4 Nombre: Juana Herndndez Hernándcz
T e l é f o n o :
5-33-46-47
M a t r í c u l a :
75117787
Clave:
85-S-O46
I/Carrera : I n g e n i e r o Bioquími co Indu
; t r i a l
T r i m e s t r e : P a s a n t e
,,
Horas semana : Tiempo completo
Lugar: H o s p i t a l de P e d i a t r í a d e l Centro Médico N a c i o n a l IMSS
Fecha de i n i c i o :
6
de Marzo de1985
/Fe cha de t e r m i n a c i ó n :
4
de Septiembre de1985
>
./
Nombre d e l t u t o r : D r : S a l v a d o r M a r t i n e z - C a i r o Cue 3J e f e d e l Departamento de Inmtinología Reumatología y A l e r g i a d e l H o s p i t e l de P e d i a t r í a d e l C.M.N. IMSS
/Título: P r o t e a e a de EndamoeUa h i n f o é y t i c n can e c t i v i d a d s o b r e I g A humana.
,_--
I .
P R O T E A S A DE €ndcmnrBn
hidtolutica
CON C A T I V I D A CSOPEE I g A HUMANA
I . ) I N T R O D U C C I O N :
~i sistema inmune s e c r e t o r humano se l o c a l i z a en:
-
g l á n d u l a s mamarias l a c t a n t e s , i n t e s t i n o delgado, á r b o l r e g p i r a t o r i o , v í a s u r o g e n i t a l e s , g l á n d u l a s l a c r i m a l e s y sal&- v a l e sI
1 , 2 , 3 ) ( F i g .1 )
La mucosa d e l i n t e s t i n o y pulmón c o n t i e n e d npdulos
-
l i n f o i d e s s o l o s o agregados; e s t o s nodulos ( c o n t i e n e nma
L
c r o f a g o s (fió), i o e c u a l e s son c é l u l a s que poseen i a c a p a c idad d e s e l e c c i o n a r
y
t r a n s p o r t a r a n t i g e n o s y materia p a r t i c u l a d a ) e s t a n a s o c i a d o s a l a s mucosas.Los
l f n f o b l a s t o s-
d e l o s nódulos l i n f o i d e s t i e n e n l a t e n d e n c i a de 1 o c a l i a a ~ - s e como p a r t e d e l sistema inmune s e c r e t o r ( F i g .
2).
Se hademostrado que l a r e t e n c i ó n d e l o s l i n f o c i t o s en l o s nÓdg-
los
l i n f o i d e s e s t á a s o c i a d o con e l metabolismo d e l á c i d o-
a r a q u i d ó n i c o ( 4 )
E s t u d i o s en modelos murinos, en donde e s t o s son cog- taminados con gérmemes; i n d i c a que e l c r e c i m i e n t o m i c r o b i a no e s t i m u l a e l d e s a r r o l l o y maduración de l a s c á l u l a s
inmg
nocompetentes de l a lámina p r o p r i a d e l i n t e s t i n o .Como s e ha señalado en r e c i e n t e s r e v i s i o n e s d e l sís- tema inmune s e c r e t o r , l o s a n t i c u e r p o s que s e l o c a l i z a n en l o s l í q u i d o s de l a s mucosas son d e n a t u r a l e z a I g A y son producidos p o r c é l u l a s p l a s m á t i c a s que s e encuentran b a j o l a membrana e p i t e l i a l de l a s mucosas. é s t a s c é l u l a s respon
-
den al a
p r o d u c c i ó n de a n t i c u e r p o s a v a r i o s a n t f g e n o s bas- t e r i a n o s y macromoléculas p r e s e n t e s en l a s u p e r f i c i e de-
l a s mucosas (1.2,3)-
Por
l o que la-X<A t i e n e f u n c i ó n de a n t i c u e r p o para-
a n t f g e n o s de: b a c t e r i a s , virus, t ó x i n a s y macromoléculas
-
I .
._
de l a d i e t a
í
5I
, .
I .
I
..
..
I....
..
i ,. I . I*-
.
aLa s í n t e s i s d e l a I g A p o r b l a s t o s de l o s nódulos
lig-
f o i d e s a s o c i a d o s a mucosas d e g l á n d u l a s mamarias, pueden-
i n d u c i r s e mediante un t r a t a m i e n t o con estrógenos, p r o g e s t c rona y p r o l a c t i n aí
4 )-
f E l h í g a d o p a r e c e tener un p a p e l muy importante en l a
v í a de eiiminacpón de l a I g A . Ya ha s i d o demostrado que l a IgA p o l i m é r i c a (dímero. t r i m e r 0 y t e t r á m e r o ) e s t r a n s p o r t a da r á p i d a y a c t i v a m e n t e c o n t r a g r a d i e n t e de concentración
I en l a b i l i s : en donde e l componente s e c r e t o r actúa como
r e
c e p t o r en l a s u p e r f i c i e sinuosa d e l h e p á t o c i t o , l a IgA e sendocitada y t r a n s p o r t a d a d e n t r o de v e s í c u l a s que s e f u s i g nan en l a membrana c a n i c u l a r b i l i a r , en donde l a IgA e s
-
descargadaI
6 )I
E s t u d i o s r e c i e n t e s i n d i c a n que l o s a n t i c u e r p o s de l a c l a s e IgA p r e v i e n e n e l a c o p l a m i e n t o de microorganismos pa- tógenos a d h e r e n t e s en l a s c é l u l a s e p i t e l i a l e s d e l huésped. Esta i n h i b i c i ó n d e l a a d h e r e n c i a d e
los
microorganismos al a s c á l u l a s e p i t e l i a l e s puede s e r d e gran importancia en
-
l a d e f e n s a inmune; a l e v i t a r que l o s patógenos adherentes puedan c o l o n i z a r al o s
t e j i d o s d e l huésped. i n v a d i r l o s y-
causar enfermedad I
I
7 . 8I
Las inmunoglobulinas westán compuestas p o r cadenas p o l i p é p t i d i c a s que s e r e p l i e g a n para formar dos r e g i o n e s
-
g l o g u l a r e s ; l a r e g i ó n F a S , o p o r c i ó n de l a molécula que se une a l a n t í g e n o , y l a r e g i ó n T c , o p o r c i ó n responsable d e l a s f u n c i o n e s b i o l ó g i c a s t a l e s como: ? ¿ j a c ¿ 6 n d e C o m p í e m e E t o y a c o p L a m i e n f o Q l a b c h l u l a b f a g o c ¿ L ¿ c a b ( 9 , 7 0I.
l a s inmunoglobulinas con enzimas p r o t e o l í t i c a s , t a l e s como Estas dos r e g i o n e s pueden s e r separadas a l t r a t a r a
I
*-
-
I1
i
I
4
papafna, t r i p s i n a y q u i m i o t r i p s i n a .
Por
e l l o son de c o n s i,
d e r a b l e i n t e r é s l o s h a l l a z g o s d e l e f e c t o delas
enzimas demicroorganismos patógenos adherentes capaces de degradar a l a I g A en f r a g m e n t o s Full
/-)
y F c(-I:
en v i s t a de l a i m- -
' ,1
~
1
p o r t a n t e f u n c i ó n de l a I g A s e c r e t o r a en l o s mecanismos de inmunidad.
f
L a s p r o t e a s a s de I g A fueron d e s c u b i e r t a s después de l a o b s e r v a c i ó n de fragmentos 7 c
(-0
en m a t e r i a f e c a l ( 1 1 3 La i d e n t i f i c a c i ó n de fragmentos F c(&I
en e l moco d e l c g-
l o n s u g i r i ó l a p r e s e n c i a de una proteasa capaz de romper a l a molécula d e I g A ; p e r o incapaz de continuar degradando L a l fragmento Fc 1-C) de l a mismaf
11I
La p r o t e a s a de I g A , e s una endopéptidasa metalode
- -
p e n d i e n t e e l a b o r a d a p o r c i e r t a s b a c t e r i a s e e r ó b i c a s l o c a l i-
zadas en l a c a v i d a d o r a l , t r a c t o g a s t r o i n t e s t i n a l y genL- t o u r i n a r i o humano. Esta enzima rompe a l a I g A humana sé-ca y s e c r e t o r a e n l a r e g i ó n s e n s i b l e ( l a r e g i ó n de l a b i s g g r a ) produciéndo fragmentos
7 u B
í*)
y ' F c / d ) : y e s i n a c t i --
va c o n t r a o t r a c l a s e de inmunoglobulina. Su a c t i v i d a d p r g t e o l í t i c a ha s i d o evaluada con o t r a s p r o t e í n a s y p é p t i d o s como: c a s e í n a , g e l a t i n a , colágena de tendón bovino, en dog de ha s i d o n e g a t i v aI
12I
La e s t r u c t u r a p r i m a r i a de l a r e g i ó n de l a b i s a g r a de p r o t e í n a s de I g A humana p r o c e d e n t e s de mieloma muestran un contenido poco usual en cantidades de: p r o l i n a , s e r i n a y
-
t r e o n i n a ;que
son l o s aminoácidos s e n s i b l e s a l e f e c t o h i-
d r o l í t i c o d e l a p r o t e a s a de I g A ( 12 )Aunque l a I g A humana puede también s e r h i d r o l i z a d a
-
p o r algunas enzimas p r o t e o l í t i c a s elaboradas p o r m i c r o o r g g nismos: p r o t e a s a n e u t r a l de d n c i l l u n n u l l t i l i b . t e r m o l i s i n aI
4
_ -
y
pronasa; e s t a s enzimas rompen al a
IgA pero s o l o en e l-
fragmento T U B ( 4 ) puede s e r recuperado i n t a c t o , en t a n t o-
que e l fragmento ? c (a) e s enzimáticamente degradado a péE t i d o s,más
pequeños ( e s t o o c u r r e b a j o l a s mismas c o n d i c i g-
nes de p r o t e ó l i s i s de l a p r o t e a s a e s p e c í f i c a de I g A ) ( 7 7 )
-
Observaciones s i m i l a r e s en l a a c t i v i d a d h i d r o l f t i c a de la' I g A o c u r r i e r o n en l a s a l i v a humana y en e l t r a c t o d& g e s t i v o . en l a s qud s e s u g i r i ó que e l o r i g e n de l a enzima era b a c t e r i a n o 1 9I
I
r P o s t e r i o r m e n t e s e demostró que
los
patógenos adhere2t e s : S t a e p t o c o c c u h h U n g u ¿ h , #e¿hhen¿a g o n o a n h o n e , 1. m e n ¿ &
g i t i d i h , Pheudomonn o u a u g i n o n a , H u e n , o p h ¿ h b ¿ n f ! l u e n r a e ,
-
H . a e g y p t i u a y S. p n e w n o n i a e s i n t e t i z a n una proteasa para l a IgA ( 12-20).
Muchas o t r a s e s p e c i e s b a c t e r i a n a s no producen e s t a
-
p r o t e a s a para l a I g A . L a s p r o t e a s a s de S ~ ~ Q ~ ~ O C O C C U A A Q ~-
gu¿h y N e i h h e n i a gonoaahoae s e han p u r i f i c a d o p a r c i a l m e n t e de sobrenadantes de medio de c u l t i v o b a c t e r i a n o , mostrando una gran e s p e c i f i c i d a d para l a I g A ; e s t a s p r o t e a s a s son ca paces de fragmentar e s p e c i f i c a m e n t e a l a IgA s é r i c a humana ( p u r i f i c a d a de p a c i e n t e s con mieloma) y a l a I g A s e c r e t o r a
,
i !
Dos
t i p o s de IgA ( I g A 7 - e I g A 2 ) s e han p u r i f i c a d o d e l suero humano y en s e c r e c i ó n ( 271.
Las p r o t e í n a s de I g A 7e I g A 2 exhiben muchas r e a c c i o n e s e n t i g é n i c a s cruzadas, e - t o i n d i c a que hay una d i f e r e n c i a e s t r u c t u r a l s i g n i f i c a t i v a
La p r o t e a s a de I g A es e s p e c í f i c a para e l t i p o I g A 7
-
produciéndo fragmentos F a & f e ) y F c (4 en t a n t o que l a-
I g A Z e s r e s i s t e n t e ; aún con t r a t a m i e n t o enzimático p r o l o n g a do ( 2 7I
4
El
e n l a c e p é p t i d i c o s u c e p t i b l ea
l a p r o t e ó l i s i s e s :La r e s i s t e n c i a a l a p r o t e ó l i s i s de l a I g A 2 s e p r o l i n a
-
t r e o n i n a l o c a l i z a d a en l a r e g i ó n de l a b i s a g r a-
de l a I g A .debe
a :
un p l e g a m i e n t o de doce aminoácidos en l a regi6h-1-
de l a b i s a g r a d e l a cadena pesada ( l a c u a l i n i c i a con e l-
aminoácido t r e o n i n a d e l e n l a c e p r o l i n a - t r e o n i n a ) ya
l a d if e r e n c i a en c u a n t o a l contenido de c a r b o h i d r a t o s . E l gra-
-
do de p l e g a m i e n t o de l a cadena pesada e s t á determinado p o rl a e s t r u c t u r a p r i m a r i a ,
l a s
r e g i o n e s de p l i e g e de l a I g A le I g A 2 d i f i e r e n s u s t a n c i a l m e n t e en conformación y además
-
en s u c e p t i b i l i d a d a l a t a q u e e n z i m á t i c o . O t r o f a c t o r no mgnos i m p o r t a n t e e s l a p r e s e n c i a o a u s e n c i a de e n l a c e s d i s u 2
f u r o i n t e r c a d e n a ( e n t r e cadenas pesadas y l i g e r a s ) ; e l hc- l o t i p o A m 2 ( - ) c o n t i e n e cadenas l i g e r a s con e n l a c e s d i s u l f g
ro, p o r e l l o e s también r e s i s t e n t e
a
l a p r o t e ó l i s i s .I
-
En e l s u e r o y c a l o s t r o humano, e l 10% de l a I g A y e l 50% r e s p e c t i v a m e n t e son de n a t u r a l e z a I g A 2 . é s t e d a t o ha
-
s e r v i d o p a r a s u g e r i r que e l e n r r i q u e c i m i e n t o de l a s s e c r g - c i o n e s con l a I g A 2l e
dá una v e n t a j a s e l e c t i v a mediante rg s i s t e n c i a a l a p r o t e a s aí
2 2I
La p r o t e a s a de I g A e s
activa
en un rango de pH de-
6.5
a 8.0 y e s t a b l ea
5 5 O C d u r a n t e una horaí
I 1I
,
su a2
t i v i d a d p r o t e o l f t i c a e s suspendida p o r a d i c i ó n d e á c i d o-
e t i l é n diamino t e t r a c é t i c o(EDTA)
en c o n c e n t r a c i o n e s de-
50 m M ; l a e l i m i n a c i ó n d e l
EDTA
( a g e n t e q u e l a n t e ) median t e d i á l i s i s y l a a d i c i ó n de MnC12. ZnC12 y CoC12 enuna
-
c o n c e n t r a c i ó n d e5
mM r e s t a u r a n l a a c t i v i d a d , m i e n t r a s que e l CaC12 y e l MgC12 en c o n c e n t r a c i o n e s 'de 50 mM r e s t a u r a ns o l o p a r c i a l m e n t e l a a c t i v i d a d . O t r o s c a t i o n e s d i v a l e n t e s como: F e t 2 y Cut2 causan d e s n a t u r a l i z a c i ó n i r r e v e r s i b l e
--
d e l s u s t r a t o d e l a p r o t e a s aI
1 2 . 7 5).
La producción de p r o t e a s a p a r a l a I g A de S i n e p t o c o c c u h h a n q u i h puede s e r e st í m u l a d a mediante l a a d i c i ó n de I g A s e c r e t o r a e s t é r i l , p r g c e d e n t e de p a r ó t i d a en una r e l a c i ó n d e l 10% ( 13 )
La d e g r a d a c i ó n de l a I g A i n d u c e l a f o r m a c i ó n de moni meros
F a g
( ) c u y a s c a p a c i d a d e s d e u n i ó na
l o s
a n t í g e n o s ymás
a ú n ;c é l u l a s , e s t á n .reducidas.
l a f i j a c i ó n de complemento y a c o p l a m i e n t o a l a s
I
Ya
se
demostró una c o r r e l a c i ó n e n t r e v i r u l e n c i a y l ap r e s e n c i a de l a p r o t e a s a e s p e c í f i c a p a r a l a I g A ( 1 3 . 1 9 J
En
l a
amYDiasis i n v a s o r a , l o s t r o f o z o i t o s de Endamog&a
h¿Atolytica
a l c a n z a n e l i n t e s t i n o g r u e s o ( 23 ) y pene-t r a n a t r a v é s de l a mucosa i n d u c i e n d o l a s í n t e s i s de a n t l - c u e r p o s s é r i c o s ( 24-27 ). Del 80 a l 100% de p a c i e n t e s
-
con a b c e s o d h e p á t i c o o d e s i n t e r i a a m i b i a n a , muestran
titi-
l o s s i g n i f i c a t i v o s de a n t i c u e r p o s s é r i c o s . l o s que se han .demostrado p o r p r u e b a s de: h e m a g l u t i n a c i ó n , i n m u n o f l u o r e s -
c e n c i a , p r e c i p i t a c i ó n en g e l e i n m u n o e l e c t r o f o r é s i s c r u z a -
da ( 24-27 )
En a l g u n o s p a c i e n t e s p o r t a d o r e s de q u i s t e s de Endamg ~ Q Q
hiAtotyt¿ca,
e l p a r á s i t o puede cambiar de comenzal a-
p a r á s i t o , e i n v a d i r l a mucosa i n d u c i é n d o l a p r o d u c c i ó n l o-
c a l de I g A en e l i n t e s t i n o , e s t o ha s i d o demostrado p o r l a
p r e s e n c i a de c o p r o a n t i c u e r p o s a n t i a m i b i a n o s ( 28-32 ) y
-
también l a s í n t e s i s de a n t i c u e r p o s s é r i c o s .
L o s f a c t o r e s que cambian
e s t e
cambio s ú b i t o en l a c o g d u c t a d e l p a r á s i t o son c o m p l e j o s , p e r o es p o s i b l e que i n v g l u c r e mecánismos e n z i m á t i c o s de a c t i v i d a d de una p r o t e a s aexcretada p o r l a Endamoega
hihtolytica
específica para l a I g A . Como o c u r r e con o t r o s p a t ó g e n o s a d h e r e n t e s , l a p r g-
d u c c i ó n de una p r o t e a s a e s p e c í f i c a c o n t r a I g A p o d r í a cons=t i t u i r un f a c t o r i n p o r t a n t e en l a v i r u l e n c i a de l a endamog
fla
h i n t o e y a i c a , r e l a c i o n a d o ccn l a adhesión y c o l o n i z a c i ó n d e l i n s t a s t i n o p o r l a s amibas.E l c o n t a c t o con l a mucosa o l a p r e s e n c i a da t r o f c z o i t o s de Endamoefla h ¿ c t c e y t ¿ c a en l h l u z i n t e s t i n e l , induce l a producción l o c a l de I g A y a n t i c u e r p o s E é r i c o s , que no
-
son capaces ~e e l i m i n a r 21 p a r á s i t oItid
v i v o " .Con e s t o s a n t e c e d e n t e s , nos i n t e r e s ó i n v e s t i g a r l a
-
p r e s e n c i a de una F r o t e a s a e s p e c í f i c a parel e
I g A en t r o f g -z o i t o s y sobrenadante d e l ci,lt,ivo de, &damoafla h i h t o t y t i c a
083ETI V O S :
Demostrar I t i n v i t r o " l a e x f s t e n c j s da m a p r o t e a s a
-
e s p e c i f i c a c o n t r a I g A producida p o r l o s t r o f o z o i t o s y e l 1 medio de c u l t i v o d e ¿ndamoe8a h i n t a l y t i c a .H a l l a r los! u g t c d o s adecuados de F c r i f j c a c i Ó n d e í l a
-
I g A p r o c e d e n t e d e t r e s f u e n t e s :
Suero
normal humano, suerode p a c i e n t e con M e l o m a y C a l o s t r o humano.
P r o b a r métodoe Ce p u r i f i a c i ó n p a r c i a l de l a p r o t e a s e en e l medio de c u l t i v o de o n d a a o e h h i n f o e y t i c a .
i
1 1 . ) M A T E R I A L Y METODOS
1.-
Obtención de I g A s é r i c a y de mieloma.( T h c n i c n 1
I
A ) P r e c i p i t a c i ó n con s u l f a t o de amonio
E l suero normal s e obtuvo a p a r t i r de una unidad de I
sangre p e r i f é r i c a ; de un i n d i v i d u o sano, donador d e l Banco C e n t r a l de Sangre d e l
C.M.N,
c e n t r í f u g a n d o a 1,000 X g du-'-
r a n t e 20 minutos. E l plasma d e mieloma t i p o 1,914 f u é o b t e -
-
n i d o d e un p a c i e n t e d e l H o s p i t a l de Oncología d e l C.M.Nme
d i a n t e p l a s m a f é r e s i s . A l sobrenadante se ñ e c u a n t i f i c a su volumen en una p r o b e t a y s e l e añade 1.0 m l de CaC12 1.0M
p o r cada 100 m l d e plasma ( para e l i m i n a r e l f i b r i n ó g e n o )y/Ó 0.4 m l de d e x t r á n s u l f a t o de s o d i o a l 1 0 % p o r cada 100 m l de suero ( p a r a e l i m i n a r l i p o p r o t e í n a s ) . E l plasma Ó
-
suero (según sea e l caso) e s almacenado a 4 O C durante toda
l a noche en p l a n o h o r i z o n t a l (para incrementar l a super-- c i e de c o n t a c t o e h t r e e l suero Ó plasma con: e l CaC12 y e l
dextrán s u l f a t o d e s o d i o ) , l a muestra es c e n t r i f u g a d a a
-
1,000 X g p o r 20 minutos para e l i m i n a r e l sedimento: e l-
c u a l e s t á c o n s t i t u í d o p o r f i b r i n ó g e n o y l i p o p r o t e í n a s . E l suero s i n l i p o p r o t e í n a s s e l e determina su c o n t e n i d o p r o-
-
t e f c o p o r e l método de Lowry ( T h c n i c n 2 ) y se procede as a t u r a r con s u l f a t o d e amonio hasta l o g r a r una c o n c e n t r s
-
ciÓn de 1.8 M (que e q u i v a l e a una s a t u r a c i ó n d e l34%).
La s a t u r a c i ó n puede r e a l i z a r s e con e l r e a c t i v o s ó l i d o como-
con una s o l u c i ó n saturada: en e l primer caso s e hace uso-
de l a t a b l a d e s a t u r a c i ó n ( T u B ~ Q II
Ó d e l Nomograma d e-
DixÓn T u B h 2
I
.
En
e l segundo caso, s e añade 1/3 d e lvolumen d e l suero d e s o l u c i ó n saturada de s u l f a t o de amo
-
n i o p o r 2/3 p a r t e s d e suero: ~ l a a d i c i ó n d e l s u l f a t o de amo n i o ( s ó l i d o O en s o l u c i ó n )f u é
l e n t a y con a g i t a c i ó n magné-
tics c o n s t a n t e , se a j u s t ó e l pH a 7.8 mediante l a a d i c i ó n-
-
*-
.
.sde NaOH 2 N.
do p o r un l a p s o e n t r e 30 y 60 minutos. La s u s p e n d ó n f u é c e n t r í f u g a d a a 1.000 X g durante 30 minutos a temperatura ambiente. E l sedimento ( p a q u e t e de gamma g l o b u l i n a s ) se
-
resuspendió en B u f f e r de Tris-HC1 15 mM pH 8.0 hasta r e c g p e r a r e l volumen i n i c i a l . E l p r o c e s o de s a t u r a c i ó n se rea l i z ó t r e s v e c e s , para e l i m i n a r c a n t i d a d e s a p r e c i a b l e s de -. albúmina. E l t e r c e r sedimento además de s e r resuspendido f u é d i a l i z a d o f T é c n i c a 3I
exhaustivamente c o n t r a e lmis-
m o B u f f e r usando una membrana de "Espectrapor 2" y en una r e l a c i ó n V:V 1:50-100 durante 1 8 horas a4
C y con f r e c u e n t e s recambios hasta que l a prueba de s u l f a t o s f PnueBa 7I ,
f u é n e g a t i v a . E l sobrenadante se sometio a l a s s i g u i e n t e s pruebas: c u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s , inmunodifusión en
-
c u a n t i f i c a c i ó n de gamma g l o b u l i n a s p o r inmunodifusión ra
-
-
Después d e a j u s t a r e l pHse
continuo a g i t a n -r
O
g e l
í
T h c n i c a 4I *
i n m u n o e i e c t r o f o r é s i sí
T é c n i c a 5I ,
-
d i a l .
B ) P u r i f i c a c i ó n d e I g A s é r i c a y de mieloma por: C r o m a t o g r a f í a de I n t e r c a m b i o I Ó n i c o
I
T é c n i c a 6I
Una muestra de 1-2 g de p r o t e í n a f u é cromatografiada
DEAE-Sephadex A-50 y eluada con un g r a d i e n t e l í n e a 1 de
-
NaCl de 0.0 a 3.0M
en B u f f e r de Tris-HC1 15 mM pH 8.0 y-
un f l u j o de 0.5 a 1.5 ml/min ( i n i c i a l y f i n a l r e s p e c t i v a
-
-
mente). E l eluado se c o l e c t ó en f r a c c i o n e s de 10.0 m l ob-t e n i é n d o s e l a g r á f i c a c o r r e s p o n d i e n t e mediante una c e l d a
-
de 1.0 m l y una densidad Ó p t i c a a 280 nm.A
cada f r a c c i ó n obtenida se l e h i z o inmunodifusión contra a n t i s u e r o e s p e c i f i c o para I g A . Las f r a c c i o n e s o b t e n i d a s de I g Ase
conceE- t r a r o n p o r u l t r a f i l t r a c i ó ní
T h c n i c a 7I
con una membrana de "AmiconXM-lOO",
b a j o una p r e s i ó n de3.5
Kg/cm.
E l--
en una columna de v i d r i o d e 3.0 X 40 cm; empacada con
-
-
2
c
concentrado
s e
d i a l i z ó en membrana "Espectrapor 2" contra agua d e s t i l a d a en una r e l a c i ó n V:V 1:50 durante 18 horas-
con c o n s t a n t e s recambios, l a f i n a l i d a d de é s t a d i á l i s i s e s
l a e l i m i n a c i ó n d e l NaCl p o r l o que s e dá como concluída
-
P o s t e r i o r m e n t e de l a d i á l i s i s s e p r o c e d i ó a l i o f i l i z a r
-
( T h c n i c u 8I
cuando l a prueba d e c l o r u r o s
e s
n e g a t i v aI
PaueBn 2 ).-
2.- Obtención de IgA s e c r e t o r a p r o c e d e n t e de c a l o s
-
t r o humanoA )
P o r
f i l t r a c i ó n e n g e lL a s muestras de c a l o s t r o humano f u e r o n c o l e c t a d a s
-
de p a c i e n t e s p o s t - p a r t o d e l H o s p i t a l d e G i n e c o o b s t e t r i c i a d e l C.M.N; l a c o l e c c i ó ns e
r e a l i z ó manualmente con un"ti-
r a l e c h e " e s t é r i l . E l p o o l r e s u l t a n t ese
d i l u y ó 1:2 con-
NaCl 0.15 M ( s o l u c i ó n .salina i s o t ó n i c a ) y s e c e n t r í f u g o a15.000 rpm durante una hora a 2OC para e l i m i n a r l f p i d o s y l i p o p r o t e i n a s . Después d e haber c e n t r í f u g a d o s e o b t u v i e
-
ron t r e s capas: un sobrenadante, un sedimrhto y una capa-
de g r a s a ( c o n t e n i d o p r o t e i c o , c é l u l a s - c a s e í n a y l f p i d o s-
l i p o p r o t e i n a s r e s p e c t i v a m e n t e ) . Tanto l a capa de grasa c g mo e l sedimento f u e r o n e l i m i n a d o s . E l sobrenadante f u ére
movido para s e r d i a l i z a d o exhaustivamente en Buffer de
-
Tris-HC1 20 mM con NaCl a l 2% y pH de 8.2 en una r e l a c i ó n V:V 1:lOO con c o n s t a n t e s recambios, durante 18 horas y a-
4 O C . La muestra de c a l o s t r o d i a l i z a d a
se
l e c u a n t i f i c ó : c o n t e n i d o p r o t e í c o , c o n t e n i d o de c a r b o h i d r a t o s ( T é c n i c a 9 )y c o n c e n t r a c i ó n d e gamma g l o b u l i n a s .
En una columna de v i d r i o de 3.0 X 40 cm empacada con Sephadex C-200. se a p l i c ó una muestra de c a l o s t r o c l a r i f - cado c o r r e s p o n d i e n t e a l
4%
d e l volumen t o t a l de l a columnaÓ b i e n en una c o n c e n t r a c i ó n d e 100 a 200 m g de p r o t e í n a .
I
< .
. I
I .
I .
.
1.1 g e l f u é e q u i l i b r a d o con B u f f e r de Tris-HC1 20 mM con NaCl a l 2% y pH de 8.2
baño maría a 50°C curante
5
horas en agua d e s t i l a d a , p a r a e l i m i n a r d e x t r a n a s s o l u b l e s y poder e q u i l i b r a r con e l Bg-
f f e r . La muestra f u é e l u i d a con e l mísmo B u f f e r obtenién- do f r a c c i o n e s de 5.0ml.
L a s f r a c c i o n e s r i c a s en I g A fue--
ron determinadas p o r inm.unodifusiÓn en agarosa a l 1 % en
-
B u f f e r de B a r b i t a l pH 8.6$
f u e r z a i ó n i c a de 0.05, y a n t i - sur0 e s p e c í f i c o para I g A s e c r e t o r a ( * ) : de l a s c u a l e s s e-
h i z o un p o o l que se c o n c e n t r ó p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en meg-
brana "Amicon XM-50" y una p r e s i ó n de3.5
Kg/cm.
E l coz- centrado s e d i a l i z ó c o n t r a agua d e s t i l a d a a LoC durante 18 horas con recambios c o n s t a n t e s , p o r Último l a muestraf u é
l i o f i l i zada.-
E l Sephadex G-200 s e p r e p a r ó en-
2
( * ) E l a n t i s u e r o e s p e c í f i c o p a r a l a IgA, s e c r e t o r a
-
f u é donado p o r e lDr:
Gustavo A c o s t a d e l Departamento de I n v e s t i g a c i ó n d e l C.M.N.B ) Obtención d e l componente s e c r e t o r p o r cromg- t o g r a f í a d e Inmunoadsorción
I
T é c n i c a 10 )D e l t e r c e r p i c o de l a f i l t r a c i ó n d e l c a l o s t r o en Se- phadex G-200 y con una r e a c c i ó n p o s i t i v a de inmunodifusión en g e l c o n t r a I g A s e c r e t o r a ; s e concentró a 1/10 d e su v o lumen o r i g i n a ñ p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en una membrana de "Ami con XM-3OIt b a j o una p r e s i ó n de
3.5
Kg/cm.
La muestra c o g centrada s e d i a l i z ó c o n t r a B u f f e r de f o s f a t o s a l i n o (PBS) 0.25 M y pH 7.2 con NaN3 a l 0.03% en una membrana "Espec-
t r a p o r 2" en una r e l a c i ó nV:V
1: 100 y a g i t a c i ó n magnéticaE l inmunoadsorvente (Anti'' 2gh s e c r e t o r a acoplada a
-
-
-
-
2
-
Sepharosa LE) s e empacó p o r gravedad en una columna de 1 0
'0
m l ( j e r i n g a ) . Se e q u i l i b r ó con 50
m l
d e PBS f r i o .L a muestra d i a l i z a d a s e a p l i c ó a l a columna de inmu- noadsorción. se l a v o con Pbs r e c i c l a n d O l a s primeras t r e s f r a c c i o n e s ( p a r a i n c r e m e n t a r l a c a n t i d a d de componente
se-
c r e t o r pegado a l a n t i c u e r p o a n t i I g A s e c r e t o r a de l a c o-
lumna. con t i o c i a n a -
-
t o de amonio
(NH
SCN) 1.5 M en B u f f e r de PBS pH d e6.8,
c o-
l e c t a n d o f r a c c i o n e s de 2.0 m l .l a e l u s i ó n de l a muestra se r e a l i z ó
4
L a s f r a c c i o n e s con componente s e c r e t o r ( d e t g a c t a d a s por inmunodifusión con a n t i I g A s é r i c a y s e c r e t o r a ) f u e r o n concentradas p o r u l t r a f i l t r a c i ó n en membrana "Amicon XM50tt
2
y una p r e s i ó n de
3.5
Kg/cm:
e l concentrado se d i a l i z ó con t r a PBS 0.15 M y pH 7.2 en una r e l a c i ó n V:V 1 : l O O y se guardo en c o n g e l a c i ó n .-
3.-
OrganismosSe u t i l i z a r o n t r o f o z o i t o s d e endantoela h i n t o e y t i c a
-
de l a cepa H K - 9 ; l o s c u a l e s f u e r o n c u l t i v a d a s axénicamenteen medio TPS ( * )
( * ) C u l t i v a d a s en e l Departamento de B i o l o g i a C é l u
- -
l a r d e l Cnetro de I n v e s t i g a c i ó n y E s t u d i o s Avanzados d e l 1.P.N
L a s amj-bas f u e r o n separadas d e l medio de c u l t i v o p o r c e n t r i f u g a c i ó n a 400 X g durante 20 minutos, ajustando su c0ncentraciÓn.a 1
X
l o 6 células/ml en medio de c u l t i v o .-
Sometiéndolas a c o n g e l a c i ó n e nN 2
l í q u i d o para su uso pos-t e r i o r
.
-
Se tomaron a l í c u o t a s de 1.0 m l ; una de e l l a s se l e
-
t r a t ó con T r i t Ó n X-100 a l 1 % (en B u f f e r de Tris-HC1 50 mM
_I
pH 8.1) en baño maria a 3 7 O C durante 30,60,90 y 180 m i n u
- -
t o s , a l a o t r a s o l o se l e t r a t ó con B u f f e r b a j o l a s mísmas c o n d i c i o n e s . Se p r o c e d i ó a c e n t r í f u g a r a 400 X g durante- 20 minutos o b t e n i é n d o : un sedimento ( paquete c é l u l a r , trg tad0 y no t r a t a d o con T r i t Ó n X-100) y un sobrenadadnte (me-
d i o de c u l t i v o t r a t a d o y no t r a t a d o )I
4.-
P r e p a r a c i ó n de l a P r o t e a s a d e I g AE l sobrenadante d e l medio d e c u l t i v o d e
las
amibas-
se p r o c e s o p o r dos métodos:
A )
P o r
u l t r a f i l t r a c i ó n . ( E 11)E l sobrenadante l i b r e de amibas, s e u l t r a f i l t r ó 2 en membrana "Amicon
XM-50"
b a j o una p r e s i ó n de 2.2 Kg/cmreduciéndo a l a 1/10 p a r t e d e l volumen i n i c i a l : p o s t e r i o r - mente s e d i a l i z ó c o n t r a B u f f e r de Tris-HC1 50
m M
pH 8.1B)
P o r
s a t u r a c i ó n . ( E I )E l sobrenadante d e l medio de c u l t i v o 6e s a t u r ó a l 30% con s u l f a t o de amonio, p o s t e r i o r m e n t e a l 601, e l s e
-
dimento o b t e n i d o de a i s l ó p o r c e n t r i f u g a c i ó n a 1,000X
g-
durante 30 minutos. E l sedimento s e resuspendió en s o l ;-
ciÓn s a l i n a i s o t ó n i c a hasta o b t e n e r 1/80 d e l volumen o r i g 2 n a l , p o s t e r i o r m e n t e f u é sometido a d i á l i s i s c o n t r a solu- -
ciÓn i s o t ó n i c a hasta l o g r a r que l a prueba de s u l f a t o s fue--
r a n e g a t i v a . Después de l a d i á l i s i s l a muestra s e l l e v ó-
a 1/20 d e l volumen o r i g i n a l con s o l u c i ó n s a l i n a i s o t ó n i c a y s e s a t u r ó a 70% con acetona a 4 O C en donde e l sedimentof u é
resuspendido en B u f f e r de tris-HC1 50 m M pH 8.1centésima d e l volumen i n i c i a l , d i a l i z a n d o en r e l a c i ó n V:V 1 : l O O
a una
d u r a n t e 18 horas a AoC c o n t r a e l mísmo B u f f e r .
5.- I g A como s u s t r a t o
Se prepararon p o r d u p l i c a d o s o l u c i o n e s de I g A proc- dentes de t r e s fuentes: sur0 normal humano, plasma de
mig-
loma y c s l o s t r o ; a una c o n c e n t r a c i ó n de 5.0 mg/ml en Bg-
f f e r de 'Tris-HC1 50 mM pH 8.1 La e s t a n d a r i z a c i ó n s e reg-lid
p o r -inmunodifusiÓn r a d i a l y n e f e l o m e t r f a .B
6.-
Determinación d e l a r e l a c i ó n Óptima Ag/Ab( 7 h c n i c a 7 7
I
E l , o b j e t i v o de é s t a d e t e r m i n a c i ó n f u é e l e v i t a r e l
-
exceso d e a n t f g e n o o a n t i c u e r p o en l a e l e c t r o f o r é s i s .I g A ' ( a n t í g e n o ) s e probó c o n t r a a n t í I g A s é r i c a (en e l caso de I g a p r o c e d e n t e de suero normal humano y de plasma de
-
mieloma), y a n t i I g A s e c r e t o r a para c a l o s t r o .La
E l a n t i s u e r o a n t i I g A s é r i c a
f u é
o b t e n i d a de l o s Lg- b o r a t o r i o s Bohering.En p l a c a s de l u c i t a en formade U
s e
h i z o una d i l u -- -
c i ó n en s e r i e 1;2 de e l a n t í g e n o con B u f f e r de Tris-HC1 50m M
pH
8.1, s e incubó a 37'C durante 60 minutos.tiempo se h i z o una p l a c a d e a g a r o r a a l 1% en B u f f e r de Bar
b i t a 1 pH 8.6 y f u e r z a i ó n i c a de 0.01 con un e s p e z o r de 2
-
m m , a l a que s e l e h i c i e r o n p e r f o r a c i o n e s de 2 mm en l a-
p a r t e c e n t r a l y dos c a n a l e s en l o s extremos ( p a r t e s u p e r k or e i n f e r i o r ) E n L o s o r i f i c i o s c e n t r a l e s s e d e p o s i t ó sobre-
nadante de l a mezcla Ag/Ab incubado, e l canal s u p e r i o r s e i i e n o con a n t í g e n o y e i i n f e r i o r con e i a n t i c u e r p o y s e-
contínuo incubando a temperatura ambiente durante 18 horas A l mismo
-7.- D i g e s t i ó n e n z i m á t i c a " i n u i t a o ' de I g A
( T é c n i c a 72 I
e - ,
E s t e p r o c e s o se e f e c t u ó con l a f i n a l i d a d d e t e n e r l a degradación d e l a molécula de I g A que p u d i e r a s e r v i r como r e f e r e n c i a d e l a a c t i v i d a d p r o t e o l í t i c a .
A 100 mg de I g A “se l e añadió 1.0 mg de t r i p s i n a ,
-
0.01 M de c i s t e í a n a en 10 m l de B u f f e r de f s o f a t p s 0.1 M-
pH7.6.
Se incubó en un baño a temperatura constante a-
37OC durante 72 horas; ‘durante(i1as que s e tomaron muestras a 1y
2 h o r a s , añadiéndo yodacetamida a l 0.1% como inhibL-dor de l a p r o t e ó l i s i s ; l a s muestras o b t e n i d a s s e c o n g e l g
-
ron hasta e l momento de l a l e c t r o f o r é s i s .I
8.- D e t e c c i ó n de l a a c t i v i d a d de p r o t e a s a contra I g A
Se incubaron volumenes i g u a l e s de l a s s o l u c i o n e s de I g A
(50111)
de l a s t r e s f u e n t e s ( s é r i c a , mieloma y c a l o s-
t r o ) a una c o n c e n t r a c i ó n de 5.0 mg/ml con: A ) t r o f o z o i t o s de E n d u n o e t k h i n t o t y t i c n t r a t a d o s con T r i t Ó n X-100 a l 1%.
B)
t r o f o z o i t o s de EndurnoeBu h ¿ n t o @ y t i c a no t r a t a d o s con-
TritÓn X-100 a l I % , C ) medio de c u l t i v o p r e c i p i t a d o con-
s u l f a t o d e amonio( E
I ) , 0 ) medio d e c u l t i v o concentrado-
p o r u l t r a f i l t r a c i ó n( E
1 1 ) . La inaubación s e r e a l i z ó enbaño maria
a
37OC durante 30.60. 120y
180 minutos.La a c t i v i d a d p r o t e o l í t i c a s e d e t e c t ó p o r inmunoelec-
-
t r o f o r é s i s en agarosa t i p oI1
a l1%
en B u f f e r de b a r b i t a lpH 8.6 y f u e r z a i ó n i c a d e 0.1; y a n t i s u e r o e s p e c í f i c o pa
-
r a I g A s é r i c a y s e c r e t o r a . E l c o r r i m i e n t o e l e c t r o f o r é t i c o
se
h i z o b a j o l a s s i g u i e n t e s c o n d i c i o n e s : 30 V o l t s , 12-18 miliampers; e l c o n t r o l f u é suero humano Ó c a l o s t r o mezclg-do con una s o l u c i ó n de a z u l de bromofenol a l 0.01% en e l
-
’B u f f e r de c o r r i m i e n t o . L a s p l a c a s o b t e n i d a s f u e r o n f i j a
-
-
das y t e ñ i d a s con a z u l b r i l l a n t e d e Cppmasie R-250.1 1 1 .
-
RESULIADOS:L a columna empacada ( a
3
I!
30 cm) con S e p k d e x A-50; y que f u é empleada p a r e l a p x r i f i c a c i ó n de l a I g A s é r i c a-
procedmt.e Ce: suero n c r ~ a l humano y suero d e p a c i e n t e con Mieloma t,ipo !IbA t e n í a un volumeri vircic d e 50ml.
d e t e r n i n a d o n e d i a n t e e x c l u s i ó n d e una muestra de A z u l DFx-
-
t r á n (pol.ímerc d e e!.cva¿c p e s o m o i é c u l a r ) a l 1% en B u f f e r d e corriulitatt> (Tris-ECI 15 mM pH 8) ( G r á f i c a 1 )Este f u é
De l a muestra de: 1 ) s u e r o de p a c i e n t e con Kioloma
-
o b t e n i d o d e l Hospita.1 de Q n c o l o g í a d e l C.M.K.IMSS
y2 )
-
deüpugs d e t r e s p r e c i p i t a c i c n e s con su1fat.c Ce anonio a-
cica m t u r a c i ó n c1.e :.8
M ;
ai6
l o s s i g u i e n t e s r e s ~ l t a c o s .-
a )
Por.
El.ef.trofor6si.5,b)
Mediant.6 determinación de p r o t e i .-
nas p o r e l uétCdO ¿e Lowry.
ns
P r G t e í n a s t o t s l e s AlbÚmir-aG l o k u l i n a s A l f a - 1
A l f a - 2 B e t t a
Game. Ab a /mi 10.2 3.1 7 r
‘I
0.38 1.174.55
1.o
0.44
1 2
b a b
mg/rr.l mg / m i ‘ 9 ;&l
4.54 2.8 2.68
0.36 2.54 0.02 0.16 2.02 0.34 0.10
V Comc s e .puede c k s e r v a r en 1.8 t.i<.i-Ia n e t e r i c - r . l a cog-
cerit,ración di: & , r o t e i n a s S E ve b a s t a n t e disminuido después
d e l p r o c e s o d e s a t c r a c i ó n cor el s u l f a t o ae arncnio; e s t e
-
decrsnieritc, e s causado p o r l a e l i m i r ( o c i 6 n $.E> p r c t r í n a s en
-
e l sobrens.dar~:e, l a s c u a 1 . e ~ no l l e g a n w punto I s o e l é c
-
t r i c o con e s t a c o n c e c i r a c i ó n d e se.1 y p o r
IC
tsnt,c nc I C-
grsn p r e c i F i t , a r . Es menester hacer not,ar q u e ? e 1 ~ s PI'S- -. t.efnac: s t r i c a s ; l a sn . 6 ~
abm&n+#ek< Ecn l a s que migran e n-
l a reKi6n Ec?t;ta y e c t r e e l l a ss e
encuent.:.a l a I g A .I g A : I g G I 9 M
n>g/dl. nig/Gl m g i d l Suero d s Kieloma 520 . I 2,200 540
Suero
cor. C?C,E p r e c i p i t . . 3,000 1 , 6 C G 150Suero con t r e s p r e c . 3,000 7
4U
82Consi,derando
EI
ccr,t&nj.cc p r c * t e í c o &e1&
muestrq, sea.plicÓ ur; volumen d e
4
m l
y u n e c.oncefitr&c:Ón de p r o t e i-
nac < e 10.7 mg. Se ei.i;c cor, un grn?ier.te i í n s d cor,st;itci
d o por: t:C, ni.: de NaCl 0 . 3 b! en B u f f e r de Tris-HC1 1 5 mlii
-
F H
8 y 150 m l de B u f f e r d6Tris-EC1
75 ml.; p€ie.
E l c o r r i -miento coricj.uy6 con cr- f l u j o de 7 8 m l / h .
Se obt.iivierei 5C f r a c c i o n e s con 100 g o t a s ccide ur.u
-
d t e l ? a s ; l a 4-8 f u é p c e i t j w . pir¿ IgG y d e Ir; IC-36 f u e r o n
p o s i t i v a s y n r h I g A ( F L g u r 6
3)
Se r e a d i z a r c n v a r i c r c o r r i m j ~ n t i - ~ s cbt.eni.éndose un'
-
rend?iriierit.o d e l ei.9%
y u i x piireza d e l 8 4 % (aetermir.sd«-
p o r N e f c l o m e t r í a ) .
S e soc!f;t.i.b a c r o m a t o g r e f í a 6 e I c t . e r c s m b i c I ó n i c o Una.
v!!!cc:?t.aI d e
7 ,
5 u81 d e s u e r o n a m a l . tumaie'c p r e c i p i t s c c3X
C O Ls ü l f a t o d e amonio
(1.8M)
y una c o a c a t , r a c i Ó n de 1'2.5 i g de cor.t,t?n:dc F r o t e í c c . üsa.ndc. e l mfsnc; gra?cen<,e. l í n e a ) ,ei
f r a c i o r a m i e n t o sc- r e a l i z o c c n un f l u j o i n i c i a l de18mlÍk.-
Se x o l a c t a r o n5s
f r a c c l o c e f i de I C 0 g o t a s c a 2 a una.Al
i g u a l que e n l a : : ~ p e I a c j C nd e l
Tuero 6 e p a r i e z t eCOK ~ ; i . e ~ o r n a ; si fra.ccic'nen;ici:.t,c. cie suero c o r m a i hurrario 6á
uan gI.áf2 c.a coli. tre:. m c : c c - t ~ s ( e n t r e m e z c l a d e s ) . En dcends
-
1 8 s dos p r i n t e i . ~ ~ . d i n p I i ; ~ b a 1 x s i t . i v a p a r 6 IgG ( f r a c c i o n e s5-11 y 17-30) y en i n t e r c e r a S E er.c.~ent.ra
l a
I g H (deterroLricdp u.e?iantt? inmLrcd.ifUsiÓn r a d j . 8 1 ) en l a s f r a c c i o n e s
28
e. Ln,Como e.x.Ferimer,tcs p ~ e l i m i n a r e s se e f e c t u a r o n ~ C E
t é 2
r i c a s 6 e p u r i l ; c a c i & i de l e I g A precedente de calcs:?.rc
hg-
mano; s í n i o g r s r okt.er,ei hi cric.:: r e c u i i a i o s . La,. t é c n i c a s-
eirplcrics f u e r o n : 1 ) F i l t r a c i ó n en L c : p h a d t x C-20G oluenüo
-
con: a.) Ke.C1
O.'!.¿
K
pH
6..&
,
b) grai2Sent.e l í n e a ? ?.E. KECI-
C- 0:!4 Ii. er. B u f f e i driPBS
(1.:M
p t 7.2,
C.: i*Ci! p a d i e - -t c s c:scslcnodas de Ma C.1 d e 0-2 M en P u f f e r de
Tri
V-BCI. 70*-
.
T E C N I C A S
PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO ( 7 h c n i c a 7 )
INTRODUCCION :
Uno de l o s componentes d e l suero son l a s p r o t e í n a s , - l a s c u a l e s se encuentran en una c o n c e n t r a c i ó n d e l
6%.
DeI
acuerdo a su m o b i l i d a d en un campo e l é c t r i c o , e s t a s p r o t e i nas s e c l a s i f i c a n como: a l f a , b e t a y gamma.
Cuando e s t a s se encuentran e l e v a d a s causan h i p e r g s
-
mmaglobulimemia y puede s e r p a t o l ó g i c o . corn0 l o e s e l caso de mieloma m ú l t i p l e y l a macroglobulinemia de Waldestrom.L a s inmunoglobulinas son un grupo de p r o t e í n a s con
-
p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s y c e r o l ó g i c a s que recientemente han s i d o e s t u d i a d a s extensamente.C o n s t i t u y e n un grupo h e t e r o g é n e o en cuanto a carga.- masa y a c t i v i d a d , b i o l ó g i c a . Su a i s l a m i e n t o en e n t i d a d e s
-
f i s i c o q u í m i c a s d i s c r e t a s í m p l i c a una sel-ie de problemas y-e s tema d e i n v e s t i g a c i ó n en a l g u n o s l a b o r a t o r i o s .
'
Los
a n t i c u e r p o s son inmunoglobulinas ( I g C , IgM, I g A I g E e I g D ) y s e encuentran en l a s f r a c c i o n e s b e t a y gamma d e l suero..
D e l t o t a l de g l o b u l i n a s s é r i c a s , l a cantidad de a n t i cuerpos es r e l a t i v a m e n t e pequeña, generalemente e s menor
-
a l10%
d e l t o t a l de p r o t e í n a s de un animal hiperinmuniaado.
, , ."
,,.,
Las inmunoglobulinas de d i f e r e n t e s e s p e c i e s pueden- mostrar p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s d i f e r e n t e s , p o r l o que e s i m p o r t a n t e c o n s i d e r a r l a f u e n t e d e l m a t e r i a l .
*-
.
cuerpo en l a f r a c c i ó n p u r i f i c a d a .
i
,
L a s inmunoglobulinas r e p r e s e n t a n a l a s p r o t e í n a s bá--
do punto i s o é l e c t r i c o y en e s t o se basan l a mayoría de l o s
I
I
I *Is i a a s d e l suero. Sus s o l u b i l i d a d e s c o i n c i d e n con su e l e v a
I
métodos de separación.
Los
métodos de s e p a r a c i ó n y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e rp o r se r e f i e r e n generalmente como e s p e c í f i c o a y no e s p e c i - I
f i c o s .
Aunque l a s g l o b u l i n a s t i e n e n algunas propiedades f i - s i c a s semejantes a l a s inmunoglobulinas, e l p o r c e n t a j e de
pureza ( 100 X g l o b u l i n a con f u n c i ó n de anticuerpo/ t o t a l
de g l o b u l i n a s ) d e l producto f i n a l depende d e l contenido de l a s f r a c c i o n e s c í r c u l a n t e s d e inmunoglobulinas s é r i c a s .
Generalmente l o s métodos no e s p e c í f i c o s dan a l t o s
-
rendimientos y b a j a pureza, en t a n t o i e n l o s e s p e c í f i c o s s e o b t i e n e b a j o rendimiento con mayor pureza.E l a i s l a m i e n t o y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e r p o s p o r
mé-
-
t o d o s e s p e c í f i c o s t i e n e n un fundamento simple y c o n s i s t e-
en l a propiedad que t i e n e n los a n t i c u e r p o s de p r e c i p i t a r ..
En cada caso m e t o d o l ó g i c o , e l complejo r e s u l t a n t e-
puede s e r d i s o c i a d o a j u s t a n d o e l pH a 3.0, que es l a condi
ciÓn p r e f e r i b l e para l a mayoría d e sístemas antígeno-antL
-
cuerpo y a s í o b t e n e r e l a n t i c u e r p o .-
e- 1
1
3
Los a n t í g e n o s s o l u b l e s t i e n e n p r o p i e d a d e s d i f e r e n t e s a l a s de l a s inmunoglobulinas, p o r l o que e l complejo a n t i geno-anticuerpo, ambos pueden s e r removidos mediante p r e c 2 p i t a c i ó n Ó c e n t r i f u g a c i ó n d i f e r e n c i a l . Cuando el a n t í g e n o e s t á en forma i n s o l u b l e , s o l o
se
r e q u i e r e de r e n o v e r p o r c e n t r i f u g a c i ó n .~ I
L a d i s o c i a c i ó n d e l complejo a n t í g e n o - a n t i s u e r p o acg-
r r e también a pH cercanhs a
9.5;
p e r o , l a d e s n a t u r a l i z g-
c i ó n en l a s , s o l u c i o n e s a l c á l i n a s , o c u r r e rápidamente, p o r l o que é s t e método t i e n e poco v a l o r .Aunque e l p r e c i p i t a d o e s p e c í f i c o ( c o m p l e j o i n s o l g
-
b l e ) c o n s i s t e p r i n c i p a l m e n t e d e a n t í g e n o y a n t i c u e r p o , una pequeña p e r o s i g n i f i c a t i v a c a n t i d a d de m a t e r i a l no e s p e c - f i c o también e s t a r á p r e s e n t esi
no s e toman precauciones.De p a r t i c u l a r i m p o r t a n c i a e s l a i n c l u c i ó n d e l comple-
mento, p o r e l l o e s n e c e s a r i o
el
"descomplementar" e l ant&-suero a n t e s de que r e a c c i o n e con e l a n t í g e n o e s p e c í f i c o .
Aunque l a pureza de
los
a n t i c u e r p o s d e l t i p o de l a sg l o b u l i n a s , generalmente
e s
e l e v a d a s i s e o b t i e n e p o r méto-
dos e s p e c í f i c o s .O t r a t é c n i c a para e l a i s l a m i e n t o de a n t i c u e r p o s espg
p r e p a r a c i ó n d e m a t r i c e s i n s o l u b l e s que cog- adecuado unido a e l l a ' c o o v a c í f i c o s
e s
l at i e n e n un a n t í g e n o e s p e c í f i c o l e n t em en t e .
E l uso de inmunoadsorventes f u é r e c i e n t e m e n t e a p l i c a
-
da con e l nombre de C r o m a t o g r a f í a p o r A f i n i d a d .E l a d s o r v e n t e que o r i g i n a l m e n t e f u é u t i l i z a d o f u é un
d e r i v a d o d e l a c e l u l o s a con un grupo p-amino b e n c í l , e l
c u a l e s f á c i l m e n t e d i a z o n i z a d o acoplando a l o s a n t í g e n o s p r o t e í c o s Ó haptenos.
-
P o s t e r i o r m e n t e se d e s c u b r i o que e l e n l a c e de l a s p r o
t e í n a s e r a un e n l a c e amido con l a c a r b o x i m e t í 1 c e l u l o s a .
I
Se d e s a r r o l l a r o n nuevas t é c n i c a s y su uso
más
exte"- s i v o con l a i n t r o d u c c i ó n de g e l e s de agarbsa y d e x t r a n cg- mo m a t r i c e s .L a s m o l é c u l a s que ticenen grupos amido l i b r e s s e unen coovalentemente a l o s g e l e s mediante l a a c t i v a c i ó n con
rc-
d i c a l e s de bromuro de cianógeno que atacan a l g e l .L o s avances t é c n i c o s de l a inmunología y Bioquímica han c o n t r i b u i d o a l entendimiento de l a e s t r u c t u r a de l a mo
-
l é c u l a d e l a n t i c u e r p o .E l a i s l a m i e n t o y p u r i f i c a c i ó n de a n t i c u e r p o s a pap
- -
t i r
de un a n t i s u e r o p o r métodos e s p e c í f i c o s . c o n s i s t e en-
l a a d i s i ó n d e un a g e n t e p r e c i p i t a n t e d e l a n t f g e n o s o l u b l e
Ó b i e n l a a d s o r c i ó n
del
a n t í g e n o i n s o l u b l e e s p e c í f i c o .En l a a c t u a l i d a d se cuenta con a g e n t e s p r e c i p i t a n t e s para l a s inmunoglobulinas t a l e s como: e t a n o l , s a l e s ne2
-
t r a s ( s u l f a t o d e amonio. s u l f a t o de s o d i o ) , p r e c i p i t a n t e s complejos ( r i v a n o l , s a l e s de aluminio, f o s f a t o s . sales de zinc).La p r e c i p i t a c i ó n de l a f r a c c i ó n gamma d e l suero e s p o s i b l e d e b i d o a que e s t a s p r o t e í n a s t i e n e n puntos i s o e l é c tri cos r e l a t i v a m e n t e a l to s.
~~
e
Cuando l a f r a c c i ó n gamma s e t r a t a con p r e c i p i t a n t e s complejos, s e forman c o m p l e j o s c a t i ó n i c o s i n s o l u b l e s con
--
l a mayoría d e l a s o t r a s p r o t e í n a s s é r i c a s a v a l o r e s d e pH donde l a f r a c c i ó n gamma queda como a n t i g e n 0 soluble ( s i n-
formar t a l e s c o m p l e j o s ) , p o rio
quee s
n e c e s a r i o precip'-
t a r l a p o r o t r o método; p e r o p r e v i o a e s t o s e r e a l i z aun
-
p r o c e s o de c l a r i f i c a c i ó n ; e s t e método I m p l i c a una s e r i e
-
de pasod y p o r l o t a n t o v a r i a s t é c n i c a s y en e l l o s e basa
su
poca a p l i c a c i ó n .Las inmunoglobulinas d i f i e r e n unas de o t r a s , y a
su
v e z de l a s o t r a s p r o t e í n a s s é r i c a s en cuanto a su s o l u b i l i dad en s o l u c i o n e s acuosas, é s t a c a r a c t e r í s t i c a puede ser
-
empleada para f r a c c i o n a r l a s en c l a s e s .Durante mas de 100 años, l a s s a l e s m i n e r a l e s
s e
han a p l i c a d o en l a p r e c i p i t a c i ó n y f r a c c i o n a m i e n t o de l a s p r g - t e í n a s .Hammarsten y
Méhu
en 1878 f u e r o n l o s p r i m e r o sen
i n --
v e s t i g a r e l e f e c t o de l a p r e c i p i t a c i ó n
n i o . H o f m e i s t e r en 1888 r e a i z ó i n t e r e s a n t e s i n v e s t i g a c i o -
-
nes a c e r c a de l a e f i c i e n c i a de
l o s
aniones y c a t i o n e s comoa g e n t e s : j p r e c i p i t a n t e s y l a s l e y e s f i s i c o q u í m i c a s que r i g e n t a l e s r e a c c i o n e s .
d e l s u l f a t o de amo
-
En
1937
K j e n d a l l f u é e l primero que p u b l i c ó e l méto--
do a s e g u i r para l a p r e c i p i t a c i ó n de l a f r a c c i ó n gamma sh- r i c a mediante e l uso d e l s u l f a t o de amonio.I,.
S i se t r a t a n a l a s gamma g l o b u l i n a s con s a l e smine-
r a l e s n e u t r a s , a medida d e que s e incrementa l a concentra- ciÓn s a l i n a en e l medio, e x í s t e una i n t e r a c c i ó n de l a s
mg-
-
~
?
lécu'ias
de agua con l o s g r u p o s p o l a r e s de l a s moléculas-
p r o t e í c a s h a c i é n d o l a s c a d a v e z
más
h i d r ó f o b a s l u b i l i e a r l a s .h a s t a i n s o -
.
L a c o n c e n t r a c i ó n s a l i n a a l a q u e cada p r o t e í n a p r e c i p i t a e s d i f e r e n t e : aunque en e l caso de n o l é c u l a s e s t r e c h a monte r e l a c i o n a d a s como es e l caso ,de
Pa
s i n m u n o g l o b u l i n a s l a d i f e r e n c i a no e s l o s u f i c i e n t e m e n t e g r a n d e como p a r a-
d a r un p r e c i p i t a d o de g r a n p u r e z a . P o r l o q u e é s t em é t -
do se emplea p a r a . c o n c e n t r a r i n m u n o g l o b u l i n a s ,más
no s e p ara a c a d a una de e l l a s como e n t i d a d e s i n d i v i d u a l e s . I
S e ha i n v e s t i g a d o l a i n f l u e n c i a de una
s e r i e
de v a-
r i a b l e s que i n t e r v i e n e n en l a p r e c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e i -nas: s a l e s m i n e r a l e s ( c l o r u r o d e s o d i o . s u l f a t o de amonio) f u e r z a i ó n i c a , pH, c o n c e n t r a c i ó n de p F o t e í n a s
y
temperat&-ra.
En c u a n b a s a l e s m i n e r a l e s . l o s i Ó n e s d i v a l e n t e s :
-
s u l f a t 0 , p r e c i p i t a n a l a hemoglobinamás
e f i c i e n t e m e n t e que e l iÓn monovalente c l o r u r o . E s t e e f e c t o s e l e a t r i b u y e a l a I 1 d e s h i d r a t a c i Ó n " de l a p r o t e í n a p o r l a s a l .E l s u l f a t o de
amonio
t i n e l a v e n t a j a de que sus s o l u c i o n e s s a t u r a d a s c o n t i e n e n g r a n d e s c a n t i d a d e s de l a s a l ysu
s o l i b i l i d a d depende muy poco de l a t e m p e r a t u r a . S ere-
comienda u s a r en r e a c t i v o l i b r e de c o n t a m i n a n t e s m e t á l i c o s . p u e s e s t o s i Ó n e s pueden f o r m a r enlaces con a l g u n a s p r o t e i-
n a s , y a l g u n o s pueden c a t a l i z a r r e a c c i o n e s de o x i d a c i ó n .E l s u l f a t o de s o d i o t i e n e una s o l u b i l i d a d l i m i t a d a a
b a j a s ~ t e m p e r a t u r a s
.
Algunos a u t o r e s recomiendan e l uso-
de e s t a s a l a 370C. A 3OoC su a c t i v i d a d p r e c i p i t a n t e e s-
u. .
comparable a l a d e l s u l f a t o de amonio. E l s u l f a t o de so
-
d i o p r e s e n t a l a v e n t a j a de no c o n t e n e r n i t r ó g e n o , p o r l o-
que e v i t a l a d i s t o r c i ó n en l a c u a n t i f i c a c i ó n de p r o t e í n a s .
E l s u l f a t o de magnecio p r e c i p i t a l a f r a c c i ó n de l a s gamma g l o b u l i n a s s é r i c a s . E l c l o r u r o de s o d i o e s usado
-
Únicamente para l a p r e c i p i t a c i ó n de f i b r i n ó g e n o .I
E l c o n t r o l d e l pH e s un f a c t o r importante en l a prg- c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e í n a s ; no o b s t e n t e s e ha observado
-
I ** que su v a l o r , en e l suero no juega un p a p e l muy i m p o r t a n t e
I ,< en e l f r a c c i o n a m i e n t o con s a l e s mir)erales neutras, p e r o s i
,v* l o e s para e l f r a c c i o n a m i e n t o con e t a n o l .
I:::
1)'. ~ I//"ip
1"
I.. I. ..La c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a s en e l medio de precipi- t a c i ó n
,
t i e n e d o b l e e f e c t o : i n f l u y e enl o s
l í m i t e s d e l ap r e c i p i t a c i ó n y en l a c o p r e c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e í n a s '
-
acompañantes.La temperatura no e s tan c r í t i c a para l a p r e c i p i t a
-
c i Ó n de l a s p r o t e í n a s con s a l e s m i n e r a l e s n e u t r a s, como
l o e s cuando se usa e t a n o l . S i se usan s a l e s m i n e r a l e s no s e r e q u i e r e d e equipo de e n f r i a m i e n t o y puede r e a l i z a r s e-
a temperatura ambiente.Cuando s e t r a t a de p r o t e í n a s temosensibles o de r e a 2 c i o n e s e s z i m á t i c a s . es recomendable t r a b a j a r a b a j a s temps r a t u r a s .
Las p r o t e í n a s , t a l e s como: hemoglobina, miosina y
-
l a s s é r i c a s preeentan b a j a s s o l u b i l i d a d e s con calentamien- t o : e s menor a 25OC que a O°C. La mayoría de l a s p r o t e i-
nas p r e c i p i t a n a temperaturas templadas o f r i a s . E l i n c r g-
rq
I L..