Estandarización de método de degradación de BTEX a
partir de interacción entre Bacillus Subtilis
W.J. Ruiz Ávila
aaPregrado en Ingeniería Ambiental, Universidad de los Andes, Colombia.
Abstract
Por medio de experimentación se buscó generar la estandarización del método de degradación de BTEX con microorganismos. Se utilizó la especie Bacillus subtilis y se estableció como metodo de medición la cromatografía de gases.El cromatógrafo tiene diferentes maneras de extraer los hidrocarburos de la muestra, sin embargo se exponen dos: extracción purga-trampa y micro-extracción en fase sólida (SPME). Para el montaje de la extracción purga-trampa se decide utilizar medio Bushnell Haas y se prepara 450mL mezclados con 50mL de
Bacillus subtilis en medio nutritivo BHI y 500ppm de gasolina comercial; el montaje para la micro-extracción en fase sólida se diferencia en que se utiliza el consorcio Bacillus subtilis, Enterobacter sp, Serratia fonticola y Pseudomonas fragi. Durante la medición se demostró la dificultad de medición para el método de extracción purga-trampa mediante un análisis estadístico que permitió encontrar diferencias a lo largo del tiempo de degradación, especialmente irregularidades en la degradación de alguno de los hidrocarburos. Para el caso de la medición con el método de micro-extracción se corroboró de una mejor manera la replicabilidad de los datos también con análisis estadístico, pero no se evidenció significativamente la degradación de los hidrocarburos, a lo cual se le atribuye la competitividad creada en el consorcio. Finalmente se evalúa el experimento como tal y se dejan estipuladas varias recomendaciones para mejorar el desarrollo de los procesos descritos en el documento.
Palabras clave: BTEX; Degradación; Bacillus subtilis; Consorcio; Cromatografía de Gases; SPME; Purga-trampa; Estandarización; Anova; Boxplot
1. Introducción
La gasolina está entre las claras fracciones líquidas del petróleo y consiste principalmente de hidrocarburos alifáticos y aromáticos. Entre los hidrocarburos alifáticos se encuentran los alcanos, alquenos y alquinos, sin embargo, la extensión del documento está centrada en los hidrocarburos aromáticos; basados en anillos bencénicos como unidad estructural que incluyen hidrocarburos monocíclicos como el benceno, tolueno, etilbenceno y los isómeros meta, orto y para -xileno (grupo BTEX). El porcentaje de estos compuestos en la gasolina es considerablemente alto en comparación con otro tipo de combustibles como el diésel, es por esto que se utilizan concentraciones de BTEX para detectar contaminación con gasolina [1]. Adicionalmente, estos compuestos han sido considerados como los mayores contribuidores en el deterioro de la calidad del agua y el aire, contando también con el efecto perjudicial que tienen estos compuestos en organismos vivos, la mayoría de los gobiernos han implementado estándares de calidad estrictos.
Consecuentemente, hay una necesidad urgente por el desarrollo de eficientes tecnologías que sean capaces de eliminar o minimizar las concentraciones de manera tal que se reduzca el efecto perjudicial prescrito [2]. En los últimos años se ha evidenciado un método que implica la eliminación de hidrocarburos aromáticos monocíclicos que consiste en la biodegradación a partir de microorganismos [3]. BTEX son altamente receptivos a interacciones microbianas y la degradación ocurre en condiciones aerobias [4-5]. Dentro del proceso de degradación se busca transformar el compuesto en un producto que resulte menos perjudicial tal como el catecol, para realizarse esta reacción interviene la bacteria y con ayuda de un plasmido o enzima propia genera el consumo y presión necesaria para oxidar el grupo metil y eventualmente las transformaciones necesarias para generar el producto benigno [6]. Particularmente, se ha encontrado que la familia
Bacillus sp. tiene las caracteristicas bioquimicas necesarias para realizar el proceso de biodegradación [7-13], y de esta especie se ha
encontrado la habilidad de producir surfactantes que permitan aumentar la solubilización de diferentes compuestos [14]. En este estudio se analizará el método de degradación más conveniente y la estandarización del método para futuros estudios.
2. Materiales y metodología
2.1. Microorganismos
Para el desarrollo de este documento se utilizó la especie Bacillus subtilis proveniente de humedales artificiales, y posteriormente almacenado mediante congelación en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental de la Universidad de Los Andes, Colombia [15].
2.2. Crecimiento
Los microorganismos fueron descongelados por 24 horas y sembrados en medio agar de soya tríptica (TSA) que ayuda al crecimiento de Bacillus subtilis. Se toman 250 uL de microorganismo y se siembran en el medio masivamente de forma tal que se evidencie su crecimiento 24 horas después de incubación a 35°C [16]. Después de corroborar cualitativamente el crecimiento del microorganismo se dispone a fortificar y duplicar el número de microorganismos existentes para llevar a cabo el proceso de degradación. Para este proceso se dispone a tomar pequeñas cantidades con asas y sembrarlas en 16 tubos de 25 mL de medio de infusión cerebro-corazón (BHI), el cual provee al microorganismo los nutrientes necesarios para su crecimiento; nitrógeno, vitaminas y fuente de carbono [17].
2.3. Medio de Cultivo
Al mismo tiempo que se preparan los tubos con el medio nutritivo, se dispone a preparar el medio de cultivo que permitirá la degradación de BTEX con ayuda de Bacillus subtilis. Este medio es conocido como Bushnell Haas y se ha caracterizado por tener las propiedades adecuadas que permiten la degradación de hidrocarburos a través del uso de microorganismos [18-21]. Se preparan frascos de 450 mL de medio con la siguiente composición por litro: 𝐾𝐻2𝑃𝑂4 (1.0g), 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 (1.0g), 𝐶𝐻4𝑁2𝑂 (1.0g), 𝑀𝑔𝑆𝑂4∙ 7𝐻2𝑂 (0.2g), 𝐹𝑒𝐶𝑙3 (0.05g), 𝐶𝑎𝐶𝑙2∙ 2𝐻2𝑂 (0.08g), 500ppm de
gasolina comercial y 50 mL de microorganismo en medio nutritivo. Para corroborar la efectividad de los microorganismos a degradar BTEX y con el fin de verificar que el método sea correcto, se preparan 6 frascos: 2 de los cuales son muestras que evaluaran degradación por contener gasolina, medio y microorganismo. ´Los siguientes dos contienen microorganismo y medio, los cuales servirán de blanco para el método al suponer que ni los microorganismos ni el medio contienen BTEX, y finalmente dos frascos que contienen medio y gasolina, éstos con el fin de considerar la posible volatilización de la gasolina en el medio y serán reconocidos a lo largo del documento como controles. Cabe anotar que se realizan dos muestras de cada experimento para replicar los resultados y asimismo verificarlos.
2.4. Cuantificación de degradación
Se utilizará para la medición de BTEX el cromatografo de gases Agilent 6890N, el cual tiene la capacidad de tomar lo gases de la muestra y caracterizar la cantidad de benceno, tolueno, etilbenceno y los isómeros meta, orto y para -xileno mediante diferentes sistemas capilares que retienen los gases, los calienta y los cuantifica [22]. Para la experimentación, se utilizarán tres tiempos de medición: tiempo 0; que representa el inicio de la degradación, y los siguientes tiempos que son a las 24 y a las 48 horas después de iniciada la degradación. Para aumentar el contacto entre microorganismos y gasolina en el momento de la degradación, durante las 48 horas se utilizo el sistema de mezcla Thermo Scientific MaxQ 3000, con agitación programada a 100 rpm y diámetro de orbita de 2.54 cm [23]. El cromatógrafo tiene diferentes maneras de extraer los hidrocarburos de la muestra, sin embargo en este documento se expondrán dos y se verificaran las diferencias encontradas entre los métodos.
2.4.1. Extracción Purga-Trampa
Este método de extracción es considerado más automático que los demás dado que la muestra es instalada en el equipo y éste desarrolla todo el procedimiento. La extracción tiene como referencia EPA5030B y funciona mediante el burbujeo de un gas inerte dentro de la muestra y transfiere los compuestos volátiles de una fase acuosa a una gaseosa, estos gases generados son llevados a una columna absorbente, y cuando es
terminado el proceso de purga la columna se calienta para luego llevar los compuestos al cromatógrafo de gas [24]. Sin embargo, este método tiene una restricción: la muestra no debe contenener ninguna particula sólida; lo cual lleva a que se elimine la biomasa de la muestra antes de ser llevada a la extracción, por lo que se utiliza el método a continuación descrito de separación de fase sólida-líquida.
2.4.1.1. Filtración a Vacio
Para este método se cuenta con un Erlenmeyer autoclavado, un sistema de embudo Büchner, un papel filtro y una bomba que permita la absorción del líquido dentro del Erlenmeyer. Al iniciar el bombeo, el líquido pasa a través del sistema mientras que las partículas sólidas son retenidas en el papel filtro [25]. Al finalizar el proceso se dispone la muestra totalmente líquida a almacenamiento y posteriormente al sistema de extracción purga-trampa.
2.4.2. Micro-Extracción en Fase Sólida
Este método difiere en el de extracción purga-trampa en que el proceso es manual y no requiere de una previa filtración para su procedimento. El proceso de extracción se genera a partir de una microfibra de 1-2 cm de longitud que está en el interior de una aguja para su protección. Esta aguja es inyectada en la muestra y la microfibra es expuesta, al estar dentro de la muestra la microfibra se comporta como una esponja ya que absorbe todo lo que se le rodee en el ambiente [26]. Para este proceso es necesario calentar la muestra a 50°C por 20 mins, luego se inyecta la fibra y se deja a exposición por 10 mins y finalmente se retrae la fibra dentro de la jeringa y se lleva la jeringa al cromatógrafo de gases para la inyección y exposición de la fibra a la columna.
Es importante aclarar que para este método se varió el proceso de degradación dado que se realizo un consorcio entre las siguientes especies: Bacillus subtilis, Enterobacter sp, Serratia fonticola y Pseudomonas fragi. Adicionalmente, se realizó dos veces el método de degradación pero se mantuvo la cantidad de medio utilizado y el número de replicas y muestras (seis en total).
2.5. Crecimiento post-degradación
Para verificar que los microorganismos se mantuvieran vivos las 48 horas después de la experimentación de degradación, se optó por realizar una siembra aislada tomando en el caso de la extracción purga-trampa parte del sólido retirado en el papel filtro y colocado en agar TSA, mientras que para la micro-extracción en fase sólida se tuvo que realizar diferentes medios selectivos para verificar cuales microorganismos se mantuvieron y cuales no.
3. Resultados y discusión
3.1. Cuantificación con método de Extracción Purga-Trampa
Para la cromatografía de gases se utilizó la muestra blanco para calibrar el equipo, después se midieron las muestras con sus replicas para cada compuesto y se verificó que el valor estuviera dentro de la curva de calibración. Es preciso destacar que la mayoría de las muestras tuvo que presentar una dilución con agua para que los valores entraran en esta curva; ésto evidentemente aumenta el error del experimento. Por convención de las tablas y gráficas se define M como muestra, MD como muestra diluida, MR como replica de muestra, MRD como replica de muestra diluida, C como control y CD como control diluido, además para los tiempos de medición se toma T0 como el tiempo inicial, 24h como las 24 horas después y 48h como las 48h después.
3.1.1. Benceno
Los resultados de las mediciones son observados en la Tabla 1, sin embargo, es necesario realizar pruebas estadísticas para evaluar el diseño experimental; se decide dividir los resultados en los tres tiempos, además se tiene en cuenta la muestra control sólo para el el tiempo inicial. Adicionalmente, se tienen en cuenta las diluciones por muestra como un dato del mismo tipo de población y se realiza inicialmente boxplot para evaluar cualitativamente las poblaciones, pero para tener una conclusión significativa se realiza anova de un factor para cada tiempo y así constatar la replicabilidad. En la prueba anova se tiene estandarizada como hipótesis nula que las medias de las diferentes poblaciones son iguales.
Tabla 1. Concentración de Benceno por muestra (ug/L)
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 1 las medianas son relativamente diferentes y los intercuartiles tienen diferente tamaño, lo cual genera inquietud de si las muestras realmente son iguales, teniéndose en cuenta que las tres muestras fueron realizadas de la misma manera y que cada una en teoría tiene la misma cantidad de gasolina y además todavía no se ha presentado la degradación al ser tiempo inicial de medición. La Fig 2 muestra una diferencia considerable para las 24 horas de degradación; primero en el tamaño de los intercuartiles por la diferencia que hay entre las
diluciones y segundo en la diferencia de las medianas ya que no son significativamente diferentes. La Fig 3 presenta lo esperado en cuanto al tamaño de los intercuartiles ya que al diluirse la concentración no debe variar, sin embargo, la diferencia de medianas entre la muestra original y la replica son representativas, además cabe anotar que no se consiguió tener un valor de dilución para la replica. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
Fig 1. Boxplot de concentraciones de benceno por muestra en T0
Fig 2. Boxplot de concentraciones de benceno por muestra para t=24h
M MD MR MRD C CD
T0 919.22 1096.51 821.37 714.25 876.75 986.83
24h 862.63 519.09 649.87 568.82 747.98 327.69
Fig 3. Boxplot de concentraciones de benceno por muestra para t=48h
La prueba anova con un factor separa las poblaciones por tipo de muestras, de esta manera se comparan las medias y se establece si existe al menos en uno de los grupos una media diferente de las otras. Adicionalmente, para todas las pruebas estadísticas se asume un nivel de significancia del 5%. Para el tiempo inicial se observa en la Fig 4 que el p-value da por encima de la significancia por lo que existe evidencia estadística para no rechazar la hipótesis nula. En el caso de la medición a las 24 horas se muestra
en la Fig 5 que el p-value es considerablemente mayor que la significancia, de esta manera también existe evidencia estadística para no rechazar la hipótesis nula. Finalmente, para el caso de medición a las 48 horas se muestra en la Fig 6 que el p-value es considerablemente menor que la significancia, por lo que se puede afirmar que existe evidencia significativa para rechazar la hipótesis nula, dando a corroborancia la diferencia considerable que se presentaba en la Fig 3.
Fig 4. Prueba Anova de concentraciones de Benceno por muestra para T0
Fig 5. Prueba Anova de concentraciones de Benceno por muestra para t=24h
Tabla 2. Porcentaje de remoción de benceno por muestra Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la degradación. De esta forma en los tres tipos de muestra clasificados se deduce el porcentaje de remoción de benceno para cada intervalo de tiempo, donde se toma como valor principal el promedio entre muestra y dilución; desde el tiempo inicial a las 24 horas, desde las 24 horas a las 48 horas y finalmente desde el tiempo inicial a las 48 horas. Se observa en la Tabla 2 que el control en la mayoría de los casos presentó mayor degradación que las muestras con microorganismo, lo cual genera preocupación ya que debe existir un error en el método utilizado.
3.1.2. Tolueno
Se realiza el mismo procedimiento estadístico del benceno, por lo que se presentan inicialmente los resultados en la Tabla 3.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 7 las medianas son relativamente diferentes y los intercuartiles tienen diferente tamaño, lo cual genera la incognita de si las muestras realmente son iguales a pesar de que la muestra y la replica tienen un comportamiento similar. La Fig 8 muestra una diferencia considerable para las 24 horas de degradación; en el tamaño de los intercuartiles por la diferencia que hay entre las diluciones, sin embargo en la diferencia de las medianas se observa que no son considerablemente diferentes. La Fig 9 presenta lo esperado en cuanto al tamaño de los intercuartiles ya que al diluirse la concentración no debe variar, sin embargo, la diferencia de medianas entre la muestra original y la replica son representativas, además cabe anotar que no se consiguió tener un valor de dilución para la replica. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
Tabla 3. Concentración de Tolueno por muestra (ug/L)
Fig 7. Boxplot de concentraciones de Tolueno por muestra en t0 Intervalo de t Original Replica Control
0-24 31.45 20.64 42.28
24-48 29.95 69.63 49.74
0-48 51.98 75.89 70.99
Porcentaje de remoción benceno por muestra (%)
M MD MR MRD C CD
T0 1468.96 1691.95 1561.55 1327.12 1589.62 1692.16 24h 1662.50 1034.32 1304.13 1142.80 1541.42 743.86
Fig 8. Boxplot de concentraciones de tolueno por muestra para t=24h
Fig 9 Boxplot de concentraciones de tolueno por muestra para t=48h Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición, para el tiempo inicial se observa en la Fig 4 que el p-value se encuentra por encima de la significancia así que existe evidencia estadística para no rechazar la hipótesis nula. En el caso de la medición a las 24 horas se muestra en la Fig 11 que el p-value es mayor que la significancia, de esta manera
también existe evidencia estadística para no rechazar la hipótesis nula. Finalmente, para el caso de medición a las 48 horas se muestra en la Fig 12 que el p-value es menor que la significancia, por lo que se puede afirmar que existe evidencia significativa para rechazar la hipótesis nula, corroborando así la diferencia vasta que se presentaba en la Fig 913.
Fig 12 Prueba Anova de concentraciones de Tolueno por muestra para t=48h
Tabla 4. Porcentaje de remoción de tolueno por muestra Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la degradación de tolueno. De esta forma en los tres tipos de muestra clasificados se deduce el porcentaje de remoción de tolueno para cada intervalo de tiempo, donde se toma como valor principal el promedio entre muestra y dilución; desde el tiempo inicial a las 24horas, desde las 24 horas a las 48 horas y finalmente desde el tiempo inicial a las 48 horas. Se observa en la Tabla 4 que el control en este caso presentó menor degradación que una de las muestras con microorganismo, mientras que la original presenta una degradación minúscula, atribuyéndose además que una de las muestras aumentó su concentración de tolueno en el tiempo y luego volvió a disminuir, lo cual causa preocupación debido a que se reitera el posible error en el método, especialmente en la obtención de la muestra.
3.1.3. Etilbenceno
Se realiza el mismo procedimiento estadístico del benceno, por lo que se presentan inicialmente los resultados en la Tabla 5.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 13 las medianas son prácticamente las mismas pero los intercuartiles tienen diferente tamaño, lo cual genera la pregunta de si las muestras realmente son iguales a pesar de la igualdad en las medianas. La Fig 14 no muestra una diferencia considerable para las 24 horas de degradación; solamente en el tamaño de los intercuartiles por la diferencia que hay entre las diluciones, sin embargo en la diferencia de las medianas se observa que son muy parecidas. La Fig 15 presenta la mayor diferencia de medianas, adicionalmente para el caso de la muestra original el tamaño de los intercuartiles es considerablemente alto comparado con los otros compuestos en el mismo espacio de tiempo, además cabe anotar que no se consiguió tener un valor de dilución para la replica. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
M MD MR MRD C CD
T0 295.40 268.8 357.2 225.8 314.2 239.9
24h 382.1 170.6 315.7 213.4 378.9 116.5
48h 234.8 172.7 72.2 - 225.3 54.1
Tabla 5. Concentración de Etilbenceno por muestra (ug/L)
Intervalo de t Original Replica Control
0-24 34.56 13.89 30.36
24-48 5.35 68.64 42.72
0-48 38.05 73.00 60.12
Al evaluar la prueba anova para los diferentes tiempos de medición se observa que en el tiempo inicial la Fig 16 evidencia que el p-value se encuentra por encima de la significancia así que existe evidencia estadística para no rechazar la hipótesis nula. En el caso de la medición a las 24 horas se muestra en la Fig 17 que el p-value es mayor que la significancia, de
esta manera también existe evidencia estadística para no rechazar la hipótesis nula. Finalmente, para el caso de medición a las 48 horas se muestra en la Fig 18 que el p-value es parecido a la significancia, por lo que se puede afirmar que existe evidencia significativa para rechazar la hipótesis nula, corroborando así la diferencia vasta que se presentaba en la Fig 15.
Fig 13. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno por muestra en t0
Fig 14 Boxplot de concentraciones de Etilbenceno por muestra en t=24h
Se destaca igualmente el rendimiento que tuvo el microorganismo en sí para generar la degradación de etilbenceno. De esta forma en los tres tipos de muestra clasificados se deduce el porcentaje de remoción de etilbenceno para cada intervalo de tiempo, donde se toma como valor principal el promedio entre muestra y dilución; desde el tiempo inicial a las 24horas, desde las 24 horas a las 48 horas y finalmente desde el tiempo inicial a las 48 horas. Se observa en la Tabla 6 que el control en este caso presentó menor degradación que una de las muestras con microorganismo, mientras que la original presenta una degradación minúscula, atribuyéndose además que la mayoría de las muestras aumentó su concentración de etilbenceno en el tiempo y luego volvió a disminuir, lo cual causa preocupación debido a
que se reitera el posible error en el método y en la forma de toma de muestras.
3.1.4. MP Xileno
Los resultados son presentados en la Tabla 7 y se realiza el mismo procedimiento que con los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 19 las medianas son prácticamente las mismas pero los intercuartiles tienen diferente tamaño, lo cual genera la duda de si las muestras realmente son iguales a pesar de la igualdad en las medianas. La Fig 20 no muestra una diferencia considerable para las 24 horas de degradación; solamente en el tamaño de los intercuartiles por la diferencia que hay entre las diluciones, sin embargo en la diferencia de las medianas se aprecia que son parecidas. La Fig 21 presenta la mayor diferencia de medianas. Fig 16. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno por muestra para T0
Fig 17. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno por muestra para t=24h
Fig 18. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno por muestra para t=48h
Intervalo de t Original Replica Control
0-24 2.03 9.24 10.60
24-48 26.28 72.72 43.60
0-48 27.78 75.24 49.58
Porcentaje de remoción etilbenceno por muestra (%)
Fig 19. Boxplot de concentraciones de MP Xileno por muestra en t0
Fig 20 Boxplot de concentraciones de MP Xileno por muestra en t= 24h
M MD MR MRD C CD
T0 1207.53 1139.8 1444.1 1009.9 1267.1 1019.4
24h 1537.6 777.6 1267.6 928.6 1508.3 570.4
48h 999.2 819.1 346.2 - 1010.2 320.9
Fig 21. Boxplot de concentraciones de MP Xileno por muestra en t= 48h Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición se observa que en el tiempo inicial la Fig 16 evidencia que el p-value se encuentra por encima de la significancia así que existe evidencia estadística para no rechazar la hipótesis nula. En el caso de la medición a las 24 horas se muestra en la Fig 17 que el p-value es mayor que la significancia, de esta manera también existe evidencia estadística
para no rechazar la hipótesis nula. Finalmente, para el caso de medición a las 48 horas se muestra en la Fig 18 que el p-value es parecido a la significancia, por lo que se puede afirmar que existe evidencia significativa para rechazar la hipótesis nula, corroborando así la diferencia vasta que se presentaba en la Fig 15.
Fig 22. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno por muestra para T0
Fig 23. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno por muestra para t=24h
Porcentaje de remoción MP Xileno por muestra (%)
Intervalo de t
Original
Replica
Control
0-24
31.78
8.06
9.09
24-48
-16.93
62.72
35.96
0-48
20.23
65.72
41.78
Tabla 8. Porcentaje de remoción de MP Xileno por muestra Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la degradación de MP xileno. De esta forma en los tres tipos de muestra clasificados se deduce el porcentaje de remoción de MP Xileno para cada intervalo de tiempo, donde se toma como valor principal el promedio entre muestra y dilución; desde el tiempo inicial hasta las 24 horas, desde las 24 horas hasta las 48 horas y finalmente desde el tiempo inicial hasta las 48 horas. Se observa en la Tabla 8 que el control en este caso presentó menor degradación que una de las muestras con microorganismo, mientras que la original presentó una degradación minúscula y en un caso presentó degradación negativa, es decir, formación del compuesto, lo que aumenta la preocupación del método ya que en los promedios no se había evidenciado una degradación negativa.
3.1.5. O Xileno
Los resultados son presentados en la Tabla 9 y se realiza el mismo procedimiento que para los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 25 las medianas son prácticamente las mismas pero los intercuartiles tienen diferente tamaño, lo cual genera la inquietud de si las muestras realmente son iguales a pesar de la igualdad en las medianas. La Fig 26 no muestra una diferencia considerable para las 24 horas de degradación; solamente en el tamaño de los intercuartiles por la diferencia que hay entre las diluciones, sin embargo en la diferencia de las medianas se aprecia que son parecidas. La Fig 27 presenta la mayor diferencia de medianas, adicionalmente para el caso de la muestra original el tamaño de los intercuartiles es razonable y demuestra la replicabilidad de las muestras, además cabe anotar que no se consiguió tener un valor de dilución para la replica. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
M MD MR MRD C CD
T0 629.2 596.4 732.3 540.6 662.6 550.3
24h 792.0 411.2 594.9 444.9 716.6 303.6
48h 486.5 446.9 162.4 - 574.1 207.1
Tabla 9. Concentración de O Xileno por muestra (ug/L)
Fig 26. Boxplot de concentraciones de O Xileno por muestra en t=24h
Fig 27. Boxplot de concentraciones de O Xileno por muestra en t=48h Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición se observa que en el tiempo inicial la Fig 28 evidencia que el p-value se encuentra por encima de la significancia así que existe evidencia estadística para no rechazar la hipótesis nula. En el caso de la medición a las 24 horas se muestra en la Fig 29 que el p-value es mayor que la significancia, de esta manera también existe evidencia estadística
para no rechazar la hipótesis nula. Finalmente, para el caso de medición a las 48 horas se muestra en la Fig 30 que el p-value es inferior a la significancia, por lo que se puede afirmar que existe evidencia significativa para rechazar la hipótesis nula, corroborando así la alta diferencia que se presentaba en la Fig 27.
Porcentaje de remoción O Xileno por muestra (%)
Intervalo de t
Original
Replica
Control
0-24
1.83
18.31
15.89
24-48
22.42
68.77
23.42
0-48
23.84
74.49
35.59
Tabla 10. Porcentaje de remoción de O Xileno por muestra Se destaca igualmente el rendimiento que
tuvo el microorganismo en sí para generar la degradación de O xileno. De esta forma en los tres tipos de muestra clasificados se deduce el porcentaje de remoción de O Xileno para cada intervalo de tiempo, donde se toma como valor principal el promedio entre muestra y dilución; desde el tiempo inicial hasta las 24horas, desde las 24 horas hasta las 48 horas y finalmente desde el tiempo inicial hasta las 48 horas. Se observa en la Tabla 10 que el control en este caso presentó menor degradación que una de las muestras con microorganismo, mientras que la original presentó una degradación minúscula. Lo que genera finalmente preocupación del método es que para todos los compuestos se notó la misma tendencia, especialmente para las 48 horas donde se rechazaron las hipótesis nulas. Dada esta tendencia y los errores contemplados en cada compuesto se puede verificar que existe un error en el método. Sin embargo, se verificó el crecimiento de los microorganismos a las 48h y resultó en ser masivo como la siembra inicial.
3.2. Cuantificación con método de Micro-Extracción en Fase Sólida
Para la cromatografía de gases se utilizó la muestra blanco para calibrar el equipo, después
se midieron las muestras con sus replicas para cada compuesto y se verificó que el valor estuviera dentro de la curva de calibración. Es preciso destacar que para todas las muestras se tuvo que presentar una dilución con agua de dos en 25 mL para que los valores entraran en esta curva, lo cual evidentemente aumenta el error del experimento. Finalmente se aclara nuevamente que se utilizó el consorcio en todo este método y que se realizaron dos muestras con sus replicas así como dos controles y sus replicas para tener más claridad de la estandarización del método y su comportamiento. Por convención de las tablas y gráficas se define M1 como muestra 1, M2 como muestra 2, M1R como replica de muestra 1, M2R como replica de muestra 2, C1 como control de la primera muestra, C1R como replica del control de la primera muestra, C2 como control de la segunda muestra y C2R como la replica del control de la segunda muestra, además para los tiempos de medición se toma T0 como el tiempo inicial, 24h como las 24 horas después y 48h como las 48h después. Finalmente se aclara que este método busca evaluar la estandarización más no la degradación, especialmente porque se genera la experimentación con el consorcio y no se tuvo la oportunidad de evaluar individualmente el microorganismo para saber si generaba la degradación de esta manera.
Fig 29. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno por muestra para t=24h
3.2.1. Benceno
Los resultados de las mediciones son observados en la Tabla 11. Concentración de Benceno por muestra (ug/L), sin embargo, es necesario realizar pruebas estadísticas para evaluar el diseño experimental; se decide dividir los resultados en los tres tiempos y en la experimentación, es decir, se evaluará la muestra 1 y el control 1 con sus replicas, y posteriormente la muestra 2 y el control 2 con sus replicas. Para el análisis estadístico se realiza inicialmente boxplot para evaluar cualitativamente las poblaciones, pero para tener una conclusión significativa se realiza anova de un factor para cada tiempo y muestra para constatar la replicabilidad. En la prueba anova se desarrolla como hipótesis nula que las medias de las diferentes poblaciones son iguales.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 31 las medianas son diferentes y los intercuartiles tienen diferente tamaño, sin embargo los intercuartiles presentan un menor tamaño en comparación con el anterior método, siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación se ve una pequeña igualdad, cabe anotar que por cuestiones del laboratorio la muestra 1 no arrojó ningún valor de benceno. La Fig 32 muestra una diferencia considerable para la segunda experimentación en el tiempo inicial, sin embargo
el tamaño de los cuartiles también es minúsculo en comparación con el anterior método. La Fig 33 presenta la mayor diferencia de medianas, adicionalmente para el caso de la muestra original el tamaño de los intercuartiles es realmente pequeño y demuestra la replicabilidad de las muestras, dado que se evalúan las 24 horas y no se demuestra una diferencia significativa se observa que no hay degradación por parte del consorcio. La Fig 34 que es la experimentación 2 a las 24 horas tampoco muestra un grado de degradación, sin embargo muestra valores más altos de concentración de benceno, lo cual genera preocupación dado que las cantidad añadidas de gasolina por experimento fue la misma, asimismo se observa que las muestras generan tamaños de intercuartiles considerables y que ayudan a verificar la estandarización del método. La Fig 35 muestra medianas diferentes pero tamaño de intercuartil insignificante para control y muestra, igualmente al evaluar las 48 horas no se evidencia un cambio severo en la concentración de benceno. Finalmente, la Fig 36 muestra valores más altos de concentración que el experimento 1, pero comparado con las 24 horas se evidencia un cambio minúsculo en la concentración. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 - 698.0 469.8 697.5 457.5 597.5 599.3 944.3
24h 653.0 648.5 755.1 870.4 1144.0 1144.6 1010.5 1077.1
48h 646.9 697.1 755.1 870.4 1010.5 1077.1 1011.8 971.4
Tabla 11. Concentración de Benceno por muestra (ug/L)
Fig 34. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 2 en t=24h Fig 32. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 2 en t0
Fig 35. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 1 en t=48h
Fig 36. Boxplot de concentraciones de Benceno para Experimento 2 en t=48h
Al evaluar la prueba anova para los diferentes tiempos de medición y diferentes experimentos se observa que para todos los tiempos la relación del control y las muestras cada una con sus replicas hace que no se rechace
la hipótesis nula en ningún momento (Fig 37-42), lo cual concuerda ya que se está examinando la estandarización y aunque no se realizó una degradación per se, sí se evidenció la replicabilidad para el caso del benceno.
Fig 38. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 2 para T0
Fig 39. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 1 para t=24h
Fig 40. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 2 para t=24h
Fig 41. Prueba Anova de concentraciones de Benceno de Experimento 1 para t=48h
3.2.2. Tolueno
Los resultados son presentados en la Tabla 7 y se realiza el mismo procedimiento que para el compuesto anterior.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 43 las medianas son diferentes y los intercuartiles tienen diferente tamaño, sin embargo los intercuartiles presentan un menor tamaño en comparación con el anterior método, siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación se ve una pequeña igualdad. La Fig 44 muestra una diferencia considerable para la segunda experimentación en el tiempo inicial, sin embargo el tamaño de los cuartiles también es minúsculo en comparación con el anterior método. La Fig 45 presenta la mayor diferencia de medianas, adicionalmente para el caso de la muestra original el tamaño de los intercuartiles es realmente pequeño y demuestra la replicabilidad de las muestras, especialmente para las muestras de degradación dado que se evalúan las 24 horas y
no se demuestra una diferencia significativa se observa que no hay degradación por parte del consorcio. La Fig 46 que es la experimentación 2 a las 24 horas tampoco muestra un grado de degradación, sin embargo muestra valores más altos de concentración de tolueno, lo cual genera preocupación dado que la cantidad añadida de gasolina por experimento fue la misma, asimismo se observa que las muestras generan tamaños de intercuartiles considerables y que ayudan a verificar la estandarización del método. La Fig 47 muestra medianas diferentes pero tamaño de intercuartil insignificante para control y muestra, igualmente al evaluar las 48 horas no se evidencia un cambio considerable en la concentración de tolueno. Finalmente, la Fig 48 muestra valores más altos de concentración que el experimento 1, pero comparado con las 24 horas se evidencia un cambio minúsculo en la concentración. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 654,50 2012,8 1536,4 1638,4 2339,6 2347,8 2265,9 3019,4
24h 1655,9 1634,9 1648,1 1995,0 3573,6 3523,5 3719,8 3538,6
48h 1627,1 1658,1 1821,5 1747,1 2629,6 2719,5 2968,6 3297,3
Tabla 12. Concentración de Tolueno por muestra (ug/L)
Fig 44. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 2 a t0
Fig 46. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 2 para t=24h
Fig 47. Boxplot de Concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para t=48h
Al evaluar la prueba anova para los diferentes tiempos de medición y diferentes experimentos se observa que para todos los tiempos la relación del control y las muestras cada una con sus replicas hace que no se rechace
la hipótesis nula en ningún momento (Fig 49-53), lo cual concuerda ya que se está examinando la estandarización y aunque no se realizó una degradación per se, sí se evidenció la replicabilidad para el caso del tolueno.
Fig 49. Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para T0
Fig 50. Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 2 para T0
Fig 51. Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para t=24h
Fig 52.Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 2 para t=24h
Fig 53. Prueba Anova de concentraciones de Tolueno de Experimento 1 para t=48h
3.2.3. Etilbenceno
Los resultados son presentados en la Tabla 7 y se realiza el mismo procedimiento que para los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 4355 las medianas son diferentes y los intercuartiles tienen diferente tamaño, sin embargo los intercuartiles presentan un menor tamaño en comparación con el anterior método, ya que siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación se ve una pequeña igualdad. La Fig 56 muestra una diferencia considerable para la segunda experimentación en el tiempo inicial, sin embargo el tamaño de los cuartiles también es minúsculo en comparación con el anterior método. La Fig 57 presenta la menor diferencia de medianas, adicionalmente para el caso de la muestra original el tamaño de los intercuartiles es realmente pequeño y demuestra la replicabilidad de las muestras, especialmente para las muestras de degradación dado que se evalúan las 24 horas
y no se demuestra una diferencia significativa se observa que hay poca degradación por parte del consorcio. La Fig 58 que es la experimentación 2 a las 24 horas tampoco muestra un grado considerable de degradación, sin embargo muestra valores más altos de concentración de etilbenceno, lo cual genera preocupación dado que las cantidad añadida de gasolina por experimento fue la misma, asimismo se observar que las muestras generan tamaños de intercuartiles considerables y que ayudan a verificar la estandarización del método, y que podría existir un error de medición del experimento 2 ya que los compuestos en general presentan ese incremento severo de concentración después de las 24 horas. La Fig 4759 y Fig 60 muestra tamaños de intercuartil pequeños y las medianas están muy cercanas. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 654,5 311,3 328,5 285,1 494,8 463,6 347,3 456,8
24h 222,5 224,4 204,9 304,6 602,3 587,6 594,3 541,3
48h 213,0 211,3 242,1 241,5 364,0 379,1 424,1 494,9
Tabla 13. Concentración de Etilbenceno por muestra (ug/L)
Fig 56. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t0
Fig 58. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=24h
Fig 60. Boxplot de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=48h
Fig 61. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para T0
Fig 62. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para T0
Fig 63. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para t=24h Al evaluar la prueba anova para los
diferentes tiempos de medición y diferentes experimentos se observa que para todos los tiempos la relación del control y las muestras cada una con sus replicas hace que no se rechace la hipótesis nula en la mayoría de los casos (Fig 61-64), lo cual concuerda ya que se está examinando la estandarización y aunque no se
realizó una degradación per se, sí se evidenció la replicabilidad para el caso del etilbenceno. Para el caso de la Fig 65 se rechaza la hipótesis nula dado que el tamaño de intercuartil es tan pequeño que a pesar de tener una diferencia de medianas relativamente baja no se considera estadísticamente significativa. La Fig 66 presenta significancia como en la mayoría de los casos.
Fig 64. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=24h
Fig 65. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 1 para t=48h
Fig 66. Prueba Anova de concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=48h
3.2.4. MP Xileno
Los resultados son presentados en la Tabla 14 y se realiza el mismo procedimiento que para los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig 67 las medianas son diferentes y los intercuartiles tienen diferente tamaño, sin embargo los intercuartiles presentan un menor tamaño en comparación con el anterior método, siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación se ve una igualdad. La Fig 68 muestra una diferencia considerable para la segunda experimentación en el tiempo inicial, sin embargo el tamaño de los cuartiles también es minúsculo en comparación con el anterior método. La Fig 69 presenta la menor diferencia de medianas, adicionalmente para el caso de la muestra original el tamaño de los intercuartiles es realmente pequeño y demuestra la replicabilidad de las muestras, especialmente para las muestras de degradación dado que se evalúan las 24 horas y
no se demuestra una diferencia significativa se observa que hay poca degradación por parte del consorcio. La Fig 70 que es la experimentación 2 a las 24 horas tampoco muestra un grado considerable de degradación, sin embargo muestra valores más altos de concentración de MP Xileno, lo cual genera preocupación dado que la cantidad añadida de gasolina por experimento fue la misma, asimismo se observa que las muestras generan tamaños de intercuartiles considerables y que ayudan a verificar la estandarización del método, y que podría existir un error de medición del experimento 2 ya que los compuestos en general presentan ese incremento severo de concentración después de las 24 horas. La Fig 71 y Fig 72 muestra tamaños de intercuartil pequeños y las medianas están muy cercanas. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 3250,1 1470,3 1675,5 1399,5 2380,4 2246,5 1709,0 1982,3
24h 1139,0 1131,8 1085,5 1459,3 2542,1 2479,8 2506,9 2332,1
48h 1097,0 1081,6 1203,3 1200,3 1684,0 1725,4 1913,6 2214,4
Fig 67. Boxplot de Concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t0
Fig 69. Boxplot de Concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t=24h
Fig 72. Boxplot de Concentraciones de Etilbenceno de Experimento 2 para t=48h Fig 71. Boxplot de Concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t=48h
Al evaluar la prueba anova para los diferentes tiempos de medición y diferentes experimentos se observa que para todos los tiempos la relación del control y las muestras cada una con sus replicas hace que no se rechace la hipótesis nula en la mayoría de los casos (Fig 73-76), lo cual concuerda ya que se está examinando la estandarización y aunque no se
realizó una degradación per se, sí se evidenció la replicabilidad para el caso del MP Xileno. Para el caso de la Fig 77 se rechaza la hipótesis nula dado que el tamaño de intercuartil es tan pequeño que a pesar de tener una diferencia de medianas relativamente baja no se considera estadísticamente significativa. La Fig presenta significancia como en la mayoría de los casos.
Fig 73. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para T0
Fig 74. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 2 para T0
Fig 75. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 1 para t=24h
Fig 76. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 2 para t=24h
3.2.5. O Xileno
Los resultados son presentados en la Tabla 15. Concentración de O Xileno por muestra (ug/L) y se realiza el mismo procedimiento que para los compuestos anteriores.
Para el caso de los boxplots se observa que en la Fig las medianas son diferentes y los intercuartiles tienen diferente tamaño, sin embargo los intercuartiles presentan un menor tamaño en comparación con el anterior método, siendo el tiempo inicial el periodo de evaluación se ve una pequeña igualdad. La Fig muestra una diferencia considerable para la segunda experimentación en el tiempo inicial, sin embargo el tamaño de los cuartiles también es minúsculo en comparación con el anterior método. La Fig presenta la menor diferencia de medianas, adicionalmente para el caso de la muestra original el tamaño de los intercuartiles es realmente pequeño y demuestra la replicabilidad de las muestras, especialmente para las muestras de
degradación dado que se evalúan las 24 horas y no se demuestra una diferencia significativa se observa que hay poca degradación por parte del consorcio. La Fig que es la experimentación 2 a las 24 horas tampoco muestra un grado considerable de degradación, sin embargo muestra valores más altos de concentración de O Xileno, lo cual genera preocupación dado que la cantidad añadida de gasolina por experimento fue la misma, asimismo se pudo observar que las muestras generan tamaños de intercuartiles considerables y que ayudan a verificar la estandarización del método, así podría existir un error de medición del experimento 2 ya que los compuestos en general presentan ese incremento severo de concentración después de las 24 horas. La Fig y Fig muestran tamaños de intercuartil pequeños y las medianas están muy cercanas. De igual manera, se realiza la prueba anova para tener cuantitativamente una aproximación estadística del método tomando las mismas consideraciones para la realización de los boxplots.
M1 M1R C1 C1R M2 M2R C2 C2R
T0 1283,9 580,4 744,8 563,4 733,3 791,1 621,4 801,5
24h 450,8 446,1 440,3 582,1 1012,9 989,0 1051,3 976,1
48h 444,6 439,1 483,0 484,1 725,3 750,6 823,8 932,3
Tabla 15. Concentración de O Xileno por muestra (ug/L)
Fig 78. Prueba Anova de concentraciones de MP Xileno de Experimento 2 para t=48h
Fig 82. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t=24h Fig 80. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t0
Al evaluar la prueba anova para los diferentes tiempos de medición y diferentes experimentos se observa que para todos los tiempos la relación del control y las muestras cada una con sus replicas hace que no se rechace la hipótesis nula en la mayoría (Fig 85-88), lo cual concuerda ya que se está examinando la estandarización y aunque no se realizó una
degradación per se, sí se evidenció la replicabilidad para el caso del O Xileno. Para el caso de la Fig se rechaza la hipótesis nula dado que el tamaño de intercuartil es tan pequeño que a pesar de tener una diferencia de medianas relativamente baja no se considera estadísticamente significativa. La Fig 86 presenta significancia como en la mayoría de los casos. Fig 84. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t=48h Fig 83. Boxplot de Concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para t=48h
Finalmente se puede evidenciar que el método mejora la replicablidad del experimento ya que en la mayoría de los casos no se rechazó la hipótesis nula, demostrando así que no existía diferencia en las medias de las poblaciones. Cabe anotar que la degradación no se evidenció claramente en el método debido a la competencia
que se presentó en el medio por el consorcio. Una de las razones para afirmar este hecho es que al analizar los medios selectivos la única especie que creció rápida y masivamente fue Bacillus Subtilis, por lo que se considera que esta especie se encargó de sobrevivir en vez de degradar la gasolina.
Fig 89. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para t=48h
Fig 90. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t=48h Fig 86. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 2 para t0
Fig 87. Prueba Anova de concentraciones de O Xileno de Experimento 1 para t=24h
En cuanto a las propiedades fisicoquímicas tomadas durante el proceso no se evidencia un cambio en pH, conductividad y temperatura, además cuentan con la misma tendencia lo cual no genera sentido en la medida que la interacción con los microorganismos tiene que generar diferencias en estos aspectos por su naturaleza, sin embargo, se evidencia un cambio en oxigeno disuelto a tal punto que para las muestras 1 y 2 se evidencia un comportamiento anaerobio desde el momento inicial, lo cual es provocado por el consorcio ya que al estar en competencia e inhibición se consumen todo el oxígeno.
4. Conclusiones
Durante el proceso de experimentación se logro identificar abundantes errores que provocaron la inconcordancia en la mayoría de las muestras tomadas. Inicialmente se realizó el método de purga-trampa sin una previa estandarización, ya que se contó con diferentes personas interviniedo en todos los métodos y no se estableció un patrón de realización lo que hizo que se generará un error diferente para cada tipo de muestra. Adicionalmente, se encontró que el proceso de filtración tomaba un tiempo considerable para provocar la volatilización de la gasolina y la retención de la misma en el filtro de papel como consecuencia de la acumulación masiva de microorganismo. La diferencia en los boxplots del método purga-trampa eran considerablemente altos para muestras que tienen la misma concentración inicial. De ahí también se tiene la duda de si la gasolina comercial adquirida estaba mezclada homogéneamente, lo cual causa evidentemente las diferencias en las concentraciones medidas.
El método de micro-extracción en fase sólida se realizó con mayor organización, iniciada con la designación de cada persona en una única labor con eso se mantendría el mismo error para cada proceso. De esta manera se observó que la replicabilidad de los datos sí fue posible y que se mejoró considerablemente la toma de las muestras. Un ejemplo claro se dio con la muestra 1 original en el tiempo inicial ya que fue el único que arrojó datos de concentración diferentes a los demás, inclusive la replica de la muestra 1 tenía valores similares al control 1 y su replica.
5. Recomendaciones
Para próximos eventos de degradación de hidrocarburos con microorganismos y que se tenga en mente evaluar la degradación por medio de cromatografía de gases se recomienda utilizar en cualquier medida el método de micro-extracción en fase sólida; toma mayor tiempo pero asegura la replicabilidad de los datos. Posteriormente es imperativo evaluar un microorganismo individualmente al inicio; si se decide utilizar Bacillus subtilis es importante evaluar las propiedades biosurfactantes para verificar si esta propiedad afecta considerablemente el proceso de degradación. En la parte inicial del proceso se recomienda también generar presión en el microorganismo a través de la adición de gasolina desde el primer momento para que se acostumbre; de este mismo tema se generó la preocupación en cuanto al momento de servir el microorganismo dentro del Bushnell Haas con el medio nutritivo incluido se eliminará la presión de selección y el microorganismo decidiera no degradar gasolina. Para mejorar este aspecto se recomienda ejercer presión para evitar pérdida del plásmido; se centrifuga a 4500RPM a 4°C por 15 minutos, de esta manera se extrae el microorganismo sin medio nutritivo y se alcanza la medición exacta [27]. Debido a la incertidumbre por la concentración inicial de BTEX a lo largo de la experimentación se recomienda tener una muestra patrón que sea homogénea y que claramente no tenga una concentración inicial variable. Finalmente, para descartar completamente el error en el método de extracción se recomienda evaluar las mediciones en otro lugar certificado; puede ser un laboratorio externo o compañía, y para evitar errores en la dilución cuando es requerida se recomienda utilizar todos los medios mecánicos posibles ya que para este experimento se tuvo que aforar y este proceso es cualitativo lo cual genera más error, asimismo con la mezcla inicial. Finalmente, se recomienda aumentar el número de replicas de manera que se realice una mejor valoración estadística del diseño experimental.
Agradecimientos
Es importante aclarar que este proceso y consolidación del proyecto ha sido realizado en conjunto con un equipo de trabajo conformado por Maria Victoria Castro, Camilo Diaz, Jaime
Cardenas y Valeria Arroyave. Cada uno aportó de manera importante a la investigación y es por esto que se destaca su participación y se les agradece. Adicionalmente, se agradece a todo el equipo del laboratorio de Ingeniería Ambiental en el área de muestras y cromatografía ya que presentó toda la disposición y el apoyo incondicional para poder desarrollar cada uno de los procesos antes descritos. Se agradece también a las investigadoras Raquel Romero y Juliana Martinez por todos los aportes significativos que permitieron hacer realidad el proyecto. Finalmente se agradece al Director del Centro de Investigaciones en Ingeniería Ambiental de la Universidad de los Andes Manuel Rodriguez por brindar la oportunidad de trabajar en este proyecto, y por transmitir en sus roles de profesor y asesor del proyecto parte de todo el conocimiento que posee, así como la inspiración por el profesionalismo y el buen ser de un ingeniero ambiental. Este proyecto realmente ha contribuido en el desarrollo del conocimiento y la importancia del aprendizaje a partir de lo práctico.
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