El virus de la fiebre aftosa

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(1)BAC. El documento fuente se encuentra en La Biblioteca Agropecuaria de Colombia. M O D U L O D I G I TA L. ELEMENTOS BIBLIOGRAFICOS AUTOR (ES): Lobo Arias, C.A. TITULO: El virus de la fiebre aftosa FUENTE: Instituto Colombiano Agropecuario, Bogotá (Colombia). La fiebre aftosa y otras enfermedades vesiculares en Colombia. Bogotá (Colombia), 1975. Boletín Técnico - Instituto Colombiano Agropecuario (Colombia), no. 32, p. 23-35..

(2) César Augusto Lobo A.". 3.1. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES FISICO-QUIMICAS.. F1 virus de la Fiebre Aftosa ( F . A . ) , pertenece a la categoría dc los Kibovirus (virus que contienen Acido Ribonucleico o ,4RN), grupo Picornavirus, subgrupo de los Rhinovirus (4 1 ). El conocimiento de la estructura del virus de la F.A., ha sido Útil para predecir su reacción en un determinado ambiente o huésped. Pequehas cantidades de virus purificado, fueron suficientes para su icklbtificaciÓn por inicroscopía electrónica ( 5 ). Sin embargo. para la determinación de sus propiedades físico-químicas e inmunológicas, se necesitaron cantidades mucho mayores, lo cual se logró con el empleo de ciertos métodos de concentración y purificación, mediante el uso de sustancias tales como el a l c o h o l m e t í l i c o , polyethylenglycol, sulfato de amonio, etc., con centrifugación en gradiente de densidad de Cloruro de Cesio (3,541. Los parámetros fijados a través de los estudios físico-químicos del virus purificado, indican que el virus completo (virión), tiene un diámetro de 23 Nanómetros (nin) --antiguamente milimicras- (7), y un peso inolecular aproximado de 6.9 millones de daltons, del cual, el 69 por ciento es proteína y el 31 por ciento ARN ( 5 ) . El virus completo esta formado por una masa central d e ARN rodeada por una cubierta protéica periférica compuesta por 3 2 capsómeros esféricos que le dan la estructura cúbica icosaédrica (34) (Figura 7). El ARN puede liberarse del virus por calentamiento a 5 6 grados centígrados o bajo la acción de u n pH vecino a 6.0. Otro método Médico Veterinario M.C. Programa Nacional de Enfermedades Vesiculares. Laboratorio de Investigaciones Médicas Veterinarias, L I M V , ICA, Ciudad Universitaria, Apartado Aéreo 29743 Bogotá, D.E..

(3) F I G U R A 7. Representación esquemática del virus de la Fiebre Aftosa.. satisfactorio consiste en liberar el ARN con el uso de dodecil sulfato de sodio, a un pH 5.0 ( 1 1. Asso (2) sugiere que existe una relación inversa entre la potencia del capside de los virus vivos modificados y su habilidad de replicarse en el huésped. Probablemente la estructura relativamente flexible del virus de la Fiebre Aftosa, sería responsable de la lenta desorganización del núcleo de ARN in situ que ocurre cuando se calienta virus entre 25 y 37 grados centígrados, lo que se traduce en pérdidas de infecciosidad de la partícula vira1 (6).. 3.2. ACCION DE AGENTES FISICOS. La desecación, la temperatura, las radiaciones y el pH, son factores considerados importantes en la conservación o destrucción del virus de la Fiebre Aftosa.. 3.2.1. Acción de la Desecación. V a r i o s autores, han observado que el virus puede conservar su infecciosidad por meses o años en productos orgánicos desecados. Si la desecación se lleva a cabo a temperatura ambiente y en las condiciones relativas de humedad de los establos, el virus puede sobrevivir hasta por cinco meses ( 19). 24.

(4) 3.2.2. Acción de la Temperatura. El c a l o r es de fundamental importancia para la desinfección y conservación del virus, con aplicación práctica en la elaboración de vacunas inactivadas. A 37 grados centígrados, el virus puede resistir 4 a 5 días. En la linfa de vesículas es destruido por el calentamiento a 55 grados centígrados durante 15 a 40 minutos ó en 10 minutos de 60 a 70 grados centígrados. La destrucción es instantánea a 1 O0 grados centígrados. La temperatura de nevera (3 a 7 grados centígrados), favorece la conservación del virus en linfa, plasma o suero desecado, hasta por i 8 meses (19). En el laboratorio, la congelación entre 40 y 70 grados centígrados bajo cero, se muestra ideal para la conservación de cepas y tejidos virulentos destinados a la producción de vacunas. De esta manera, los títulos infectantes se mantienen por largos períodos de tiempo, mientras que a temperaturas más altas, entre 15 y 40 grados centígrados bajo cero, los virus pierden un alto porcentaje de su infecciosidad. La Iiofilización, que reúne las características de congelación y desecación ofrece resultados altamente prometedores (34). En todos los casos, la temperatura de cuatro grados centígrados asegura una buena Conservación del virus liofilizado, al menos durante un año. A pesar de que el virus de la Fiebre Aftosa, se puede conservar durante largos períodos de tiempo a cuatro grados centígrados, se degrada lentamente a la temperatura del laboratorio. A temperaturas entre 56 y 70 grados centígrados, las partículas virales sufren una destrucción incompleta en minutos u horas. Se estima que el calentamiento a 85 grados centígrados durante seis horas; destruye completamente la infecciosidad del virus (2 1). El proceso de degradación difiere según el grado térmico obtenido,así:. 1 . A temperaturas inferiores a 43 grados centígrados, el virus pierde su infecciosidad pero conserva su inmunogenicidad ( 1 1 ). La inactivación se ejerce sobre el ARN como soporte del material genético.. 2. A temperaturas más elevadas, la inactivación se ejerce sobre la cubierta proteica. A 56 grados centígrados, el virus completo se degrada dejando en libertad ARN con pérdida de poder inmunógeno. Sin embargo, las partículas degradadas conservan ciertas propiedades serológicas (6).. 3.2.3. Acción de las Radiaciones La radiación ultravioleta provoca la inactivación del virus, dependiendo de la longitud de onda y de la dosis empleada (1 1). La acción se opera sobre el ARN, conservándose inalteradas las propiedades serológicas detectables por fijación de complemento y por seroprecipitación. Este tipo de inactivación se utiliza ampliamente en la desinfección de laboratorios cuando se trabaja en estrictas condiciones de aislamiento..

(5) 3.2.4. Acción del pH y de sus Variaciones. El virus de la Fiebre Aftosa, es estable dentro de una zona de pH comprendida entre 7.0 y 7.7. En la zona ácida, el virus se inactiva rápidamente perdiendo su infecciosidad en minutos, mientras que en la zona alcalina, este proceso se opera lentamente. El virus es destruido por la solución de soda cáustica al 2 por ciento en menos de un minuto. En diluciones al 1 :20.000, la destrucción es completa en tres horas (57). Idénticos resultados se obtienen con el carbonato de sodio al cuatro por ciento, y que se debe a la alta coricentración de iones de hidrógeno. El medio más práctico, usado mundialmente para el envío y conservación de muestras de material epitelial es la glicerina bufferada al 50 por ciento con pH 7 . 6 . Las muestras así guardadas se pueden conservar infecciosas hasta por 17 años ( 1 3 ) . La extrema sensibilidad del virus a la acidez, explica su desaparición en carnes de animales infectados, debido a la formación de ácido láctico, mientras que la conservación del virus se ve favorecida por la estabilidad del pH a nivel de ganglios linfáticos y medula ósea ( 19). 3 . 3 . ACCION DE AGENTES QUIMICOS. Los agentes químicos actúan frente al virus d e la Fiebre Aftosa, así:. 3.3.1. Acción de Solventes Orgánicos. El virus es resistente a la acción del cloroformo o del éter, debido a la ausencia d e lípidos en sus constituyentes (34). La acetona, el metano1 y el etanol, a concentraciones elevadas, pueden precipitar el virus por acción sobre las proteínas. El fluorocarbono o forane 113, precipita las partículas virales menoresde 7 nanómetros(nm.), y las proteínas extravirales, sin ejercer ninguna acción sobre el virus completo (44). Después de este tratamiento, disminuye el poder fijador del complemento, correspondiendo la actividad fijadora al virus completo, que se crée es el responsable de la antigenicidad de la suspensión vira1 (9,3 1 ).. 3.3.2. Acción de Detergentes. El virus n o es afectado por la acción de los detergentes aniónicos (dodecil sulfato d e sodio), catibnicos (bromuro de cetyltrymethylamonium), o n o iónicos (tween 80) (15,25). El dodecil sulfato de sodio, se utiliza en la extracción del virus de células infectadas. La saponina, inmunoestimulante utilizada en las vacunas inactivadas, n o afecta las propiedades inmunogénicas del virus de la Fiebre Aftosa. Los jabones detergentes en polvo existentes actualmente en el comercio, coadyuvan en la inactivación del virus..

(6) 3.3.3. Acción de Agentes Virulicidas. C i e r t o s productos químicos han sido ampliamente usados en la preparación de las vacunas inactivadas. Entre ellos el formol ha ocupado un puesto predominante como agente inactivante. Su actividad depende de varios factores tales como concentración, temperatura, preparución vira! y pH. A una temperatura de 4 grados centígrados, la inactivación es lenta, escogiéndose en la elaboración de vacunas, temperaturas entre los 26 y 37 grados centígrados, a un pH vecino a 8.0. El formol ejerce su acción inactivante sobre el ARN sin modificar la cápside proteica. Sin embargo, a ciertas conccntraciones, produce una acción desintegrante sobre la proteína viral. E 1 acetyl-ethylene-imine (AEI) usado a una concentración del 0.05 por ciento, pH 7.6 y temperatura de 37 grados centígrados, inactiva el virus aftoso en varias horas. Esta acción se ejerce sobre el ARN ( 1 1 ) trayendo como resultado una inactivación linear de primer orden, contrariamente a lo que sucede con el formol, que se desvía de este tipo de linearidad dejando una cierta infecciosidad residual (29). Otros agentes inactivantes usados en forma menos extensa incluyen: la betapropiolactona (34), el glycidaldehyde (38), y el óxido de Ethylene (52). 3.4. ESTRUCTURA ANTIGENICA, TIPOS Y VARIANTES. Hasta el presente han sido reconocidos siete tipos inmunológicamente distintos: O, A, C, SATl, SAT2, SAT3 y ASIA 1. El grado d e diferencia entre los diversos tipos es tal, que se han citado casos d e animales afectados con tres tipos distintos dentro de un período de seis meses. En cada caso, la recuperación resulta con un alto grado de resistencia frente a la reinfeccibn con virus homólogos, la que frecuentemente persiste por varios años (20,50). Dentro de los tipos, se han identificado numerosos subtipos q u e presentan un grado variable de reactividad cruzada. Es un hecho reconocido que la evolución de las variantes dentro de cada tipo, es un proceso dinámico que resulta en la creación de una amplia gama de subtipos, algunos de los cuales pueden presentar diferencias tan grandes, al igual que si se tratara de dos tipos diferentes (24,33). La determinación de tipo y subtipo de virus es una condición rápida y segura para la confirmación del diagnóstico de campo y una labor indispensable en la correcta evaluación de la situación epizootiológica y la incorporación de nuevas cepas de campo en la elaboración de la vacuna a n t i - a f t o s a . C o n estas finalidades, la mayoría de los laboratorios especializados en Fiebre Aftosa utilizan hoy d í a la prueba de Fijación del Complemento. En caso de resultado negativo, la muestra es inoculada en un sistema sensible, ratones lactantes y cultivos celulares, con el objeto de recuperar el virus y proceder a su identificación. En u n o u otro caso, se establece el diagnóstico diferencia! entre Fiebre Aftosa y Estomatitis 17.

(7) Vesicular, seguido por la tipificación, determinación d e subtipo y estudio de las características del virus (35). 3.5. CULTIVO DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA EN TEJIDOS. El descubrimiento d e la reproducción del virus de la Fiebre Aftosa en cultivos celulares, marcó una época d e gran progreso en el estudio d e sus características y en la elaboración de los diferentes tipos de vacunas. En la primera mitad del siglo, numerosos investigadores aportaron sus experiencias ensayando técnicas de cultivo con los más variados sistemas. F u ~ así como Frenkel y Van Waveren (26), en 1937, obtuvieron buenos resultados con cultivos d e piel d e fetos de bovinos, ovinos y porcinos. Este método, además de ser poco práctico, n o producía antígeno de buena calidad. Frenkel (27), en 1947 introdujo una técnica de cultivo en trozos de epitelio lingual bovino, la cual continúa en uso en la mayoría de los laboratorios productores d e vacuna anti-aftosa. Nuevas técnicas de cultivo, separando células de los tejidos y haciéndolas cre’cer en monocapa (22), fueron confirmadas y ampliadas con la demostración del crecimiento del virus de la Fiebre Aftosa en células renales de diferentes especies animales (23,37,49), células de membrana amniótica de bovinos (43), células embrionarias de pulmón y de corazón de bovino (40), células de epitelio lingual bovino (43) y células testiculares de carnero (32). Scllers (49) y Rachrach et al. (4), en 1955 demostraron que el virus de la Fiebre Aftosa, producía un efecto citopático en cultivos de células renales de cerdo, y usaron este sistema en titulación de infectividad, basadas en formación de placas (49) y en diluciones límites (4). Ubertini et al. (55) fueron los primeros en utilizar cultivos primarios de c6liilas renales de ternero, para la producción industrial de vacunas, proceso que ha sido mejorado con la introducción de una línea estable de células BHK (42), cultivadas en monocapas (45) o en suspensión (56). Los substratos más corrientemente usados en la actualidad para la reproducción y estudio del virus de la Fiebre Aftosa, son los cultivos de riñón de ternero, riñón de cerdo y células BHK, cuya sensibilidad varía de acuerdo con las diferentes cepas del virus aftoso (6). 3.6. MULTIPLICACION DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA. La multiplicación del virus aftoso, comprende las siguientes etapas: 1. 2. 3. 4. 5.. Adsorción a la membrana celular. Penetración al interior de la célula. Ubicación en determinadas zonas del protoplasma. Suspensión del metabolismo celular. Liberación del virus de la célula infectada..

(8) Se ha demostrado que el virus se adsorbe a la superficie de la célula, debido a una atracción específica entre las proteínas de la cápsidc y ciertos receptores celulares. La presencia o ausencia de estos receptores específicos, determina la susceptibilidad o resistencia a los virus intactos. En infecciones experimentales con alta multiplicidad por cklula, la mayoría de los viriones adsorbidos a los receptores celulares son ciuídos de nuevo o no alcanzan a penetrar al interior de la cClula. El mecanismo de penetraciOn del virus a la cc‘liila no se ha aclarado completamente, aunque parece que se lleva a cabo por fagocitosis activa. El sitio exacto en que el virus pierde su cubierta protcica y libera e l AKN, pcrnianece incierto. Lo que si se sabe con certeza, es q u e c.1 A R;; d e los I’icornavirus, actíia como niensajcro induciendo la foriiiación dc proteínas en las células infectadas, entre las cuales hay ciertas enzimas rcqiic~ridaspara la síntesis d e las proteínas estructiirales de la cápside y tina poIiriii~ras:i vira1 específica. La mayoría de los nuevos coniponentcs viralcs ( A K N y protcínas). se foriiian en el citoplasma. Después de l a infección celular. s4 produce una rápida suspensión en la síntcsis de protctínas y ácidos nuclCicu?; de la célula, sobreviviendo posteriorniente la lisis celular. con libcracióii de grandes cantidades de partículas vir;ilt’s ( 4 7).. 3 . 7 . ANTIGENOS Y ANTICUEKI’OS. Varios antígenos han sido identificados en el virus de la Fiebre Aftoya. Originalmente se serialaron dos antígenos con diferentes coeficientes de sedimentación (Coeficiente S): una partícula mayor, el virus completo, con un coeficiente de 140 S y un diámetro de 23 nanómetros ( n m ) (3.46): y una partícula menor derivada de la degradación del virus, con un coeficiente de 12 S ( 1 6, 5 3 ) , y un diámetro de 7 a 8 nanómetros (nm). Dos nuevos antígenos han sido reconocidos recientemente: cápsides vacías con un coeficiente de 75 S ( 3 0 ) y un antígeno asociado con la infección (antígeno VIA), con u n coeficiente de sedimentación menor de 4 . 5 S (16). La proporción de las cápsides vacías, respecto a los virus completos. es variable de acuerdo coi1 el tipo o subtipo de virus en estudio. Bachrach (6), describe que en células BHK infectadas con virus A 1 , cl 8 4 por ciento de las partículas corresponden a cápsides vacías. En estudios posteriores, Lobo (36) comprobó que &te mismo tipo de células infectadas con los subtipos A12, A24, A 3 1 y A32, contenían 5 , 68, 4 3 y 65 por ciento respectivamente. d e cápsides vacías. Estas partículas pueden ser precipitadas por anticuerpos contra el virión, así como por anticuerpos contra la subunidad vira1 de 12 S, existiendo evidencia de que las cápsides vacías se originan como consecuencia de una deficiencia en la producción de ARN (6). El antígeno VIA se forma solamente en células en las cuales se efectúa una replicación activa del virus. Animales inoculados con vacunas iiiactivadas no forman este antígeno o sus anticuerr9s específicos (16). 29.

(9) Los cuatro antígenos citados, son activos en las pruebas de Fijación del Complemento y de precipitación en agar, aunque existen marcadas diferencias en su reactividad específica. Parece que solamente los antígenos de 140 S y 75 S, dan lugar a la formación de anticuerpos neutralizantes, que serían los más importantes en cuanto a elaboración de vacunas se refiere. Sin embargo, recientes observaciones indican que los antígenos de 12 S, pueden coadyuvar en la producción de anticuerpos neutralizantes que se formarían más lentamente que los inducidos por las dos partículas mencionadas (Cowan, K.M., 197 1, Comunicación Personal. Plum Island Animal Disease Laboratory, E.U.A.). Si se llega a demostrar en forma definitiva que la antigenicidad del virus de la Fiebre Aftosa está íntimamente asociada con las partículas de 140 S, según lo han sostenido Brown y Crick (9). y posteriormente Graves (31), se podrían utilizar técnicas que solamente determinen la concentración de las partículas de 140 S, quedando eliminada la reactividad de los otros a n t í g e n o s , tales como la utilización de compuestos derivados del fluorocarbono (44, 48), o seleccionar ciertas condiciones en la Prueba de Fijación del Complemento, de tal forma que ésta indique el contenido en términos de 140 S (8, 17).. Los anticuerpos originados en bovinos, porcinos y cobayos, a raíz de una infección o vacunación, pueden ser de dos tipos: rápidos y lentos (28, 39): a m b o s poseen actividades neutralizantes, pero difieren en cuanto a especificidad, actividad fijadora del complemento, y ciertas propiedades f ísico-qu ímicas.. Los primeros anticuerpos aparecen siete días después de un estímulo antigénico, correspondiendo a las macroglobulinas 19 S (IgM), que persisten por períodos relativamente cortos. Estos anticuerpos ofrecen buena capacidad neutralizante, pero poco o ninguna actividad fijadora del complemento (10, 12). Su desaparición va seguida por la presencia de microglobulinas 7 S (IgG) a los 14 días, que pueqen persistir por largos períodos de tiempo. Estos anticuerpos son altamente específicos de tipo, poséen actividad neutralizante, precipitante y fijadora del complemento (34), (Figura 8).. En bovinos, se ha descrito un tercer tipo de anticuerpos con un coeficiente de sedimentación de 1 1 S denominados IgA. Este tipo de inmunoglobulinas está presente en las glándulas exocrinas, intestino, y tracto respiratorio, asignándoseles un papel de gran importancia en los mecanismos de defensa local (14). 30.

(10) v >. 7. m. V. C. -O. o. i. L. c. +--u UI. m. c. U. 31.

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