍk.-

Se x o l a c t a r o n

5s

f r a c c l o c e f i de I C 0 g o t a s c a 2 a una.

Al

i g u a l que e n l a : : ~ p e I a c j C n

d e l

Tuero 6 e p a r i e z t e

COK ~ ; i . e ~ o r n a ; si fra.ccic'nen;ici:.t,c. cie suero c o r m a i hurrario

uan gI.áf2 c.a coli. tre:. m c : c c - t ~ s ( e n t r e m e z c l a d e s ) . En dcends

-

1 8 s dos p r i n t e i . ~ ~ . d i n p I i ; ~ b a 1 x s i t . i v a p a r 6 IgG ( f r a c c i o n e s

5-11 y 17-30) y en i n t e r c e r a S E er.c.~ent.ra

l a

I g H (deterroL

ricdp u.e?iantt? inmLrcd.ifUsiÓn r a d j . 8 1 ) en l a s f r a c c i o n e s

28

e. Ln,

Como e.x.Ferimer,tcs p ~ e l i m i n a r e s se e f e c t u a r o n ~ C E

t é 2

r i c a s 6 e p u r i l ; c a c i & i de l e I g A precedente de calcs:?.rc

hg-

mano; s í n i o g r s r okt.er,ei hi cric.:: r e c u i i a i o s . La,. t é c n i c a s

-

eirplcrics f u e r o n : 1 ) F i l t r a c i ó n en L c : p h a d t x C-20G oluenüo

-

con: a.) Ke.C1

O.'!.¿

K

pH

6..&

,

b) grai2Sent.e l í n e a ? ?.E. KECI

-

C- 0:!4 Ii. er. B u f f e i dri

PBS

(1.:

M

p t 7.2

,

C.: i*Ci! p a d i e - -

t c s c:scslcnodas de Ma C.1 d e 0-2 M en P u f f e r de

Tri

V-BCI. 70

(21)
(22)

*-

.

(23)

T E C N I C A S

(24)

PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO ( 7 h c n i c a 7 )

INTRODUCCION :

Uno de l o s componentes d e l suero son l a s p r o t e í n a s , - l a s c u a l e s se encuentran en una c o n c e n t r a c i ó n d e l

6%.

De

I

acuerdo a su m o b i l i d a d en un campo e l é c t r i c o , e s t a s p r o t e i nas s e c l a s i f i c a n como: a l f a , b e t a y gamma.

Cuando e s t a s se encuentran e l e v a d a s causan h i p e r g s

-

mmaglobulimemia y puede s e r p a t o l ó g i c o . corn0 l o e s e l caso de mieloma m ú l t i p l e y l a macroglobulinemia de Waldestrom.

L a s inmunoglobulinas son un grupo de p r o t e í n a s con

-

p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s y c e r o l ó g i c a s que recientemente han s i d o e s t u d i a d a s extensamente.

C o n s t i t u y e n un grupo h e t e r o g é n e o en cuanto a carga.- masa y a c t i v i d a d , b i o l ó g i c a . Su a i s l a m i e n t o en e n t i d a d e s

-

f i s i c o q u í m i c a s d i s c r e t a s í m p l i c a una sel-ie de problemas y-

e s tema d e i n v e s t i g a c i ó n en a l g u n o s l a b o r a t o r i o s .

'

Los

a n t i c u e r p o s son inmunoglobulinas ( I g C , IgM, I g A I g E e I g D ) y s e encuentran en l a s f r a c c i o n e s b e t a y gamma d e l suero.

.

D e l t o t a l de g l o b u l i n a s s é r i c a s , l a cantidad de a n t i cuerpos es r e l a t i v a m e n t e pequeña, generalemente e s menor

-

a l

10%

d e l t o t a l de p r o t e í n a s de un animal hiperinmuniaado

.

, , ."

,,.,

Las inmunoglobulinas de d i f e r e n t e s e s p e c i e s pueden- mostrar p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s d i f e r e n t e s , p o r l o que e s i m p o r t a n t e c o n s i d e r a r l a f u e n t e d e l m a t e r i a l .

(25)

*-

.

cuerpo en l a f r a c c i ó n p u r i f i c a d a .

i

,

L a s inmunoglobulinas r e p r e s e n t a n a l a s p r o t e í n a s bá-

-

do punto i s o é l e c t r i c o y en e s t o se basan l a mayoría de l o s

I

I

I *I

s i a a s d e l suero. Sus s o l u b i l i d a d e s c o i n c i d e n con su e l e v a

I

métodos de separación.

Los

métodos de s e p a r a c i ó n y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e r

p o r se r e f i e r e n generalmente como e s p e c í f i c o a y no e s p e c i - I

f i c o s .

Aunque l a s g l o b u l i n a s t i e n e n algunas propiedades f i - s i c a s semejantes a l a s inmunoglobulinas, e l p o r c e n t a j e de

pureza ( 100 X g l o b u l i n a con f u n c i ó n de anticuerpo/ t o t a l

de g l o b u l i n a s ) d e l producto f i n a l depende d e l contenido de l a s f r a c c i o n e s c í r c u l a n t e s d e inmunoglobulinas s é r i c a s .

Generalmente l o s métodos no e s p e c í f i c o s dan a l t o s

-

rendimientos y b a j a pureza, en t a n t o i e n l o s e s p e c í f i c o s s e o b t i e n e b a j o rendimiento con mayor pureza.

E l a i s l a m i e n t o y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e r p o s p o r

mé-

-

t o d o s e s p e c í f i c o s t i e n e n un fundamento simple y c o n s i s t e

-

en l a propiedad que t i e n e n los a n t i c u e r p o s de p r e c i p i t a r .

.

En cada caso m e t o d o l ó g i c o , e l complejo r e s u l t a n t e

-

puede s e r d i s o c i a d o a j u s t a n d o e l pH a 3.0, que es l a condi

ciÓn p r e f e r i b l e para l a mayoría d e sístemas antígeno-antL

-

cuerpo y a s í o b t e n e r e l a n t i c u e r p o .

-

(26)

e- 1

1

3

Los a n t í g e n o s s o l u b l e s t i e n e n p r o p i e d a d e s d i f e r e n t e s a l a s de l a s inmunoglobulinas, p o r l o que e l complejo a n t i geno-anticuerpo, ambos pueden s e r removidos mediante p r e c 2 p i t a c i ó n Ó c e n t r i f u g a c i ó n d i f e r e n c i a l . Cuando el a n t í g e n o e s t á en forma i n s o l u b l e , s o l o

se

r e q u i e r e de r e n o v e r p o r c e n t r i f u g a c i ó n .

~ I

L a d i s o c i a c i ó n d e l complejo a n t í g e n o - a n t i s u e r p o acg-

r r e también a pH cercanhs a

9.5;

p e r o , l a d e s n a t u r a l i z g

-

c i ó n en l a s , s o l u c i o n e s a l c á l i n a s , o c u r r e rápidamente, p o r l o que é s t e método t i e n e poco v a l o r .

Aunque e l p r e c i p i t a d o e s p e c í f i c o ( c o m p l e j o i n s o l g

-

b l e ) c o n s i s t e p r i n c i p a l m e n t e d e a n t í g e n o y a n t i c u e r p o , una pequeña p e r o s i g n i f i c a t i v a c a n t i d a d de m a t e r i a l no e s p e c - f i c o también e s t a r á p r e s e n t e

si

no s e toman precauciones.

De p a r t i c u l a r i m p o r t a n c i a e s l a i n c l u c i ó n d e l comple-

mento, p o r e l l o e s n e c e s a r i o

el

"descomplementar" e l ant&-

suero a n t e s de que r e a c c i o n e con e l a n t í g e n o e s p e c í f i c o .

Aunque l a pureza de

los

a n t i c u e r p o s d e l t i p o de l a s

g l o b u l i n a s , generalmente

e s

e l e v a d a s i s e o b t i e n e p o r méto

-

dos e s p e c í f i c o s .

O t r a t é c n i c a para e l a i s l a m i e n t o de a n t i c u e r p o s espg

p r e p a r a c i ó n d e m a t r i c e s i n s o l u b l e s que cog- adecuado unido a e l l a ' c o o v a c í f i c o s

e s

l a

t i e n e n un a n t í g e n o e s p e c í f i c o l e n t em en t e .

E l uso de inmunoadsorventes f u é r e c i e n t e m e n t e a p l i c a

-

da con e l nombre de C r o m a t o g r a f í a p o r A f i n i d a d .

E l a d s o r v e n t e que o r i g i n a l m e n t e f u é u t i l i z a d o f u é un

(27)

d e r i v a d o d e l a c e l u l o s a con un grupo p-amino b e n c í l , e l

c u a l e s f á c i l m e n t e d i a z o n i z a d o acoplando a l o s a n t í g e n o s p r o t e í c o s Ó haptenos.

-

P o s t e r i o r m e n t e se d e s c u b r i o que e l e n l a c e de l a s p r o

t e í n a s e r a un e n l a c e amido con l a c a r b o x i m e t í 1 c e l u l o s a .

I

Se d e s a r r o l l a r o n nuevas t é c n i c a s y su uso

más

exte"- s i v o con l a i n t r o d u c c i ó n de g e l e s de agarbsa y d e x t r a n cg- mo m a t r i c e s .

L a s m o l é c u l a s que ticenen grupos amido l i b r e s s e unen coovalentemente a l o s g e l e s mediante l a a c t i v a c i ó n con

rc-

d i c a l e s de bromuro de cianógeno que atacan a l g e l .

L o s avances t é c n i c o s de l a inmunología y Bioquímica han c o n t r i b u i d o a l entendimiento de l a e s t r u c t u r a de l a mo

-

l é c u l a d e l a n t i c u e r p o .

E l a i s l a m i e n t o y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e r p o s a pap

- -

t i r

de un a n t i s u e r o p o r métodos e s p e c í f i c o s . c o n s i s t e en

-

l a a d i s i ó n d e un a g e n t e p r e c i p i t a n t e d e l a n t f g e n o s o l u b l e

Ó b i e n l a a d s o r c i ó n

del

a n t í g e n o i n s o l u b l e e s p e c í f i c o .

En l a a c t u a l i d a d se cuenta con a g e n t e s p r e c i p i t a n t e s para l a s inmunoglobulinas t a l e s como: e t a n o l , s a l e s ne2

-

t r a s ( s u l f a t o d e amonio. s u l f a t o de s o d i o ) , p r e c i p i t a n t e s complejos ( r i v a n o l , s a l e s de aluminio, f o s f a t o s . sales de zinc).

La p r e c i p i t a c i ó n de l a f r a c c i ó n gamma d e l suero e s p o s i b l e d e b i d o a que e s t a s p r o t e í n a s t i e n e n puntos i s o e l é c tri cos r e l a t i v a m e n t e a l to s.

~~

(28)

e

Cuando l a f r a c c i ó n gamma s e t r a t a con p r e c i p i t a n t e s complejos, s e forman c o m p l e j o s c a t i ó n i c o s i n s o l u b l e s con

--

l a mayoría d e l a s o t r a s p r o t e í n a s s é r i c a s a v a l o r e s d e pH donde l a f r a c c i ó n gamma queda como a n t i g e n 0 soluble ( s i n

-

formar t a l e s c o m p l e j o s ) , p o r

io

que

e s

n e c e s a r i o precip'

-

t a r l a p o r o t r o método; p e r o p r e v i o a e s t o s e r e a l i z a

un

-

p r o c e s o de c l a r i f i c a c i ó n ; e s t e método I m p l i c a una s e r i e

-

de pasod y p o r l o t a n t o v a r i a s t é c n i c a s y en e l l o s e basa

su

poca a p l i c a c i ó n .

Las inmunoglobulinas d i f i e r e n unas de o t r a s , y a

su

v e z de l a s o t r a s p r o t e í n a s s é r i c a s en cuanto a su s o l u b i l i dad en s o l u c i o n e s acuosas, é s t a c a r a c t e r í s t i c a puede ser

-

empleada para f r a c c i o n a r l a s en c l a s e s .

Durante mas de 100 años, l a s s a l e s m i n e r a l e s

s e

han a p l i c a d o en l a p r e c i p i t a c i ó n y f r a c c i o n a m i e n t o de l a s p r g - t e í n a s .

Hammarsten y

Méhu

en 1878 f u e r o n l o s p r i m e r o s

en

i n -

-

v e s t i g a r e l e f e c t o de l a p r e c i p i t a c i ó n

n i o . H o f m e i s t e r en 1888 r e a i z ó i n t e r e s a n t e s i n v e s t i g a c i o -

-

nes a c e r c a de l a e f i c i e n c i a de

l o s

aniones y c a t i o n e s como

a g e n t e s : j p r e c i p i t a n t e s y l a s l e y e s f i s i c o q u í m i c a s que r i g e n t a l e s r e a c c i o n e s .

d e l s u l f a t o de amo

-

En

1937

K j e n d a l l f u é e l primero que p u b l i c ó e l méto-

-

do a s e g u i r para l a p r e c i p i t a c i ó n de l a f r a c c i ó n gamma sh- r i c a mediante e l uso d e l s u l f a t o de amonio.

I,.

S i se t r a t a n a l a s gamma g l o b u l i n a s con s a l e s

mine-

r a l e s n e u t r a s , a medida d e que s e incrementa l a concentra- ciÓn s a l i n a en e l medio, e x í s t e una i n t e r a c c i ó n de l a s

mg-

-

~

(29)

?

lécu'ias

de agua con l o s g r u p o s p o l a r e s de l a s moléculas

-

p r o t e í c a s h a c i é n d o l a s c a d a v e z

más

h i d r ó f o b a s l u b i l i e a r l a s .

h a s t a i n s o -

.

L a c o n c e n t r a c i ó n s a l i n a a l a q u e cada p r o t e í n a p r e c i p i t a e s d i f e r e n t e : aunque en e l caso de n o l é c u l a s e s t r e c h a monte r e l a c i o n a d a s como es e l caso ,de

Pa

s i n m u n o g l o b u l i n a s l a d i f e r e n c i a no e s l o s u f i c i e n t e m e n t e g r a n d e como p a r a

-

d a r un p r e c i p i t a d o de g r a n p u r e z a . P o r l o q u e é s t e

m é t -

do se emplea p a r a . c o n c e n t r a r i n m u n o g l o b u l i n a s ,

más

no s e p a

ra a c a d a una de e l l a s como e n t i d a d e s i n d i v i d u a l e s . I

S e ha i n v e s t i g a d o l a i n f l u e n c i a de una

s e r i e

de v a

-

r i a b l e s que i n t e r v i e n e n en l a p r e c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e i -

nas: s a l e s m i n e r a l e s ( c l o r u r o d e s o d i o . s u l f a t o de amonio) f u e r z a i ó n i c a , pH, c o n c e n t r a c i ó n de p F o t e í n a s

y

temperat&-

ra.

En c u a n b a s a l e s m i n e r a l e s . l o s i Ó n e s d i v a l e n t e s :

-

s u l f a t 0 , p r e c i p i t a n a l a hemoglobina

más

e f i c i e n t e m e n t e que e l iÓn monovalente c l o r u r o . E s t e e f e c t o s e l e a t r i b u y e a l a I 1 d e s h i d r a t a c i Ó n " de l a p r o t e í n a p o r l a s a l .

E l s u l f a t o de

amonio

t i n e l a v e n t a j a de que sus s o l u c i o n e s s a t u r a d a s c o n t i e n e n g r a n d e s c a n t i d a d e s de l a s a l y

su

s o l i b i l i d a d depende muy poco de l a t e m p e r a t u r a . S e

re-

comienda u s a r en r e a c t i v o l i b r e de c o n t a m i n a n t e s m e t á l i c o s . p u e s e s t o s i Ó n e s pueden f o r m a r enlaces con a l g u n a s p r o t e i

-

n a s , y a l g u n o s pueden c a t a l i z a r r e a c c i o n e s de o x i d a c i ó n .

E l s u l f a t o de s o d i o t i e n e una s o l u b i l i d a d l i m i t a d a a

b a j a s ~ t e m p e r a t u r a s

.

Algunos a u t o r e s recomiendan e l uso

-

de e s t a s a l a 370C. A 3OoC su a c t i v i d a d p r e c i p i t a n t e e s

-

(30)

u. .

comparable a l a d e l s u l f a t o de amonio. E l s u l f a t o de so

-

d i o p r e s e n t a l a v e n t a j a de no c o n t e n e r n i t r ó g e n o , p o r l o

-

que e v i t a l a d i s t o r c i ó n en l a c u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s .

E l s u l f a t o de magnecio p r e c i p i t a l a f r a c c i ó n de l a s gamma g l o b u l i n a s s é r i c a s . E l c l o r u r o de s o d i o e s usado

-

Únicamente para l a p r e c i p i t a c i ó n de f i b r i n ó g e n o .

I

E l c o n t r o l d e l pH e s un f a c t o r importante en l a prg- c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e í n a s ; no o b s t e n t e s e ha observado

-

I ** que su v a l o r , en e l suero no juega un p a p e l muy i m p o r t a n t e

I ,< en e l f r a c c i o n a m i e n t o con s a l e s mir)erales neutras, p e r o s i

,v* l o e s para e l f r a c c i o n a m i e n t o con e t a n o l .

I:::

1)'. ~ I//"

ip

1"

I.. I. ..

La c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a s en e l medio de precipi- t a c i ó n

,

t i e n e d o b l e e f e c t o : i n f l u y e en

l o s

l í m i t e s d e l a

p r e c i p i t a c i ó n y en l a c o p r e c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e í n a s '

-

acompañantes.

La temperatura no e s tan c r í t i c a para l a p r e c i p i t a

-

c i Ó n de l a s p r o t e í n a s con s a l e s m i n e r a l e s n e u t r a s

, como

l o e s cuando se usa e t a n o l . S i se usan s a l e s m i n e r a l e s no s e r e q u i e r e d e equipo de e n f r i a m i e n t o y puede r e a l i z a r s e

-

a temperatura ambiente.

Cuando s e t r a t a de p r o t e í n a s temosensibles o de r e a 2 c i o n e s e s z i m á t i c a s . es recomendable t r a b a j a r a b a j a s temps r a t u r a s .

Las p r o t e í n a s , t a l e s como: hemoglobina, miosina y

-

l a s s é r i c a s preeentan b a j a s s o l u b i l i d a d e s con calentamien- t o : e s menor a 25OC que a O°C. La mayoría de l a s p r o t e i

-

nas p r e c i p i t a n a temperaturas templadas o f r i a s . E l i n c r g

-

rq

I L..

Referencias

Documento similar

Esta Comisión sugiere aprobar la realización de un llamado a registro de antecedentes para la selección de 4 (cuatro) cargos de Docente Adscriptx Estudiante y/o

Ma´alo´ob ka ts´aabak u jobonilo´ob xunáan kaab naats´ tu´ux yaan xíiwo´ob ku ts´áako´ob kaab yéetel u yiik´el nikte´, ku ts´o´okole´ ka ts´aabak ti´ junp´éel

El objetivo principal del curso es divulgar el mundo del dinero digital, para eso realizamos sesiones teóricas para explicar des- de cero qué son, para qué sirven, cómo conseguirlas

4 En un es- tudio intervencional se evaluó como los factores endocrinos y de la composición corporal están relacionados con la concentración de leptina, 21 evidenciándose que

• Incluir dentro de los conceptos a considerar para la constitución de la reserva de riegos en curso los gastos establecidos en la nota técnica multiplicados por un

La Universidad Privada Antonio Guillermo Urrelo (UPAGU), como una institución que pone dentro de sus prioridades a la investigación, plantea estas políticas para la protección de

ILUSTRE MUNICIPALIDAD DE CALAMA DPTO... CAMINO A CHIU CHIU S/N

Los montos imputados en esta cuenta no podrán permanecer por un plazo superior a los 90 días, transcurridos los cuales deberán transferirse a la modalidad operativa de préstamo a