Espectrofotómetros GENESYS 10

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(2) Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas FACULTAD DE INGENIERÍA ELÉCTRICA DEPARTAMENTO DE TELECOMUNICACIONES Y ELÉCTRONICA. TRABAJO DE DIPLOMA Espectrofotómetros GENESYS 10. Autor: Heykel Iglesias Reyes [email protected]. Tutor: Dr. Ing. Emilio Francisco González Rodríguez Profesor Titular y Coordinador Doctorado y Maestría de Electrónica [email protected], [email protected]. Consultantes: Ing. Miguel Gutiérrez Pardo Ingeniero Especialista . [email protected] Ing. Jesús Miguel López Cuétara Ingeniero Especialista . [email protected] Santa Clara 2006 "Año de la Revolución Energética en Cuba".

(3) Hago constar que el presente trabajo de diploma fue realizado en la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la especialidad de Ingeniería en Telecomunicaciones y Electrónica, autorizando a que el mismo sea utilizado por la Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de forma parcial como total y que además no podrá ser presentado en eventos, ni publicados sin autorización de la Universidad.. _____________ Firma del Autor Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.. _____________. ______________. Firma del Tutor. Firma del Jefe de Departamento donde se defiende el trabajo. ____________________. Firma del Responsable de Información Científico-Técnica.

(4) i. PENSAMIENTO. Es de importancia para quien desee alcanzar una certeza en su investigación, el saber dudar a tiempo. Aristóteles.

(5) ii. DEDICATORIA. Abuela siempre me deseaste éxito en la vida, aunque no te tenga ya junto a mi te dedico este trabajo con todo mi amor..

(6) iii. AGRADECIMIENTOS. A mi Dios por ser incondicional conmigo y por amarme tanto. A mis padres por guiarme y apoyarme en cada momento. A mi tía Angelita, siempre preocupada por mi, a Nélida y a Emilio. A mi novia Danay por su amor y comprensión y a su familia. A todos mis amigos. A Leonor y Evelyn por su apoyo. A Fichi y a Enmita. A Mayra. A mi tutor Emilio. A mis consultantes Miguel y Jesús por tanta ayuda. A los trabajadores del CDE. A Felito, Fernando, Alain, Alberto Rubio, Doris, Migdalia, Rodosvaldo, Darío, Alexis, y a todos los que de una forma u otra me ayudaron, gracias..

(7) iv. TAREA TÉCNICA. Realizar una revisión bibliográfica y un análisis crítico de las fuentes de información. Vincular la base teórica con la serie de espectrofotómetros GENESYS 10. Explicar el funcionamiento general de los instrumentos. Detectar posibles fallas en los modelos mediante el software de diagnóstico..

(8) v. RESUMEN. La espectrofotometría se encuentra hoy en día presente en un gran número de aplicaciones y campos. Se hace necesaria para el desarrollo y el conocimiento en la determinación de parámetros específicos. Los espectrofotómetros son los instrumentos encargados de realizar las mediciones. Modelos como los de la serie GENESYS 10 llaman nuestra atención por su modernidad y diseño. Se ha comprobado que la información existente de la serie no satisface las necesidades de quienes atienden el mantenimiento especializado de esta línea de equipos. El objetivo principal de nuestro trabajo es realizar una inmersión en los modelos ultravioleta y visible para brindar a los interesados una información enriquecida. El estudio esclarece el funcionamiento de los circuitos que integran los equipos y que no es suministrado por el fabricante, así como algunas interrogantes ante posibles fallas..

(9) vi. ÍNDICE. PENSAMIENTO ________________________________________________________________i DEDICATORIA________________________________________________________________ ii AGRADECIMIENTOS _________________________________________________________ iii TAREA TÉCNICA ______________________________________________________________iv RESUMEN____________________________________________________________________ v INTRODUCCIÓN ______________________________________________________________ 1 Hipótesis de la investigación___________________________________________________________ 2 Organización del informe _____________________________________________________________ 2. CAPÍTULO 1.. BASE TEÓRICA ______________________________________________ 3. 1.1. Introducción a la espectrofotometría ______________________________________________ 3. 1.2. Luz y radiación ______________________________________________________________ 5. 1.2.1. Definiciones y unidades ____________________________________________________________ 5. 1.2.2. Fuentes de radiación _______________________________________________________________ 6. 1.3. Teoría cuántica_______________________________________________________________ 7. 1.4. Orígenes físicos de la absorción uv/vis ____________________________________________ 9. 1.5. Interacción de la luz __________________________________________________________ 10. 1.5.1. Ley de Lambert (o Bouger ) ________________________________________________________ 11. 1.5.2. Ley de Beer - Lambert ____________________________________________________________ 12. 1.6. Aplicaciones de la espectrofotometría uv/vis ______________________________________ 12. 1.6.1. Análisis Cuantitativo ______________________________________________________________ 13. 1.6.2. Cinética ________________________________________________________________________ 13.

(10) vii 1.6.3. Análisis de muestras ______________________________________________________________ 14. 1.6.4. Mediciones multi-longitudes de ondas ________________________________________________ 14. 1.7. Instrumentación _____________________________________________________________ 14. 1.7.1. Fuentes ________________________________________________________________________ 15. 1.7.1.1. Lámpara de filamento de tungsteno______________________________________________ 15. 1.7.1.2. Lámpara halógena de tungsteno ________________________________________________ 15. 1.7.1.3. Lámpara de Deuterio _________________________________________________________ 16. 1.7.1.4. Arcos de Mercurio y de Xenón _________________________________________________ 16. 1.7.1.5. Láseres____________________________________________________________________ 17. 1.7.2. Elementos de enfoque _____________________________________________________________ 17. 1.7.2.1. Lentes ____________________________________________________________________ 17. 1.7.2.2. Espejos____________________________________________________________________ 17. 1.7.3. Monocromadores_________________________________________________________________ 18. 1.7.3.1. Filtros_____________________________________________________________________ 19. 1.7.3.2. Prismas ___________________________________________________________________ 19. 1.7.3.3. Rejillas de difracción _________________________________________________________ 21. 1.7.4. Celdas de muestra ________________________________________________________________ 21. 1.7.5. Detectores ______________________________________________________________________ 22. 1.7.5.1. Fotoceldas _________________________________________________________________ 22. 1.7.5.2. Fototubos __________________________________________________________________ 22. 1.7.5.3. Fotodiodos _________________________________________________________________ 23. 1.7.5.4. Fotomultiplicadores __________________________________________________________ 23. 1.7.6. Sistemas de lectura _______________________________________________________________ 24. 1.7.6.1. 1.8. Señal _____________________________________________________________________ 25. Configuraciones básicas de espectrofotómetros ____________________________________ 25. 1.8.1. Instrumentos de longitud de onda fija o ajustada ________________________________________ 25. 1.8.2. Espectrofotómetros con barrido de longitudes de ondas ___________________________________ 26. 1.9. Algunos parámetros del espectrofotómetro a tener en cuenta __________________________ 28. 1.9.1. Resolución espectral ______________________________________________________________ 28. 1.9.2. Luz espuria (stray light) ___________________________________________________________ 29. 1.10. Selección de un espectrofotómetro ______________________________________________ 31. 1.10.1. 1.11. Selección del espectrofotómetro uv/vis _____________________________________________ 31. Conclusiones parciales________________________________________________________ 32.

(11) viii CAPÍTULO 2.. CIRCUITOS DEL ESPECTROFOTÓMETRO GENESYS 10____________ 33. 2.1. Espectrofotómetros GENESYS™ 10 visible (vis) y uv/vis _____________________________ 33. 2.2. Diagrama de bloques de los espectrofotómetros GENESYS 10 vis y uv/vis ______________ 34. 2.3. Especificación en los bloques __________________________________________________ 36. 2.3.1. Bloque Main Board CPU (Procesador) _______________________________________________ 36. 2.3.2. Bloque Main Board Memory and Address Decoder ______________________________________ 37. 2.3.3. Bloque Simple Detector Board / Reference Detector Board________________________________ 38. 2.3.4. Bloque Diagnostic Multiplexer _____________________________________________________ 40. 2.3.5. Bloque Delta-Sigma A/D Converter __________________________________________________ 41. 2.3.6. Bloque Lamp Control (tungsten lamp / flash lamp) ______________________________________ 43. 2.3.7. Bloque SIN / COS Microstep Drive __________________________________________________ 44. 2.3.8. Bloque Power Drivers (Turret & Filter Wheel Motors) ___________________________________ 44. 2.3.9. Bloque Serial DAC Control (Analog Output Board) _____________________________________ 46. 2.3.10. Bloque RS-232 Conversion (Internal Printer & RS-232 Port) ______________________________ 47. 2.3.11. Bloque LCD Control + VRAM (Display) ______________________________________________ 47. 2.4. Conclusiones parciales________________________________________________________ 50. CAPÍTULO 3.. PROGRAMAS DE LA SERIE GENESYS 10 _________________________ 51. 3.1. Programas del instrumento ____________________________________________________ 51. 3.2. Comunicación Serie __________________________________________________________ 51. 3.2.1. 3.3. Programa de Diagnóstico __________________________________________________________ 51. 3.2.1.1. Calibración de longitudes de ondas ______________________________________________ 52. 3.2.1.2. Calibración de los motores de la torreta y la rueda de filtros __________________________ 53. 3.2.1.3. Alineación de la óptica _______________________________________________________ 54. 3.2.1.4. Diagnóstico de las tarjetas de los detectores _______________________________________ 55. 3.2.1.5. Reinicio de la lámpara ________________________________________________________ 58. Consideraciones finales _______________________________________________________ 59. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ________________________________________ 60 Conclusiones ______________________________________________________________________ 60 Recomendaciones __________________________________________________________________ 60. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS_______________________________________________ 61 ANEXOS ____________________________________________________________________ 64.

(12) INTRODUCCIÓN. 1. INTRODUCCIÓN. Desde hace varios años la espectrofotometría viene cubriendo necesidades que surgen en la medida que el mundo evoluciona. Prácticamente no existe incertidumbre que no cause desarrollo en los medios que la eliminan. Los instrumentos espectroscópicos son los agentes que hacen visibles los avances en el mundo de la espectrofotometría. Modelos de ellos existen en demasía, no es extraño hoy en día ver un espectrofotómetro en el más recóndito de los laboratorios. Algunos son ya antiguos, otros más actuales, pero con un principio básico de operación que no cambia. En la Universidad Central ¨Marta Abreu de las Villas¨, en específico la facultad de QuímicaFarmacia y centros de investigación como el CBQ,, CEQA e IBP, se han realizado inversiones en instrumentos como estos de avanzada tecnología, entre ellos, modelos de la serie GENESYS 10. Las compras se realizan a través de firmas comercializadoras, cuyas representaciones se encuentran en la Ciudad Habana y por tanto la comunicación se afecta, así como las instalaciones y el mantenimiento de los equipos. EL Centro de Desarrollo Electrónico (CDE) asume el mantenimiento especializado de estas modernas tecnologías, cuya documentación y dominio presentan dificultades en nuestra universidad y en otros centros del territorio central, aunque se cuenta con la colaboración de especialistas en Ciudad Habana, que han brindado sus conocimientos, información y experiencias. Los GENESYS se han caracterizado siempre por su buen desenvolvimiento y la serie GENESYS 10 no es la excepción. Son tecnologías de punta que poseen numerosas ventajas entre las que se destaca la calidad. Desconocer el funcionamiento detallado de los modelos ultravioleta y visible, promueve la necesidad de una profundización en ello, para facilitar su mantenimiento correctivo..

(13) INTRODUCCIÓN. 2. De esta manera, se plantea la necesidad de contribuir con el estudio de la serie GENESYS 10 teniendo en cuenta la carencia de información científico-técnica y la presencia de varios de estos equipos en los laboratorios de la Universidad Central y de otras instituciones del territirio. El objetivo general que se persigue con el presente trabajo es desarrollar un conjunto necesario de recursos humanos y materiales que se vinculen con la serie de espectrofotómetros GENESYS 10 para su mantenimiento correctivo. Los objetivos específicos son los siguientes: ¾ Recopilar la información científico-técnica. ¾ Detallar las características circuitales del equipo. ¾ Explotar las potencialidades del programa de diagnóstico brindado por el fabricante. Hipótesis de la investigación El estudio posibilitará una mejor comprensión en el funcionamiento de la serie GENESYS 10 para aplicar el mantenimiento correctivo ante las fallas. Organización del informe El Capítulo 1 nombrado ¨Base Teórica¨, introduce la espectrofotometría y sus términos para que el lector comprenda los conceptos empleados durante el cuerpo del trabajo. Se explican varias de las partes que poseen los espectrofotómetros antiguos, de los modernos y se resalta la instrumentación empleada en los equipos. Se citan algunas de las posibles configuraciones que pueden existir en la instrumentación, al igual que algunos parámetros técnicos a tener en cuenta en los equipos y por último, la selección de un espectrofotómetro El Capítulo 2 explica el funcionamiento de los bloques electrónicos del Espectrofotómetro GENESIS 10. El Capítulo 3 aborda los programas de autochequeo y diagnóstico del instrumento, así como manejo y utilidad de este último para la detección de probables fallas en los espectrofotómetros de la serie GENESYS 10 y programa.. también cita ejemplos prácticos de mediciones realizadas con el.

(14) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 3. CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 1.1. Introducción a la espectrofotometría. Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias químicas. Al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiación se puede estudiar la absorción de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino también en ultravioleta e infrarrojo. Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación y a las mediciones a una determinada longitud de onda. [1] Otros la definen como los métodos cuantitativos de análisis químico que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas y según sea la radiación utilizada, como espectrofotometría de absorción visible (colorimetría), ultravioleta, e infrarroja. [2] Los métodos espectroscópicos se basan en la medida de la radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia. O sea podemos determinar la concentración en mg de un elemento que puede ser calcio, en un medio como suelo o agua. Los métodos de absorción están basados en la disminución de la potencia de la radiación electromagnética como consecuencia de la absorción que se produce en su interacción con el analito (muestra). La espectrofotometría de absorción atómica se refiere a la absorción de elementos. Si se aplica energía a un átomo, esta puede ser absorbida y un electrón externo puede ser promovido a una configuración conocida como estado excitado; dado que ese estado es inestable, el átomo retornará inmediatamente al estado fundamental,. emitiendo. energía.. La característica de interés en las medidas de absorción atómica, es la cantidad de luz absorbida por un analito, a la longitud de onda resonante, cuando pasa a través de una nube atómica..

(15) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 4. Conforme al número de átomos se incrementa en el paso de la luz, la cantidad de luz absorbida o aumentará. [3] La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de cuantos de energía llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda está asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad definida de energía. [1] Un espectrofotómetro es un instrumento que maneja un haz de Radiación Electromagnética, por lo general denominado haz de luz. Lo separa en bandas de longitudes de onda específicas, con el fin de identificar, calificar y cuantificar su energía [3]. Permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. [4] Los espectrofotómetros de radiaciones ultravioletas y visibles (uv/vis) son parte casi indispensable del equipo del laboratorio analítico moderno. En muchas aplicaciones otras técnicas podrían ser empleadas, pero ninguna sobrepasa a la espectrofotometría visible y ultravioleta como combinación de simplicidad, versatilidad, exactitud y efectividad de costo. Tomemos el análisis de aleaciones como ejemplo donde la elección de técnicas a usar es amplia. Si la velocidad es una prioridad absoluta, como en la fundición, que puede ser necesario ajustar la composición final del derretido antes de fundir, entonces lo Rayos X o las técnicas de emisión por arco serán empleadas. Ambas técnicas requieren una cara instrumentación, pero yace la información en varios elementos a la vez. Cuando el tiempo no presiona, entonces la absorción atómica podría ser usada. El chequeo completo de una aleación toma de una hora a dos, pero con la ventaja de una menor inversión en la instrumentación. Esta demora se debe a que son utilizados pasos químicos extras para producir una solución colorida cuya intensidad es proporcional al metal específico de interés. Las longitudes de ondas visibles o ultravioletas también son empleadas en el campo de la biotecnología, en análisis de la sangre y en químicas de inmunoensayos para el cuidado de la salud. La mayor parte de los espectrofotómetros uv/vis modernos pueden llegar a ubicar su ascendencia en el principio de la década de los 40 cuando los avances en amplificadores y los detectores.

(16) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 5. hicieron de la espectrofotometría de precisión, algo opuesto a la colorimetría y las comparaciones a simple vista, una proposición práctica. Los espectrofotómetros modernos han sido grandemente beneficiados desde los avances de nuestra sociedad tecnológica, son ahora más precisos, confiables y simples de operar respecto a sus predecesores. Sin embargo, los espectrofotómetros tienen límites finitos respecto a su desempeño, se deterioran gradualmente en los extremos de sus rangos de longitudes de onda, así como decrece la transmisión por la muestra. 1.2 1.2.1. Luz y radiación Definiciones y unidades. La radiación es una forma de energía y estamos constantemente apercibidos de su presencia a través de nuestro sentido de la vista y de nuestra habilidad de sentir el calor. Sin embargo, el cuerpo humano está sometido a otras formas de radiación: la natural y la creada por el hombre. Estos tipos de radiación pueden ser solamente detectados con la ayuda de dispositivos que convierten la energía en señales sensorias. Por ejemplo, un contador Geiger nos permite detectar la radiación de materiales radiactivos, mientras que un receptor de televisión convierte energía de radiofrecuencias en señales de audio y visuales. La radiación se considera como una onda en movimiento, donde la longitud de onda (λ) es la distancia entre dos picos continuos, la frecuencia (υ) es el número de picos que pasan por un punto en un segundo y se relacionan ambas magnitudes como en la expresión 1.1: c = υλ. 1.1. donde c es la velocidad de la luz en el vacío. El espectro de radiación electromagnética es continuo, cada región se enlaza o fusiona gradualmente con la siguiente. Para propósitos espectrofotométricos escogimos caracterizar las regiones visible y ultravioleta en términos de longitud de onda expresadas en nanómetros (NM), aunque se pueden utilizar otras unidades como el ángstrom (Ǻ) y el milimicrón (mµ) : 1 nm = 1 mµ = 10 Ǻ = 10 −9 m.

(17) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 6. Como referencia se han establecido definiciones de varias regiones espectrales: Tabla 1.2.1. Longitudes de ondas de las regiones espectrales Región. Longitud de onda (nm). Ultravioleta lejano. 10-200. Ultravioleta cercano. 200-380. Visible. 380-780. Infrarrojo cercano. 780-3000. Infrarrojo medio. 3000-30000. Infrarrojo lejano. 30000-300000. Microondas. 300000-1000000. El ojo humano es solo sensible a una diminuta porción del espectro, aproximadamente entre 380780 nm, dentro de esta área percibimos los colores del arco iris, desde el violeta hasta el rojo. En la figura 1.2.1 se muestra el espectro electromagnético.. Figura 1.2.1. Espectro electromagnético. 1.2.2. Fuentes de radiación. La radiación de sólidos calientes está constituida por varias longitudes de onda, la energía emitida a una específica longitud de onda depende fundamentalmente de la temperatura del sólido. Las curvas de la figura 1.2.2 muestran la distribución de energía para un filamento de tungsteno a tres temperaturas diferentes. Notemos cómo la energía emitida se incrementa con la temperatura y cómo la longitud de onda de los máximos de energía se desplaza a valores más pequeños..

(18) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 7. Figura 1.2.2. Radiación emitida para un filamento de tungsteno. 1.3. Teoría cuántica. Para ganar un entendimiento de los orígenes de la espectrofotometría de absorción, es necesaria una breve introducción a la teoría cuántica. Para este propósito ahora debemos pensar en la radiación como una corriente de partículas conocida como fotones, en vez de las ondas consideradas anteriormente. En nuestro mundo cotidiano normal estamos acostumbrados a que los objetos tengan un rango infinito de estados de energía, pero las mecánicas de los átomos y moléculas son diferentes. Pueden existir solamente en un número definido de estados de energía y un cambio de nivel requiere la absorción o emisión de un número integral de una unidad de energía llamada cuanto o fotón. Una analogía puede servir para enfatizar esta diferencia entre las mecánicas clásica y cuántica. Podríamos escoger el hacer la escala del lado de un edificio usando una soga suspendida desde el techo. Podemos escalar y detenernos en un número de puntos durante el viaje para descansar. No hay leyes que gobiernen donde podemos o no podemos hacer la pausa. Sin embargo, si estuviéramos atados por las reglas de la mecánica cuántica, tendríamos que usar una escalera en la que cada vez que escalamos un peldaño, utilizamos un cuanto de energía, no podemos detenernos entre peldaños, sino que tenemos que utilizar una unidad completa y continuar a la próxima..

(19) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 8. Los escaños de la escalera corresponden a los niveles fijos de energía en la molécula o átomo. Mientras que podemos gastar energía muscular, la molécula necesita absorber energía de un fotón para ascender uno o más escaños. Si nos cayéramos de la escalera y regresáramos al piso, probablemente emitiríamos alguna de nuestra energía de forma vocal, mientras que la molécula liberaría un fotón. La energía de un fotón emitido o absorbido durante la transición de un nivel de energía a otro, está dada por la ecuación 1.2: E=һυ. 1.2. Donde һ es la constante de Planck y υ es la frecuencia del fotón. Antes se vio que c=υλ y por lo tanto al sustituir se obtiene la expresión 1.3: E=һc/λ. 1.3. mientras menor sea la longitud de onda, mayor será la longitud del fotón y viceversa.. Una molécula de cualquier sustancia tiene una energía interna que se puede considerar como la suma de las energías de sus electrones, la energía de las vibraciones entre sus átomos constituyentes y la energía asociada con la rotación de la molécula. Los niveles de energía electrónicos de las moléculas simples están ampliamente separados y usualmente solo la absorción de un fotón de alta energía (de pequeña λ), puede excitar a una molécula de un nivel a otro. En moléculas complejas los niveles de energía están más cercanamente espaciados, los fotones del ultravioleta cercanos y de la luz visible pueden efectuar la transición. Estas sustancias, por lo tanto, absorberán la luz en algunas áreas de las regiones visible y ultravioleta cercano. Los estados de energía de vibración cuantizada de varias partes de una molécula están mucho más unidos que los niveles de energía electrónicos, de modo que fotones de menor energía son suficientes para traer consigo cambios vibracionales. La absorción de la luz se debe a los cambios de vibración que ocurren en la región infrarrojo. Los estados de energía rotacionales de las moléculas están tan cercanamente espaciados que la luz en el infrarrojo lejano y en las regiones.

(20) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. de microondas. 9. del espectro electromagnético, tienen suficiente energía para causar estos. pequeños cambios. Concentrándonos en las longitudes de ondas de las regiones visible y ultravioleta, esperamos de esta discusión que el espectro de absorción de una molécula (grado de absorción en función de la longitud de onda de la radiación incidente), debe mostrarse en líneas bien finas. Cada línea debe aparecer a la longitud de onda donde la energía del fotón incidente garantiza la energía requerida para que ocurra la transición electrónica. En la práctica encontramos que el espectro visible y ultravioleta de la mayoría de las moléculas consiste en algunas curvaturas y no en líneas finas. Estas curvas en forma de picos nos muestran que la molécula absorbe radiación sobre una banda de longitudes de onda. En resumen, cuando las moléculas están estrechamente unidas como normalmente aparecen en mediciones espectrofotométricas, ejercen influencias entre ellas, las cuales ligeramente perturban los niveles de energía y desvanecen las líneas espectrales finas convirtiéndolas en bandas. 1.4. Orígenes físicos de la absorción uv/vis. Cuando la luz blanca incide sobre una muestra, la luz puede ser totalmente reflejada en caso de que la sustancia sea blanca, o absorbida en caso de que la sustancia sea negra. Sin embargo, solo una pequeña porción de la luz es absorbida y el balance es reflejado, el color de la muestra se determina por la luz reflejada. De modo que si el violeta es absorbido, la muestra es amarilloverdosa, y si el amarillo es absorbido, la muestra aparecerá azul. El color se describe como un ser complementario, sin embargo muchas sustancias las cuales apreciamos sin colorido, sí tienen espectro de absorción. Aquí la absorción tomará lugar en las regiones del infrarrojo y ultravioleta, pero no en la visible. La tabla 1.4 ilustra la relación entre la absorción de la luz y el color de la muestra..

(21) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 10. Tabla 1.4. Relación entre la absorción de luz y el color Color Absorbido. Color Observado. Radiación Absorbida (nm). Violeta. Amarillo- verde. 400-435. Azul. Amarillo. 435-480. Verde-azul. Naranja. 480-490. Azul-verde. Rojo. 490-500. Verde. Púrpura. 500-560. Amarillo- verde. Violeta. 560-580. Amarillo. Azul. 580-595. Naranja. Verde-azul. 595-605. Rojo. Azul-verde. 605-750. Una relación estrecha existe entre el color de una sustancia y su estructura electrónica. Una molécula o ion manifestarán absorción en la región ultravioleta o visible cuando la radiación causa una transición electrónica dentro de su estructura. De igual manera, la absorción de la luz por una muestra en la región ultravioleta o visible está acompañada por un cambio en el estado electrónico de las moléculas en la muestra. 1.5. Interacción de la luz. Similar a lo anterior, cuando un as de radiación llega a un objeto, este puede ser absorbido, transmitido, dispersado, reflejado, o puede provocar fluorescencia. Cuando ocurre la dispersión, que se define como la distribución de longitudes de onda en el espacio, es decir la separación de una mezcla de longitudes de onda en sus monocomponentes [5], se considera que la radiación es primeramente absorbida y casi instantánea y completamente reemitida uniformemente en todas las direcciones. Los procesos con los cuales está relacionada la espectrofotometría de absorción son: la absorción y la transmisión. Usualmente las condiciones bajo las cuales la muestra es examinada, se crean para mantener la reflexión, la dispersión y la fluorescencia en el mínimo..

(22) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 11. En las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagnético las bandas que observamos generalmente no especifican lo suficiente como para permitir una identificación positiva de la muestra desconocida, aunque esta información se puede usar para confirmar su naturaleza deducida desde su espectro infrarrojo a través de otras técnicas. La espectrofotometría es casi completamente usada para el análisis cuantitativo, que es la estimación de la concentración de un compuesto conocido que está presente en la muestra, la cual es normalmente examinada en una solución. 1.5.1. Ley de Lambert (o Bouger ). Esta ley establece que cada capa de igual grosor de un medio absorbente, absorbe la misma fracción de energía radiante que lo atraviesa. Esa fracción de energía transmitida posteriormente por el medio absorbente es independiente de la intensidad de radiación, siempre que esta no altere el estado químico del medio. Si la intensidad de la radiación incidente es Io y la transmitida a partir de ella (por el medio absorbente) es I, entonces la fracción transmitida está dada por 1.4: T=I/Io. 1.4. donde T es la transmitancia y su porcentaje será la expresión 1.5: %T=I/Io*100. 1.5. Si se tiene una serie de placas coloridas de igual grosor las cuales absorben cada una un cuarto de la radiación incidente, entonces la cantidad de radiación que atraviesa a la primera será:. 1−1 / 4 *100 = 75% 1 Y la segunda 56,25% (75% de 75), cumpliendo con la regla (0.75)ⁿ * 100, donde n es el número de la placa correspondiente. Ahora imaginemos que tenemos una solución absorbente dentro de un recipiente de cristal con paredes internas igualmente espaciadas. Si la luz monocromática incidente se reduce al 75% al salir de cada compartimiento, la ley de Lambert nos dice que ocurrirá lo mismo en la próxima celda..

(23) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 12. Si el contenido de dos celdas se evapora a la mitad de su volumen, la concentración entonces se dobla y cuando se analice la transmisión de la luz en una de estas celdas, se encontrará que se reduce al 56,25%. Inmediatamente vemos que si deseamos determinar la concentración de una muestra desconocida, podemos trazar el por ciento de transmitancia de una serie de soluciones de concentración conocida o “estándares” y leer la concentración que no conocemos en el gráfico. Se verá que el gráfico es una función exponencial, lo cual es inconveniente para una fácil interpolación. 1.5.2. Ley de Beer - Lambert. Esta ley plantea que la concentración de una sustancia en solución es directamente proporcional a la absorbancia (A) de la solución. Esta ley solo se cumple para la ley monocromática, que es la luz de una sola longitud de onda o de una banda bien estrecha de longitudes de onda y cuando el estado químico o físico de la sustancia no cambie con la concentración. Matemáticamente la absorbancia se relaciona con el porcentaje de transmitancia a través de la expresión 1.6: A = log. Io 100 = log = KcL I T. 1.6. donde L es la longitud del camino que atraviesa la radiación en la muestra, c es la concentración de las moléculas absorbentes y K es el coeficiente de extinción es una constante que depende de la naturaleza de la molécula y de la longitud de onda de la radiación. Es mucho más conveniente trabajar con la absorbancia que con la transmitancia para análisis cuantitativos. 1.6. Aplicaciones de la espectrofotometría uv/vis. Una vez vista parte de la teoría y de los orígenes del espectro uv/visible, se investiga cómo aplicar la técnica espectrofotométrica al análisis químico comenzando con el estado de la muestra. Cuando se tienen muestras sólidas, se aprecia que el material es una condición inapropiada para la espectrofotometría directa. El índice de refracción del material es alto y una porción de la radiación se puede perder por la reflexión aleatoria o por la refracción en la superficie o en la.

(24) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 13. masa. A no ser que la muestra sea una película bien pulimentada y homogénea, se eliminan estas interfases disolviéndola en un solvente transparente. Los líquidos se vierten dentro de un recipiente de un material transparente, ya sea silica, cristal o plástico, conocido como celda o cubeta. Las caras de estas celdas por donde pasa la radiación están bien pulidas para mantener las pérdidas por reflexión y dispersión al mínimo. Los gases pueden estar contenidos en celdas similares, selladas o taponadas para hermetizarlas. Una vez que la muestra está lista para medir, la intensidad de radiación incidente (Io) se establece o fija sin poner la muestra en el espectrofotómetro dejando pasar el rayo directo al detector. La instrumentación moderna permite que el establecimiento de Io se haga a través de un comando “autocero”. En la práctica ese método no informa la parte de la radiación que es reflejada o dispersada por la cubeta. Tampoco nos dice la cantidad de radiación que el solvente absorbe y pasa de forma efectiva por la muestra. Por lo tanto, es usual emplear una celda idéntica a la de la muestra, pero en su contenido solo con el solvente para tomar la radiación transmitida como patrón o referencia. Habiendo ya establecido la posición de referencia de Io, el procedimiento adoptado para el análisis dependerá de la información requerida. En términos generales, existen dos técnicas de medida, determinar cuánto analito hay en la muestra (análisis cuantitativo) y cuáles analitos encontramos en la muestra (análisis cualitativo). 1.6.1. Análisis Cuantitativo. Para este análisis se debe seleccionar la longitud de onda a la cual el coeficiente de extinción sea el máximo. Usando instrumentos modernos con microprocesadores, el analista solo requiere un estándar tope, el cual usa para calibrar el dispositivo de tal manera que refleje la concentración de las muestras subsecuentes en las unidades requeridas. Si la curva de calibración no es lineal debido al instrumento o a las consideraciones químicas, entonces algunos de estos equipos confeccionan automáticamente una calibración lo más exacta posible. 1.6.2. Cinética. La cinética de reacción estudia todo lo relacionado con el cambio de concentración de los elementos en la reacción como una función en el tiempo. Analiza el aumento o disminución de la.

(25) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 14. absorción de una longitud de onda establecida, ya sea por las sustancias reaccionantes o productos. La aplicación de la cinética espectrofotométrica más ampliamente difundida la encontramos en el estudio de las enzimas. 1.6.3. Análisis de muestras. En una mezcla es muy raro que solo un elemento absorba radiación, es común que varios absorban a una misma longitud de onda. Esto hace que no sea verdad que la absorbancia de la muestra sea proporcional a la concentración de un componente en específico, sino de varios. Un método común para solucionar este problema, consiste en la adición de un reactivo que incrementa la absorción de un componente deseado y cambia la longitud de onda de ese máximo de absorción. Así queda eliminada la interferencia entre los componentes. 1.6.4. Mediciones multi-longitudes de ondas. El análisis de multi-longitudes de ondas o multi-elementos se debe al desarrollo de instrumentos con microprocesadores. Habiendo medido los estándares, las muestras pueden ser procesadas y los resultados se presentan de forma apropiada. Programas de este tipo, incluyendo la medida de parámetros, se pueden almacenar y utilizar con la mínima intervención de un operador, proveyendo resultados de mezclas complejas que contienen hasta más de diez componentes. 1.7. Instrumentación. En los acápites anteriores vimos que el propósito de la espectrofotometría es proveer un rayo de radiación monocromática de forma apropiada para iluminar la muestra y medir la relación I/Io. Un espectrofotómetro típico posee cuatro componentes básicos: una fuente de radiación que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, un compartimiento para esta, y un foto- detector acompañado de un sistema de medición, que analizan cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra.[6] Cualquier espectrofotómetro está compuesto por las partes ilustradas en la figura 1.7:.

(26) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 15. Figura 1.7. Partes de un espectrofotómetro. Existen varias combinaciones de fuentes, monocromadores, sistemas de medida, etc., los cuales pueden ser ensamblados para formar espectrofotómetros integrados con grados variados de precisión y conveniencia para aplicaciones particulares. A continuación se hará un breve resumen de las partes fundamentales que conforman un espectrofotómetro. 1.7.1. Fuentes. 1.7.1.1 Lámpara de filamento de tungsteno. El método más sencillo para proveer radiación visible es a través de este tipo de lámpara. Tiene las ventajas de ser barata, confiable, y una intensidad de luz estable puede ser obtenida mediante una fuente de alimentación. La vida útil de la lámpara está frecuentemente limitada por el oscurecimiento de la envoltura de cristal, causado por la evaporación del filamento de tungsteno. 1.7.1.2 Lámpara halógena de tungsteno. Prácticamente casi todos los espectrofotómetros modernos utilizan una lámpara halógena de tungsteno o iodino de cuarzo. Estas lámparas tienen un filamento de tungsteno mucho más compacto dentro de una envoltura de cuarzo pequeña. Esta lámpara tiene una serie de ventajas en relación con la de filamento de tungsteno. Opera a una temperatura de filamento mayor, así que la salida ultravioleta será más potente, y obviamente la envoltura de cuarzo absorbe menos radiación que la de cristal. Además, no sufren de.

(27) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 16. oscurecimiento en la envoltura, ya que el tungsteno evaporado reacciona con el halógeno antes de alcanzar la envoltura y se forma un hálido volátil. Cuando este hálido entra en contacto con el filamento caliente, se descompone y se deposita el tungsteno nuevamente en el filamento. 1.7.1.3 Lámpara de Deuterio. Por debajo de los 330 nm aproximadamente, la fuente de radiación ultravioleta más satisfactoria para propósitos espectrofotométricos es la lámpara de arco de deuterio. Cuando es termalmente excitada, el gas deuterio emite un espectro continuo por debajo de los 400 nm, más una pequeña e intensa emisión de líneas en la región visible. La envoltura de la lámpara está construida normalmente de un grado óptimo de silica, la cual exhibe una excelente transmisión ultravioleta, pero contribuye pesadamente con un alto costo de reemplazo comparado con las fuentes de luz visible. Antes de que se establezca un arco entre el ánodo y el cátodo de la lámpara, el cátodo se eleva a unos cientos de grados de temperatura a través de un elemento calefactor, y posteriormente es que comienza la emisión de electrones. En este momento es aplicado un alto voltaje a través de los electrodos y se establece el arco. La corriente que provoca el calentamiento es cortada, debido a que el arco produce suficiente calor como para mantener la emisión. El arco está limitado a un pequeño volumen dentro de la lámpara por un recinto de metal alrededor de los electrodos y la radiación pasa a través de una pequeña abertura. Como en las lámparas halógenas de tungsteno, las de deuterio son prealineadas por el fabricante del instrumento. Se debe tener un cuidado razonable al cambiar estas lámparas, no se debe mirar directamente al rayo, porque puede dañar la vista. 1.7.1.4 Arcos de Mercurio y de Xenón. Para algunas aplicaciones (como las técnicas de fluorimetría), un arco de deuterio no es suficientemente intenso y es por ello que se usan estas lámparas. Ambas producen un intervalo de radiación con líneas espectrales superpuestas en la banda. Las lámparas de mercurio pueden ser usadas como accesorios dentro del compartimiento para la calibración de la longitud de onda. Son lámparas de baja potencia, compactas, que aportan líneas espectrales bien definidas..

(28) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 17. 1.7.1.5 Láseres. Los láseres aún no han encontrado una amplia aplicación en la espectrometría convencional uv/visible. Existen algunos comercialmente disponibles y se utilizan en un ancho de banda requerido, son voluminosos y caros. Es poco probable que estas fuentes reemplacen a las descritas anteriormente. 1.7.2. Elementos de enfoque. Habiendo ya establecido una fuente de radiación, es obvio y necesario concertarla tanto como sea posible para transferirla a través del monocromador a la muestra. Este proceso de transferencia de energía está acompañado por una serie de lentes y espejos. 1.7.2.1 Lentes. Fueron empleados en una serie de instrumentos más antiguos, pero se encuentran presentes en la instrumentación actual. Su inconveniente primario es la aberración cromática, originada por su rápido y variante índice de refracción en el ultravioleta. De modo que porciones del espectro uv/vis pueden ser enfocadas hasta 20 mm de separación en lugar de ser enfocadas de forma óptima en el sostenedor de la muestra. 1.7.2.2 Espejos. En espectrofotómetros se emplean espejos delanteros con superficies cubiertas por aluminio. El aluminio es uno de los pocos materiales con una alta reflectividad a lo largo de un intervalo ultravioleta-visible-infrarrojo. Una alta reflectividad es importante, porque si el espectrofotómetro contiene varios espejos, las pérdidas de energía son considerables. Seis espejos, cada uno reflejando el 90% de la radiación incidente, darán una salida por debajo del 50%. El aluminio cuando se expone a la radiación ultravioleta envejece y pierde reflectividad. Por esta razón, los espejos son recubiertos por una capa transparente. El mejor material que se emplea es el cuarzo (sílice), el cual previene la formación de óxido y le suministra a la superficie una tenacidad para que resista fregados vigorosos. El fregado normalmente restablece el valor original de reflectividad..

(29) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 1.7.3. 18. Monocromadores. La función principal de un monocromador es la de proporcionar un haz de energía radiante con una longitud de onda nominal y una anchura de banda dada. La salida espectral de cualquier monocromador usado con una fuente de radiación continua, independientemente de su distancia focal y anchura de rendijas, consiste de una gama de longitudes de onda con un valor promedio de longitud que se presenta en el indicador del monocromador. La función secundaria de un monocromador consiste en el ajuste del rendimiento de energía. Este puede aumentarse, aumentando el ancho de la rendija de salida, a costa de una mayor anchura de banda espectral que puede introducir desviaciones a la ley de Beer, porque ésta exige radiación monocromática. Sin embargo, los anchos de rendijas excesivamente pequeños provocan rendimientos de baja energía en la señal del detector, afectando la sensibilidad analítica como resultado de la degradación de la relación señal-ruido. El funcionamiento de un monocromador comprende tres aspectos correlacionados: pureza de la radiación de salida, resolución y poder de captación de luz. La pureza la determina principalmente la cantidad de radiación dispersada mientras que la resolución depende de la dispersión y perfección en la formación de la imagen. Se requiere un poder de dispersión grande y un alto poder resolutivo en un monocromador, para medir con precisión las líneas discretas en los espectros de emisión o absorción atómica y para obtener los espectros de bandas angostas de absorción molecular. [7] El monocromador es el corazón del espectrofotómetro, y las deficiencias en su funcionamiento no pueden ser complementadas por otros elementos de mayor calidad en el sistema óptico. En la práctica, la mayoría de los monocromadores consisten en una ranura de entrada para delimitar la radiación de la fuente a un área utilizable, espejos para pasar la luz a través del sistema, un elemento dispersivo para extender la radiación en componentes de longitudes de ondas y una ranura de salida la cual selecciona la longitud de onda con la que se va a iluminar la muestra. Antes de comparar el funcionamiento relativo de diferentes monocromadores, se necesita una medida de su habilidad para seleccionar un intervalo de longitudes de ondas estrecho..

(30) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 19. 1.7.3.1 Filtros. El monocromador más sencillo es una pieza de cristal colorido o una gelatina colorida intercalada entre placas de cristal para formar un filtro de luz. El término especial “colorímetro” o “fotómetro” está reservado para instrumentos que emplean solo filtros para aislar o separar una banda de longitudes de ondas deseadas. Estos dispositivos normalmente no poseen una ranura de entrada, sino que la armadura de sujeción del filtro cumple ese propósito. Similarmente, la ranura de salida es una máscara determinada para delimitar el rayo a las dimensiones del porta muestras. Para permitir algún grado de versatilidad de longitudes de ondas se colocan diferentes filtros en un disco rotatorio. Estos tipos de filtros tienen una tolerancia del ±10-25 nm, consecuentemente, los fotómetros son menos sensitivos que los espectrofotómetros, ya que no siempre se pueden ajustar para medir el pico de absorbancia. Son menos eficientes al ignorar cualquier radiación interferente de las longitudes de ondas cercanas, de aquí que no son verdaderamente lineales con el incremento de la concentración. Los colorímetros son obviamente poco prácticos para el ploteo del espectro de absorbancia y se limitan a la región visible debido al uso del vidrio en la construcción de los filtros. Filtros dieléctricos o de interferencia son usados algunas veces en los fotómetros. Se construyen cubriendo una pieza de cristal o de sílice con diferentes grosores de materiales de variados índices de refracción, de manera tal que las longitudes de ondas no deseadas sean absorbidas o reflejadas por el filtro. Los filtros de interferencia se pueden construir con un ancho de banda espectral en el orden de los 10 nm. Tienen un alto costo, es más frecuente y económico usar un monocromador continuo y sintonizable que una hilera de filtros de interferencia. 1.7.3.2 Prismas. Por muchos años los prismas se utilizaron como el estándar de elemento dispersivo en los espectrofotómetros. Un prisma monocromador se muestra en la figura 1.7.3.2:.

(31) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 20. Figura 1.7.3.2. Prisma monocromador. La luz de una fuente se convierte en rayos paralelos alineados por el espejo M1 y reflejados hasta el prisma. Este tiene la propiedad de desviar la luz de diferentes longitudes de ondas en diferentes cantidades. La luz pasa a través del prisma para que este doble la dispersión o la separación angular de las longitudes de ondas. Si el rayo dispersado es ahora reenfocado por el espejo M2, el punto focal de una longitud de onda será físicamente desplazado por otra. Se puede seleccionar la longitud de onda requerida moviendo la ranura de salida a través del plano focal. Los sistemas ópticos más usados en la práctica difieren del mostrado anteriormente por razones de compactación, conveniencia y costos, pero el principio es el mismo. En la mayoría de los casos, el prisma es más bien quien se rota para desplazar el espectro a través de la ranura de salida y no la ranura y se emplea un espejo que cumpla las funciones de M1 y M2 para disminuir los costos. La eficiencia de los prismas monocromadores es mucho mejor que la de los filtros. Sin embargo, la dispersión cambia con la longitud de onda y si se requiere que las medidas se realicen a un ancho de banda constante, entonces el ancho de la ranura de salida debe ser ajustado de tal manera que pueda cerrarse cuando el espectro desde el prisma se agrupa y abrirse cuando se expande..

(32) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 21. 1.7.3.3 Rejillas de difracción. En la mayoría de los espectrofotómetros modernos el elemento de dispersión preferido es la ranura de difracción. Consiste en una serie de ranuras o muescas grabadas en una superficie reflectante. Un buen funcionamiento para las regiones uv/visible, requiere por lo menos 1200 líneas/mm. Cuando se hace incidir un rayo sobre una rejilla de manera que esta se ilumine, funciona como un espejo bien estrecho. La radiación reflejada de las muescas vecinas se superpone provocando interferencia. Cuando la longitud de onda de la radiación es tal que la separación entre las ranuras es un número entero de longitudes de onda, las ondas están en fase y la radiación se refleja de forma ordenada. Cuando las separaciones no son un número entero, las ondas se suprimen y no se propaga la radiación. Las rejillas de difracción tienen ciertas ventajas sobre los prismas, por ejemplo, es posible obtener pequeñas longitudes de ondas debido a su diseño; la dispersión sigue una ley geométrica que no es propiedad del material, así que las medidas a un ancho de banda constante se alteran mucho menos; y son menos sensibles a los cambios de temperatura. 1.7.4. Celdas de muestra. Las celdas de muestra están disponibles en una amplia gama de formas y tamaños para que se ajusten a casi cualquier medición espectrofotométrica. Casi todos los instrumentos se ajustan con sostenedores ( o porta celdas) para celdas estándares rectangulares de 10 mm de recorrido. Estos porta celdas deben asegurar que las caras de las celdas queden perpendiculares al rayo. Las celdas modernas normalmente se construyen de vidrio o sílice. El vidrio se adecua para el uso en la región desde 340 a 1000 nm, pero la sílice es necesaria para trabajar entre 220 y 340 nm, así que es común que se fusionen sílice y vidrio. Entre 185 y 220 nm un grado especial de sílice debe ser usado. Celdas polietileno moldeado están disponibles como una alternativa del vidrio. Tienen las ventajas de ser baratas y desechables, de modo que se evita tener que limpiarlas. Sin embargo, las celdas fusionadas son preferibles para las mediciones por razones de precisión. Las caras de estas celdas están pulidas, son planas y bien paralelas para evitar pérdidas de luz en la superficie, ya sea por reflexión o dispersión..

(33) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 1.7.5. 22. Detectores. Existen varios tipos de detectores diferiendo estos en su rango de longitudes de ondas, velocidad de respuesta, sensibilidad, etc. Su propósito es convertir la energía de la radiación incidente en señales eléctricas que serán procesadas y puestas en pantalla de forma interpretable para el operador. 1.7.5.1 Fotoceldas. Este detector es el más simple y menos costoso de todas las variantes. Está formado por una pieza de metal cubierta por un material fotosensible (usualmente selenio). Tienen las ventajas de ser robustos, pequeños, y no necesitan alimentación externa. Como desventajas se aprecian un rango limitado de longitudes de ondas, entre 400 y 750 nm, y comparativamente, una baja sensibilidad. Por esta razón, más bien las fotoceldas están destinadas a los colorímetros y no a los espectrofotómetros. Tienen una respuesta lenta ante los cambios en los niveles de luz y temperatura. 1.7.5.2 Fototubos. Han sido lentamente reemplazados por los fotodiodos ya que dependen de una tecnología de válvulas para su construcción. Están hechos de una envoltura de cristal o sílice en dependencia del rango de longitudes de ondas requerido. Dentro de su envoltura encontramos un cátodo cubierto por una aleación fotoemisora y una fina malla como ánodo. La luz entra por la malla hasta el cátodo donde se liberan electrones que son capturados por el ánodo, provocando así una corriente. Los cátodos se hacen para que sean sensibles a longitudes de ondas entre 190 y 650 nm, o de 600 a 1000 nm, así que los espectrofotómetros que los emplean necesitan dos fototubos para cubrir su rango de longitudes de onda. Por los fototubos circula una corriente de oscuridad cuando no incide luz sobre ellos. Esta corriente depende de la temperatura y como en los laboratorios el clima es variable, es necesaria una función “reset” en los instrumentos para obtener los niveles de absorbancia deseados. Así como las fotoceldas, los fototubos se fatigan, o sea, decrece la salida cuando se exponen durante largos intervalos de tiempo a niveles de luz elevados, por esta razón se protegen..

(34) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 23. Aunque son más sensibles que las fotoceldas, requieren de una fuente de alimentación para mantener el voltaje entre los electrodos y un amplificador de señal externo. Debido a estas desventajas y al costo, no se encuentran tan difundidos en los espectrofotómetros. 1.7.5.3 Fotodiodos. Los fotodiodos de silicio han estado disponibles por muchos años, pero solo ha sido posible con el avance de la tecnología que se hayan incorporado como detectores en espectrofotómetros. El fotodiodo consiste en una unión p-n polarizada en inverso, cuando la luz incide sobre la superficie se incrementa la conductancia del dispositivo. Un fotodiodo usualmente tiene su sensibilidad pico a los 1000 nm y aparentemente no son sensibles por debajo de los 400 nm, razón por la que serían inadecuados para la espectrofotometría uv/visible. Sin embargo, el avance tecnológico ha permitido que su respuesta se extienda por debajo de los 200 nm, haciéndolos eminentemente apropiados para los espectrofotómetros. Su sensibilidad no se iguala a la de los fotomultiplicadores, por lo tanto, no se emplean donde los niveles de energía sean muy bajos. Haciendo uso de la tecnología de circuitos integrados, son una realidad los arreglos de cientos de estos diodos en un solo dispositivo de pequeño tamaño. Si el espectro se expande sobre este arreglo es posible medir la intensidad a cualquier longitud de onda monitoreando la salida del elemento del diodo adecuado en vez de tener que mover el elemento dispersivo. Barridos de longitudes de ondas bastante rápidos pueden estar acompañados puramente por la interrogación electrónica de diodos en secuencia. Los espectrofotómetros con estos arreglos de diodos ofrecen la velocidad necesaria para las reacciones químicas que ocurren rápidamente, pero sufren considerablemente las desventajas de los precios respecto a espectrofotómetros convencionales de similar rendimiento. 1.7.5.4 Fotomultiplicadores. Los fotomultiplicadores son parientes bastante cercanos de los fototubos, pero tienen las ventajas de ser mucho más sensibles y de ofrecer un rango de longitudes de onda mucho más amplio. Tienen una rápida respuesta a los cambios en los niveles de luz y son los detectores preferidos para instrumentos con sistemas de doble rayo..

(35) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 24. Su principio de funcionamiento está basado en que el rayo de luz golpea a un fotocátodo liberando así electrones. Estos electrones son atraídos por un segundo electrodo (dinodo) con un potencial más alto que el fotocátodo. Cada electrón que alcanza el primer dinodo provoca que se liberen dos electrones más, y de forma consecutiva causan un efecto de avalancha al pasar por un número determinado de dinodos con potenciales mayores uno respecto al otro. Con una cadena de nueve o más dinodos un simple fotón puede logar que en este último electrodo se liberen millones de electrones. Por tanto, un fotomultiplicador tiene una amplificación interna útil que ayuda a la circuitería externa. Los fotomultiplicadores no son propensos a fatigarse como las fotoceldas y los fototubos, pero se pueden quemar o fundir si llega a incidir sobre ellos la luz del día mientras trabajan. Los fotomultiplicadores son sensibles a la luz en el rango visible y ultravioleta aproximadamente desde 190 a 900 nm. Son caros al necesitar una fuente de alto voltaje. Su uso está destinado a la espectrofotometría de alto rendimiento con estrechos anchos de bandas que requieran la detección de bajos niveles de luz y una rápida respuesta ante las variaciones de estos niveles. 1.7.6. Sistemas de lectura. El eslabón final en la cadena es la conversión de la señal del detector a una forma en la que el analista comprenda. La señal amplificada del detector es proporcional al porcentaje de transmitancia de la muestra, y para que sea más útil se convierte a niveles de absorbancia. Los instrumentos modernos con microprocesadores pueden utilizar una tabla de búsqueda para realizar la conversión. Los microprocesadores, por supuesto, han revolucionado la electrónica de los espectrofotómetros. Inicialmente fueron usados puramente para controlar el instrumento, pero en la actualidad también se encargan de calibrar y comprobar sus funciones con ayudas de programas, así como de poner en pantalla la lectura realizada..

(36) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 25. 1.7.6.1 Señal. Una señal puede definirse como la respuesta obtenida a la salida de un transductor que está respondiendo al sistema químico de interés. La señal que se origina posee varios componentes: el causado por la señal que origina el analito o sustancia de interés, el originado por la señal de las otras especies que conforman la matriz de la muestra y el originado por la instrumentación utilizada en la medición. Todas las señales que acompañan a la señal del analito y que pueden interferir en la medida de la señal de este se conocen como ruido de fondo o background. En las medidas se trata, por diferentes medios, de reducir el ruido para obtener una alta relación Señal / Ruido, o S / N.. Generalmente se acepta como válida una señal cuando su valor es el doble o el triple de la señal de fondo o ruido, es decir S / N ≥.2 ó 3. [8] 1.8. Configuraciones básicas de espectrofotómetros. Los componentes de los espectrofotómetros discutidos anteriormente pueden ser ensamblados de varias formas. Se consideran ahora dos configuraciones bastante típicas que servirán para ilustrar sus aplicaciones prácticas. 1.8.1. Instrumentos de longitud de onda fija o ajustada. La vasta mayoría de los espectrofotómetros uv/visibles se usan para las medidas de la concentración o la velocidad de cambio de la absorbancia en el tiempo (cinética) a una longitud de onda fija. Tales requerimientos se pueden encontrar en el uso de una configuración óptica de simple rayo como el de la figura 1.8.1.. Figura 1.8.1. Sistema de simple rayo..

(37) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 26. Esta terminología indica que el rayo de luz sigue un solo camino desde la fuente hasta el detector. En estos instrumentos las fuentes están montadas sobre bases prealineadas y un espejo selector enfoca la radiación de la fuente que se va a utilizar a la rendija de entrada del monocromador. La luz pasa por diferentes espejos y lentes hasta llegar a la red de difracción o al prisma donde se dispersa. La banda de luz dispersada se enfoca en la rendija de salida. Esta estrecha banda de luz atraviesa la muestra que se halla contenida en una celda, la luz transmitida por la muestra pasa al detector originándose una corriente eléctrica que por medio de diferentes circuitos eléctricos o electrónicos permite observar una señal.[9] Se hablará del sistema de doble rayo, donde la luz es dividida en dos rayos para suministrarle a la muestra y tener a la vez un rayo de luz de referencia. Este sistema de doble rayo es casi exclusivamente usado en instrumentos con capacidad de exploración o barrido de longitudes de ondas. 1.8.2. Espectrofotómetros con barrido de longitudes de ondas. La salida del detector de un espectrofotómetro de simple rayo varía rápidamente en dependencia de efectos combinados que guardan relación con la longitud de onda de la fuente de energía, con la eficiencia de la ranura, con la reflectividad de los espejos y con la fotosensitividad del detector. Esto significa que un espectro puede ser obtenido por este tipo de instrumentos a través de un tedioso proceso colocando un cero de absorbancia en una celda que contiene el solvente (el ¨blanco¨ o la solución de referencia), moviendo la celda de muestra hacia el rayo, midiendo la absorbancia, cambiando la longitud de onda y repitiendo el proceso para cada punto requerido. Este tedioso proceso se puede eliminar a través de instrumentos que utilizan un barrido de longitudes de ondas. La exploración se enmarca dentro del intervalo de longitudes de ondas requerido. Se comienza desde la primera y se almacena en memoria cada nivel de absorbancia, repitiéndose este proceso hasta llegar a la última longitud de onda programada. Esta programación puede estar incluida en el mismo instrumento o se puede hacer a través de un acople con una computadora. Pudieran emplearse espectrofotómetros de simple rayo con exploración de longitudes de ondas, pero estos están más bien destinados a rendimientos bajos y medios debido a una serie de desventajas. Para niveles más altos de desempeño, el concepto de doble haz o rayo debe ser utilizado..

(38) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 27. En los instrumentos uv/visibles de doble haz, la luz proveniente de la fuente después de salir del monocromador es rota o dividida en dos haces, mediante un espejo rotatorio semicircular o ¨shopper¨, o mediante un sistema de espejos divisores semitransparentes, produciéndose dos haces de luz de pulsos alternantes. Uno de ellos se dirige a la celda de referencia o que contiene el blanco y el otro haz se dirige hacia la celda de muestra. Los dos haces de luz después de atravesar la celda de referencia y la de muestra pueden nuevamente recombinarse, por medio de un espejo para llegar al detector o bien, cada haz puede llegar a detectores separados (doble detector o ¨dual detectors¨), para obtener luego la señal correspondiente. Los sistemas de doble haz tienen la ventaja que cualquier variación en la intensidad de la fuente, la eficiencia de la red, la reflectividad de los espejos, la fotosensibilidad del detector, afecta simultáneamente o casi simultáneamente ( la frecuencias de rotación del shopper son de 50 y 100 Hz o ciclos/s ) a los dos haces. En consecuencia, la relación de energía de los dos haces permanece inalterada. Otra de las ventajas es que permite el registro automático de los espectros y la corrección del espectro por señales fluctuantes (background), además de múltiples procesos de manejo de los datos del espectro entre ellos la derivación, suma y resta de espectros, entre otros. [10] En las figuras 1.8.2a y 1.8.2b se muestran los sistemas ¨doble rayo con simple detector¨ y ¨doble rayo con doble detector¨ respectivamente.. Figura 1.8.2a. Sistema de doble rayo con simple detector..

(39) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 28. Figura 1.8.2b. Sistema de doble rayo con doble detector. 1.9 1.9.1. Algunos parámetros del espectrofotómetro a tener en cuenta Resolución espectral. Para el presente propósito, la concentración será en aspectos prácticos. Lo más importante es saber qué resolución se necesita para trabajor, esta se expresa en general como ancho espectral del instrumento (spectral bandwidth). Como regla general, el ancho de media banda instrumental debe ser como máximo 1/10 del ancho de media banda espectral de la banda de absorción a medir, una representación gráfica de ello es apreciada en la figura 1.9.1.. Figura 1.9.1. Resolución espectral. Dado que la mayoría de las moléculas en solución presentan en fase líquida bandas de absorción con anchos medios entre 20 y 40nm, un instrumento con “resolución” de 2nm es generalmente adecuado. A veces se encontran casos particulares (Ej.: cianocobalamina – vitamina B12) con bandas de anchos del orden de 10nm. En este caso, la cuantificación con un instrumento de 2 nm daría un error por defecto del orden del 2-3%, mientras que con un equipo de 1 nm de ancho de banda el error sería despreciable..

(40) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 29. En el caso de medición de gases o vapores, las interacciones son menores y por lo tanto las bandas de absorción también, por lo que en general se requieren instrumentos de alta resolución (0,1nm). Hay dos parámetros que afectan directamente la resolución de un monocromador: la densidad de líneas de la red y la distancia focal. La resolución es directamente proporcional a cada uno de estos parámetros. Sin embargo, al aumentar la densidad de líneas de la red, aumenta la dispersión y disminuye la eficiencia reflectiva aparente, lo que se corrige aumentando el ancho de ranura y por tanto disminuye la resolución. Aumentar la distancia focal también tiene su costo: el monocromador se hace más grande, disminuyen las tolerancias ópticas y mecánicas y las especificaciones para el alineamiento se hacen más estrictas, por lo cual también aumenta el precio. Y aún si el precio no fuera un problema, no siempre es lo mejor un instrumento con la mayor resolución. Un importante costo a pagar con el aumento de la resolución es un deterioro en la sensibilidad: al aumentar la resolución, disminuye en proporción cuadrática la relación señal / ruido y con ella la sensibilidad analítica. Por ejemplo: al disminuir a la décima parte el ancho de banda instrumental (digamos de 1nm a 0,1nm) la relación señal / ruido disminuye a la centésima parte. Esto es importante para tener en cuenta en los espectrofotómetros con ancho espectral variable. [11] 1.9.2. Luz espuria (stray light). La segunda más importante causa de error en fotometría es la luz espuria, que es toda luz de longitud de onda diferente a la de medición que llega al detector. El gráfico 1.9.2 muestra los errores de medición en función de la absorbancia teórica, para instrumentos con diferente nivel de rechazo de luz espuria (S)..

(41) CAPÍTULO 1. BASE TEÓRICA. 30. Figura 1.9.2. Efectos de la luz espuria en mediciones. Además del intervalo fotométrico informado por el fabricante del instrumento, es importante tener en cuenta el nivel de rechazo de luz espuria, que es el que en definitiva limitará el rango superior de mediciones. Por ejemplo, con un instrumento típico con S=0.05%, habría que tener en cuenta que el error de medición es de casi 6% al medir muestras con valores de absorbancia alrededor de 3 unidades. La luz espuria puede tener varios orígenes: luz de órdenes superiores de la red de difracción, reflexiones internas en el monocromador, en los montajes de componentes ópticos y en superficies ópticas deterioradas, luz dispersada por partículas de polvo flotando en el camino óptico. Para disminuir la luz espuria por órdenes superiores, los fabricantes utilizan filtros de corte que se ubican en general en forma automática en función de la longitud de onda seleccionada. Para evitar las reflexiones internas, todas las superficies no ópticas se pintan de negro mate. El deterioro de las superficies con el tiempo depende de la calidad de las mismas, de la hermeticidad del sistema y de las condiciones ambientales. La manera más efectiva de disminuir la luz espuria es mediante el uso de dos monocromadores en serie, pero esto aumenta mucho los precios. Además de ser un parámetro importante en la evaluación de la calidad de un espectrofotómetro en el momento de su adquisición, la medición periódica de luz espuria es una excelente medida del deterioro del equipo en el tiempo. [12].