Técnicas in vitro para la valoración espermática en bovinos

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(1)Técnicas in vitro para la valoración espermática en bovinos. Estudiante Diego Fernando González Clavijo. Asesor Dunia Yisela Trujillo Piso MVZ, MSc, Phd©. SEMINARIO DE PROFUNDIZACIÓN EN REPRODUCCIÓN BOVINA VII COHORTE. UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA IBAGUÉ – TOLIMA 2018.

(2) Técnicas in vitro para la valoración espermática en bovinos 1 Diego 1.. Fernando González Clavijo. Estudiante De Medicina Veterinaria Y Zootecnia, Universidad Cooperativa De Colombia, Facultad de Medicina Veterinaria. y. Zootecnia,. Sede. Ibagué. –. Espinal.. Resumen La implementación de técnicas in vitro para la valoración espermática es fundamental en la implementación de programas reproductivos con el fin de generar el uso eficiente del semen bovino. Logra mejorar la probabilidad de generar animales de alta calidad genética y tener proyección a un sexo determinado, haciendo el uso de técnicas como Citometría de Flujo, Computer Assisted Semen Análisis (CASA), Reacción Acrosómica in vitro con Heparina, y test de host, siendo estos los de mayor transcendencia laboratorial y comercial, por su fácil manejo y acceso rápido, igualmente por el alto porcentaje en efectividad de evaluación espermática. El presente trabajo busca, a través de un análisis comparativo de varias técnicas in vitro, establecer cuáles son las ventajas y desventajas en la valoración espermática del semen bovino. Palabras clave: Citometría, Semen, Reproducción, Andrologia.. Abstract The implementation of in vitro techniques for sperm assessment is fundamental in the implementation of reproductive programs in order to generate the efficient use of bovine semen. It manages to improve the probability of generating animals of high genetic quality and have projection to a specific sex, making use of techniques such 1. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(3) as Flow Cytometry, Computer Assisted Semen Analysis (CASA), Acrosome Reaction in vitro with Heparin, and host test, being These are of greater laboratory and commercial importance, because of their easy handling and rapid access, also due to the high percentage of sperm evaluation effectiveness. The present work seeks, through a comparative analysis of several in vitro techniques, to establish which are the advantages and disadvantages in the sperm valuation of bovine semen. Key words: Cytometry, Semen, Reproduction, Andrology. INTRODUCCIÓN Para poder garantizar que el semen bovino a emplear en una técnica como fertilización in vitro o inseminación artificial sea de óptima calidad y los espermatozoides cumplan las características requeridas es necesario realizar un examen completo del potencial reproductivo del macho a colectar, este análisis consiste en efectuar una exploración física, sanitaria y una evaluación básica macroscópica y microscópica del eyaculado (In vitro) (Moron, 2015). En la valoración espermática la calidad del semen va a depender de que contenga un número suficiente de espermatozoides viables, morfológicamente normales y funcionalmente competentes (Garcia, 2015) esto se determina por técnicas In vivo (Inseminaciones) o In vitro (Técnicas en laboratorio) Las características básicas que se valoran macroscópicamente son el volumen, color y aspecto del eyaculado. El volumen se expresa en mililitros (ml) y normalmente un toro joven puede eyacular aproximadamente 2 ml de semen, y en 2. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(4) adultos puede ser ≥ a 4 ml pudiendo llegar hasta 12 ml. El color y aspecto seminal optimo debe ser cremoso, puede variar en aspecto lechoso hasta completamente claro siendo estos últimos indeseables, con esta característica se pueden identificar anormalidades como semen de color rojizos o amarillentos, indicando muestras contaminadas (Brito, 2017) Las características básicas que se valoran microscópicamente son la Motilidad masal e individual, indica la capacidad de movimiento de los espermatozoides, La Morfología que es muy importante para que el espermatozoide desempeñe su función biológica, cumpliendo su estructura típica de cabeza, cuello, parte intermedia y cola (Nuñez, 2015). En las técnicas de valoración espermática in vitro se pueden encontrar el sistema CASA, La citometría de flujo, la reacción acrosómica con heparina, y el test de host; (Veloz, 2017) las cuales son automatizadas, fiables, de fácil ejecución y elevada repetibilidad (Fernandez, 2005) que permiten al veterinario, técnico y propietario conocer si el semen de su reproductor es apto o no, además existe la posibilidad de predecir el sexo, siendo esta técnica de gran importancia en el sector lechero demostrando un avance significativo (Larocca, 2017) En el sector productivo los avances que se llevan a cabo en la reproducción animal son muy relevantes, logrando determinar aspectos importantes como la clasificación de los gametos que darán como resultado un sexo específico en las especies de producción (Agûero, 2012), con el fin de dar un uso adecuado a los diferentes sistemas, para el caso específico de las lecherías, va en pro de generar hembras y en ganaderías de carne generar machos y algunas hembras para el 3. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(5) reemplazo (Jiménez, 2011), De esta manera se da cumplimiento a muchas exigencias por parte de los ganaderos que van en pro del uso de nuevas tecnologías y realizan aportes de desarrollo productivo al gremio (Alfonso, 2011). La implementación de nuevas tecnologías en la reproducción bovina es importante para la salud, el mantenimiento y la calidad del producto que se estará generando, la compra de pajillas o la adquisición de machos reproductores (Cabrera, 2014) en un hato puede garantizar ejemplares de buenas características genotípicas y fenotípicas para las producciones, y el gremio ganadero bovino, dejando un material genético competitivo (Jiménez, 2011) MARCO TEÓRICO La evaluación de las técnicas para la valoración espermática puede llegar a determinar la calidad seminal para eliminar aquellos eyaculados que puedan presentar características no apropiadas para lograr pajillas de calidad (Aquino, 2017). Los métodos in vitro están siendo utilizados frecuentemente por su economía y su rapidez en comparación con los métodos in vivo. La calidad seminal con estos métodos puede ser identificada pero no la fertilidad real. Estas pruebas deben ser objetivas, precisas, rápidas, sencillas y de bajo costo. Con estas características se desarrollaron las siguientes técnicas. el sistema CASA, La citometría de flujo, la reacción acrosómica con heparina, y el test de host (Veloz, 2017).. 4. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(6) La valoración espermática es un método que día a día a estado tomando fuerza, debido a su importancia en la producción de pajillas de mejor calidad, la realización de semen sexado, la disminución de espermatozoides alterados (Trujillo, 2017), y otros beneficios en la reproducción bovina (Muiño, 2008) CITOMETRÍA DE FLUJO La citometría de flujo es una técnica que se basa en el recuento o caracterización de células por medio de un citómetro, fue desarrollada en los años 50 cuando su fin era contar y caracterizar células sanguíneas, actualmente está técnica representa un método rápido, objetivo y cuantitativo de análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión (Izquierdo et al, 2016) La citometría de flujo es la principal herramienta en el sexaje de semen bovino, por medio de la cual se hace la diferenciación de los espermatozoides con cromosoma X y los que tienen el Y (Echeverry , 2015) logrando también determinar algunas características morfológicas y fisiológicas de los mismos, y clasificando los de mejor desempeño, y obteniendo cantidades de semen de óptima calidad y con una probabilidad superior al 85% en producto final de la preñez con el sexo escogido sea macho o hembra (Oliveira, 2009). Los. espermatozoides. son. sometidos. a. un. colorante. específico. (bisbenzimidazol, Hoechst 33342) que se fija de manera selectiva al ADN (Schenk et all, 1999) que genera fluorescencia cuando es sometido a luz ultravioleta emitida. 5. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(7) por un láser de onda corta; la fluorescencia que emite el espermatozoide X es un 4 % mayor comparado con la emitida por el espermatozoide Y (Seidel, 2007). Para detectar la diferencia de fluorescencia y separar los espermatozoides deseados, se utiliza un citómetro de flujo. Consiste en un circuito cerrado de alta velocidad de flujo de líquidos que permite alinear y “leer” los espermatozoides individualmente en microgotas. La fluorescencia que produce cada espermatozoide teñido es procesada por un software que permite al operador seleccionar la población espermática con mínima o máxima luminosidad, según el sexo. Los espermatozoides elegidos son cargados eléctricamente, desviados del flujo original en un campo magnético y finalmente recolectados para su posterior congelación (Teruel, 2009) Esta técnica posiblemente sea la de mayor uso y desempeño en la programación de sistemas de reproducción aplicados a diferentes ganaderías, elevando sus índices de natalidad tanto de hembras para las lecherías, como de machos para las de propósito cárnico (Ramirez et al, 2016), así se garantiza que los tiempos de reemplazo y el crecimiento adecuado de los rebaños sea el indicado para la región donde se establecerá y sus resultados sean favorables para el productor (Franchini, 2016). Igualmente es una de las técnicas con mayor antigüedad en la innovación reproductiva, y que presenta en la actualidad el más alto índice de resultados acertados con su finalidad (Magali, 2012), logrando que quienes han usado la. 6. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(8) técnica incrementen sus rebaños, también productivamente eleven sus tasas y económicamente han sido favorecidos positivamente (Urruego, 2008). Esta técnica es de las más seguras y que representa un gran porcentaje de viabilidad del semen, ya que tiene una seguridad casi del 100% en tener espermatozoides vivos y solo el 10% de estos podrían lograr ser el sexo no deseado (Muiño, 2008), pero mayormente el resultado en los procesos reproductivos es siempre el deseado, lo que infiere mucho en la productividad de los hatos y el crecimiento favorable de los rebaños (Quintero, 2017), y se destaca en alta proporción en la producción de animales genéticamente valiosos. El citómetro de flujo evalúa la calidad, estructura, función y motilidad del esperma luego de ciclos de congelación/descongelación; valorar daños en el esperma y su calidad para la fertilización (Izquierdo et al, 2016) además el porcentaje de daño espermático encontrado en los espermatozoides sexados mediante citometría de flujo puede ser el doble o hasta el triple que los detectados mediante microscopía de fluorescencia en los espermatozoides criopreservados de la forma tradicional (Echeverry , 2015). COMPUTER ASSISTED SEMEN ANÁLISIS (CASA) El sistema de análisis computarizado asistido del semen se ha desarrollado con el paso de tiempo y con relación a los diferentes métodos manuales que han servido de ayuda como los son: videomicrografia, cinemicrografia, fotografía con tiempo de exposición y fotografía con exposición múltiple, siendo el primero el más acertado e implementado en el acoplamiento a sistemas computarizados dando 7. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(9) como finalidad el CASA (Agûero, 2012), dando como resultado positivo el desarrollo de un equipo que se encarga de medir características morfológicas y funcionales del semen, que a su vez determina el porcentaje de viabilidad y efectividad fértil del mismo (Urrego, 2005). El sistema está conformado por una cámara de video conectada a un microscopio de fases y a una computadora que digitaliza las imágenes del tamaño y de los movimientos espermáticos. Las imágenes digitalizadas permiten analizar la velocidad de las células, el movimiento rectilíneo, circular o lateral (Anchatuña, 2017) Esta técnica de gran innovación a nivel laboratorial y tecnológico, ha logrado garantizar a los diferentes productores e investigadores la herramienta con un mayor porcentaje de efectividad y elección indicada en la estandarización del manejo seminal de los animales (Almela, 2014), lo que es uno de los avances quizás con mayor relevancia y el que cada vez cumple con mayores requerimientos exigidos por el gremio reproductivo de bovinos, generando un incremento y fortalecimiento del mismo (Farfán, 2015), al lograr producir pajillas, embriones y fertilizaciones in vitro de calidad óptima y con garantías bastante prometedoras, que se encargan cada vez mas de darle beneficios al sector pecuario, a nivel de producción bovina (Medina, 2007). Por medio de este proceso se busca determinar principalmente la motilidad de los espermatozoides, lo cual es determinante para el tiempo de recorrido a la hora de generar la fecundación y logra así, que las concepciones sean más probables. 8. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(10) (González, 2013), ya que este parámetro microscópico del semen se debe mantener en el semen fresco y congelado, de tal forma que la calidad y la garantía que den los productores de pajillas sea siempre la misma, sin importar el tiempo de congelación que han tenido los espermatozoides (Bury, 2016). Esta técnica se basa en la captura de imágenes para observar los espermatozoides en movimiento, estas imágenes son digitalizadas identificando las células espermáticas, luego se procede a observar los espermatozoides en imágenes sucesivas para poder establecer las trayectorias definitivas de los mismos (Barragán, 2017) Las trayectorias se procesan matemáticamente, obteniendo así resultados numéricos 22 precisos. Los parámetros determinados para cada espermatozoide son la velocidad de movimiento sobre la base de varios descriptores, las trayectorias que realiza la cabeza del espermatozoide y la frecuencia de los cambios de dirección que efectúa (Hidalgo, 2005). En el mercado existen variedad de sistemas CASA, desarrollando diferencias en sus sistemas ópticos, técnicas de captura, reconocimiento espermático, algoritmos para la construcción de trayectorias espermáticas, y manejo y análisis de los datos obtenidos (Muiño, 2008) además Las desventajas del CASA están relacionadas con el costo del equipo, la necesidad extrema de validación y la normalización de las medidas realizadas (Hernandez, 2014). 9. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(11) REACCIÓN ACROSÓMICA IN VITRO CON HEPARINA Para llevar a cabo una evaluación espermática también se debe tener en cuenta el índice de fertilidad de los espermatozoides, para eso la técnica de reacción acrosómica con heparina es la más indicada (Cabrera, 2014). La heparina es una sustancia que se encuentra a nivel oviductal y tiene como principal funcionalidad la capacitación espermática y contribuir en la reacción acrosómica por medio de la activación de las proteínas presentes en el acrosoma. (Fernández, 2014). De esta forma, si se usa in vitro puede mejorar las tasas de fecundación en los bovinos (Montes & et al, 2012) Durante la capacitación se da la alteración de la membrana plasmática para permitir al espermatozoide fusionarse a la membrana plasmática y membrana acrosomal externa, denominada reacción acrosómica (In vivo), la capacitación espermática es adquirida durante la migración de los espermatozoides a través del tracto reproductivo de la hembra y la reacción acrosómica ocurre cuando los espermatozoides se unen a la zona pelúcida. La técnica in vitro más utilizada consiste en la exposición del semen a la heparina para que puede adquirir la capacidad fertilizante (Salgado, 2005) se ha podido determinar que la concentración de 10 µg/ml de heparina utilizada demuestra resultados óptimos para que los espermatozoides sean activados (shamsuddin et al, 1996). La heparina se une al espermatozoide de bovino a través de proteínas de unión situadas en la membrana celular produciendo un aumento en la fosforilación. 10. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(12) de proteínas y en el Ca2+ libre que conlleva a un incremento del pH intracelular (Risopatron et al, 2005) Hasta el momento se ha indicado como la técnica más revolucionaria que genera un porcentaje de determinación de fertilidad en machos con resultados exitosos hasta de un 75% y a su vez logra establecer la capacidad de incremento en la motilidad de los mismos, siendo un dato relevante a la hora de parametrizar las características del semen usado en las pruebas (Ruiz, 2010), generando la herramienta indicada para los poseedores de toros de valor genético bueno y fabricación de pajillas para su correcto y exitoso desarrollo en el mercado (Salgado, 2005). La capacitación espermática en bovinos, dada por la heparina, depende de su concentración en el medio de incubación con tasas de fecundación in vitro sobre el 70%, utilizando dosis entre 10 µg/ml a 20 µg/ml de heparina (Reyes, 1992). Investigaciones actuales demuestran que concentraciones de heparina de 10 ug/ml y de semen de 1x106 espermatozoides/ml han arrojado las mejores tasas de penetración de oocitos bovinos de manera in vitro observados en una resolución 4x en el microscopio (Salgado, 2005) . Finalmente el lograr un incremento en la determinación de los mejores espermatozoides y sus características morfológicas, fisiológicas y de fertilidad sería la mayor tecnología aplicada en la biotecnología de reproducción (MINITUBE, 2017), siendo muy relevante en la investigación de nuevos procesos y la determinación del más adecuado para el avance en producción y eficiencia. 11. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(13) económica del sector ganadero tanto del país como de Latinoamérica, siendo países con deficiente desarrollo comparado con Europa y Estados Unidos (Bury, 2016). TEST HIPOSMÓTICO (Test de Host) Su función es evaluar la integridad funcional de la membrana plasmática de la célula espermática, considerando que el espermatozoide sea móvil y que sea capaz de realizar la fecundación (Mejía Gutiérrez, 2017) Esta técnica se basa en la observación de las alteraciones morfológicas que sufren los flagelos de los espermatozoides (incremento de tamaño y flagelos flectados o curvos) al ser expuestos a un medio hiposmótico, el cual ocasiona un desequilibrio osmótico entre el medio extracelular e intracelular, situación que el espermatozoide trata de vencer difundiendo agua al compartimiento intracelular, aumentando la célula su volumen, lo cual se evidencia al observar la torsión de sus flagelos en diferentes grados (Quintero et al, 2013) Se debe preparar una solución con 0.735 gr de citrato de sodio, 1.35 gr de fructosa y se disuelve en 100 ml de agua destilada y filtrar, agregar en un vial 1000 micro litros de solución hipo-osmótica y llevar a baño maría a 37 grados centígrados por 15 minutos, adicionar a esta solución 50 micro litros de semen y llevar a baño maría por 30 minutos colocar una muestra en un portaobjetos y contar (Barragán, 2017). 12. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

(14) CONCLUSIÓN La efectividad en la valoración espermática genera un impacto altamente positivo en la reproducción bovina y sus diferentes programas, como inseminación artificial, transferencia de embriones y la conservación de semen de animales de alto valor genético, lo que revoluciona en la actividad económica y con mayor espacio de tiempo iniciara un mayor impacto, logrando llevar a las producciones a fortalecer sus ámbitos reproductivos y conjuntamente un acrecentamiento productivo que difícilmente sea medible o sus resultados sean exitosos, llevando a la producción de rebaños con grandes características de rusticidad y productividad, gracias al uso de tecnologías de desarrollo pecuario y su importancia en las ganaderías mundiales. 13. Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional..

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