TP N°2: PCR-I
PROBLEMAS PRÁCTICOS PARA LA ESTANDARIZACION DE
UNA REACCION DE PCR
Dra. Silvia Mabel Varas
Objetivos:
- Establecer las tareas a realizar en cada área de un laboratorio que realiza PCR. - Analizar y resolver problemas prácticos que surgen en la estandarización de una reacción de PCR.
- Realizar todos los cálculos necesarios para preparar la mezcla maestra de la reacción de PCR.
- Conocer la nomenclatura para la solicitud de síntesis de oligonucleótidos.
- Integrar todos estos conocimientos con la preparación de todos los reactivos usados en la etapa pos-PCR.
- Conocer el fundamento de la reacción de amplificación de fragmentos de ADN.
- Establecer las normas de seguridad para impedir riesgos de contaminación de los productos amplificados.
Las tareas a realizar en cada área de PCR son:
I. Área de Pre-PCR:
Preparación de reactivos: Mix de dNTPs, pedido y dilución de primers. Preparación de la dilución de las muestras de ADN.
II. Área de PCR:
Realización de la Master Mix.
Reparto de la Master Mix y realización de la PCR. Cuidados con la contaminación.
III. Área de Post-PCR:
Preparación de geles de poliacrilamida: reactivos. Preparación de las muestras para sembrar en los geles. Siembra de las muestras.
NORMAS QUE SE DEBEN CUMPLIR EN UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR CLÍNICO
Además de las prácticas habituales de bioseguridad en el laboratorio y del cumplimiento de los programas de control de calidad requeridos para garantizar la calidad de un resultado, el laboratorio de diagnóstico molecular clínico debe cumplir con otros requisitos, como son las áreas de trabajo separadas. Dichas áreas son:
AREA 1: Preparación de reactivos. AREA 2: Preparación de muestras.
AREA 3: Amplificación y detección de resultados.
AREA 1
En ésta se preparan las soluciones de trabajo, se almacenan los reactivos y las mezclas para las reacciones de amplificación.
Consideraciones:
• La superficie de trabajo debe limpiarse y descontaminarse con una solución de hipoclorito de sodio al 10% (ésta debe ser preparada diariamente) seguido de un lavado con Etanol 70%. Además, siempre se trabajará sobre papel absorbente, el cual debe ser removido una vez terminado el trabajo.
• Las pipetas son exclusivas de esta área y no deben ser trasladadas a otras.
• Dentro de lo posible, utilizar tips antiaerosoles (especialmente al trabajar con ARN).
• Por su seguridad y para evitar contaminación, DEBE USAR GUANTES EN TODO MOMENTO.
• Los guantes deben cambiarse al cambiar de área de trabajo y deben ser cambiados periódicamente durante el trabajo.
• Las muestras deben guardarse separadas de los reactivos para no contaminar estos últimos.
AREA 2
En esta área se preparan las muestras y las mezclas para las reacciones de amplificación. Aquí se debe disponer de cabinas biológicas especiales, en las que se debe considerar:
• En caso de usarse campana UV, desconectar la luz ultravioleta antes de introducir los brazos y las manos en esta área de trabajo.
• La superficie de trabajo debe estar lista media hora antes de iniciar el procedimiento de preparación de la muestra.
• Las pro-pipetas, pipetas y otros componentes del equipo que se usan en la preparación de la muestra deben permanecer en esta cabina todo el tiempo.
• Todo el material remanente debe ser descartado en contenedores con hipoclorito de sodio al 10%.
AREA 3
Las muestras listas para amplificación son sometidas a PCR y a continuación los productos de la misma podrán ser detectados utilizando diferentes alternativas.
• Las pipetas de esta área nunca deben ser trasladadas a las anteriores.
• Dentro de lo posible, los productos de amplificación deben ser pipeteados con tips con puntas antiaerosoles, ya que una pipeta contaminada puede dar lugar a resultados FALSOS POSITIVOS.
• Una vez realizada la interpretación de resultados, todo el material debe ser descartado en hipoclorito de sodio al 10% y se debe limpiar exhaustivamente el lugar de trabajo.
• Cuando los productos sean visualizados en geles de agarosa expuestos a luz UV, recordar que la exposición del operador debe ser mínima y siempre se debe usar máscara protectora y anteojos.
I. ÁREA DE PRE-PCR:
PREPARACIÓN DE REACTIVOS: MIX DE dNTPS, PEDIDO Y DILUCIÓN DE PRIMERS.
1. PREPARACIÓN DE LA MIX DE dNTPS.
Ud. necesita preparar 100 µl de una mezcla (mix de los 4 d-NTPs) necesarios para la reacción de PCR y que tenga una concentración de 2,5 mM de c/u de ellos. ¿Cómo realiza esta preparación?
2. PEDIDO DE PRIMERS: ESTUDIO Y CONFIRMACIÓN DE LA SECUENCIA DE LOS INICIADORES O CEBADORES (PRIMERS).
Dada la secuencia del gen CFTR (Exón 10) se muestran los corchetes donde deseamos que hibriden los primers. Le pedimos que complete la planilla de pedido de oligonucleótidos, para solicitar al proveedor que sintetice los primers.
Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. ACCESSION: M55115
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=306520)
ORIGIN
3. PREPARACIÓN DE LA DILUCIÓN DE PRIMERS.
Ud. solicito la síntesis de los primers que necesita a la empresa Annovis Inc. (Biodynamics, Argentina). Le envían el par de primers y la siguiente planilla adjunta a los mismos:
En el protocolo de PCR Ud. necesita que 25 pmol de c/u estén contenidos en 1 µl de solución Buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH= 8,0). ¿Con qué volumen retoma esos primers para tener esa solución y cómo prepara el buffer de dilución?
PREPARACIÓN DE LA DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ADN.
1. CUANTIFICACIÓN DEL ADN.
Para realizar la cuantificación del ADN existen dos métodos ampliamente usados: a) Espectrofotométricamente: Tiene como condición para su lectura que debe tratarse de muestras puras (sin cantidades significantes de contaminantes tales como proteínas, fenol, agarosa u otros ácidos nucleicos). Se basa en la cantidad de luz ultravioleta que absorben las distintas bases nitrogenadas que conforman la muestra. La lectura se realiza a 260 nm.
b) Cuantificación Fluorescente con GelRed: Si la cantidad de ADN es muy pequeña o si contiene cantidades significativas de impurezas, la cantidad de ácidos nucleicos puede ser estimada por la intensidad de fluorescencia emitida corriendo un gel de agarosa con GelRed.
a) Determinación Espectrofotométrica de las cantidades de ADN
Se cuantifica el ADN leyendo a 260 nm y 280 nm.
La lectura a 260 nm calcula la concentración de ácidos nucleicos en la muestra. La lectura a 280 nm da idea de la presencia de proteínas como factor de impureza. Una densidad óptica de 1 corresponde a ≅ 50 µg /ml ADN doble cadena o ≅ 40 µg / ml ADN simple cadena y ARN.
La relación entre las lecturas a 260 y 280 nm (A260/A280) da una idea de la pureza del ácido nucleico.
Preparaciones puras de ADN y ARN tienen valores de A260/A280 entre 1,8 y 2,0. Si hay contaminación con proteínas o fenol la relación será significativamente menor.
Ejemplo de cuantificación: ¿Cuál es la concentración de ADN doble cadena de una muestra cuya absorbancia es de A260=0,089? Se realizó una dilución 1/100 de la solución madre.
Rta: La concentración de ADN doble cadena es = 0,089x 50 x 100= 445 µg/ml
b) Cuantificación Fluorescente con testigos de concentración conocida de ADN.
Se realiza una electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Se siembra en una calle una muestra de ADN de concentración conocida y en las otras, las muestras a cuantificar.
Se calcula la concentración por la intensidad de fluorescencia emitida al UV con GelRed, comparándola con la emitida por los testigos.
Concentración de ADN de los testigos: 1, 1.5, 2, 3 y 5 μg/ml.
2. PREPARACIÓN DE LA DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ADN
Muestra A260 ADN µg/ml Volumen de solución madre que
contienen 1 μg de
µl de H2O (c.s.p.* 5 µl)
1 0,0571 µl
2 0,0785 µl
3 0,2828 µl
4 0,0663 µl
5 0,0750 µl
6 0,0877 µl
*c.s.p.: cantidad suficiente para.
II. ÁREA DE PCR:
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Reacción que involucra repetidos ciclos de calentamiento y enfriamiento, en el cual se producen copias en forma logarítmica de un segmento de ADN determinado, el cual está limitado por un par de primers específicos.
Pasos de la Reacción
1) El inicio de la reacción es a partir del ADN aislado de células, el cual es calentado hasta que se separan las hebras complementarias, es la desnaturalización del ADN. Esto ocurre aproximadamente a 92-94 °C.
2) Estas hebras luego hibridan con un exceso de dos oligonucleótidos (de no más de 20 nucleótidos) que se sintetizaron químicamente y que se denominan “primers” o “cebadores”. Es el proceso conocido como hibridación o “annealing”. El segmento a amplificar (de una longitud de X nucleótidos, donde X generalmente está entre 50 hasta 2000 nucleótidos) se encuentra flanqueado por el par de “primers” como se muestra en el siguiente esquema:
Donde F es el primer “Forward” (“va hacia adelante”), tiene la secuencia “sense” y por lo tanto, se une por complementariedad a la cadena antisense.
R: es el primer “Reverse” (“en contra”), tiene la secuencia de la cadena antisense y entonces se une por complementariedad a la cadena sense.
3) Una vez unidos los primers, la temperatura se eleva para que pueda actuar la ADN Polimerasa en el paso de elongación, copiando por complementariedad, a partir de los primers, las dos hebras de ADN. La enzima que se utiliza es la ADN Polimerasa aislada de una bacteria acuática termófila llamada Thermus aquaticus, de manera entonces, que a esta enzima se la nombró Taq ADN polimerasa, cuya temperatura óptima es de 72°C.
Estos tres pasos constituyen UN CICLO. La reacción se lleva a cabo durante “n” ciclos (entre 30- 40 ciclos); de manera que la cantidad del fragmento de ADN deseado que se obtiene es de a x 2n (donde a: es la concentración inicial de ADN, 2 por ser 2 las hebras de la molécula de ADN y n: el número de ciclos realizados). En realidad este es el producto teórico que se obtiene, ya que también habría que tener en cuenta la EFICIENCIA de la reacción, que podría disminuir un poco este resultado).
Factores importantes a controlar:
Temperatura de annealing o hibridación: es muy importante, ya que si es baja, la hibridación es INESPECIFICA; y si es muy alta, no se da el apareamiento de los primers y no existe síntesis de ADN. Para que dicha temperatura sea la adecuada, hay que tener en cuenta: (1) la concentración de cationes de la mezcla y (2) el porcentaje de bases G y C en los primers.
La presencia de agentes que mejoran la especificidad en la hibridación, como la formamida, que por ejemplo, disminuye la temperatura de annealing.
Contaminación de la PCR
Uno de los mayores problemas de la PCR es la posible contaminación con otros ADN. Por este motivo, hay que usar guardapolvos, guantes, tips individuales, material estéril, etc.
Las posibles fuentes de contaminación son: 1. Contaminación pre-PCR:
En la recolección del material estéril (siempre rellenar los envases y cajas de tips con guantes)
Contaminación con ADN de personas (piel, cabellos, manos, saliva, etc.) Por mala ventilación, siendo entonces una contaminación esporádica,
En los reactivos de “Grado PCR” (enzimas, productos biológicos, Taq polimerasa, buffer, etc).
Existencia de productos amplificados en PCR previas (denominados contaminación por amplicones).
2. Contaminación post-PCR:
1 µg de ADN humano contiene aproximadamente 1.4 x 105copias de un gen de copia única, de manera que si al transferir producto de amplificación lo hago, por ejemplo, con un tip usado o mal esterilizado, aunque sea un volumen de 0.1µl, estoy transfiriendo 109 copias de un ADN “extraño”, pudiendo luego puedo obtener FALSOS positivos y contaminar el control negativo y, por lo tanto, invalidar la reacción global.
Preparación de las muestras:
annealing (la cual es específica para cada primer por los factores enumerados más arriba).
Se debe preparar primero una MASTER MIX, que contiene Buffer para la Taq polimerasa, nucleótidos a la concentración correspondiente, MgCl2, los dos primers, H2O y la enzima Taq polimerasa.
A esta Mix se la distribuye en los respectivos tubos de reacción, se agrega el ADN problema y se llevan los tubos al termociclador.
REALIZACIÓN DE LA MASTER MIX.
En un tubo eppendorf de 1,5 ml estéril medir los siguientes componentes:
8. Repartir 20 µl de la master mix en cada tubo de PCR (200 µl) que contiene 1 µg de ADN en 5 µl de agua
III. ÁREA DE POST-PCR:
PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA Y POLIACRILAMIDA: REACTIVOS Y PROCEDIMIENTO.
1. PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA:
a) Agregar la agarosa al 1% p/v en un erlenmeyer que contenga el volumen necesario de buffer TBE (Tris-Ácido Bórico-EDTA) 1X.
b) Disolver la agarosa en el horno de microondas.
c) Dejar enfriar la solución a 50ºC y agregar una solución stock de GelRed, a una concentración final de 0,5 X.
d) Volcar en la gelera preparada con el peine. e) Dejar solidificar.
f) Extraer el peine.
g) Agregar 150 ml del buffer de corrida en la gelera. h) Siembra: colocar en un Eppendorf de 0,5 ml:
• 5 µl del ADN resuspendido + 2 µl del Buffer de siembra
i) Realizar un spin en la centrifuga y sembrar los 12 µl por inmersión, ver figura.
2. ELECTROFORESIS:
1. Conectar los terminales eléctricos a la fuente de poder. 2. Aplicar un voltaje constante, a razón de 4V/ cm.
3. Dejar correr hasta ≅ unos 4-5 cm por lo menos desde el lugar de siembra. 4. Desconectar la fuente de poder.
5. Retirar el gel y llevarlo al cuarto oscuro para observar la fluorescencia emitida en el transiluminador.
Reactivos utilizados:
• Buffer de corrida: TBE 1X con GelRed 0,5X.
• Solución Madre de TBE 5X, pH=8: Tris Base……...54 g
Ac. Bórico….….…..27,5g EDTA 0,5M…..….. 20 ml H2O csp…..……..1000 ml
• Solución Stock de GelRed: 10.000X en agua.
• Buffer de siembra 6 X: 30 % glicerol (v/v en H2O ). 0,25 % azul de bromo fenol.
Consideraciones importantes:
• Los buffer de siembra cumplen tres funciones: (1) aumentan la densidad de la muestra, de esa forma permanecen en el well o pocillo de siembra del gel, (2) añaden color a la muestra, de esa forma permiten una mayor visualización de la misma, como así también del frente de corrida y (3) contienen sustancias que en un campo eléctrico se mueven hacia el ánodo (+) a velocidades predecibles. Así, el Azul de Bromo Fenol migra en un gel de agarosa al 1% ≅ como un ADN doble cadena lineal de 300 pb.
posibilidad de almacenarlo incluso a temperatura ambiente sin que esto se traduzca en ningún tipo de detrimento de su actividad o funcionalidad. Otra ventaja, también desde el punto de vista de su toxicidad, es que vienen diluido en agua y no en DMSO como por ejemplo el SYBR Safe.
En resumen, las principales características del colorante GelRed son:
• No es mutagénico.
• No es citotóxico.
• Detecta ADN simple doble cadena y RNA en gel de agarosa y poliacrilamida.
• Compatible para calentarse en microonda.
• No necesita protección de la luz para cuando se tiñe el gel.
3. PREPARACIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA:
Ud. debe preparar 10 ml de un gel de poliacrilamida al 12 %. En la siguiente tabla se le suministran los volúmenes que debe medir de acrilamida, agua, TBE 5X, Persulfato de amonio (PSA) y TEMED de acuerdo al porcentaje final de acrilamida en el gel.
Reactivos 3,5% 5,0% 8,0% 12,0% 20%
Agua 6,77 ml 6,27 ml 5,27 ml 3,93 ml 1,27 ml Acrilamida 30% 1,16 ml 1,66 ml 2,66 ml 4 ml 6,66 ml
TBE 5X 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
PSA 10% 0,07 ml 0,07 ml 0,07 ml 0,07 ml 0,07 ml Añadir 3,5 µl de TEMED por cada 10 ml de solución de acrilamida
El Buffer de siembra contiene azul de bromofenol y xilenocianol como marcadores del frente de corrida. De acuerdo a la concentración del gel, marcan el frente de corrida en los tamaños indicados en la siguiente tabla:
% gel
Azul de bromofenol Xilanocianol
3,5 100 pb 460 pb
5,0 65 pb 260 pb
8,0 45 pb 160 pb
12,0 20 pb 70 pb
15,0 15 pb 60 pb
20,0 12 pb 45 pb
ELECTROFORESIS:
1. Para los geles de poliacrilamida se usa un sistema de electroforesis vertical. 2. Conectar los terminales eléctricos a la fuente de poder.
3. Correr a 100 V en Buffer TBE 0,5X 4. Desconectar la fuente de poder.
5. Terminada la corrida, sacar el gel y teñir 10 minutos con una solución de GelRed 1X dentro de un recipiente.
Solución Madre: 10.000X contenidos en 0,5 ml
Solución de Trabajo Recomendada por los proveedores: 1X (1µ g/ml) Problema:
¿Qué volumen de GelRed debe medir para 10 ml de agua tengan la concentración recomendada (1X)?
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
1- Curso: Aplicaciones de la Ingeniería Genética al Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias y Filiación. Cátedra de Genética y Biología Molecular. FFyB. UBA.
2- Sambrook, Fritsch and Maniatis: “Molecular Cloning”. A Laboratory Manual 2º Edición- Tomo 1, 2 y 3. 1989.
3- Curso: Biología Molecular y Diagnóstico Clínico. Hospital Privado. Centro Médico de Córdoba y Fundación para el Progreso de la Medicina.
4- Quantitation of mRNA by polymerase chain reaction. Nonradioactive PCR Methods. Springer Lab.Manual. Köhler et al. ISBN 3540591923.
5- Giménez MS, Ciuffo GM, Oliveros LB, Zirulnik Z, Varas SM, Ramirez DC, Alvarez SM, Depetris- Boldini C, Dodelson de Kremer R, Oller de Ramirez AM y Frechtel GD. Bioquímica Molecular. 2003. Nueva Editorial Universitaria. ISBN987-98436-7-3.
