Composición General del Medio de Cultivo.

1. Suero o substitutos del suero.

2. L-Glutamina.

3. Antibióticos.

4. Factores de crecimiento adicionales.

Composición General del Medio de Cultivo.

• Sales: CaCl

, NaHPO

, MnSO

, SnCl

, etc).

• Aminoácidos: Ala, Val, leu, aAsp, Gly…

• Vitaminas (Biotina, ác. Fólico, pantotenato de sodio, riboflavina.

• Otros Componentes (glucosa, ác. Linoléico, rojo de fenol, timidina).

* hormonas, anticuerpos, el medio no debe estar suplementado.

Solución Salina Equilibrada o Buffer (BSS) en el cultivo de células y tejido.

En 1885, Sydney Ringer desarrolló una solución de sales inorgánicas para mantener la contractilidad del tejido cardiaco de mamífero.

Una solución de sal menos específica fue diseñada por Tyrode para su uso en el trabajo con células primarias de mamífero. Solución de sal de Tyrode , fluido aceptado para la dilución de componentes proteicos.

La función actual de la solución de sal equilibrada (buffer) en el cultivo celular es multifacética y puede dividirse en cuatro funciones principales.

Mezclas de Sales Basales.

Contienen un requisito básico para cinco iones: Ca, Mg, K, Na, ion PO₄.

• Fluido de irrigación, transporte y diluyente, mantiene el equilibrio osmótico intra y extracelulares.

• Proporciona a las células ciertos iones inorgánicos esenciales para el metabolismo normal célular.

• Combinado con hidrato de carbono (glucosa), fuente de energía principal para el metabolismo celular.

• Ofrece sistema de tamponamiento para mantener el medio en el intervalo de pH fisiológico (7.2 a 7.6).

Nombre Bicarbonato de sodio

Cambio de pH durante filtración

Glucosa

El fosfato de Dulbecco tamponada con solución salina (D-PBS).

1.0 M, pH 7.4 (25 °C)

No contiene Menos

susceptible

Con y sin

Sales equilibradas de Earle (EBSS)

2,2 g / L

Pueden requerir el ajuste después de la filtración.

1,0 mg / L Sales equilibradas de Hanks

(HBSS)

0,35 g / L

Solución buffer: NaH₂PO₄ , Na₂HPO_4, 0.1 mM

Utilizados para el cultivo celular. Tienen una formulación específica.

Medio de Eagle medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM),

Medio de Cultivo

Medio basal de Eagle (BME)

DMEM original

Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM),

4X [aminoácidos y vitaminas]

1000 mg / L

glucosa 4500 mg / L glucosa óptimo

Ver dif. medios Ver medio Williams

DMEM.

DMEM/F12.

Ham’s F-10 y F-12.

Medio 199.

MEM.

RPMI 1640.

Medios de Cultivo

Temperatura 37^oC

Humedad

Gas: CO₂

¿pH?

El balance ácido-base es mantenido por NaHCO₃, buffer y componente nutricional.

Estabilización del pH en el Medio de Cultivo.

CO₂ + H₂O  H₂CO₃  HCO₃^- + H

[ ]

pH

Lo cual es neutralizado por una elevada [NaHCO₃]. específica p/c medio.

Si [CO₂ ] , el pH .

NaHCO₃ + H₂O  Na⁺ + HCO₃^- + H₂O.

Na⁺ + H₂CO₃ + OH^-  Na⁺ + H₂O + CO₂ + OH^-.

Cuando la presión parcial del CO₂ es baja, el equilibrio , el medio [OH^- ] y se torna básico.

Depende del CO₂ atm.

pH opt. =7.4.

Sistema buffer dentro del medio de cultivo. NaHCO₃ disociado y CO₂.

La capacidad buffer del sistema :

H⁺ + HCO₃  H₂CO₂  CO₂ + H₂O.

una elevada concentración de OH- causa OH^- + H₂CO₂  HCO₃ + H₂O.

Incubadora entrada de CO₂.

pK . H₂CO₃  HCO₃^- + H⁺

HCO₃  CO₃^- + H⁺

*Valor termodinámico

Medio no definido, suero varía de lote a lote.

Medios definidos , sin suero pero con apropiados suplementos.

Medio conteniendo Suero.

Es el suplementó más frecuente.

Razones:

 Algunas células sólo proliferan al adicionarle suero.

 Provee biodisponibilidad de hormonas.

 Incrementa la capacidad buffer del medio.

 El medio extracelular óptimo a las células.

El suero es una mezcla compleja y heterógenea de proteínas, hormonas, factores de crecimiento, iones y otros componentes no definidos.

Diferentes animales.

Rebaños.

Razas.

Países.

1. Suero de ternera.

2. Suero de ternera donante (ternera hasta de 8 meses).

3. Suero de ternera fetal (terneras fetales, por cardiopuntura).

4. Suero de caballo (edad desconocida).

5. Suero de mono (mono verde).

6. Suero de cordero (< 6 meses).

7. Suero de pollo (sacrificados).

8. Suero Humano (adultos).

9. Suero de porcino

El Suero Fetal de Bovino (SFB) es el

suplemento de crecimiento más empleado

para el medio de cultivo celular, Contiene

un alto contenido de factores que

promueven el crecimiento, ya sean

definidos o no definidos , los cuales

satisfacen los requerimientos metabólicos

para el cultivo celular.

Producto. Sterile-filtered, suitable for cell culture . Origin Treatment Hemoglobin Endotoxin Fetal Bovine Serum. Australia origin, USDA approved. Australia Hemoglobin,

≤25 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum. New

Zealand

Fetal Bovine Serum. USA origin, Charcoal Stripped. USA ^Charcoal

Stripped

Hemoglobin,

≤20 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum USA origin, Dialyzed by

ultrafiltration against 0.15 M NaCl, sterile-filtered. USA

Dialyzed by ultrafiltration against 0.15 M NaCl

Hemoglobin,

≤20 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum USA origin, Heat Inactivated, sterile- filtered, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture

USA ^Heat

Inactivated

Hemoglobin,

≤20 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum USA origin, γ-irradiated by SER-

TAIN^® process. USA

Fetal Bovine Serum. USA Hemoglobin,

≤25 mg/dL

≤25 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum . suitable for cell culture, suitable

for hybridoma . USA Hemoglobin,

≤20 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum USDA approved countries. non- USA

Hemoglobin,

≤25 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum USDA. Hemoglobin,

≤25 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum non-USA origin, from USDA approved countries, Heat Inactivated.

non- USA

Heat

Inactivated

Hemoglobin,

≤10 EU/mL

≤25 mg/dL endotoxin

SFB

Suero inactivado, incubado a 56º C, 30’.

¿Suero correcto?

Otros Suplementos

Albúmina Proteínas de Transporte.

Aminoácidos y Vitaminas.

Factores de adhesión.

Factores de Crecimiento y Citocinas.

Hormonas.

Antibióticos.

Preparación y Esterilización del medio de cultivo

Ver medio Williams

Tanque de Gas Nitrógeno

Tanque depósito del líquido a esterilizar

Membranas para esterilizar

Solución Estéril

La Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC).

Líneas celulares de una variedad de fuentes animales:

• Mamíferos,

• Anfibios

• Peces

• Insectos.

Humanas.

Ratón.

Cáncer.

Líneas celulares

Sueros:

Riesgo de contaminación microbial.

Algunos medios con suero deben esterilizarse.

Economía.

El cambio a medio libre de suero, no debe ser abrupto.

Medio de Cultivo libre de Suero, claramente definido.

Al elegir (contenidos individuales del suero), frec. fluctúan en cal, y cant.

Esto es importante cuando los experimentos son de tiempo prolongado.

Medio Definido: se conoce la concentración de todos los componentes.

Considerar:

oRiesgo de movimiento.

oSin tráfico de personal.

oDistancias cortas entre unidades individuales.

oSuficiente espacio para moverse.

Cultivo Celular en el laboratorio.

1) Accesorios necesarios, instrumentos, etc.

2) Esterilidad en campana de flujo laminar.

3) Proveer a las células para un periodo de cultivo.

4) Preparado para experimentos en cultivo celular.

Alrededores adecuados:

 Cuarto de cultivo.

 Campana de flujo laminar e incubadora.

 Preparación de medios de cultivo cuidadosa y críticamente.

 Prohibido: fumar, beber y comer.

 Ropa adecuada para protección, (bata algodón, gorros y guantes).

 Prohibido pipetear con la boca, utilizar pipeteadores o perillas estériles.

 Posibles peligros deben ser dados a conocer a los compañeros.

 Lavar manos entre descanso y descanso.

 Limpieza escrupulosa es proporcional a buenos resultados en el cultivo.

 Laboratorio limpio (piso, paredes, equipos, baños , gavetas, etc.).

 Cerrar llaves de gas al finaliza el trabajo.

 Limpiar regularmente: baños maría, incubadoras y campana de flujo.

 Entrada al cuarto de cultivo, sólo personal autorizado.

 Limitar el acceso de visitas.

Seguridad en el Cultivo Celular.

Reglas de seguridad y precaución (DNA, material patógeno,

substancias radiactivas, carcinógenos, corrosivos, etc.)