Extracción de proteínas a partir de hojas y semillas de pentacalia nítida y evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto proteico acuoso

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Pentacalia nítida Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO PROTEICO ACUOSO

LINA DANIELA LÓPEZ QUIMBAYO

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de

Microbióloga Industrial.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Pentacalia nítida Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO PROTEICO ACUOSO

LINA DANIELA LÓPEZ QUIMBAYO

____________________ _________________________ Dra. INGRID SCHULER. JANETH ARIAS PALACIOS, M.Sc Decana académica Directora de Carrera Facultad de Ciencias Microbiología Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Pentacalia nítida Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO PROTEICO ACUOSO

LINA DANIELA LÓPEZ QUIMBAYO

_______________________ ____________________

Dr. RICARDO VERA BRAVO Dra. ALIX E. LOAIZA

Director Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

NOTA DE ADVERTENCIA

La U iversidad o se ha e respo sa le por los o eptos e itidos por sus alu os e sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en

ellas el a helo de us ar la verdad y la justi ia .

Este trabajo de grado se encuentra financiado bajo el proyecto de investigación de convocatoria

AGRADECIMIENTOS

Quisiera expresar mis agradecimientos a:

Dios por ser la razón de todo.

Mis padres por brindarme amor y apoyo incondicional durante toda mi vida, por que por ellos puedo desarrollar este trabajo, muchas gracias papis por todo.

Mi hermanita por brindarme ánimo y alegría.

A la Pontificia Universidad Javeriana por brindarme los recursos y formarme como persona.

Profesor Ricardo Vera por su asesoría, conocimientos y acompañamiento durante el desarrollo del trabajo de grado.

Profesor Alex Rodríguez por todo el tiempo dedicado, por sus sugerencias y conocimientos que fueron de suma importancia.

Al grupo de Química de Macromoléculas: Diana Gómez por su colaboración incondicional con todo en el laboratorio, a Max Martínez por su ayuda y a Juliana Vásquez por su amistad y ayuda incondicional. Sin ustedes habría sido más difícil.

Dra. Ofelia Díaz por facilitarme los materiales necesarios para desarrollar el trabajo de laboratorio.

Felipe por su alegría, comprensión y ser incondicional siempre.

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ... 1

INTRODUCCIÓN ... 2

JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 3

MARCO TEÓRICO Y REFERENTES CONCEPTUALES ... 4

1.1 Pentacalia nítida ... 4

1.2 Extracción y precipitación de proteínas en plantas ... 5

1.3 Péptidos antimicrobianos... 5

1.4 Microorganismos patógenos ... 7

1.4.1 Bacterias ... 7

1.4.2 Hongos... 7

OBJETIVOS... 8

METODOLOGÍA ... 9

1. Recolección del material vegetal ... 9

2. Extracción y determinación del contenido de proteína ... 9

3. Obtención de proteína ... 9

3.1.1 Sulfato de amonio ... 9

3.1.2 TCA-Acetona ... 10

3.1.3 Fenol-Tris ... 10

4. Cromatografía ... 11

5. Electroforesis ... 11

6. Cuantificación de Proteína ... 11

7. Actividad antimicrobiana ... 11

7.1 Prueba difusión en agar ... 12

7.1.1 Bacterias ... 12

7.1.2 Hongos... 12

7.2 Microdilución con cloruro de 2, 3, 5, - trifenil-tetrazolio (TTC) ... 12

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 13

1. Identificación de la planta ... 13

2. Extracción de las proteínas de hojas y semillas de P. nítida ... 13

4. Cromatografía ... 18

5. Actividad antimicrobiana ... 19

CONCLUSIONES ... 21

RECOMENDACIONES ... 21

BIBLIOGRAFÍA ... 22

1 RESUMEN

Los estudios respecto a los productos naturales con actividad antimicrobiana han venido en auge, debido a la importancia que esta cobrando la resistencia que presentan los microorganismos hacia los antibióticos sintetizados químicamente que se usan ampliamente para combatir enfermedades.

El objetivo de este trabajo de grado fue extraer y evaluar la actividad antimicrobiana del extracto acuoso proteico a partir de las semillas y las hojas de la planta Pentacalia nitida, frente a las cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis spp y Colletotrichum spp; para alcanzar los objetivos específicos propuestos primero se evaluaron 3 soluciones buffer para extracción: Tris-HCl, HEPES y Fosfato; la mayor recuperación de la proteína se obtuvo con el buffer fosfato, además al evaluar el corrido electroforético este mostró mejor definición de bandas respecto a los otros dos.

Para definir el perfil electroforético se realizaron 3 métodos de obtención de proteína: Sulfato de amonio, TCA-Acetona y Fenol-Tris; a partir de los métodos de sulfato de amonio y TCA-Acetona se definieron los perfiles electroforéticos de las hojas y semillas de Pentacalia nitida, mientras que el método de fenol- Tris según el protocolo empleado, no permitió la definición del perfil electroforético.

2 INTRODUCCIÓN

Las plantas se han usado a lo largo de la historia de la humanidad como agentes curativos, esta propiedad se descubrió por ensayos y errores donde los humanos seleccionaban aquellas que eran benéficas para la salud, esta experiencia se ha transmitido de generación en generación (1); Las plantas son fuente de innumerables recursos renovables que mejoran la vida de las personas, por esto es necesario realizar estudios que permitan buscar compuestos biológicamente activos que brinden alternativas frente a los medicamentos actuales mediante bioensayos que detecten la actividad de los extractos de las plantas.

Las plantas del género Pentacalia se consideran plantas promisorias de Colombia, pertenecen al orden Asterales, al que pertenecen aproximadamente 19.000 especies de plantas herbáceas (2) de las cuales se han aislado y caracterizado metabolitos secundarios de diferente naturaleza química los cuales han presentado actividades repelentes, plaguicidas, citotóxicas, antiprotozoarias, tripanomicidas, antibacteriales y antioxidantes (3).

Pentacalia nítida, es un matorral que se encuentra en el Páramo de Sumapaz, entre 2000 a 3850 msnm (4). Los estudios realizados por el grupo de Fitoquímica de la Pontificia Universidad Javeriana sobre esta planta se han dirigido a aislar y caracterizar diferentes metabolitos secundarios como flavonoides, terpenos, cumarinas, mezclas de ácidos grasos, hidrocarburos alifáticos tipo triacontano, esteroides y el cicloartano (3).

3 JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los últimos años se ha incrementado la resistencia que presentan los microorganismos frente a los antibióticos, debido a que las personas no siguen los esquemas de tratamientos médicos y usan estos medicamentos indiscriminadamente; Los microorganismos desarrollan genes de resistencia frente a los antibióticos que al transferirse horizontalmente agravándose el problema(5).

Las plantas son una alternativa usada por nativos para tratar enfermedades, existen numerosos productos naturales que poseen la misma actividad antifúngica y antibacterial que tienen los mismos efectos que los productos sintetizados químicamente.

Las plantas del género Pentacalia han sido empleadas porlos campesinos Cundiboyacenses para curar forúnculos, tratar dolores de garganta, sus partes aéreas en decocción para contrarrestar los efectos de venenos, las hojas maceradas como desinfectantes y cicatrizantes de heridas difíciles (3). Este conocimiento tradicional de las comunidades cercanas a estas plantas se debe validar con estudios para determinar su actividad biológica, ya que en un futuro podría ser alternativa para tratar infecciones(6).

Algunas proteínas y péptidos exhiben actividad antimicrobiana y debido a que son de origen natural pueden ser una alternativa para los problemas de resistencia a antibióticos, se podrían usar como conservantes de productos alimenticios, en la industria farmacéutica, como controlador biológico y como agentes antimicrobianos en el tratamiento de infecciones (7) además los extractos proteicos con actividad antimicrobiana brindan una alternativa para productos químicamente sintetizados puesto que son recursos renovables y no presentan efectos adversos para el medio ambiente; son conocidos como péptidos antimicrobianos (AMPs de su sigla en inglés Antimicrobial peptides) que constituyen mecanismos de defensa presente en plantas, insectos y vertebrados, son componentes evolutivamente conservados y ejercen actividades inmunomoduladoras (8), estos péptidos antimicrobianos se clasifican de acuerdo a su tamaño y estructura (helicoidal y lineal) (7).

4 MARCO TEÓRICO Y REFERENTES CONCEPTUALES

La purificación y extracción de proteínas se remonta hace más de 200 años; los primeros reportes que existen de aislar sustancias a partir de plantas con propiedades similares a la albúmina del huevo se llevaron a cabo por Foucroy en 1789; durante el siglo XIX se purificaron gran cantidad de proteínas (10).

De Pentacalia nítida se conoce su morfología, la distribución geográfica en el país, las especies asociadas y algunos metabolitos secundarios no proteicos que se han estudiado en la Pontificia Universidad Javeriana (3) pero antes de la realización de este estudio no se tenía información a cerca de la composición de los extractos proteicos de esta planta y si estos presentan algún tipo de actividad antimicrobiana.

Los microorganismos que se usan para determinar la actividad antimicrobiana son patógenos, las bacterias causan enfermedades transmitida por alimentos siendo de importancia para el estudio. Escherichia coli es un habitante normal del intestino grueso de los seres humanos, que puede llegar a causa enfermedades entéricas e infecciones urinarias (11). Staphylococcus aureus es un patógeno humano que se conoce por ser causante de bacteriemia adquirida en los hospitales ocasionando infecciones en pacientes (12).Listeria monocytogenes, que causa listeriosis que se contagia por la ingesta de alimentos contaminados (13). Los hongos que se evaluaron son patógenos de plantas siendo de importancia agrícola, pues causan enfermedades a los cultivos afectando la economía y la productividad del sector agrícola del país.

1.1 Pentacalia nítida:

Es un arbusto reportado en Ecuador y Colombia, en nuestro país se encuentra en los departamentos de Arauca y Cundinamarca. Su nombre común es Guasquín, Huasguín, Basgüín o Guasgüín (14).

5 identificaron los glicósidos de fracciones más polares: Rutina y (1 hidroxi – 4 –oxo- 2,5- ciclohexan

– dienil) acetato de 6´-escopolinilo y un flavonoide identificado como 5-hidroxi, 3,7,4´- trimetoxi flavona; los glicósidos son importantes a nivel farmacológico, algunos presentan actividad antimicrobiana y se usan como colorantes (3).

1.2 Extracción y precipitación de proteínas en plantas:

Las plantas presentan poco contenido de proteínas comparado con los tejidos animales, puesto que solo 1-2% de la célula es citoplasma donde están las proteínas y el resto del volumen celular lo componen las vacuolas y la pared celular, estas dos secciones de la célula presentan gran cantidad de fenoles, terpenos, pigmentos, ácidos orgánicos, carbohidratos y otros compuestos no proteicos que son interferentes al extraer las proteínas y al definir el perfil electroforético de las plantas (15).

El primer paso a considerar para la extracción es la lisis celular que permite liberar los componentes de los compartimentos intracelulares, esta lisis debe conservar la integridad de la proteína; otro factor importante es el buffer de extracción que depende de la naturaleza de la célula y de la aplicación esperada (16); Para este trabajo se extrajeron las proteínas y se evaluó la actividad biológica de los extractos proteicos acuosos por esto se aplicó el protocolo de precipitación con sulfato de amonio que mantuvo intacta la estructura de la proteína y de forma activa.

El buffer de extracción para las proteínas es un factor importante debido a que son muy sensibles a los cambios de pH y permite que los resultados sean reproducibles; el buffer en que se haga la extracción debe evaluarse desde diferentes puntos de vista considerándose las interacciones posibles con otros componentes, la compatibilidad con técnicas de purificación, absorción UV y costo (16).

1.3 Péptidos antimicrobianos:

6 respuesta rápida y efectiva frente al microorganismo patógeno, estos se dominan péptidos antimicrobianos (AMP´s) que hacen parte del sistema inmune primitivo presente en insectos, animales y plantas. (19).

Los péptidos antimicrobianos hacen parte de la defensa antigua de los organismos, se sintetizan de forma rápida para contrarrestar el ataque de microorganismos, además son pequeños y se requiere de una mínima inversión de energía para su síntesis, poseen carácter anfipático permitiéndoles una interacción a nivel de membrana con el patógeno, un ejemplo de estos péptidos son las ceproninas que se acumulan en la hemolinfa de muchos vertebrados en respuesta a una lesión o infección (20); por otra parte las plantas sintetizan péptidos antimicrobianos como defensinas y tioninas al ser invadidas por microorganismos (21), estos hacen parte del sistema inmune innato, se producen por diferentes tipos de células y se pueden expresar de forma inducible o constitutiva, además poseen un amplio espectro frente a microrganismos (22).

Los péptidos antimicrobianos tienen pesos moleculares menores a 10 KDa (17), se clasifican es 5 grupos según su estructura y abundancia de aminoácidos en: alfa hélice, péptidos ricos en cisteína que pueden ser catiónicos o aniónicos y estabilizados con puentes disulfuro, hojas betas, péptidos ricos en aminoácidos regulares y aquellos que poseen aminoácidos modificados (19).

El modo de acción de estos péptidos depende de su naturaleza anfipática que le permite interactuar con la membrana de la bacteria al ser reconocidos y produciendo una alteración de esta (23), estos péptidos pueden formar poros transmembranales, donde las partes hidrofóbicas del péptido interactúan con los lípidos de membrana, después el péptido se introduce en esta formando un poro produciendo la muerte del microorganismo; otro mecanismo por el que estos péptidos tienen actividad antimicrobiana es cuando están en alta concentración entran en contacto con la cabeza de los fosfolípidos de la membrana permeándola, no se insertan en la parte hidrofóbica de la membrana pero producen la desintegración de esta pues evita que tenga su forma normal de bicapa (19).

7 1.4 Microorganismos patógenos evaluados:

1.4.1 Bacterias:

Escherichia coli, es un bacilo Gram negativo, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae y de origen entérico muy adaptable pues puede colonizar diferentes ambientes como el tracto gastrointestinal de mamíferos y aves, además puede crecer en temperaturas de 7 a 45°C y a pH entre 4 a 10; lo que lo hace un patógeno importante ya que puede estar presente en alimentos que al ser ingeridos producen enfermedad diarreica; se estima que genera 76 millones de enfermedades domésticas y 5000 muertes al año (25).

Listeria monocytogenes, es una bacteria Gram positiva, no formadora de esporas y móvil a 22°C, causante de la enfermedad transmitida por alimentos denominada listeriosis, es una bacteria oportunista pero también puede afectar a adultos, niños y mujeres en estado de embrazo siendo las mas afectadas por esta bacteria pues se estima que se presentan 500 muertes por esta enfermedad y un tercio de estas son mujeres en embarazo; esta bacteria es capaz de sobrevivir a bajas temperaturas (25).

Staphylococcus aureus, coco Gram positivo, pertenece a la familia Micrococcaceae, causa intoxicación alimentaria estaficocal, infecciones en la piel, osteomielitis, entre otras enfermedades; Esta bacteria posee genes que le confieren resistencia a agentes antibacterianos, siendo de importancia por que se hace difícil su tratamiento (25).

1.4.2 Hongos:

8 OBJETIVOS

General:

Evaluar la actividad antimicrobiana del extracto acuoso proteico a partir de las semillas y las hojas de la planta Pentacalia nitida, frente a las cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis spp y Colletotrichum spp.

Específicos:

 Obtener el extracto proteico acuoso a partir de semillas y hojas de Pentacalia nítida.  Definir el perfil electroforético del extracto proteico acuoso.

9 METODOLOGÍA

1. Recolección del material vegetal:

La planta Pentacalia nítida se recolectó en el Páramo de Sumapaz, ubicado en el departamento de Cundinamarca a 3575 msnm con temperatura promedio de 0 a 4 °C, allí se tomaron los tallos de la planta y se empacaron en bolsas negras luego se transportaron a temperatura ambiente, después en el laboratorio el material vegetal se conservó en congelación (-20 °C); un ejemplar se llevó al Herbario de Pontificia Universidad Javeriana para su identificación taxonómica.

2. Extracción y determinación del contenido de proteína:

El material vegetal se maceró en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. Con el fin de evaluar el mejor buffer de extracción, se tomaron las hojas maceradas en nitrógeno líquido, a 0,1 g de material vegetal se le agregó 1 ml por cada buffer de extracción, se evaluaron las siguientes soluciones buffer: Tris-HCl, HEPES y fosfato, cada buffer contenía 0,1 M con KCl 1 mM, EDTA 2 mM y Polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1,5% se ajustó a pH 7.5, se extrajo por 4 horas a 4 °C; pasado este tiempo se centrifugó a 10.000 gravedades por 5 minutos, la fase acuosa resultante se precipitó toda la noche a 4 °C con sulfato de amonio al 70% (27). Después se centrifugó a 10.000 gravedades por 10 minutos a 4°C y el pellet se resuspendió en cada uno de los buffers evaluados, posteriormente se dializó en membrana de diálisis (Spectra/Por® 6 MWCO 1KDa) por 4 horas a 4°C, luego se cuantificó con el método de ácido bicinconinico (BCA) y se realizó electroforesis.

3. Obtención de proteína:

Se realizaron 3 métodos para obtener la proteína:

3.1.1 Sulfato de amonio:

10 De este material vegetal se tomó 1 g para realizar la extracción con buffer fosfato 0,1 M con KCl 1 mM, EDTA 2 mM y Polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1,5% y a un pH 7.5(27),se dejó en extracción a 4 °C por 4 horas, después se centrifugó a 10.000 gravedades por 5 min a 4 °C, el extracto acuoso obtenido se precipitó toda la noche a 4°C con sulfato de amonio al 70% agregándolo en polvo y disolviéndolo (27). Pasado este tiempo se centrifugó a 10.000 gravedades por 10 minutos a 4°C y el pellet se resuspendió en buffer fosfato, posteriormente se dializó en unamembrana de diálisis (Spectra/Por® 6 MWCO 1KDa) con buffer fosfato a 4°C por 4 horas, finalmente el extracto dializado se pasa por un filtro de 0,22 µm.

Este procedimiento de precipitación de la proteína con sulfato de amonio se utiliza para realizar los ensayos de actividad antimicrobiana y para la cromatografía.

3.2TCA-Acetona:

Las semillas y hojas de Pentacalia nítida se maceraron en nitrógeno líquido, luego se les agregó 0,0025g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) por cada 1 g de material vegetal, posteriormente a este material vegetal se le realizaron 3 lavados con acetona fría, centrifugando a 10.000 gravedades por 3 min a 4°C entre cada lavado.

Por cada 0,1 g de material vegetal se adicionó 1 ml de buffer fosfato con 1,5% PVPP, 10mM KCl y 2 mM EDTA, pH 7.5, se dejó en extracción por 2 horas a 4°C, después se centrifugó a 12.000 gravedades por 20 minutos a 4°C al sobrenadante se adicionó la solución de precipitación que contiene 10% de ácido tricloroacetico (TCA) y 0,07% de betamercaptoetanol en 2 ml de acetona fría, luego se sonicó la muestra por 30 min y se dejó precipitar toda la noche a -20°C. Después se centrifugó a 12.000 gravedades por 20 minutos a 4 °C, se descartó el sobrenadante y al pellet se le realizó tres lavados con 400 µL de acetona fría centrifugando a 10.000 gravedades por 5 minutos a 4°C entre cada lavado, finalmente el remanente de acetona presente en el pellet se dejó secar y este se resuspendió en buffer fosfato (29).

3.3Fenol-Tris:

11 dejó toda la noche a -20°C, después se centrifugó a 10.000 gravedades por 10 min, se realizaron 3 lavados con solución de precipitación fría y un lavado con acetona fría, se deja secar el pellety resuspendió (30).

4. Cromatografía:

Se realizó cromatografía en columna de intercambio iónico Q- Sepharose, con flujo de 4,5 ml/ min, volumen de 5 ml; La columna previamente fue equilibrada con buffer fosfato 500 mM pH 7.5, se añadió 1 ml del extracto proteico acuoso de las hojas de la planta que se obtuvo por el método de sulfato previamente descrito. Las proteínas se eluyeron de la columna con buffer fosfato 500 mM con NaCl pH 7.5, con 2 gradientes 50% y 100% del buffer eluyente, se monitoreó la absorbancia de las proteínas eluidas a 280 nm.

5. Electroforesis:

Se realizó electroforesis de una dimensión SDS-PAGE con el sistema de Laemmli (31) en cámara de electroforesis Mini-PROTEAN® Tetra cell, a partir de los extractos proteicos acuosos de semillas y hojas obtenidos por los métodos de: TCA-Acetona, fenol-Tris y sulfato de amonio, también de las tres soluciones buffer: Tris-HCl, HEPES y fosfato; se llevaron a cabo en geles del 12% de acrilamida, se corrieron a 120 V constantes por aproximadamente 1 hora y fueron teñidos con azul de Comassie (32) y con plata (33). El peso molecular de las proteínas se determinó por la comparación de la movilidad electroforética de la muestra con el patrón.

6. Cuantificación de Proteína:

Las proteínas obtenidas por los diferentes métodos que se llevaron a cabo en el trabajo, se cuantificaron por el método del BCA por sus siglas en ingles ácido binciconico, se realizó según el protocolo del Kit de Thermo Scientific: Pierce Microplate BCA Protein Assay Kit No. 23252. (34).

7. Actividad antimicrobiana:

12 7.1Prueba Difusión en agar:

7.1.1 Bacterias:

A 1 ml de la bacteria con105 UFC/ ml se le adicionó 7 ml de agar semisólido Tripticasa soya (TSA), se homogenizó y se agregó a una caja de Petri con agar TSA para Escherichia coli, Staphylococcus aureus y TSA suplementado con 0,6% de extracto de levadura para Listeria monocytogenes, después de que el agar se solidificó se realizaron pozos con una pipeta Pasteur y se agregó 50 µL de: Extracto proteico acuoso de hojas o semillas, control positivo se usa Cloranfenicol (1 mg/ml) y control negativo Buffer Fosfato pH 7.5 en cada pozo (35), se realizó por triplicado.

7.1.2 Hongos:

Los hongos se sembraron por punción central en agar papa dextrosa (PDA) suplementado con cloranfenicol al 0,02%, se incubaron por 5 días y después de este tiempo los hongos presentaron un crecimiento radial de aproximadamente 4 cm; se realizaron pozos en el agar con una pipeta Pasteur y se agregó 50 µL de: Extracto proteico acuoso de hojas o semillas, control positivo se usa Terbinafina 2,5 mg/ml y control negativo Buffer Fosfato pH 7,5 en cada pozo (35), se realizó por triplicado.

7.2Microdilución con cloruro de 2, 3, 5, - trifenil-tetrazolio (TTC):

13 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Identificación de la planta:

La planta Pentacalia nítida fue identificada en el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana donde le asignaron el siguiente número de identificación HPUJ: 27544, estableciendo que efectivamente era el género Pentacalia y especie nítida.

2. Extracción de las proteínas de las hojas y semillas de P. nítida:

Para realizar la extracción de las proteínas de la planta es necesario hacer lisis de los tejidos pues las células vegetales son complejas, ricas en polisacáridos y otros compuestos que son difíciles de destruir, la forma más común de realizarlo es utilizando maceración con nitrógeno líquido que minimiza la degradación de la proteína, además el éxito de la extracción de la proteína depende de la fineza del polvo del tejido obtenido (37), por esto en las tres metodologías evaluadas se maceró el material vegetal con nitrógeno líquido, ya que es ampliamente usado en protocolos para extracción de proteínas de tejidos vegetales (30, 38).

14 Tabla 1: Concentración de la proteína de hojas de Pentacalia nítida extraída con 3 soluciones buffer, y precipitada con sulfato de amonio. Cuantificación con BCA, se realizó por triplicado.

En un estudio realizado por Chun y colaboradores en 2007, donde se extrajeron y aislaron proteínas del tipo globulinas a partir de semillas de soya, evaluaron diferentes pH (7.5, 8, 8.5 y 9) para el buffer de extracción Tris-HCl, y establecieron que el mayor porcentaje de proteína que se recuperó fue con el buffer pH 8.5 y con pH 7.5 se obtuvo el menor valor de proteína (40); comparando con los resultados obtenidos en este trabajo el pH del buffer Tris-HCl no fue el más adecuado, puesto que a pH mas alcalinos se extrae mayor proteína y al ser interferente con el método de cuantificación no es el ideal para la extracción.

El buffer fosfato es el más apropiado para la extracción de proteínas a partir del material vegetal de Pentacalia nítida pues presenta una alta concentración de proteína y en el corrido electroforético este buffer permitió definir mas bandas comparando con los otros dos buffers evaluados, como se observa en la figura 13 del anexo donde se realizó electroforesis a partir de los 3 buffers de extracción.

3. Obtención de proteínas y perfiles electroforéticos:

Los primeros resultados obtenidos en el trabajo presentaron problemas al obtener el perfil electroforético de los extractos proteicos acuosos por precipitación con sulfato de amonio, debido a que no se tenía una resolución de bandas, entonces fue necesario buscar otros métodos que permitieran definir el perfil, por tal razón se compararon los 3 métodos: TCA-Acetona, fenol-Tris y sulfato de amonio, estos diferentes métodos de obtención de proteína se evaluaron con el fin de determinar cual permitía una mayor recuperación de la proteína y una mejor definición del perfil electroforético.

Buffer Proteína µg/ml Tris-HCl 134 ± 20

HEPES 182,3 ± 6,6

15 Las plantas son ricas en metabolitos secundarios que interfieren con la separación de las proteínas afectando la calidad de la electroforesis, la expresión de estos depende de la edad y el desarrollo de la planta; compuestos como los fenoles pueden construir complejos irreversibles con las proteínas, además la oxidación de compuestos fenólicos puede generar puntos en electroforesis de 2 D (37) por eso para evitar estas interferencias con compuestos fenólicos, el buffer de extracción usado contenía Polivinilpolipirrolidona (PVPP), un polímero de adsorción selectiva de polifenoles, mediante la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos fenólicos y el oxígeno del grupo amida del anillo pirrolidona (41) este compuesto permite desde el momento de la extracción eliminar los polifenoles del material vegetal.

Los métodos para extraer proteínas deben ser reproducibles para todos los tipos de plantas y con poca contaminación de otras moléculas, en cuanto a los métodos de TCA-Acetona y fenol-Tris son ampliamente reportados para electroforesis de 2D (29). El método de TCA- Acetona permite inhibir las proteasas, fenolidasa y peroxidasas, la forma en que se precipita la proteína se debe a que la proteína se desnaturaliza en el medio ácido dado por el ácido tricloroacético y esta se precipita al exponer sus residuos insolubles (37); este método se considera compatible con una gran variedad de tejidos de plantas, es desnaturalizante e inhibe las proteasas que podrían afectar la muestra de proteínas (30) por esta razón los extractos obtenidos con este método no se usaron para determinar actividad antimicrobiana puesto que al desnaturalizar la proteína su actividad biológica se pierde.

El método del fenol-Tris es un método alternativo al de TCA-Acetona ya que permite retirar lípidos, polisacáridos y compuestos fenólicos que son interferentes en la electroforesis (30), de acuerdo a los resultados obtenidos este método no resultó eficiente pues no se logró una definición de bandas como se observa en la figura 1 y 2. Lo que no concuerda con lo reportado de este método, ya que es un método eficiente para proteómica (30).

Tabla 2: Concentración de la proteína de hojas y semillas de Pentacalia nítida extraída con 3 métodos diferentes para realizar la electroforesis, cuantificado por medio del protocolo BCA

TCA-Acetona Proteína µg/ml Sulfato Proteína µg/ml Fenol Proteína µg/ml

Hojas 494,71±17,85 1435,42±12,85 3109±10,71

16 Según los resultados obtenidos en la cuantificación de proteína mediante los métodos desarrollados para definir el perfil electroforético (ver la tabla 2), la mayor concentración se obtuvo con el método de fenol-Tris, lo que no concuerda con los resultados obtenidos en los geles de electroforesis (figura 1 y2) donde este método no definió el perfil electroforético comparándolo con los otros 2 métodos, lo que indica que con fenol-Tris no se logró una recuperación alta de las proteínas, lo que sugiere que el método de cuantificación puede ser interferente con fenol-Tris. Por otra parte la concentración de proteína de los extractos acuosos de semillas presenta valores similares entre los métodos de TCA-Acetona y sulfato, lo que indica que con estos dos métodos se obtiene una recuperación de proteínas semejantes.

Figura 1: Electroforesis SDS PAGE, gel 12%, doble tinción: Azul de Comassie y plata. Extractos de Hojas de Pentacalia nitida por el método de TCA-Acetona, Sulfato de Amonio y Fenol-Tris.

TCA-Acetona Sulfato de Amonio

17 En la figura 1 donde se muestran los perfiles electroforéticos de las hojas de P. nitida; el método de sulfato de amonio y TCA-acetona mostraron el mismo número de bandas, algunas de las bandas son similares en los dos métodos, pero con el método de TCA-acetona se logró definir bandas de alto peso molecular y de bajo peso molecular como de 9, 8 y 6 KDa que no se obtuvieron por el método del sulfato de amonio, mientras con el de sulfato de amonio se logró definir un banda 4 KDa. En cuanto al método de fenol-Tris no se definieron tantas bandas como con los obtenidos con los otros 2 métodos.

Figura 2: Electroforesis SDS PAGE, gel 12%, doble tinción: Azul de Comassie y plata. Extractos de Semillas de Pentacalia nitida por el método de Sulfato de Amonio y TCA-Acetona.

En la figura 2 los perfiles electroforéticos de las semillas de la planta obtenidos por el método de sulfato de amonio y el de TCA- Acetona permite definir bandas con pesos moleculares similares: 91, 68, 50 y 24 KDa; el método de TCA- Acetona al igual como sucedió con el perfil obtenido de las hojas se logran obtener bandas de alto peso molecular respecto al perfil que se obtuvo con el método de sulfato de amonio. Comparando con el perfil electroforético de las hojas, el de las semillas no presentó proteínas de menos de 7 KDa.

Para complementar el perfil electroforético de los extractos proteicos de semillas y hojas de la planta se realizó electroforesis con Tricina (Tricina SDS-PAGE), este método permite separar proteínas con pesos moleculares entre 1 a 100 KDa ya que la acrilamida en el gel se encuentra en baja concentración, permitiendo la separación de proteínas de bajo peso molecular (42). En el anexo en la figura 14 donde este electroforesis definió proteínas de bajo peso molecular tanto en el extracto de semillas y hojas obtenidos por precipitación con sulfato de amonio, con las semillas

18 no se definió tantas bandas como con hojas, las bandas de bajo peso molecular que se definieron fue de 16 KDa para hojas y en semillas una de 19 KDa.

4. Cromatografía:

Con el fin de complementar el trabajo de grado se realizó cromatografía de intercambio aniónico en la que se obtuvieron 3 picos, en el primero se separaron aquellas proteínas que no se retuvieron en la columna es decir, aquellas con carga positiva o sin carga; para el segundo pico se eluyó la columna con 50% de buffer fosfato con NaCl 500 mM y 50% de buffer fosfato, en este se separaron las proteínas que poseían carga negativa pero no son fuertemente retenidas por la columna; en el tercer pico se eluyó la columna con 100% de buffer fosfato con NaCl 500mM y en este se separaron aquellas proteínas que poseían una carga negativa alta y se adhirieron fuertemente a la columna.

Figura 3: Cromatografía de intercambio aniónico del extracto proteico acuoso de hojas de Pentacalia nitida en columna Sepharosa, fase móvil buffer Fosfato 0,05 M pH 7.5 y buffer

eluyente Fosfato pH 7.5 NaCl 500 mM con flujo de 4,5 ml/min.

19 proteínas por cargas, lo que permitiría determinar en que fracción se encuentra las proteínas que tengan actividad antimicrobiana.

5. Ensayos de actividad antimicrobiana:

El método de difusión en agar es ampliamente usado para detectar la actividad antimicrobiana de una sustancia y el método de microdilución en microplaca con TTC es considerado como una alternativa a los métodos en caja de Petri, ya que son útiles para determinar la concentración mínima inhibitoria de los extractos. Se ha sugerido que este método de microdilución se emplee para determinar la actividad antimicrobiana de extractos de plantas como un método estándar y rápido (45), el método de microdilución con TTC que se realizó es sencillo y fácil de analizar pues permite probar el extracto proteico frente a varias bacterias al mismo tiempo y los resultados obtenidos cualitativamente son fáciles de interpretar.

Los extractos proteicos acuosos de hojas y semillas, no presentaron actividad frente a las bacterias y hongos fitopatógenos evaluados por los dos métodos, como se observa en el anexo en las figuras 1-11, así como de las fracciones obtenidas por cromatografía a partir de las hojas de la planta, no presentaron actividad ver el anexo figura 4.

El método de TTC es una sal de tetrazolio que permite detectar por coloración rojiza las células viables, puesto que el compuesto cloruro de 2,3,5,-trifenil-tetrazolio toma los hidrógenos liberados por la enzima deshidrogensa, que resultan de la reducción de las células vivas formándose el compuesto rojizo estable e insoluble llamado Trifenilformazan (46). Como se observa en la figura 4 y 8 del anexo donde la prueba de microdilución con TTC reveló que los extractos de las semillas y de las hojas así como las fracciones de la cromatografía no presentaron inhibición frente a las 3 bacterias que se probaron presentaron color rojo debido a que los microorganismos están viables.

21 CONCLUSIONES

Se obtuvo el extracto proteico acuoso a partir de las hojas y semillas de Pentacalia nítida y se determinó que el buffer fosfato extrae la mayor cantidad de proteína, permitiendo obtener una concentración de 657,3 µg/ml, respecto a la obtenida con HEPES de 182,3 µg/ml y Tris-HCl de 134 µg/ml; el buffer fosfato no presenta interferencias con el método de cuantificación de proteína por BCA.

Se definió el perfil electroforético a partir del extracto proteico acuoso de las hojas y semillas de Pentacalia nítida, por medio de 3 métodos: Sulfato de amonio, TCA-Acetona y Fenol-Tris, se obtuvo resultados similares con los métodos de sulfato de amonio y TCA-Acetona, mientras que con el método de Fenol-Tris no se obtuvo un perfil electroforético comparable con los otros dos métodos, de esta forma se complementa la información sobre P. nítida.

Se determinó que los extractos proteicos acuosos a partir de semillas y hojas según el protocolo de sulfato de amonio que se empleó en este trabajo no presentaron actividad antimicrobiana frente a las cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis spp. y Colletotrichum spp.

Se propuso el pre-tratamiento del material vegetal con acetona que permite una mejor definición del perfil electroforético de los extractos proteicos acuosos de hojas y semillas de P. nítida.

RECOMENDACIONES

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25 ANEXO

1. Actividad antimicrobiana:

Hojas de Pentacalia nítida Pruebas difusión en agar, Bacterias:

Figura 1: Prueba de difusión de agar E. coli frente a extracto crudo (Ext), Pico 1 (3), Pico 2 (18), Control positivo: Cloranfenicol 0,5 mg/ml (C+) y control negativo: buffer fosfato pH 7.5 (C-). Se realizó por triplicado.

Figura 2: Prueba de difusión de agar S. aureus frente a extracto crudo (Ext), Pico 1 (3), Pico 2 (18), Control positivo: Cloranfenicol 0,5 mg/ml (C+) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (C-). Se realizó por triplicado.

Figura 3: Prueba de difusión de agar L. monocytogenes frente a extracto crudo (Ext), Pico 1 (3), Pico 2 (18), Control positivo: Cloranfenicol 0,5 mg/ml (C+) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (C-). Se realizó por triplicado.

26 Figura 4: Prueba de inhibición con TTC frente a E. coli, S. aureus y L. monocytogenes frente al Extracto crudo de Hojas, fracciones: 3, 18, 23, 35 y control positivo Cloranfenicol (1mg/ml) y control negativo buffer fosfato pH7.5.m.o: Microorganismo-BHI:Caldo infusión cerebro corazón.

Semillas de Pentacalia nitida

Figura 5: Prueba por difusión en agar frente a S. aureus de Extracto crudo de Semillas 869 µg/mL (Ext), control positivo: Cloranfenicol 1 mg/ml (C+) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (C-). Se realizó por triplicado.

Figura 6: Prueba por difusión en agar frente a E. coli de Extracto crudo de Semillas 869 µg/mL (A), control positivo: Cloranfenicol 1 mg/ml (B) y control negativo: Buffer fosfato (C). Se realizó por triplicado.

E. coli

S. aureus

L. monocytogenes

Pico 1

Pico 2 f1

Pico 2 f2

Pico 3

BHI + m.o

Controles

BHI + m.o + BPS

Cloranfenicol+ m.o

Extracto

Extracto+BHI

BHI+Cloranfenicol

+m.o

B

C

27 Figura 7: Prueba por difusión en agar frente a L. monocytogenes de Extracto crudo de Semillas 869 µg/mL (A), control positivo: Cloranfenicol 1mg/ml (B) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (C). Se realizó por triplicado.

Prueba en Microplaca con TTC:

Figura 8: Prueba de inhibición con TTC frente a E. coli, S. aureus y L. monocytogenes frente al Extracto crudo de Hojas, Extracto crudo Hojas diluido (1/2), Extracto crudo de Semillas, Extracto crudo Semillas diluido (1/2), control positivo Cloranfenicol (1mg/ml) y control negativo buffer fosfato pH 7.5. -m.o: Microorganismo.-BHI: Caldo Infusión Cerebro Corazón.

Prueba difusión en agar, Hongos:

Figura 9: Prueba por difusión en agar frente a Fusarium oxysporum de Extracto crudo de Semillas (A), Extracto crudo Hojas (B), control positivo: Terbinafina 2,5 mg/ml (C) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (D). Se realizó por triplicado.

A

C

B

E. coli

S.

aureus

L.

monocytogenes

Controles

Ext Hojas 1/2

Ext Hojas

Ext Semillas

C

Ext Semillas 1/2

28 Figura 10: Prueba por difusión en agar frente a Collecotrichum de Extracto crudo de Semillas (A), Extracto crudo Hojas (B), control positivo: Terbinafina 2,5 mg/ml (C) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (D). Se realizó por triplicado.

Figura 11: Prueba por difusión en agar frente a Botrytis sp de Extracto crudo de Semillas (A), Extracto crudo Hojas (B), control positivo: Terbinafina 2,5 mg/ml (C) y control negativo: Buffer fosfato pH 7.5 (D). Se realizó por triplicado.

2. Cuantificación de Proteína:

Figura 12: Curva patrón BCA para cuantificación de proteínas. Absorbacia vs concentración (µg/mL).

B

D

A

C

D

A

29 3. Perfiles electroforéticos:

Figura 13: Electroforesis SDS PAGE, gel 12%, tinción con Azul de Comassie. Extractos de Hojas de Pentacalia nitida por el método de Sulfato de Amonio con diferentes buffers de extracción: HEPES

(H), Tris HCl (T) y Fosfato (F).

Figura 14: Electroforesis Tricina (Tricina SDS PAGE), gel 16% y 10%, tinción con Azul de Comassie y plata. Extractos de Hojas (H 2:1, H 3:1, H 4:1) y semillas (S 2:1, S 3:1 y S 4:1) de Pentacalia nitida