SEPARAR-IDENTIFICAR-CUANTIFICAR CROMATOGRAFIA

Preguntas que puedo resolver con una cromatografía:

1- ¿Qué alcoholes y en qué concentraciones puedo encontrar en un vino?

2- ¿Hay residuos de pesticidas en las cáscaras de naranjas? Mancozeb (preventivo); carbendazim (curativo) 5 ppm

3- ¿Qué aminoácidos se acumulan en las hojas de trigo durante la etapa de llenado de granos?

CROMATOGRAFIA

SEPARAR-IDENTIFICAR-CUANTIFICAR

Permite separar analitos muy similares en sus propiedades físicas y químicas.

Enfermedades fúngicas

CONTENIDOS DE LA CLASE

 I- Cromatografía: presentación general del método analítico y presentación de términos nuevos propios de las cromatografías.

Fase estacionaria, fase móvil y soporte

Diferentes formas de clasificar a los métodos cromatográficos

 II- Cromatografía en columna: formas de realizarla, parámetro que se mide.

 III- Cromatografía plana: formas de realizarla, parámetros que se miden.

 IV- Cromatógrafos y cromatogramas: Equipos, descripción y análisis de los gráficos. C la se 1 C la se 2

Fase estacionaria contenida en un soporte Inyección de la muestra: punto de siembra

Muestra: dos analitos muy similares que necesito separar

Fase estacionaria contenido en un soporte Inyección de la muestra: punto de siembra

Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra

Fase estacionaria contenida en un soporte

Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra

FASE ESTACIONARIA (FE):

 fija en un soporte

 sólida o líquida gaseosa

 cuanto más homogénea sea más eficiente será la separación cromatográfica

FASE MÓVIL (FM):

 «empuja» a la muestra a través de la fase estacionaria  líquida o gaseosa sólida

FM líquido: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA FM gas: CROMATOGRAFÍA GASEOSA

 la eficiencia de la separación cromatográfica se relaciona con la velocidad de FM

SOPORTE: cromatografía plana: vidrio (capa fina); papel

cromatografía en columna: vidrio; vidrio con relleno; capilares

1- Toda cromatografía pone en contacto dos fases inmiscibles.

2- La FM «empuja» a los analitos atravesando la FE.

3- Los analitos se desplazan a diferentes velocidades dependiendo de su

afinidad por cada fase.

Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases: Fase móvil Fase estacionaria Cromatografía

Gas Liquida CGL

Sólida CGS

Líquida Liquida CLL

Sólida CSL

Clasificación de las cromatografías según la forma de contacto entre las fases (lo que depende del soporte):

Plana Columna

Placa de vidrio ó papel Wathman N° 1 Vidrio con relleno ó capilar

FM se mueve por acción capilar o por efecto de la gravedad.

FM se mueve por presión o por gravedad

Parámetro que se mide: Rf Parámetro que se mide: tr ó Vr

Lecho abierto Elución

Revelado Detector

Trabajo práctico

Clasificación de las cromatografías según el equilibrio existente entre las fases (mecanismo de separación):

Nombre Algunas características C. de Adsorción FE sólida y FM líquido / gas

Diferencias en la polaridad C. de Reparto FE líquido y FM líquido / gas

Diferencias en la polaridad C. de intercambio iónico FE resina (sólido) con grupos

cargados unidos covalentemente.

FM líquido (gas)

Reacción entre iones de carga opuesta.

C. de Exclusión molecular FE gel poroso FM líquido ( gas)

Tamaños

C. de Afinidad FE especialmente diseñada para

atrapar a un soluto en particular. Muy selectiva

Trabajo práctico Trabajo práctico

Cromatografía de exclusión molecular: separa por tamaño

 Moléculas grandes salen primero de la columna: menos retenidas por la fase estacionaria, tr pequeño.

 ¿Moléculas pequeñas? Cómo será el tr???????

Frente de la fase móvil Línea de siembra Fase móvil (líquido) Soporte _{Frente de la} fase móvil Línea de siembra Parámetro Rf: RELACIÓN DE FRENTES

Rf= distancia recorrida por el analito/distancia recorrida por la fase móvil

Rf_x=dx/dFM

CROMATOGRAFÍA PLANA

REVELADO: permite poner en evidencia donde quedó cada uno de los analitos separados

C. plana ascendente

Ejemplos de cromatografía plana

Pigmentos de hojas de espinaca Pigmentos de cáscara de

mandarinas

Control de impurezas

RF como criterio de identificación

Malt Gluc Sac Fruc JUGO

Placa de vidrio (soporte) con silicagel (FE)

FM:butanol-acético-agua

Revelado: resorcinol (universal para azúcares)

Línea de siembra Frente del solvente

Y

X

Trabajo práctico: Cromatografía en papel

 El jugo NO tiene glucosa y

sacarosa; posiblemente SI tiene maltosa y fructosa.

Problema para resolver:

La tabla muestra los resultados obtenidos en una cromatografía de papel. Explique el significado de Rf y sus valores extremos. Ordene los analitos de menor a mayor en cuanto a su afinidad por la fase móvil. Justifique. Analito Rf Glutamina 0,38 Lisina 0,78 Arginina 0,25 Cuestionario de cromatografía. https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8

Fase estacionaria Fase móvil Soporte: columna muestra (A y B)

Cromatografía en columna

Parámetro en función del tiempo tr: TIEMPO DE RETENCIÓN

ELUCIÓN

A B

Fase estacionaria Fase móvil Soporte: columna muestra (A y B)

Parámetro en función del

volumen de FM que circuló por la columna Vr: VOLUMEN DE RETENCIÓN

Cromatografía en columna

ELUCIÓN

Cromatografía de intercambio iónico

FE: resina con carga positiva Intercambiadora de aniones

cationes

aniones

FE: resina con carga negativa Intercambiadora de cationes

Trabajo práctico

Fase estacionaria puede ser:

 Resina con grupos sulfónicos (cargas negativas)  Resina con aminas cuaternarias (cargas positivas)

CONTENIDOS DE LA CLASE

 I- Cromatografía: presentación general del método analítico y presentación de términos nuevos propios de las cromatografías.

Fase estacionaria, fase móvil y soporte

Diferentes formas de clasificar a los métodos analíticos

 II- Cromatografía en columna: formas de realizarla, parámetro que se mide.

 III- Cromatografía plana: formas de realizarla, parámetros que se miden.

 IV- Cromatógrafos y cromatogramas: Equipos, descripción y análisis de los gráficos.

C

lase

1

C

lase

2

Fase estacionaria Fase móvil Soporte: columna muestra (A y B)

Parámetro en función del tiempo que transcurre desde que inyectamos la muesta hasta que

salen los analitos.

tr: TIEMPO DE RETENCIÓN

Cromatografía en columna

ELUCIÓN

A B

FM= eluyente

Parámetro en función del volumen de FM que circuló por la

columna.

Cromatógrafo gaseoso

FM: gas

Tubos de gas y válvulas reguladoras de presión

Detector de CG: Conductividad térmica

FID (detector de ignición a la llama)

Componentes de un cromatógrafo gaseoso

Detectores CL: índice de refracción; espectrofotometría UV-Vis.

Componentes de un HPLC (cromatógrafo líquido de alta resolución)

Columna rellena, 10 cm de largo y 0,3 cm diámetro

FE: Polímero Acclaim Trinity P2 FM: Acetonitrilo – Buffer pH 4 Temperatura 60° C

Caudal: 0,50 mL/min Vol de inyección: 5 µL

Contenido de azúcares en una etapa de la fermentación

Datos del cromatograma:

tr:

Área

cantidad de analito.

Ancho

Análisis de un cromatograma

V´r = Vr-VM (VM volumen muerto de la columna)

tr = tiempo de retención Vr = volumen de retención

t´r = tr-tM (tM tiempo muerto de la columna)

Área del triangulo: base x altura

2

Línea de base: corresponde a la salida de fase móvil sin ningún analito.

Ancho de la base del pico: W 1- 2- 3- 4- W

Parámetro cuantitativo Área bajo la curva Parámetro cualitativo Tiempo de retención A B C patrones muestra desconocida

Señal de det ect o r Tiempo ó Volumen R_s = (trB – trA) (WA + WB ) 2

W:ancho del pico

Cuanto más ancho

es el pico más va a

comprometer a la

resolución.

RESOLUCIÓN

 Rs >1,5 OK

Alta eficiencia Baja eficiencia Alta eficiencia Baja eficiencia

Los picos deben ser agudos, es decir W pequeños

Una baja eficiencia terminará complicando la resolución, es decir los picos no se separan.

Eficiencia de una columna: Teoría de los platos teóricos

Según la teoría de los platos teóricos…..la eficiencia de la columna para un determinado analito se relaciona con el número de equilibrios que se pueden establecer dentro de la columna (N).

N: Número de platos teóricos

H: Altura equivalente del plato teórico

H = L/N

Señ al d e d et ec tor Tiempo (min) L= 5 cm tr W Pico 1 5 7,2 Pico 2 12,5 6 L= 10 cm tr W Paracetamol 2,665 0,34 Ibuprofen 3,673 0,22 1- Calcular la eficiencia de la columna para cada analito (N y H).

2- Calcular la resolución de los picos.

B: difusión longitudinal

¿Qué factores determinan el ancho de los picos? (y por lo tanto la eficiencia de la columna?)

FE: tamaño de partículas y empaquetamiento

Coeficiente de difusión de los analitos en ambas fases, por lo tanto de la

TEMPERATURA

VELOCIDAD CON QUE CIRCULA LA FM

C: RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA

FE y FM Temperatura

VELOCIDAD CON QUE CIRCULA LA FM

¿Qué puedo modificar experimentalmente?

µ

Hmin

µop

difusión en remolino

H

Problemas a resolver:

1- En el caso de una cromatografía en columna

a) ¿Cuáles son los parámetros que puede obtener de un cromatograma?

b) ¿Cómo puedo obtener la eficiencia y la resolución de una columna a partir de estos datos?

c) ¿Cuáles son los factores que pueden modificar la eficiencia de una columna? Justifique su respuesta.

2- La tabla muestra los resultados obtenidos del cromatograma correspondiente al análisis de ácidos grasos presentes en semillas de maracuyá. Calcule la eficiencia de la cromatografía para cada uno de los analitos obtenidos. Calcule la resolución de la columna para cada par de analitos indicando si han sido resueltos. Indique cuál es el analito con mayor afinidad por la fase estacionaria y cuál es el que tiene mayor

afinidad por la fase móvil, justifique su respuesta.

analito tr W palmítico 13,67 2 esteárico 15,63 3 oleico 15,96 5 linoleico 16 5 linolénico 17,65 9

Bibliografía

Química analítica cuantitativa. R.A.Day, JR.A.L. Underwood. 5ta. Edición. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A.1r. Edición 1989. Capítulos 17 y 18.

https://www.youtube.com/watch?v=dXR9wcK-LUo High Performance Liquid Chromatography HPLC . Fecha de acceso 16/05/18

https://www.youtube.com/watch?v=e_ZAsfZ1AUo Cromatografía gaseosa en español. Fecha de acceso 16/05/18