INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
Departamento de Biotecnología
Establecimiento del cultivo in vitro de Castilleja tenuiflora Benth.
T E S I S
Que para obtener el grado de
Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos
P R E S E N T A
Gabriel Rosas Romero
Directora: Dra. Gabriela Trejo Tapia
Yautepec, Morelos, México, Noviembre 2007
El presente trabajo fue realizado en el Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Gabriela Trejo Tapia y en el Centro de Investigaciones Biomédicas del Sur del Instituto Mexicano del Seguro Social con asesoría del Dr. Alejandro Zamilpa Álvarez. Fue financiado por la Secretaría de Investigación y Posgrado del Instituto Politécnico Nacional (Proyectos 20060011 y 20070118).
Para la realización del mismo se contó con una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Registro 199411) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) del Instituto Politécnico Nacional.
ÍNDICE
ÍNDICE DE TABLAS………...………...… i
ÍNDICE DE FIGURAS………... ii
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS………...……... iv
RESUMEN………...………...….. 1
ABSTRACT………..… 2
1. ANTECEDENTES……….………..…. 3
1.1 Aspectos generales de Castilleja tenuiflora Benth……….……….... 3
1.2 Iridoides en especies del género Castilleja……….………….... 5
1.3 Aspectos generales de los iridoides………..….. 8
1.3.1 Ecología de los iridoides………..……… 8
1.3.2 Biosíntesis de los iridoides……….………..……… 9
1.3.3 Actividad antitumoral y quimiopreventiva de los iridoides………... 13
1.4 Cultivo de células y tejidos vegetales………..……... 15
1.4.1 Generalidades………..……….……..…….. 15
1.4.2 Reguladores de crecimiento vegetal………. 17
1.4.3 Cultivos de células desdiferenciados y diferenciados……….. 18
2. JUSTIFICACIÓN………. 21
3. OBJETIVOS………. 22
3.1 Objetivo general……….. 22
3.2 Objetivos específicos……….. 22
4. MATERIALES Y MÉTODOS………. 23
4.2 Germinación de semillas………. 24
4.2.1 Prueba in vitro……….. 24
4.2.2 Prueba en papel filtro………... 24
4.2.3 Prueba en sustrato……… 24
4.3 Desinfestación de hojas de plantas silvestre………... 25
4.4 Inducción de cultivos in vitro……….. 25
4.5 Establecimiento y mantenimiento del cultivo in vitro de raíces……… 26
4.6 Cultivo de brotes y plántulas………... 27
4.7 Cinética de crecimiento, pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces 27 4.7.1 Condiciones experimentales……… 27
4.7.2 Determinación gravimétrica del crecimiento………... 28
4.7.3 Determinación del pH……….. 28
4.7.4 Determinación de azúcares totales………... 28
4.7.5 Cálculo de los parámetros cinéticos………. 29
4.8 Aislamiento de los iridoides……… 30
4.8.1 Preparación de extractos de parte aérea y raíz………. 30
4.8.2 Fraccionamiento de los extractos………. 30
4.8.3 Preparación de los extractos de los cultivos in vitro……… 31
4.8.4 Cromatografía en capa fina………..……….…….……….. 31
4.8.5 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)………... 32
4.9 Elucidación estructural mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN)……… 33
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……….. 34
5.1 Obtención de material silvestre de C. tenuiflora………. 34
5.2 Germinación de semillas………. 36
5.3 Inducción de callogénesis y organogénesis……… 38
5.4 Establecimiento del cultivo in vitro de raíces, brotes y plántulas………... 41
5.5 Cinética de crecimiento, pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces 44 5.6 Obtención de estándares de la planta silvestre……… 48
5.6.1 Rendimiento de las extracciones……….. 48
5.6.2 Análisis por cromatografía en capa fina………... 48
5.6.3 Análisis por HPLC………... 50
5.6.4 Elucidación estructural mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN13C) 52 5.7 Análisis químico de los cultivos in vitro y comparación con la planta silvestre… 53 6. CONCLUSIONES……… 57
7. RECOMENDACIONES………... 58
8. BIBLIOGRAFÍA……….. 59
9. ANEXOS……….. 71
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Iridoides identificados en especies del género Castilleja………..……... 7 Tabla 2. Ensayos realizados que prueban la actividad antitumoral, quimiopreventiva
e inmunoestimulante de los iridoides de especies de la familia
Scrophulariaceae………..… 14
Tabla 3. Función de los reguladores de crecimiento vegetal en los cultivos de células
y tejidos vegetales………...………….… 17
Tabla 4. Cultivos in vitro de especies de la familia Scrophulariaceae….………... 20 Tabla 5. Combinación de auxinas y citocininas para inducir callogénesis y
organogénesis………... 26 Tabla 6. Mezcla de disolventes por gradiente de polaridad ascendente…..……...…... 31 Tabla 7. Germinación de semillas de C. tenuiflora en diferentes condiciones……... 37 Tabla 8. Tipo de respuesta y porcentaje de inducción de las hojas de plantas
silvestres de C. tenuiflora a los reguladores de crecimiento vegetal………... 39 Tabla 9. Parámetros cinéticos del crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C.
tenuiflora……….…… 46
Tabla 10. Rendimientos de las extracciones de C. tenuiflora………..….... 48 Tabla 11. Desplazamientos químicos (δ) de RMN13C del bartsiósido y F-37A…... 52 Tabla 12. Comparación de los principales compuestos detectados por HPLC en los
extractos metanólicos de la parte aérea y la raíz de la planta silvestre con los cultivos in vitro de raíces, brotes y plántulas de C.
tenuiflora……….………….... 55
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Castilleja tenuiflora Benth……….………..… 4
Figura 2. Estructura química de los iridoides glicosilados identificados en la parte aérea de C. tenuiflora………... 6
Figura 3. Estructura química de los iridoides y seco-iridoides……….... 8
Figura 4. Metabolismo primario, metabolismo secundario, compartamentalización y sitio de biosíntesis de los iriodoides………..……… 11
Figura 5. Biosíntesis del antirrhinósido……….……….. 12
Figura 6. Espectro de absorción de la aucubina……….…………..…… 32
Figura 7. Distribución de C. tenuiflora en México……….. 34
Figura 8. Frecuencia de colecta de C. tenuiflora en los distintos meses del año en México de 1990 a 2006……….…..…………. 35
Figura 9. A Semillas de C. tenuiflora germinadas en caja Drigalski; B Fruto de C. tenuiflora (Cápsula); C Semillas amarillas y cafés; D Plántulas obtenidas a partir de semillas germinadas en tepojal-turba……….. 38
Figura 10. Callogénesis y organogénesis a partir de hoja silvestre de C. tenuiflora…. 40 Figura 11. Cultivo in vitro de raíces, brotes y plántulas de C. tenuiflora……….. 43
Figura 12. Caracterización del crecimiento de raíces in vitro de C. tenuiflora en base húmeda……….. 45
Figura 13. Caracterización del crecimiento de raíces in vitro de C. tenuiflora en base seca………... 45
Figura 14. pH durante el crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora…. 47 Figura 15. Concentración de azúcares totales residuales durante el crecimiento del cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora………. 47
Figura 16. Cromatografía en capa fina. Fracciones del extracto de acetato de etilo de la parte aérea de C. tenuiflora………... 49 Figura 17. Cromatografía en capa fina. Aucubina, F-37A y F-40A del extracto de
acetato de etilo de la parte aérea, F-37R y F-40R del extracto metanólico
Figura 18. Cromatogramas de HPLC. A Aucubina; B F-37A; C F-40A; D F-40R de la planta silvestre de C. tenuiflora... 51 Figura 19. Estructura del bartsiósido………. 52 Figura 20. Cromatogramas de los extractos metanólicos de cultivos in vitro de C.
tenuiflora……….. 54
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
δ Desplazamiento químico 2,4 D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético ANA Ácido α-naftalenacético
BAP 6-bencilaminopurina
CCTV Cultivo de células y tejidos vegetales Ic Índice de crecimiento
KIN Cinetina
RCV Reguladores de crecimiento vegetal Rf Factor de retención
S Concentración de fuente de carbono en un tiempo determinado So Concentración de fuente de carbono inicial
td Tiempo de duplicación tR Tiempo de retención Vc Velocidad de crecimiento
X Biomasa en un tiempo determinado Xmáx Biomasa máxima
Xo Biomasa inicial
Yx/s Rendimiento de biomasa con base a sustrato
RESUMEN
Castilleja tenuiflora Benth. (Scrophulariaceae) es una planta mexicana silvestre, conocida como “hierba del cáncer” y usada tradicionalmente para tratar el cáncer y otros padecimientos relacionados. En la parte aérea se identificaron iridoides glicosilados a los cuales se les atribuye actividad anticancerígena e inmunoestimulante. En el interés de contar con sistemas biotecnológicos para producir compuestos bio-activos, el objetivo del presente trabajo fue establecer el cultivo in vitro de C. tenuiflora y comparar el perfil de iridoides con la planta silvestre. Para inducir callogénesis y organogénesis, se inocularon explantes de hoja de C. tenuiflora silvestre, en medio MS con sacarosa y diferentes reguladores de crecimiento vegetal (RCV) con una concentración 10 µM: auxinas (ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 2,4 D y ácido α-naftalenacético, ANA) y citocininas (cinetina, KIN y 6-bencilaminopurina, BAP). KIN y BAP indujeron la formación de brotes, mientras que en combinación con ANA indujeron la formación de callos; sin embargo, estas estructuras se oxidaron y no crecieron. Por el contrario, ANA indujo la formación de callos rizogénicos, estas estructuras crecieron en medio de cultivo fresco. El cultivo de raíces se estableció cuando las raíces de los callos rizogénicos se transfirieron a medio MS líquido sin RCV. El crecimiento de las raíces in vitro de C. tenuiflora fue caracterizado. En el día 28 se alcanzó la concentración de biomasa máxima (Xmáx), la cual fue de 25.14±1 g/L. El índice de crecimiento (Ic) en el intervalo de 0-28 días del cultivo de raíces fue de 2.02, lo cual significa que el inóculo se triplicó, las raíces crecieron con una Vc de 0.49 g/L día correspondiente a un td de 19 días. Por otro lado a las 4 semanas se observó la formación de brotes, estas estructuras se aislaron y cultivaron en medio líquido sin RCV. De estos brotes, se cortaron segmentos, incluyendo hoja y entrenudo, y se sembraron en medio MS semisólido sin RCV, los segmentos se elongaron dando lugar a la formación de plántulas.
Los análisis químicos de las plantas silvestres de C. tenuiflora, mediante cromatografía en capa fina, HPLC y RMN13C mostraron que se acumulan los iridoides aucubina y bartsióido en la parte aérea y en la raíz. En los cultivos in vitro de raíces, brotes y plántulas se detectaron varios compuestos químicos, entre ellos iridoides. En específico, la aucubina es acumulada en plántulas y el cultivo de raíces. Mientras que el bartsiósido se acumuló únicamente en las plántulas.
ABSTRACT
Castilleja tenuiflora Benth. (Scrophulariaceae) is a mexican plant growing in the wild, known as "hierba del cáncer" and traditionally used to treat cancer and other related diseases. In the aerial part were identified glycoside iridoids to which anticancer and immunostimulant activity is attributed. In the interest of having biotechnological systems to produce bio-active compounds, the aim of the present work was to establish the in vitro culture of C. tenuiflora and to compare the iridoides profile with the wild plant. To induce callugenesis and organogenesis, leaf explants of wild C. tenuiflora were inoculated in MS medium supplemented with sucrose and different plant growth regulators (PGR) with a concentration 10 µM: auxins (2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D and α- naphthaleneacetic acid, ANA) and cytokinins (kinetin, KIN and 6-benzilaminopurine, BAP). KIN and BAP induced the formation of shoots, while in combination with ANA induced calluses formation; however, these structures were oxidized and they did not grow.
By contrast, ANA induced the formation of rhizogenic calluses, these structures grew in fresh culture medium. In vitro root culture was established when the rhizogenic calluse´s roots were transferred to liquid MS culture medium whithout PGR. The growth of in vitro root of C. tenuiflora was characterized. At day 28 the highest biomass concentration was reached, it was 25.14 ±1 g/L. The growth rate index between 0-28 days was 2.02, which indicated the inoculum was triplicated; the roots grew with a rate of 0.49 g/L day corresponding a duplication time of 19 days. After 4 weeks in the roots culture was observed the formation of shoots, these structures were isolated and cultured in liquid medium without PGR. From these shoots, segments including leaves and internodes, were excised and transferred to semisolid MS culture medium without PGR. The segments were enlarged and converted in plantlets. Chemical analysis (TLC, HPLC and NMR13C) showed that wild plants of C. tenuiflora accumulates the iridoids aucubin and bartsioside in the aerial part and in the root. In vitro cultures of roots, shoots and plantlets accumulated several chemical compounds including iridoids. Specifically, aucubin was found in the plantlets and in root cultures. Bartsioside was only accumulated in the plantlets.
1. ANTECEDENTES
1.1 Aspectos generales de Castilleja tenuiflora Benth.
Castilleja tenuiflora Benth. es una planta mexicana que se conoce comúnmente como:
Bella Inés, Calzón de indio, Castilleja, Chacamekua (purépecha), Cola de borrego, Coneja, Copete de grulla, Cubano, Enchiladitas, Envidia, Espinosa, Flor de hielo, Garañona, Garayona, Hierba del cáncer, Hierba del golpe, Mirto, Platanitos, Plumero, Yerba de la epístola, Sangrinaria (Mondragón y Vibrans, 2005).
La clasificación taxonómica de C. tenuiflora es la siguiente:
Reino: Plantae
Subreino: Traqueobionta (plantas vasculares) Superdivisión: Spermatophyta (plantas con semillas) División: Magnoliophyta (plantas con flor) Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas) Subclase: Dilleniida
Orden: Scrophulariales Familia: Scrophulariaceae Género: Castilleja Mutis ex L.f.
Especie: Castilleja tenuiflora Benth.
Sinonimias: Castilleja angustifolia Martens. et Galeotti y Castilleja canescens Benth.
(Mondragón y Vibrans, 2005)
Castilleja tenuiflora (Figura 1) es una especie de hábito terrestre que crece en bosques de pino-encino, a altitudes de 740 - 3400 m.s.n.m. Es una planta herbácea que alcanza de 30 cm a 1 m de alto; el tallo es erecto, ramificado, con pelos largos y rígidos, de color blanco a blanco-grisáceo. Las hojas son sésiles y auriculadas (con oreja) en la base, linear- lanceoladas miden de 1 a 4.5 cm de largo, el ápice puede ser agudo u obtuso, con tricomas
inflorescencia es racemosa, con numerosas flores, pedicelos de 3 a 5 mm de largo, brácteas lanceoladas, de 1.2 a 4 cm de largo con ápice agudo, en ocasiones teñido de rojo. Las flores presentan una corola de 3 a 4.5 cm de largo, de color anaranjado, ocasionalmente amarilla, verdosa, con pelos simples y muy cortos, de 1.5 a 2 cm de largo; las anteras miden de 2 a 3 mm de largo; el estilo de 3 a 4 cm de largo y el estigma es bilobulado; cáliz de 2 a 3 cm de largo, lóbulos dentados, con pelos largos y tiesos a muy largos y rígidos, con el ápice teñido de rojo. El fruto es una cápsula ovoide, de 9 a 14 mm de largo que contiene semillas elipsoides de aproximadamente 1.8 mm de largo, de color café (Rzedowski y Rzedowski, 2001).
Figura 1. Castilleja tenuiflora Benth.
De acuerdo a las recomendaciones de la herbolaria mexicana, todas las partes de la planta son utilizadas para tratar enfermedades de diversa índole. Por ejemplo, el cocimiento de la parte aérea se emplea para lavar heridas y evitar la caída del pelo. La parte aérea en infusión es útil para curar el sarampión, la inflamación, afecciones del hígado o del riñón y combinada con las flores como agua de uso para la tos. La infusión de las hojas se toma en ayunas para aliviar la disentería, nervios, torzón y vómito. Las flores en infusión se usan contra vómito, nervios, disentería, retraso o adelanto menstrual y dolor menstrual. No se tiene definida la parte que se usa para aliviar cólicos hepáticos, enfermedades del estómago,
de C. tenuiflora para el tratamiento del cáncer (Hirschhorn, 1982; Graham et al., 2000).
Aunque no esta reportado la parte que se usa para tratar el cáncer, vendedores de plantas medicinales de los mercados de Sonora, Ozumba y Yautepec mencionan que la parte aérea es la que se utiliza para tratar este mal.
1.2 Iridoides en especies del género Castilleja
Estudios fitoquímicos sobre especies del género Castilleja muestran que uno de los grupos de metabolitos secundarios que acumulan principalmente son los iridoides. En la tabla 1, se resumen los trabajos entorno a la identificación de los iridoides en especies del género Castilleja. Sin embargo se reporta un alto grado de variabilidad tanto en el tipo como la concentración de iridoides entre las plantas individuales y las partes de la planta. De las hojas, el tallo y la flor de C. hispida se aisló la aucubina, el catalpol, el penstemonósido, el metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del gardósido (Stermitz et al., 1986). El mellitósido fue aislado de las hojas, el tallo y la flor de C. indivisa (Stermitz y Pomeroy, 1992). De la planta completa de C. integra se aisló el catalpol y el macfadienósido; de las hojas se identificó la shanzhisida, el metil éster de shanzhisida, el ácido 8-epilogánico y el gardósido, mientras que en las brácteas y flor, el ácido adoxosídico y el adoxósido (Stermitz y Mead, 1993). En hojas y tallo de C. miniata se identificó la aucubina, el bartsiósido, el catalpol, el 6-deoxicatalpol, la 8-epiloganina, el metil éster del gardósido, el mussaenósido y el metil éster de shanzhisida (Stermitz et al., 1985). De las hojas y el tallo de C. miniata aff. rhexifolia se aisló la aucubina, el catalpol, el penstemonósido, el metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del gardósido mientras que en la flor se identificó la aucubina, el catalpol, el 6-deoxicatalpol, la 8-epiloganina, el mussaenósido y el metil éster de shanzhisida (Stermitz et al., 1985). De las hojas, el tallo y la flor de C. occidentales se identificó la aucubina, el catalpol, el penstemonósido, el metil éster de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del gardósido (Stermitz et al., 1986). De hojas, tallo y flor de C. purpurea var. purpurea se aisló el metil éster de shanzhisida y el 6-O-acetilmellitósido. Sin embargo en C. var. citrina sólo se identificó el 6-O-acetilmellitósido (Stermitz y Pomeroy, 1992). En las hojas, el tallo y la flor de C. sulphurea se aisló la aucubina, el catalpol, el penstemonósido, el metil éster
de shanzhisida, la 8-epiloganina y el metil éster del gardósido (Stermitz et al., 1986). En específico, sobre C. tenuiflora sólo existe un reporte en el que se identificaron en los extractos butanólicos de la parte aérea los iridoides glicosilados: bartsiósido, aucubina, metil éster del ácido geniposídico, metil éster del ácido mussaenosídico y metil éster de shanzhisida (Figura 2) (Jiménez et al., 1995).
Figura 2. Estructura química de los iridoides glicosilados identificados en la parte aérea de C. tenuiflora. 1 Bartsiósido; 2 Aucubina; 3 Metil éster del ácido geniposídico; 4 Metil éster del ácido mussaenosídico; 5 Metil éster de shanzhisida (Jiménez et al., 1995).
O
βgluc HO
O
βgluc HO
HO
O
HO
COOMe
Oβgluc
O COOMe
Oβgluc HO
O COOMe
Oβgluc HO
HO
1 2 3
4 5
Tabla 1. Iridoides identificados en especies del género Castilleja.
Especie Parte de la planta Iridoides Referencias
C. hispida Hojas, tallo y flor
Aucubina, catalpol, penstemonósido, metil éster de shanzhisida,
8-epiloganina, metil éster del gardósido
Stermitz et al., 1986
C. indivisa Hojas, tallo y flor Mellitósido Stermitz y Pomeroy, 1992
C. integra
Planta completa Hojas
Brácteas y flor
Catalpol, macfadienósido Shanzhisida, metil éster de shanzhisida,
ácido 8-epilogánico, gardósido Ácido adoxosídico, adoxósido
Stermitz y Mead, 1993
C. miniata Hojas y tallo
Aucubina, bartsiósido, catalpol, 6-deoxicatalpol, 8-epiloganina, metil éster del gardósido, mussaenósido,
metil éster de shanzhisida
Stermitz et al., 1985
C. miniata aff. rhexifolia
Hojas y tallo
Flor
Aucubina, catalpol, penstemonósido, metil éster de shanzhisida, 8-epiloganina, metil éster del gardósido
Aucubina, catalpol,
6-deoxicatalpol, 8-epiloganina, mussaenósido, metil éster de shanzhisida
Stermitz et al., 1985
C. occidentales Hojas, tallo y flor
Aucubina, catalpol, penstemonósido, metil éster de shanzhisida, 8-epiloganina, metil éster del gardósido
Stermitz et al., 1986 C. purpurea
var. purpurea Hojas, tallo y flor Shanzhisida metil éster,
6-O-acetilmellitósido Stermitz y Pomeroy, 1992
C. purpurea
var. citrina Hojas, tallo y flor 6-O-acetilmellitósido Stermitz y Pomeroy, 1992
C. sulphurea Hojas, tallo y flor
Aucubina, catalpol, penstemonósido, shanzhisida metil éster, 8-epiloganina, metil éster del gardósido
Stermitz et al., 1986
1 4 3 6 5
7
8 9
6 7 8 1.3 Aspectos generales de los iridoides
Los iridoides (Figura 3) constituyen un grupo de monoterpenos con esqueleto ciclopenta[c]piránico, basados en la estructura del iridano (cis-2-oxabiciclo-[4,3,0]- nonano). También están incluidos los secoiridoides, caracterizados por la ruptura del enlace entre C7 y C8 del anillo ciclopentánico (Bianco, 1994). El término “iridoide” se debe al iridoidal, primer compuesto de este tipo que se identificó y aisló de las hormigas del género Iridomyrmex, que lo sintetizan como defensa frente a otros insectos (Trim y Hill, 1952).
Figura 3. Estructura química de los iridoides y seco-iridoides. 6 Iridano; 7 Secoiridoide; 8 Iridoidal.
1.3.1 Ecología de los iridoides
En las plantas, los iridoides forman parte del mecanismo de defensa frente a diversas condiciones ambientales como el ataque de herbívoros (Bowers y Stamp, 1993) u otros patógenos (Marak et al., 2002a; 2002b). Los heterósidos al ser hidrolizados, tienen la propiedad de desnaturalizar proteínas, mermando el contenido nutricional para el herbívoro.
Los iridoides tienen algún sabor que provoca que el animal rechace la planta en posteriores ocasiones (Jensen et al., 2002). De forma complementaria, los iridoides como las iridolactonas de Nepeta cataria (Lamiaceae) atraen a depredadores de los herbívoros (Bates et al., 1958).
Por otro lado, algunos insectos utilizan los iridoides para protegerse. Determinadas especies
de defensa contra sus depredadores. Incluso, se conoce que existe una relación directa entre la concentración y el tipo de iridoides con la oviposición y desarrollo larvario de especies de la familia Lepidopterae (Nieminen et al., 2003), Nymphalidae (Klockars et al., 1993;
Adler et al., 1995) y Chrysomelidae (Wiilinger y Dobler, 2001).
Los iridoides tienen propiedades alelopáticas. La aucubina, el harpagósido, o el laterósido inhiben la germinación de semillas de Hordeum vulgare e incluso, disminuyen la longitud de las raíces de semillas pregerminadas (Pardo et al., 1998).
Al parecer, algunos factores ambientales afectan la síntesis de iridoides. Por ejemplo estudios in vitro realizados con Plantago lanceolata, temperaturas comprendidas entre 18- 20 °C aumentaron los niveles de iridoides y disminuyeron en situaciones de sombra o elevadas concentraciones de nitrógeno (Kordana et al., 1998; Tamura, 2001; Tamura y Nishibe, 2002), mientras que la radiación UV parece no influir en la producción de iridoides (McCloud y Berenbaum, 1999).
1.3.2 Biosíntesis de los iridoides
Hasta la década de los noventas del siglo XXI, se pensaba que el isopentenil pirofosfato (IPP) se biosintetizaba exclusivamente en el citosol y se metabolizaba allí mismo, o se transportaba a los plastidios. Sin embargo, se observó que los plastidios de trigo son capaces de biosintetizar carotenos a partir de [14C]-acetato, lo que sugirió que en ellos también se llevaba a cabo la biosíntesis del IPP (Heintze et al., 1994). El IPP es la estructura base de todos los compuestos terpénicos, incluyendo los iridoides.
Las plantas poseen dos rutas independientes para la biosíntesis del IPP, en compartimientos celulares diferentes: 1) La ruta del acetato/mevalonato en el citoplasma para la biosíntesis de esteroles, sesquiterpenos y triterpenos; 2) La ruta de la 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato (DXOP) en los plastidios para la biosíntesis de isoprenoides plastídicos, carotenoides, fitol, isoprenos, monoterpenos y diterpenos (Figura 4). La descripción de la ruta metabólica del mevalonato está basada en las investigaciones realizadas sobre la biosíntesis de los
esteroles, principalmente en mamíferos y levaduras (Rohmer, 2003). La ruta de la DXOP se inicia con la condensación entre el piruvato y el gliceraldehído-3-fosfato, productos del metabolismo primario, para dar DXOP, en una reacción dependiente de tiamina y catalizada por la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa. En el siguiente paso, la 1-deoxi-D- xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa reduce DXOP para formar 2-C-metil-D-eritriol-4- fosfato (MEP), el cuál es fosforilado por la 2-C-metil-D-eritriol-4-fosfato citidiltransferasa y de esta manera se obtiene 4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol, para después ser fosforilado por la 4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol cinasa para formar 2- fosfato-4-(citidina 5’-difosfato)-2-C-metil-D-eritriol. Subsecuentemente este compuesto es transformado a 2-C-metil-D-eritriol-2,4-ciclodifosfato por una 2-C-metil-eritriol-2,4- ciclodifosfato sintasa. El 2-C-metil-D-eritriol-2,4-ciclodifosfato es transformado a (E)-4- hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato por la 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil-difosfato sintasa para finalmente ser transformado a IPP por la 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa. El IPP es convertido a su isómero reactivo, el dimetilalil difosfato (DMAPP) por la IPP isomerasa. La condensación de DMAPP con una molécula de IPP es llevada a cabo por la dimetilalil-difosfato:isopentenil-difosfato dimetilaliltrans-transferasa y genera el geranil difosfato (GPP), iniciándose de esta forma la biosíntesis de los monoterpenos (Lichtenthaler et al., 1997, Lichtenthaler, 1999). Una vez sintetizado el GPP, éste es transformado a geraniol por una fosfatasa, aunque se sabe poco de esta reacción química. El geraniol resulta ser el punto de énlace de la ruta DXOP con la ruta de biosíntesis de los iridoides (Figura 4).
La complejidad de los procesos genéticos, catalíticos y de transporte en la biosíntesis de los iridoides, es uno de los retos intelectuales más estimulantes en el área de los metabolitos secundarios. Falta aún elucidar un importante número de pasos metabólicos, para después purificar las correspondientes enzimas e intentar clonar sus genes así como elucidar los diversos aspectos de la regulación de biosíntesis de los iridoides tanto a nivel celular como molecular y determinar su función en las plantas que los producen.
Figura 4. Metabolismo primario, metabolismo secundario, compartamentalización y sitio de biosíntesis de los iriodoides. IPP: isopentenil pirofosfato; DMAPP: dimetilalil difosfato;
GPP: geranil difosfato; HMG-CoA: 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA-sintasa.
En la figura 5 se resumen los tres trabajos relacionados con la elucidación de la ruta de biosíntesis del antirrhinósido en la especie Antirrhinum majus la cuál pertenece a la familia Scrophulariaceae.
Breinholt et al. (1992) marcaron con deuterio el 8-epi-iridodial glucósido, 8-epi-iridotrial glucósido y sus correspondientes aglicanos, y observaron que estos compuestos se incorporaron en el antirrhinósido de A. majus. La mayor incorporación fue del 8-epi- iridotrial sugiriendo que este es un intermediario en la biosíntesis del antirrhinósido.
Posteriormente marcaron con deuterio el ácido 8-epi-deoxilogánico, el ácido deoxigeniposídico y el 6,10-dideoxiaucubina, y resultó que estos compuestos fueron incorporados por A. majus para la biosíntesis del antirrhinósido. Al marcar solamente el 8- epi-deoxilogánico con deuterio se observó que éste compuesto se hidroxiló en la posición 8 para formar el ácido mussaenosídico (Damtoft et al., 1993). Posteriormente Damtoft et al.
(1995) demostraron que en las últimas etapas de la biosíntesis del antirrhinósido de A.
majus está implicada una hidroxilación en la posición 6 de dideoxiaucubina para formar el linárido (10-deoxiaucubina), seguida por una epoxidación para dar el 10-deoxicatalpol (5- deoxiantirrhinósido) y finalmente la hidroxilación en la posición 5 para obtener el antirrhinósido.
Figura 5. Biosíntesis del antirrhinósido. 9 Geraniol; 10 10-Oxocitral; 11 8-epi-iridodial; 12- 13 8-epi-iridotrial; 14 Ácido 8-epi-deoxilogánico; 15 Ácido mussaenosídico; 16 Ácido deoxigeniposídico; 17 6,10-dideoxiaucubina; 18 Linárido; 19 10-deoxicatalpol; 20 Antirrhinósido.
1.3.3 Actividad antitumoral y quimiopreventiva de los iridoides
La aucubina inhibe la enzima citocromo P450 (Bartholomaeus y Ahokas, 1995) lo que induce la apoptosis (muerte celular programada) en células cancerígenas. También induce la degradación e inhibe la fosforilación de algunas moléculas señal, relacionadas con la formación de tumores, lo que provoca que factores de transcripción (NF-kB) no se activen para translocarse al núcleo (Jeong et al., 2002) teniendo como resultado final, la inhibición de la producción de factores de necrosis tumoral (TNF-α) e interleucinas (IL-6) (Jeong et al., 2002). Por otro lado, la aglicona de la aucubina posee actividad antitumoral ya que inhibe la ADN polimerasa y la ARN polimerasa en células de hepatoma humano Hep G2 (Lee et al., 2001).
El genipósido inhibe la tumorigénesis al favorecer la acción de las enzimas como la glutation-S-transferasa (GST) y glutamil-cistein sintetasa, enzimas que detoxifican los carcinógenos (Wang et al., 1991) y también inhibe las enzimas citocromo P450 y monooxigenasas microsomales que inducen la apoptosis (Kang et al., 1997). Además, muestra una actividad antioxidante, al disminuir la peroxidación lipídica. También posee una actividad antimutagénica (Nakamura et al., 1997), al proteger al ADN de la formación de aductos con carcinógenos, como la aflatoxina B1 (Wang et al., 1991). El genipósido inhibe enzimas involucradas en procesos oxidativos y tumorales, cómo la mieloperoxidasa o la ornitin descarboxilasa (Lee et al., 1995). En ensayos in vivo, el genipósido inhibe el crecimiento de tumores y potencia los efectos de la radioterapia, incrementando el nivel de leucocitos y la respuesta blastogénica de las células del bazo. Ello hace posible considerar que el genipósido podría ser un compuesto coadyuvante para estimular la respuesta inmunitaria y reducir algunos de los efectos secundarios de la quimioterapia (Hsu et al., 1997).
El genipósido penta-acetilado, un derivado sintético del genipósido obtenido por acetilación, tiene actividad quimiopreventiva, ya que evita el ataque de carcinógenos (Ueda e Iwashashi, 1991; Tseng et al., 1992; Lin et al., 2000). También tiene actividad antitumoral, ya que inhibe la síntesis de ADN y ARN, lo cual provoca la disminución de la
velocidad de crecimiento de la línea celular de glioma C6 tanto in vitro como in vivo (Wang et al., 1992; 1993). También induce la apoptosis activando señales proapoptóticas como p- 53 y c-myc e inhibiendo el Bcl-2 (Chang et al., 2002).
La genipina, aglicona del genipósido, mostró una mayor actividad quimiopreventiva como inhibidor de la inducción de la formación de antígenos de EBV por TPA que el genipósido.
(Ueda y Iwashashi, 1991). Este compuesto tiene actividad antitumoral, ya que es genotóxico y mutagénico (Ozaki et al., 2002).
El ácido geniposídico muestra una mayor actividad quimiopreventiva (Nakamura et al., 1997) como antimutagénico y menor actividad antitumoral (Hsu et al., 1997) en comparación con el genipósido.
Sobre la actividad biológica en especies del género Castilleja, solo se ha reportado que los extractos de diferentes partes de C. linariaefolia presentaron actividad in vivo contra carcinomas en ratas; en particular, el extracto de las flores. De esta parte de la planta se aislaron los glicósidos: acteósidos e isoacteósidos, los cuales presentaron actividad citotóxica (Pettit et al., 1990). Algunos iridoides de especies de la familia Scrophulariaceae han mostrado actividad antitumoral e inmunoestimulante (Tabla 2).
Tabla 2. Ensayos realizados que prueban la actividad antitumoral, quimiopreventiva e inmunoestimulante de los iridoides de especies de la familia Scrophulariaceae.
Especie Iridoides Actividad ensayada Referencia
Picrorhiza
kurroa Pricoliv
Antitumoral:
-Inhibición de las topoisomerasas I y II.
-Reduce la síntesis de la proteín cinasa C (PKC).
-Inhibe selectivamente a tirosina cinasa (TK).
Rajeshkumar y Kuttan, 2001 Gaddipati et al., 1999
Tabla 2 (Continuación). Ensayos realizados que prueban la actividad antitumoral, quimiopreventiva e inmunoestimulante de los iridoides de especies de la familia Scrophulariaceae.
Especie Iridoides Actividad ensayada Referencia
Picrorhiza
kurroa Pricoliv
Inmunoestimulante:
-Incrementa la respuesta linfocitaria frente a Mycobacteria.
Quimiopreventiva:
-Disminuye la expresión del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) y del Factor Inducible por la Hipoxia-1 (HIF-1).
-Induce la enzima glutation sintetasa (GSH).
-Inhibe la hepatocarcinogénesis inducida por N-nitrosodietilamina en ratas.
-Inhibe la peroxidación lipídica.
-Inhibe el crecimiento de tumores transplantados en ratón.
Sinha et al., 1998
Gaddipati et al., 1999
Rastogi et al., 1995
Jose et al., 1999 Rajeshkumar y Kuttan,
1999; 2000 Chander et al., 1992; 1994 Rajeshkumar y Kuttan, 2000
Penstemon serrulatus
Penstemina Penstemonósido
Serrulatolósido
Penstemonósido
Antitumoral:
-Antriproliferativa en linfocitos de bazo de ratón y hepatoma de hamster mediante la inhibición de síntesis de ADN.
-Citostática para la línea celular de leucemia linfocítica (P-388).
Wysokinska y Skrzypek, 1992
Jolad et al., 1976
1.4 Cultivo de células y tejidos vegetales
1.4.1 Generalidades
Las plantas son fuente de diversas sustancias de interés para el hombre, en las que se incluyen compuestos llamados metabolitos secundarios que son utilizados en la industria como colorantes, saborizantes, fragancias y fármacos, entre otros. De manera general, en las plantas, la acumulación de estos compuestos ocurre sólo en ciertas épocas del año y en
algunos órganos, lo que puede limitar su abastecimiento. Por ello, el cultivo de células y tejidos vegetales (CCTV) ha sido considerado como una alternativa biotecnológica para la producción de metabolitos secundarios (Verpoorte et. al., 2002). Después del desarrollo comercial para la producción de la chiconina con cultivos de células de Lithospermum erytrorhizon, varios son los trabajos sobre el establecimiento de cultivos de células y tejidos vegetales y la identificación de compuestos con potencial para su producción industrial (Zhao et al., 2005).
El CCTV es un conjunto de técnicas que presenta en común el hecho de que un explante (semilla, órgano, tejido o célula viva) se inocula asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones controladas. Lo anterior se basa en el principio de totipotencia celular, el cuál establece que a partir de una célula vegetal, es posible regenerar un individuo fértil con las mismas características del individuo original, manteniendo su información genética para realizar todas las funciones de una planta completa (Kieran et al., 1997). Inicialmente las técnicas de cultivo de células y tejidos vegetales fueron concebidas y empleadas como herramienta de investigación básica, para estudiar la bioquímica y fisiología vegetal. Sin embargo, estas técnicas evolucionaron a tecnologías comerciales para la micropropagación, el mejoramiento genético de especies y la producción de metabolitos secundarios de interés industrial (Rodríguez-Monroy et al., 1999).
El CCTV ofrece varias ventajas sobre la recolección de plantas silvestres y el desarrollo de cultivos en campo, entre las cuales se pueden mencionar: 1) La independencia de las condiciones ambientales; 2) Establecer condiciones para la obtención de productos homogéneos; 3) Establecer un sistema de producción definido, en el lugar donde se requiere del producto; 4) Obtención de productos en menor tiempo (Doran, 1999; Sajc et al., 2000).
Para establecer un cultivo vegetal in vitro, se parte de la selección de la planta de interés y de la colecta de material biológico (ejemplares completos y semillas). La elección del
basada en el objetivo del cultivo. Si lo que se quiere es obtener plántulas asépticas (libres de virus), el explante ideal es el meristemo (dependiendo de la especie de 0.2 – 0.5 mm de longitud) o la germinación de semillas en condiciones asépticas. Para inducir respuesta de callogénesis y/o morfogénesis, las células meristemáticas de los tejidos obtenidas de plántulas en condiciones asépticas, se hacen crecer de forma desdiferenciada (masa amorfa denominada callo) o diferenciada (organogénesis o embriogénesis), mediante la aplicación de reguladores de crecimiento vegetal (CIAT, 1991).
1.4.2 Reguladores de crecimiento vegetal
Los reguladores de crecimiento vegetal (RCV) son sustancias orgánicas que a bajas concentraciones influyen en los procesos fisiológicos de las plantas (Tabla 3) (Frankenberger y Arshadm, 1995).
Tabla 3. Función de los reguladores de crecimiento vegetal en los cultivos de células y tejidos vegetales.
RCV Compuesto Respuesta
Auxinas
Ácido 3-indolacético Ácido 3-indolbutírico Ácido α-naftalenacético Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
Formación de raíces adventicias Inducción de embriones somáticos Formación y crecimiento de callos Inhibición de la elongación de raíces
Citocininas
6-bencilaminopurina Cinetina
Zeatina
Formación de brotes adventicios Inhibición de la elongación de brotes Inhibición de la senesencia de las hojas
Giberelinas Ácido giberélico Estimulación de la elongación de hojas Rompimiento de la dormancia de semillas y brotes
Ácido abscísico Ácido abscísico
Estimulación de la maduración de embriones Promoción de la abscisión de hojas
Inducción de la dormancia de semillas, brotes y bulbos
Los RCV cuando son producidos por las plantas (endógena) se les denominan fitohormonas, las cuales actúan como mensajeros químicos que regulan el crecimiento y
desarrollo de la planta. También regulan las respuestas a las señales ambientales (Morgan, 1990). El término regulador de crecimiento vegetal se refiere a un compuesto sintético o natural que se aplica (exógena) para alterar el crecimiento y desarrollo de las plantas o cultivos de células y tejidos vegetales. El término fitohormona y regulador de crecimiento vegetal se utiliza alternativamente, particularmente cuando se refiere a auxinas, citocininas, giberelinas y ácido abscísico (Frankenberger y Arshadm, 1995).
1.4.3 Cultivos de células desdiferenciados y diferenciados
Los cultivos de células desdiferenciados (callos y cultivos en suspensión) y los cultivos diferenciados (cultivos de brotes y raíces), son utilizados con el objetivo de implementar sistemas biológicos vegetales como un sistema alternativo a otros sistemas biológicos (bacterias, levaduras o células animales) para la producción de moléculas de interés industrial. La elucidación de las rutas biosintéticas de varios metabolitos secundarios y la tecnología del ADN recombinante abren posibilidades para desarrollar sistemas biológicos vegetales masivos de producción de metabolitos secundarios bioactivos (Bourgaud et al., 2001; Verpoorte et. al., 2002).
Las suspensiones celulares están constituidas por células meristemáticas, las cuales son inducidas a crecer de forma desdiferenciada en un medio de cultivo líquido en agitación constante, lo que permite su disgregación, su proliferación y su continúo crecimiento. Los cultivos en suspensión permiten estudiar los mecanismos bioquímicos que regulan la permeabilización y la biosíntesis del metabolito secundario de interés; esto con la finalidad de redireccionar el metabolismo secundario, mediante agentes permeabilizantes y el incremento de la producción del metabolito de interés, mediante la modificación genética y los inductores bióticos y abióticos (Bourgaud et al., 2001). Para seleccionar una suspensión celular se necesitan caracterizar las cinéticas de crecimiento y la producción de metabolitos secundarios de las diferentes líneas celulares. Idealmente se prefieren líneas celulares con productividades altas del metabolito secundario de interés y que además sea un producto extracelular y que esté asociado a su crecimiento.
En muchas ocasiones, los cultivos en suspensión no producen los compuestos de interés, debido principalmente a que los metabolitos secundarios son producidos por células especializadas y/o en distintas etapas del desarrollo de la planta (Balandrin et al., 1985). En estos casos, el cultivo de órganos es una alternativa (Subroto et al., 1996; Mahagamasekera y Doran, 1998).
El cultivo de raíces representa un sistema biológico para la producción de metabolitos secundarios, debido a que: a) Su crecimiento puede ser tan rápido o incluso llega a ser más rápido que los cultivos en suspensión (Charlwood y Charlwood, 1991; Flores et al., 1999), b) El medio de cultivo no requiere RCV, c) Su capacidad biosintética para producir metabolitos secundarios es similar a la planta madre aún cuando se acumulan en la parte aérea, d) La producción de metabolitos secundarios está asociada a su crecimiento y presentan estabilidad genética (Banerjee et al., 1998; Kittipongpatana et al., 1998; Kim et al., 2002).
El cultivo de brotes es otra alternativa para la producción de metabolitos secundarios y al igual que el cultivo de raíces, la producción de metabolitos secundarios está asociado a su crecimiento y presentan estabilidad genética (Bourgaud et al., 2001).
Para obtener un cultivo de raíces y brotes, se inicia con la optimización el medio de cultivo que permita la organogénesis vía indirecta o indirecta, la proliferación de biomasa y la producción de metabolitos secundarios. Las raíces y los brotes se transfieren a medios líquidos en agitación constante para continuar su crecimiento. Para seleccionar líneas de raíces ó brotes, se caracterizan sus cinéticas de crecimiento y producción de metabolitos secundarios. Al igual que en los cultivos en suspensión idealmente se prefieren líneas de raíces o brotes con productividades altas del metabolito de interés y que además sea un producto un producto extracelular y esté asociado a su crecimiento (Bourgaud et al., 2001).
No existen reportes de cultivos in vitro de C. tenuiflora, sin embargo la información presentada en la tabla 4, indica que sea factible su implementación.
Tabla 4. Cultivos in vitro de especies de la familia Scrophulariaceae.
Especie Explante Medio RCV
(µM) Resultados Referencia
Antirrhinum majus Entrenudos con tallo Poirier-Hamon et al. (1974) 2,4-D (2.2 – 9.0) Embriogénesis Poirier-Hamon et al., 1974
A. majus Brotes Murashige & Skoog (1962) BAP (4.4) Brotes Atkinson et al., 1989
A. majus Brotes Murashige & Skoog (1962) BAP (4.4) Callo Atkinson et al., 1989
Scrophularia yoshimure Entrenudos con tallo Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001
S. yoshimure Tallo con nudos Murashige & Skoog (1962) BA (4.4 4) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001
S. yoshimure Brotes Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001
S. yoshimure Hoja Murashige & Skoog (1962) BA (4.44) + ANA (1.07) Brotes Hsin-Sheng et al., 2001
2. JUSTIFICACIÓN
Castilleja tenuiflora es una planta mexicana usada tradicionalmente para tratar el cáncer debido a las recomendaciones de la herbolaria, por lo que comúnmente se conoce como
“hierba del cáncer”. Es una especie demandada en el mercado y para su comercialización se recolecta de manera no sostenible. En los extractos butanólicos de la parte aérea de esta especie, se identificaron los iridoides glicosilados: bartsiósido, aucubina, metil éster del ácido geniposídico, metil éster del ácido mussaenosídico y metil éster de shanzhisida.
Estudios demuestran que algunos de estos iridoides tienen actividad antitumoral, quimiopreventiva e inmunoestimulante. En el interés de contar con sistemas biotecnológicos para la eventual producción de los compuestos bio-activos, es necesario establecer el cultivo in vitro de C. tenuiflora y analizar su composición de iridoides.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Establecer el cultivo in vitro de C. tenuiflora y comparar su perfil de iridoides con la planta silvestre.
3.2 Objetivos específicos
Obtener material vegetal de C. tenuiflora.
Inducir callogénesis y organogénesis mediante la manipulación de los reguladores de crecimiento vegetal.
Obtener y comparar el perfil de iridoides de la planta silvestre con cultivos in vitro de raíces, brotes y plántulas.
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Obtención de material silvestre de C. tenuiflora
Para obtener material silvestre de C. tenuiflora se utilizaron dos estrategias. La primera consistió en revisar 175 ejemplares de C. tenuiflora depositados en el herbario MEXU- UNAM en México con fecha de colecta entre 1990-2006. Los datos que se obtuvieron fueron los siguientes:
a) Número de ejemplares colectados por estado.
b) Número de ejemplares colectados y fecha de colecta.
La segunda estrategia consistó en entrevistarse con colectores y vendedores de plantas medicinales de los mercados de Sonora (D. F.), Ozumba (Edo. México) y Yautepec (Morelos).
Se ubicó una población de C. tenuiflora en el km 37 Carr. Xochimilco-Oaxtepec, Juchitepec, Edo. de México, el cuál fue el sitio de colecta. Entre Julio-Noviembre del 2006, se colectaron 25 frutos con semillas y 15 plantas silvestres de 50 cm de altura; los frutos y semillas se almacenaron en bolsas de papel a 25 °C. Las plantas se extrajeron de su hábitat con un cepellón de 30 cm de ancho y 50 cm de profundidad, con la finalidad de no dañar la raíz. Las plantas se traspasaron a bolsas de polietileno negro calibre 400 con suelo del hábitat del que fueron extraídas. Una vez transplantadas en las bolsas de polietileno, se humedeció la tierra con agua y la parte aérea se envolvió con papel periódico. De algunos de los ejemplares colectados, la parte aérea se separó de la raíz y ambas partes se envolvieron en papel periódico. Para evitar el marchitamiento de las plantas se transportaron a las 4:30 a.m. del sitio de colecta al CEPROBI e inmediatamente se colocaron bajo fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) a 25±2 ºC.
4.2 Germinación de semillas
Se probaron 3 formas de germinación de las semillas de C. tenuiflora; para cada prueba, se determinó el número de semillas germinadas cada 24 h durante 30 días.
4.2.1 Prueba in vitro
Las semillas se lavaron con detergente durante 5 min y se enjuagaron en 3 ocasiones con agua desionizada estéril. Después de sumergieron en NaOCl 0.5% durante 5 min y posteriormente en etanol 70% durante 1 min y se enjuagaron 3 veces con agua desionizada estéril. Las semillas se sembraron en cajas Magenta con 30 mL de medio de cultivo Murashige y Skoog (MS, Murashige y Skoog, 1962) (Sigma, M5519) complementado con 3% de sacarosa y 0.2% de fitagel. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. En cada caja se sembraron 10 semillas; se sembraron 250 semillas en total. Las semillas se incubaron bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) a 25±2 ºC.
4.2.2 Prueba en papel filtro
Se esterilizaron 6 cajas Drigalski con papel filtro Whatman (No. 2 de 12.5 cm de diámetro y cuadriculado 1 cm x 1 cm). Los frutos de C. tenuiflora secos (cápsulas) se colocaron en bolsas de organza previamente esterilizadas y se sumergieron en etanol al 70% por diferente tiempo de inmersión (0, 30 y 60 s) por duplicado. Posteriormente, las cápsulas se enjuagaron en agua desionizada estéril durante 30 s. Las cápsulas desinfestadas se abrieron con pinzas esterilizadas y se esparcieron las semillas (aproximadamente 100) en las cajas Drigalski con papel filtro. Las semillas se incubaron bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150- 200 µmol/m2s) a 25±2 ºC.
4.2.3 Prueba en sustrato
Se utilizaron 2 charolas germinadoras con 200 cavidades cada una. Las cavidades se
separaron según su color (amarillo y café). En cada cavidad se colocaron 5 semillas. Una charola germinadora correspondió a semillas amarillas y la otra a semillas cafés. Las charolas se taparon con un domo de plástico transparente y se colocaron en una cámara de cultivo bajo un fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) a 25±2 ºC. Diariamente se rociaron las charolas con agua desionizada para mantener húmedo el sustrato, evitando maltratar las plántulas.
4.3 Desinfestación de hojas de plantas silvestres
Antes de inocular en un medio cultivo, las hojas sin separar de los internodos se lavaron con detergente comercial “Roma” durante 5 min y en 3 ocasiones con agua desionizada.
Después se sumergieron en una mezcla de NaOCl 1% y Tween 80 al 0.01% durante 5 min y se lavaron 3 veces con agua desionizada estéril. Las hojas de aproximadamente 0.8 cm de largo fueron sumergidas en etanol 70% y benomilo 1 g/L durante 30 s, respectivamente.
4.4 Inducción de cultivos in vitro
Para inducir callogénesis y organogénesis se utilizaron las auxinas: ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y ácido α-naftalenacético (ANA) y las citocininas: cinetina (KIN) y 6-bencilaminopurina (BAP), en una concentración de 10 µM; la combinación de los reguladores de crecimiento vegetal se hizo con un diseño experimental, en el que se incluyeron experimentos sin regulador de crecimiento vegetal o con sólo uno de ellos (Tabla 5). El pH de los medios se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. En cada frasco de un volumen nominal de 60 mL (Gerber), se agregó 30 mL de medio de cultivo y en cada uno de ellos se colocaron 5 explantes de hoja (aproximadamente 0.4 × 0.8 cm). Se sembraron 5 frascos por cada combinación (n = 25 explantes).
Tabla 5. Combinación de auxinas y citocininas usadas para inducir callogénesis y organogénesis.
a Cada número representa un experimento que consiste en 5 frascos Gerber con 30 mL de medio de cultivo y 5 explantes de hoja; n = 25 explantes.
Se hicieron observaciones cada 24 h y se registró el número de explantes que formaron callo, raíz, brote y número de explantes sin respuesta. El porcentaje de inducción se determinó con la siguiente ecuación:
100 explantes x
de total Número
/brote callo/raíz formaron
que explantes de
Número Inducción
% = (1)
4.5 Establecimiento y mantenimiento del cultivo in vitro de raíces
Las raíces formadas a partir de los experimentos descritos en la sección 4.4, se transfirieron a frascos de boca ancha de 6 cm de diámetro y con volumen nominal de 200 mL, cubiertos con tapa de rosca de plástico, a los cuales se le adicionaron 30 mL de medio MS líquido sin reguladores de crecimiento vegetal y 3% de sacarosa. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. Las raíces se cultivaron en agitación orbital de 100 r.p.m., iluminación
µmol/m
cultivo fresco, transfiriendo aproximadamente ¼ de la biomasa total de cada frasco en medio de cultivo fresco.
4.6 Cultivo de brotes y plántulas
Los brotes formados a partir de los experimentos descritos en la sección 4.5, se transfirieron a frascos de boca ancha de 6 cm de diámetro y con volumen nominal de 200 mL, cubiertos con tapa de rosca de plástico, a los cuales se les adicionaron 30 mL de medio MS líquido sin reguladores de crecimiento vegetal y 3% de sacarosa. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. Los brotes fueron cultivados en agitación orbital de 100 r.p.m., iluminación continua (150-200 µmol/m2s) y a 25±2 ºC. Se subcultivaron cada 20 días en medio de cultivo fresco.
Los brotes se segmentaron y cada segmento de aproximadamente 1.5 cm, se inoculó en medio MS, con 3% de sacarosa, 0.2% de fitagel y sin reguladores de crecimiento vegetal.
El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. Se cultivaron bajo fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) y 25±2 ºC.
Las plántulas formadas a partir de los brotes, se resembraron cada 20 días en medio MS, con 3% de sacarosa, 0.2% de fitagel y sin RCV. El pH del medio se ajustó a 5.8 antes de esterilizar. Las plántulas estuvieron bajo fotoperiodo de 16 h luz (150-200 µmol/m2s) y a 25±2 ºC.
4.7 Cinética de crecimiento, pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces
4.7.1 Condiciones experimentales
El comportamiento del crecimiento (base húmeda y seca), pH y consumo de azúcares del cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora fue evaluado para un cultivo de 6 meses de haberse iniciado. Se inoculó 1 g de raíces (base húmeda) en frascos de un volumen nominal de 60 mL (Gerber) con 10 mL de medio de cultivo MS líquido con 3% de sacarosa y sin
RCV. La edad del inóculo fue de 15 días. Las raíces se cultivaron bajo las condiciones descritas previamente (ver sección 4.5). Se analizaron cinco frascos cada 3-4 días, durante 31 días.
4.7.2 Determinación gravimétrica del crecimiento
La concentración de raíces en base húmeda (g/L), se determinó colectando la totalidad de las raíces de cada frasco sobre un papel filtro Whatman (No. 1) de peso conocido; por diferencia de peso se obtuvo la biomasa húmeda. Para determinar la biomasa seca (g/L), las raíces colectadas sobre el papel filtro de peso conocido, se colocaron en una estufa al vacío a una temperatura de 70 ºC, hasta alcanzar peso constante y por diferencia de pesos se obtuvo la biomasa seca. Los resultados se reportaron en g/L.
4.7.3 Determinación del pH
Se midió el pH del medio de cultivo con un potenciómetro (JENCO, 1671).
4.7.4 Determinación de azúcares totales
El contenido de azúcares totales se midió en el medio con el método de fenol sulfúrico propuesto por Dubois et al. (1956), que a continuación se describe. A partir de las muestras de 1 mL de medio de cultivo filtrado, se realizaron diluciones 1:100. Se tomó 100 µL de la dilución 1:100 de cada muestra y se colocaron en tubos de ensaye de 20 mL, se añadió 1 mL de fenol al 5% a cada tubo y después se agregaron 5 mL de H2SO4 concentrado.
Posteriormente se agitaron los tubos con un vortex. El control consistió en una muestra de 100 µL de agua destilada. Se leyó la absorbancia de las muestras a λ=490 nm en un espectrofotómetro (Shimadzu UV-160). Se ajustó a cero con la mezcla de reacción que contenía 100 µL de agua destilada. La curva patrón se realizó con sacarosa en un intervalo de 0-200 µg/L. El contenido de azúcares totales de las muestras se calculó con la ecuación 2 y se reportó en g/L.
[
Azúcares totales]
0.016187 00 . 0 nm 490
Abs = + (2)
4.7.5 Cálculo de parámetros cinéticos
El índice de crecimiento (Ic) se calculó según la ecuación 3.
Xo Xo -
Ic= X (3)
Donde:
Xo: Biomasa inicial
X: Biomasa en un tiempo determinado
La velocidad de crecimiento (Vc), se calculó a partir de la pendiente de la línea recta obtenida por una gráfica biomasa vs tiempo.
y = b + m⋅x
X = Xo + Vc ⋅ t (4)
El tiempo de duplicación (td) es un valor cinético, que indica el tiempo en que el cultivo tarda en duplicar la biomasa correspondiente al inóculo. Se entiende inóculo a la cantidad de biomasa con la que se inicia el cultivo es decir 2Xo.
La ecuación 5 describe el crecimiento de raíces linealmente y con base en la definición de tiempo de duplicación, obtuvimos su valor de la siguiente manera:
2Xo = Xo + Vc ⋅ td
2Xo – Xo = Vc ⋅ td
Vc
td= Xo (5)
El rendimiento de biomasa con base a sustrato (Yx/s), se calculó de acuerdo a la ecuación 6.
So-S Xo -
Yx/s= X (6)
Donde:
So: Concentración de fuente de carbono inicial
S: Concentración de fuente de carbono en un tiempo determinado
4.8 Aislamiento de los iridoides
4.8.1 Preparación de extractos de parte aérea y raíz
El material vegetal (parte aérea y raíz) de C. tenuiflora fué secado bajo condiciones de oscuridad a temperatura ambiente. El material vegetal seco fue molido por separado y almacenado en bolsas de papel a temperatura ambiente hasta su uso. Se realizó una extracción exhaustiva de ambas partes de la planta. Se maceraron 1800 g de parte aérea en n-hexano, acetato de etilo y metanol durante 24 h para cada disolvente. Mientras que para obtener el extracto de la raíz, se partió de 669.1 g que se maceró únicamente en metanol durante 24 h. En todos los casos, los extractos se concentraron con un evaporador rotatorio (Büchi®, R-114) a presión reducida, a una temperatura de 50-60 °C y los residuos obtenidos se almacenaron en frascos color ámbar a 8±2 ºC.
4.8.2 Fraccionamiento de los extractos
El fraccionamiento de los extractos se llevó a cabo en una columna de vidrio de 40 cm de altura y 4 cm de diámetro empacada con 180 g de sílica (0.063-0.200 mm) y utilizando mezclas de n-hexano, acetato de etilo y metanol como eluyentes. Por cada 30 g de sílica se colocó 1 g de extracto. Se utilizaron 6 g del extracto de acetato de etilo de la parte aérea. La mezcla de los disolventes se realizó bajo un gradiente de polaridad (ascendente; menor
se concentraron con un evaporador rotatorio (Büchi®, R-114) a presión reducida, a una temperatura de 50-60 °C y se almacenaron en frascos color ámbar a 8±2 ºC hasta su análisis.
Posteriormente, las fracciones se analizaron por cromatografía en capa fina y considerando la similitud en los perfiles químicos, se agruparon.
Tabla 6. Mezcla de disolventes por gradiente de polaridad ascendente.
4.8.3 Preparación de los extractos de los cultivos in vitro
Las muestras de biomasa de raíces de la cinética, brotes (20 días) y plántulas (20 días) in vitro fueron congeladas a -18±2 ºC y posteriormente se liofilizaron (Heto drywinner®, modelo DW3). Se almacenaron en viales de plástico a -18±2 ºC, hasta su análisis por HPLC. Los liofilizados (6 g) fueron macerados en metanol, en una relación 2:1 (p/v) durante 24 horas. Los extractos se concentraron y almacenaron de acuerdo a lo descrito previamente (ver sección 4.8.1). En el caso del cultivo in vitro de raíces, también se analizó el sobrenadante filtrado previamente y congelado a -18±2 ºC.
4.8.4 Cromatografía en capa fina
Se utilizaron placas de sílica gel (cromatofolios Merck® de aluminio y sílica gel 60 F254 1.05554.0001), usando como disolvente mezclas de n-hexano:acetato de etilo (85:15) y cloroformo:metanol (95:5; 90:10; 85:15). El revelado se realizó con el reactivo para iridoides que consistió en una mezcla de ácido clorhídrico:ácido acético (80:20) (Wagner y Bladt, 1996). Después de haber aplicado el revelador, las placas se colocaron en una
