UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES UNIANDES
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGISTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA:
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA “IN VITRO” DEL EXTRACTO HIDROETANÓLICO DE HOJAS DE Vernonanthura patens
(Laritaco) SOBRE Escherichia coli.
AUTORA: BQF. RIVERA BARRERA FLOR MARÍA
ASESORES: Dr. CARRANZA QUISPE LUIS EMILIO MsC. Dr. BERMÚDEZ DEL SOL ABDEL Ph.D.
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN CERTIFICACIÓN:
Quienes suscribimos, legalmente CERTIFICAMOS QUE: El presente trabajo de titulación realizado por el señorita Flor María Rivera Barrera, maestrante del programa de la Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, con el tema “EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA “IN VITRO” DEL EXTRACTO HIDROETANÓLICO DE HOJAS DE Vernonanthura patens (Laritaco) SOBRE Escherichia coli” ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los requisitos establecidos en la normativa pertinente de la Universidad Regional Autónoma de los Andes UNIANDES, por lo que se aprueba su presentación.
Ambato, junio del 2018
____________________________ ______________________________ Dr. Carranza Quispe Emilio, Ms. C. Dr. Bermúdez Del Sol Abdel, Ph.D.
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Flor María Rivera Barrera, maestrante del programa de la maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a la obtención del grado académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.
Ambato, junio del 2018
______________________________ Bqf. Flor María Rivera Barrera
DERECHOS DE AUTORA
Yo, Flor María Rivera Barrera, declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad Regional Autónoma de los Andes UNIANDES, está constituido por: La propiedad intelectual sobre las Investigaciones, trabajos científicos o teóricos, proyectos profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella...”
Ambato, junio del 2018
______________________________ Bqf. Flor María Rivera
DEDICATORIA
A mis amados padres y hermanos, quienes con sus palabras de aliento no me dejaban decaer para que siguiera adelante y siempre sea perseverante y cumpla con mis ideales.
A mis compañeros y amigos, por brindarme su apoyo y por permitirme aprender más de la vida a su lado.
Flor Rivera
AGRADECIMIENTO
Dios, tu amor y tu bondad no tiene fin, me permites sonreír ante todos mis logros que son el resultado de tu ayuda, y cuando caigo y me pones a prueba, aprendo de mis errores y me doy cuenta que pones al frente mío para que mejore como ser humano, y crezca de diversas maneras.
Este trabajo de tesis ha sido de gran bendición en todo sentido y te lo agradezco padre, y no cesan mis ganas de decir que es gracias a ti que esta meta está cumplida.
Gracias por estar presente no solo en esta etapa tan importante de mi vida, sino en todo momento ofreciéndome lo mejor y buscando lo mejor de mi persona.
ÍNDICE GENERAL
APROBACIÓN DE LOS ASESORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
DERECHOS DE AUTORA DEDICATORIA
AGRADECIMIENTO ÍNDICES
RESUMEN ABSTRACT
INTRODUCCIÓN ... 1
Antecedentes de la investigación ... 2
Planteamiento del Problema ... 5
Formulación del problema ... 7
Identificación de la línea de investigación ... 8
Objetivos ... 8
Objetivo general ... 8
Objetivos específicos ... 8
Hipótesis ... 8
Aporte teórico, significación práctica y novedad científica. ... 8
CAPÍTULO I ... 10
MARCO TEÓRICO ... 10
1. Uso de las plantas medicinales ... 10
1.1 Estudios etnobotánicos y etnofarmacológicos ... 11
1.3 Vernonanthura patens ... 15
1.3.1 Hábitat y ecología ... 16
Características botánicas ... 16
1.3.2 Principios activos ... 17
1.3.3 Actividad biológica de Vernonanthura patens ... 17
1.4 Caracterización fitoquímica de extractos de plantas ... 19
1.4.1 Extracción de extractos vegetales ... 19
1.4 .2 Recolección y tratamiento del vegetal ... 19
1.4.3 Métodos de Extracción ... 22
1.4.4 Extractos ... 23
1.5 Tamizaje Fitoquímico de extractos vegetales ... 23
1.5.1 Técnicas para el tamizaje fotoquímica ... 23
1.6 Actividad antimicrobiana ... 25
1.6.1 Resistencia antimicrobiana ... 26
1.6.2 Tipos de resistencia ... 27
1.6.3 Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana ... 28
Factores que influencian en la actividad antimicrobiana ... 28
1.6.3.1 Factores que influyen en las pruebas antimicrobianas... 28
1.6.3.2 Antibiograma ... 30
CAPITULO II ... 31
MARCO METODOLOGICO ... 31
2.1 Estudio etnobotánica. ... 31
2.1.1 Descripción del Área de Estudio ... 31
2.1.3 Análisis de datos etnobotánicos ... 33
2.2 Obtención del extracto hidroetonólico de Vernonanthura patens. ... 33
2.2.1 Lavado y Desinfección de la planta ... 33
2.2.2 Maceración de la muestra ... 34
2.2.3 Filtración... 34
2.3 Análisis de calidad del Extracto hidroetanólico de la planta. ... 34
2.3.1 Determinación de cenizas totales. ... 34
2.3.2 Determinación de cenizas solubles en agua. ... 35
2.3.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10% ... 35
2.3.4 Determinación de agua (humedad residual) ... 36
2.4. Análisis fitoquímico ... 36
24.1 Ensayo de Espuma (saponinas) ... 37
2.4.2 Ensayo de Benedic (Fenoles) ... 37
2.4.3 Ensayo de Shinoda (Flavonoides) ... 37
2.4.4 Ensayo de Borntrager (Quinonas) ... 37
2.4.5 Ensayo de Chalconas ... 38
2.4.6 Ensayo de Rosentaler (Terpenos) ... 38
2.4.7 Ensayo de Dragendorff (Alcaloides) ... 38
2.5. Análisis microbiológico mediante método de difusión en disco (Kirby-Bauer) ... 38
CAPITULO III ... 40
RESULTADOS Y DISCUSIONES ... 40
3.1 Etapa I: Estudio etnobotánico ... 40
3.2 Etapa II: Comprobación taxonómica e identificación botánica ... 47
3.3 Etapa III: Caracterización fitoquímica del extracto de Vernonanthura patens. ... 49 3.4 Etapa IV: Evaluación de actividad antimicrobiana del extracto
Vernonanthura patens ... 50
ÍNDICE DE GRÁFICOS
GRÁFICO No. 1.. ... 15
GRÁFICO No 2. ... 32
GRÁFICO No. 3. ... 42
GRÁFICO No. 4.. ... 42
GRÁFICO No. 5.. ... 43
GRÁFICO No. 6.. ... 44
ÍNDICE DE CUADROS
CUADRO No.1. ... 40
CUADRO No. 2.. ... 44
CUADRO No. 3.. ... 45
CUADRO No. 4.. ... 48
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
CMI Concentración mínima inhibitoria DMSO Dimetilsulfóxido
h Horas
IVU Índice de valor de uso
g Gramo
mL Mililitros mm Milímetro cm Centímetro
m Metro
msnm metros sobre el nivel del mar OMS Organización mundial de la salud DAP Diámetro a la altura del pecho ug Microgramo
uL Microlitro
UST Nivel de uso significativo Tramil Vuis Valor de uso de la especie ADN Ácido desoxirribonucleico ARNr Ácido ribonucleico ribosómico
RESUMEN
El uso de plantas medicinales con fines curativos es una práctica utilizada desde la antigüedad. Estas han sido por mucho tiempo el principal e incluso el único recurso al alcance de la población, por lo que existe un gran interés en la búsqueda de nuevas especies vegetales con propiedades medicinales. El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antimicrobiana “in vitro”del extracto hidroetanólico de las hojas de Vernonanthura patens sobre Escherichia coli, para lo cual se realizó un estudio etnobotánica con el método de la encuesta a 107 informadores clave en la parroquia Pacuyacu del cantón Lago Agrio de la provincia de Sucumbíos, Ecuador. Para la caracterización fotoquímica de la especie vegetal seleccionada se recolectó, identifico, acondicionó, extrajo con solvente hidroalcohólico, concentró y se llevó a cabo el tamizaje fotoquímico, se realizó la evaluación de la actividad antimicrobiana a dicho extracto usando el método de difusión de discos frente a Escherichia coli. Como resultado de las encuestas se seleccionó a la planta Vernonanthura patens por tener un nivel de uso significativo de 67.2%. El tamizaje fotoquímico mostró la presencia en esta planta de Fenoles, Flavonoides, Terpenos y Auronas que son metabólicos con actividad antimicrobiana. El extracto mostró actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli siendo los extractos al 25%, 50%, 75% y 100% los que presentaron mayor halo de inhibición. Se concluye que Vernonanthura patens es una de las plantas más usadas para tratar afecciones infecciosas en la parroquia Pacuyacu del cantón Lago Agrio y el extracto hidroetanólico de las hojas presenta acción antimicrobiana in vitro sobre Escherichia coli.
ABSTRACT
The proper use of the medicinal plants for curative purposes has been practiced since ancient times. It is essential to mention that the mentioned practice has been the unique form to treat medical problems since hundreds of years ago. Therefore, even today, many people are looking for new natural species whose property has medicinal treats. The main objective of this research was to evaluate the antimicrobial activity “in vitro” on hydro-ethanoic extracts of leaves mainly known as “Vernonanthura patens on Escherichia coli”. It is essential to mention that ethnobotanical analysis was made; in addition, a survey to 107 people was made. This study took part in Pacuyacu – Lago Agrion, in Sucumbios province.
To do phytochemical processes on vegetal species, it was relevant to identify, collect, and extract the species by the using hydro-alcoholic substances. It was also essential to carry on a phytochemical screening as well as the assessment of antimicrobial activities by applying diffusion Methods on “Escherichia coli”. After doing he surveys, it was found out that the plant “Verbonaninthura” had a high level of medical treats (67.2%). In addition, the phytochemical screening showed that the pant had Phenols and flavonoids characteristics. It was seen a microbial activity in relation with Escherichia coli (25%, 50%, 75% and 100%). It was concluded that, “Verbonaninthura patens” is one of the pants who have high levels of inhibition as they can cure infectious diseases. In addition, hydro- ethanoic substances also present medicinal patterns.
INTRODUCCIÓN
Las plantas medicinales han formado parte importante de la historia y cultura de los pueblos indígenas. El uso de plantas medicinales es el resultado de la experiencia e íntimo contacto con la naturaleza que el hombre ha acumulado por generaciones, así como de la convivencia entre las culturas de diferentes pueblos. Este saber ha permitido que sobrevivan comunidades que habitan en lugares apartados, donde hay carencias de servicios médicos y donde las parteras, "yerberos" y curanderos son los principales responsables de la salud de los habitantes (1).
Por lo tanto, las plantas medicinales cumplen una función importante como fuente de salud y revisten un interés incuestionable, por ello la Organización Mundial de la Salud (OMS) en su programa "Salud para Todos en el año 2000" recomendó la promoción de la medicina tradicional y las plantas medicinales, por su bajo costo y aplicación popular en la atención primaria de la salud (2). En Asia, millones de personas mantienen su salud mediante el uso de hojas, raíces y cortezas de árboles. Según investigadores todas estas plantas han sido reveladas para su utilización en la medicina tradicional. De acuerdo a la capacidad científico-técnica predominante en la región latinoamericana, las nuevas tecnologías de la información, las comunicaciones, la abundante diversidad biológica y los pasos para el desarrollo de la salud de la sociedad se verán altamente favorecidos (3).
En Ecuador, el uso de las plantas en las diversas poblaciones humanas está intrínsecamente ligado a las tradiciones culturales, es así que la etnobotánica ha sido clave para investigar cómo cada población aprovecha la flora de su entorno por ser parte sustancial de su identidad. Este nexo socioambiental demuestra por qué los procesos de aculturación acelerados y la desaparición de los bosques tendrían como consecuencia no solo la pérdida de las especies de plantas útiles, sino también del saber milenario de los pueblos indígenas asociado con su aprovechamiento (6).
Actualmente, en el Ecuador la etnobotánica ha despertado una conciencia de cambio en las nuevas generaciones científicas y académicas. El reto para los etnobotánicos ecuatorianos en el siglo XXI es demostrar que sí es posible un aprovechamiento sostenible de la diversidad vegetal, el cual es factible a través de prácticas tradicionales que implican la participación de los actores locales, quienes tienen un profundo respeto por la naturaleza al concebirla de manera holística (6). Sin embargo, en el Ecuador, los estudios de plantas medicinales y etnobotánica han sido desarrollados principalmente en la región central andina y en la Amazonía y consisten mayormente en la enumeración de las plantas que conoce y usa la gente local y/o la descripción de los sistemas de salud tradicional en comunidades indígenas (7).
Por lo cual las plantas medicinales tienen importantes aplicaciones en la medicina moderna; entre estos, son fuente directa de agentes terapéuticos, se emplean como materia prima para la fabricación de medicamentos semisintéticos más complejos, la estructura química de sus principios activos puede servir de modelo para la elaboración de drogas sintéticas y tales principios se pueden utilizar como marcadores taxonómicos en la búsqueda de nuevos medicamentos (8).
Antecedentes de la investigación
eran veneradas por las virtudes que poseían al ver los resultados tras su aplicación, trasmitiéndose el conocimiento de sus propiedades de generación en generación (9). El uso de hierbas medicinales ha aumentado en todo el mundo debido a su presunta eficacia, disponibilidad y aceptación general (10). La práctica de la medicina herbaria se basa en el uso terapéutico de las plantas medicinales como sustitutas de las formas farmacéuticas o en combinación. De las plantas se usan sus extractos en diversas formas de preparación, para mejorar el estado de salud. (10) Por lo cual la (OMS) define a la medicina tradicional como todo conjunto de conocimientos, aptitudes y prácticas basados en teorías, creencias y experiencias indígenas de las diferentes culturas, sean o no explicables, usados para el mantenimiento de la salud, así como para la prevención, el diagnóstico, la mejora o el tratamiento de enfermedades físicas o mentales (11).
Los sistemas tradicionales de medicina se han convertido en un tema de importancia mundial y ha renacido el interés por el estudio y uso de las plantas como recurso terapéutico (11) (12). Las estimaciones actuales sugieren que, en muchos países en desarrollo una gran proporción de la población depende en gran medida de los médicos tradicionales (yerberos, curanderos, naturistas, etc.) y las pantas medicinales para satisfacer las necesidades de atención primaria de salud (11) (13).
Por lo que cada día se presta más atención al estudio de las plantas medicinales de forma que la etnobotánica, la etnofarmacología, la fitoterapia y la fitoquímica están tomando un auge insospechado, tanto en la práctica de la medicina complementaria como en el ámbito académico (14). El 80% de la población mundial, más de cuatro mil millones de personas, utiliza las plantas como principal remedio medicinal, según nos señala la OMS (11).
De acuerdo a estudios realizados del genero Vernonanthura de otras especies, ha demostrado actividad diurética, hipotérmica, respiratoria, cardiovascular, antioxidante, antidiabética, antimalárica, antibacteriana, antifúngicas, antimolusquicida y efecto inhibidor de cepas de: Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa; como inhibidor en la producción de células HeLa. En su composición química se ha encontrado la presencia de sequisterpenos lactónicos, diterpenos, flavonoides,triterpenos y saponinas que podrían ser los posibles responsables de las actividades terapéuticas atribuidas a estas especies (15) (16).
El Ecuador está dentro del grupo de países considerados mega diversos, se encuentra a nivel mundial entre los 17 países, que en conjunto representan más del 70% de la biodiversidad del planeta (17).
De la planta Vernonanthura patens, se utiliza sus hojas en forma de cataplasma para combatir el pie de atleta, mientras la decocciones de sus hojas son empleadas en la medicina folclórica para combatir el paludismo, los dolores estomacales y de parto; las erupciones en la piel, las diarreas, antihelmíntico, lavar heridas, aliviar el dolor de cabeza, antiinflamatorio, antitusivo, para tratar ciertos tipos de cáncer y se emplea en la preparación de suero antiofídico (15) (16).
Según Manzano P, Tulio O, et al en el año 2013 estudiaron algunos parámetros farmacognósticos de la especie Vernonanthura patens, que crece en el Cantón de Marcabelí, provincia del Oro y propusieron los parámetros de calidad de las hojas, tallos y flores de la especie, además se identificó algunos metabolitos secundarios del tallo (compuestos reductores y saponinas) y las flores (saponinas, catequinas, lactonas, aminoácidos, compuestos reductores) (15).
oxysporum (16), extracto acuoso presenta actividad antimalárica contra Plasmodium falciparum (15) (16) y el extracto etanólico tiene actividad antileishmanial.(18) (19)
De acuerdo con los antecedentes antes mencionados no se ha reportado investigaciones de manera nacional e internacional acerca de la actividad antimicrobiana “in vitro” del extracto hidroetanólico de las hojas de Vernonanthura patens sobre Escherichia coli, con la finalidad de ser un punto de partida en el descubrimiento de nuevos fármacos y aumentar el mayor interés de la población ecuatoriana al uso y consumo de la medicina herbaria.
Planteamiento del Problema
La OMS emitió un informe “Antimicrobial resistance: global report on surveillance “sobre la resistencia a antimicrobianos, el primero de carácter mundial que reconoce la realidad de este problema, que puede afectar a cualquier ciudadano de cualquier país y que supone una gran amenaza para la salud pública (20).
En la Asamblea de la OMS llevada a cabo en 2015, se consensa la necesidad de un plan de acción global para combatir la resistencia a los antimicrobianos, que involucre a países en todas las regiones y que apunte a concientizar y educar sobre la resistencia antimicrobiana, optimizar el uso de los antimicrobianos, reducir la incidencia de la infección hospitalaria y la diseminación de los microorganismos resistentes y asegurar una sostenible inversión para la lucha contra la resistencia antimicrobiana (21).
El incremento de la resistencia microbiana por la presión selectiva que representa la utilización de antibióticos a gran escala, sobre todo en los hospitales, ha permitido cepas con mecanismos de resistencia que, en muchas ocasiones, nos dejan prácticamente sin alternativas para el tratamiento de las infecciones. La resistencia a los antimicrobianos reduce las posibilidades de tratamiento eficaz de enfermedades, prolonga el tiempo de agonía de los enfermos y los obliga a utilizar medicamentos costosos, además de alargar el tiempo de hospitalización y aumentar el riesgo de mortalidad (23).
Desde 1976 la (OMS), ha estado promoviendo el uso de los sistemas tradicionales de la medicina como parte de los programas de Atención Primaria de Salud. Entre las tendencias de la medicina contemporánea se destaca la incorporación de la medicina natural y tradicional a la práctica profesional, como método alternativo y en particular el uso de las plantas medicinales (24).
La Escherichia coli en los últimos años ha presentado un incremento en la resistencia a los tratamientos con antibióticos como la penicilina, situación que ha provocado una gran preocupación a nivel sanitario y terapéutico (25). La resistencia bacteriana de Escherichia coli a antibióticos como ampicilina está entre 28-39%, a trimetoprim-sulfametoxazol 31%, a cefalosporinas entre 9 al 19% y a cefuroxime en 1% (26). Las fluoroquinolonas prescritas a menudo de forma masiva e indiscriminada desde su introducción comercial para el tratamiento de infecciones ambulatorias desencadenaron en un aumento de las infecciones causadas por E. coli resistente a estas (27). Por lo cual el aumento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos limita la administración de antibióticos baratos y de espectro limitado, lo que afecta el costo y el acceso a la atención de salud (28).
(Ciprofloxacino). Este es tan solo un ejemplo de los tantos que se van presentando en el país, así como a nivel mundial, en donde los antibióticos van perdiendo su eficacia frente a este tipo de microorganismos (29).
La Red Nacional de Resistencia Bacteriana de Ecuador (REDNARBEC), es la organización que ha presentado datos de resistencia bacteriana tanto a nivel comunitario como hospitalario en el Ecuador. En los últimos datos disponibles del año 2008, reportan que a nivel comunitario la resistencia de Shiguella spp a tetraciclina fue del 96% y a ampicilina 93%, Salmonella spp fue resistente a tetraciclina en un 30%. Escherichia coli era resistente a ampicilina y tetraciclina en un 71%. A nivel hospitalario Escherichia coli presentó hasta un 77% de resistencias a ampicilina, Klebsiella pneumoniae era resistente en un 65% a cefotaxima, enterobacter presentó un 67% de resistencias a ampicilina sulbactam (30)
Ante lo expuesto, La práctica de la medicina herbaria se basa en el uso terapéutico de las plantas medicinales como sustitutas de las medicinas farmacéuticas o en combinación. De las plantas se usa sus extractos en diversas formas de preparación, para mejorar el estado de salud (10). Las plantas medicinales son una ventaja y la mejor opción para encontrar alternativas a la terapia medicamentosa que en muchos de los casos pueden presentar efectos adversos para el individuo, son de elevado costo, difícil administración y carecen de valor nutricional comparados con las plantas (22). Con la investigación se pretende aportar a la exploración e investigación de la actividad antimicrobiana presente en el extracto hidroetanólico de Vernonanthura patens sobre Escherichia coli, mediante la experimentación en cultivo in vitro con el propósito de establecer una alternativa terapéutica a la patología causada por esta bacteria.
Formulación del problema
Objeto de investigación y campo de acción Actividad antimicrobiana de la planta.
Identificación de la línea de investigación Estudios microbiológicos.
Objetivos
Objetivo general
Evaluar la actividad antimicrobiana in vitro del extracto hidroetanólico de las hojas Vernonanthura patens sobre Escherichia coli.
Objetivos específicos
1. Determinar el nivel de uso significativo de Vernonanthura patens
2. Obtener el extracto hidroetanólico de las hojas de Vernonanthura patens. 3. Identificar la composición fotoquímica del extracto de las hojas hidroetanólico de Vernonanthura patens.
4. Evaluar el efecto antimicrobiano del extracto de las hojas hidroetanólico de Vernonanthura patens sobre Escherichia coli.
Hipótesis
El extracto hidroetanólico de las hojas de Vernonanthura patens tiene efecto antimicrobiano sobre Escherichia coli
Aporte teórico, significación práctica y novedad científica.
actividad microbiana con la finalidad de conocer sus propiedades y usos de la Vernonanthura patens originaria de Ecuador.
Con la elaboración del proyecto de investigación, se benefició la población en general debido a que las plantas medicinales se utilizan como principal alternativa terapéutica para tratar enfermedades, y así incentivar a los futuros investigadores a la elaboración de nuevos fitofármacos de bajo costo, índices de toxicidad reducido en comparación con los medicamos sintéticos.
CAPÍTULO I
MARCO TEÓRICO
1. Uso de las plantas medicinales
El uso de prácticas de salud complementarias es tan antiguo como la aparición de la especie humana, porque desde el principio de la civilización son parte de las prácticas de atención familiar y comunitaria. Entre las distintas prácticas complementarias utilizadas y difundidas a través de la cultura popular, las plantas medicinales siempre ocupan lugar destacado y durante mucho tiempo fue el principal recurso terapéutico utilizado para tratar la salud de las personas y sus familias (31).
Se estima que el 80% de la población mundial depende de remedios herbolarios tradicionales y que al menos 35 000 especies vegetales presentan potencial para uso medicinal (32). La utilización de las plantas medicinales como recurso terapéutico es bastante difundida en todo el mundo, y 67% de las especies vegetales medicinales son provenientes de países en desarrollo. Son consideradas como terapia complementaria o alternativa en salud y su uso ha sido creciente. El empleo de las plantas generalmente está fundamentado en el conocimiento popular, y muchas veces, los pacientes no relatan su utilización a los profesionales de la salud (33).
Este patrimonio cultural se ha transmitido de generación en generación, de manera que algunas costumbres subsisten y son ejercidas de manera cotidiana, tanto en áreas rurales como urbanas. Estas prácticas médicas permanecen vigentes debido a que, entre otras cosas, los tratamientos tradicionales están basados en la enfermedad como es concebida dentro de su cultura (34).
menor y principalmente relegado a personas que viven en zonas urbanas marginales y de condición socioeconómica baja. No obstante, el uso y comercio de plantas medicinales se mantiene como una práctica activa en los mercados de las ciudades ecuatorianas y particularmente en las urbes del callejón interandino, en donde se expenden por lo menos 273 especies de hierbas medicinales, mismas que se emplean para tratar más de 70 dolencias (35).
1.1 Estudios etnobotánicos y etnofarmacológicos
La investigación sobre el uso de plantas medicinales forma parte de la etnobotánica, que ha sido definida como el estudio de las interrelaciones entre los grupos humanos y las plantas (36).
Según la OMS, en la actualidad, las dos terceras partes de la población de los países con economías periféricas recurren a la medicina tradicional, siendo un sistema complementario a la medicina alopática o científica. El amplio uso de la medicina tradicional se atribuye a su accesibilidad y asequibilidad, siendo muchas veces la única fuente para la atención sanitaria de los pacientes de menores recursos (11).
Entre los principales objetivos de la etnobotánica esta: la recopilación y conservación de los conocimientos ancestrales, la búsqueda y elaboración de nuevos fármacos que contribuyan a elevar la calidad de vida de todos los seres humanos. Además, es importante señalar su contribución en la elaboración de un inventario del saber ancestral ya que en la actualidad hay una pérdida progresiva debida principalmente a la aculturación que está sometido nuestros pueblos. Por ello la recopilación de estos conocimientos permite fortalecer la identidad de cada pueblo y es factor importante para la conservación integral del patrimonio natural y cultura (37).
relevancia científica. La redefinición del campo de estudio de la etnofarmacología y su método se vieron plasmados en la evolución del concepto de la materia; en 1983 Holmstedt y Brunh definen a la etnofarmacología como “La exploración interdisciplinaria de los agentes biológicamente activos tradicionalmente empleados por el hombre”. Schultes (1991) vierte una nueva definición como: “La observación, identificación, descripción e investigación experimental de los efectos de las drogas utilizadas en la medicina tradicional”. Con este enunciado se puntualizan los sujetos de estudio de la etnofarmacología, así como cada uno de los aspectos que debe comprender un estudio completo (38).
La Etnofarmacología es una ciencia interdisciplinaria, ya que abarca las observaciones en campo, así como también la descripción del uso y preparación de los remedios, la determinación botánica del material obtenido, también engloba los estudios fitoquímicos que son muy importantes para aislar los compuestos presentes en las plantas, así como los estudios farmacológicos (38).
Esta ciencia ha tomado una gran relevancia en los últimos años, ya que varias compañías farmacéuticas están interesadas en las plantas y su potencial para obtener agentes terapéuticos que ayuden al tratamiento de algunas enfermedades de gran prevalencia entre la población (38).
Uno de los retos actuales de la etnofarmacología es documentar y preservar la riqueza biológica empleada en la medicina tradicional y desarrollar sistemas sustentables de producción y uso de plantas con potencial farmacológico para el tratamiento de diversas enfermedades (39).
1.2 Valor de uso de las plantas medicinales
Las plantas medicinales tienen una contribución importante en el sistema de salud de comunidades locales debido a que son usadas de manera frecuente por la mayoría de las poblaciones rurales.
De esta manera, la etnobotánica es una herramienta útil para el rescate del conocimiento sobre el uso del recurso vegetal y es el campo científico que estudia las interacciones que se establecen entre el hombre y las plantas a través del tiempo y en diferentes ambientes y su estudio en bosques tropicales, ha adquirido interés e importancia en las últimas décadas debido a la pérdida acelerada del conocimiento tradicional y a la degradación de los bosques (40).
El uso de la medicina tradicional en el tratamiento de enfermedades, es una práctica que se ha llevado a cabo desde tiempos ancestrales y ha demostrado que es una de las mejores opciones beneficiando a las personas y comunidades que mantienen y conservan el uso de plantas medicinales, caso particular del área rural donde se utiliza este recurso, manteniendo su valor y uso cultural.
Para el análisis etnobotánico es necesario el empleo de 3 índices para determinar la importancia de las diferentes especies identificadas en una determinada área de estudio, los cuales son: (41)
Índice de valor de uso de especies (IVU)
Conocimiento relativo de la especie por varios informantes (RVU) Nivel de uso significativo (UST)
EL Índice de valor de uso de especies evalúa la importancia o valor cultural del uso de los recursos (especias, familias) para diferentes grupos humanos (7).
Dónde:
UVis: número de usos mencionados por cada informante (i), para cada especie (s); ns: número de informantes entrevistados.
El conocimiento relativo de la especie por varios informantes (RVU). Se utilizó la siguiente formula:
VUis= valor de uso de la especie por cada informante. IVUs= es el índice de valor de uso de la especie. Nsp= es el número de especies.
Nivel de uso significativo Tramil (UST). Según la metodología propuesta por Germosén-Robineau expresa que los usos medicinales que son citados con una frecuencia superior o igual al 20%, por las personas encuestadas que usan plantas como primer recurso para un determinado problema de salud, pueden considerarse significativos desde el punto de vista de su aceptación cultural y, por lo tanto, merecen su evaluación y validación científica (7).
El UST se calcula mediante la siguiente ecuación:
Dónde:
1.3 Vernonanthura patens
GRÁFICO No. 1. Vernonanthura patens.
La Vernonanthura, es uno de los géneros de la subfamilia Cichorioideae, que cuenta con 65 especies, distribuidas a través de México, las Antillas, América Central y del Sur. (15).
La Vernonanthura patens (Kunth) H. Rob., es un arbusto originario de Sudamérica, que crece de forma silvestre en el sur ecuatoriano; los pobladores la conocen como laritaco y utilizan las cocciones acuosas de las hojas para lavar y cicatrizar las heridas, calmar el dolor de cabeza, como antiinflamatorio, calmar la tos y combatir ciertos tipos de cáncer (15).
La utilización de esta especie también se encuentra en la práctica veterinaria, que consiste en curar heridas infectadas de animales a través del lavado con mezclas de plantas en las que se incluyen a las hojas de Vernonanthura patents.
En el Ecuador, los moradores de la zona sur-oeste de Loja la utilizan para lavar heridas, por su poder cicatrizante, así como su acción analgésica, para el dolor de cabeza en humanos; en el Cantón Marcabeli, provincia del Oro, es muy utilizada como antiinflamatorio, para calmar la tos, y para combatir ciertos tipos de cáncer. Se reporta su uso en el tratamiento de leishmaniasis; en la preparación de suero antiofídico (15).
Clasificación taxonómica Reino: Plantae
Phylum o división: Tracheophyta Clase: Magnoliopsida
Orden: Asterales Familia: Compositae Género: Vernonanthura
Especie: Vernonanthura patens
Nombre científico: Vernonanthura patens (Humb., Bonpl. & Kunth) H.Rob (42).
1.3.1 Hábitat y ecología
La Vernonanthura patens (Kunth). H Rob. Es una especie que crece de 0 a 2000 msnm de forma silvestre en las diferentes zonas de Ecuador como son la región Costa, Sierra y Oriente. Se encuentra en los bosques de tipo seco pluviestacional y bosque seco andino (43) (44).
Características botánicas
1.3.2 Principios activos
Los principios activos de las plantas medicinales son moléculas resultantes del metabolismo celular de las plantas. Se clasifican en metabolitos primarios y secundarios (46).
Los productos derivados del metabolismo secundario son los más importantes como principios activos. Los principales constituyentes de Vernonanthura patents se encuentran distribuidos de la siguiente manera ya muchos de ellos se debe las propiedades farmacológicas y biológicas del vegetal (47).
Tallos: saponinas y compuestos reductores,catequinas, lactonas, triterpenos y esteroides, fenóles , taninos y flavonoides.
Hojas: tripertenoides pentacíclicos (lupeol, epilupeol, acetato de lupeol ), lactonas sesquiterpénicas, flavonoides, fenóles , taninos y catequinas
Flores: catequinas, compuestos reductores, lactonas, triterpenos y esteroides, fenoles y taninas, aminoacidos (ácido hexadecanoico), flavonoides.
La ß-amirina y el lupeol se encontraron en todos los órganos vegetales, el glutinol y el acetato de taraxasterol está en tallos, y el taraxasterol y el neoganmacer únicamente en las flores. La ᾳ-amirina se encontró como componente de tallos y flores (15) (18).
1.3.3 Actividad biológica de Vernonanthura patens
Sobre esta especie, sus componentes químicos y su actividad biológica, son pocos los informes reportados:
Se ha aislado alrededor de 12000 compuestos procedentes de organismos vegetales y se estima que constituyen tan solo el 10% de los metabolitos secundarios. Un porcentaje importante posee cierta actividad frente a los microorganismos (49).
Las plantas tienen una capacidad ilimitada de sintetizar compuestos, en su mayoría metabolitos secundarios tales como: flavonoides, catequinas y taninos y otros compuestos de naturaleza fenólica son responsables de la actividad antimicrobiana (49).
Taninos: Son sustancias de origen vegetal, no nitrogenadas de estructura polifenolica, solubles en agua alcohol y acetona. Estas sustancias son de sabor astringente y tienen la propiedad común de curtir la piel, haciéndola imputrescible e impermeable al fijarse sobre sus proteínas. Además, se han descrito más de treinta taninos que pueden inhibir a hongos y bacterias (50).
Triterpernos de naturaleza alcohólica pueden alterar la naturaleza coloidal del protoplasma de la célula provocando su muerte (51).
Lactonas sesquiterpénicas son sustancias amargas que se encuentran en todas las partes de las plantas en concentraciones que varían entre 0,01 y 8% del peso seco, siendo las concentraciones mayores generalmente en las hojas. Presentan gran importancia por la variada acción biológica que han demostrado: acción citotóxica, antitumoral, analgésica, inhibidores del crecimiento de bacterias (52).
Flavonoides son estructuras fenólicas que contienen un grupo carbonilo y cuya actividad frente a los microorganismos se debe a que forman complejos con las proteínas solubles y extracelulares y con las células de la pared bacteriana (52).
1.4 Caracterización fitoquímica de extractos de plantas
Los productos naturales pueden contener una gran variedad de sustancias con posible actividad terapéutica, que se denominan productos bioactivos, los cuales varían en su proporción, pureza y concentración dependiendo de la especie, de la época del año en que se cultivó y recolectó la planta y de su parte utilizada, por lo que se necesitan extraer e identificar estas sustancias (54).
1.4.1 Extracción de extractos vegetales
Los extractos de plantas medicinales se utilizan por el hombre desde la antigüedad para la cura de múltiples dolencias. Para lograr una concentración adecuada de los principios activos contenidos en las plantas y que su acción sea más efectiva es necesario realizar diversos procedimientos ediantes los cuales sean extraídos aquellos con solventes adecuados que se seleccionan de acuerdo a la solubilidad y la estabilidad que posean las sustancias beneficiosas.
1.4 .2 Recolección y tratamiento del vegetal
Este saber tradicional se ha ido perfeccionando a lo largo del tiempo, tamizado por el rigor científico de ensayos químicos, farmacológicos, toxicológicos y clínicos que buscan los principios activos para explicar en forma racional el uso terapéutico de una planta y que permite además la vigencia de su empleo (55)
La obtención de las drogas vegetales se realiza a partir de las plantas medicinales, las cuales se pueden clasificar en silvestres y cultivadas.
Selección
Aquella que nos permite seleccionar las mejores plantas de cada cosecha.
Selección que consiste en modificar genéticamente a una planta en
particular, para obtener plantas con características deseadas.
Recolección
Las materias vegetales medicinales deben recolectarse durante la temporada o período óptimos para asegurar la calidad óptima tanto de las materias primas, como de los productos acabados. El mejor momento para la recolección debe determinarse basándose en la calidad y la cantidad de los componentes con actividad biológica y no el rendimiento total en materia vegetal de las partes de las plantas medicinales de interés. Esta recolección puede ser manual o mecanizada (55).
Según Kuklinski, los factores que afectan la concentración de los principios activos en las drogas vegetales son:
La edad de la especie vegetal: no solo influye en la cantidad total de principio activo, sino también en la proporción de los componentes de la mezcla activa.
La época del año: el clima y la época del año influye en la cantidad de principio activo.
Hora del día: se ha evidenciado que existe una variación del día a la noche, en los metabolitos vegetales secundarios.
Conservación
Al ser arrancados de su medio natural, los vegetales ven alterado su equilibrio metabólico por lo que se presentan reacciones y fenómenos de degradación. Las causas de alteración pueden ser internas y externas:
Causas internas
a. Reacciones enzimáticas. b. Autooxidaciones.
a. Calor b. Humedad c. Radiaciones d. Microorganismos e. Insectos, etc.
Desecación
La desecación consiste en eliminar progresivamente la humedad. Una planta húmeda es fácil presa de bacterias y hongos, que la atacan alterando sus principios activos.
El proceso de desecación lo podemos dividir en:
Desecación natural: es un proceso lento, económico. Se pueden emplear cobertizos, bandejas, telas metálicas galvanizadas, papeles extendidos sobre un armazón de madera, etc.
Desecación artificial: permite un control de la temperatura, de la humedad y del tiempo que tarda el proceso. Es generalmente el más adecuado, de corta duración, útil en donde la humedad es muy elevada.
Almacenamiento
1.4.3 Métodos de Extracción
Permiten obtener los productos en formas farmacéuticas adecuadas para su administración oral o externa de acuerdo al lugar de acción que se recomiende (Solares, 2013)
Los métodos para extraer los principios activos contenidos en dicha planta, los cuales necesitan de un líquido extractivo que va a depender del procedimiento técnico y de la naturaleza química del principio activo.
A continuación, se citarán los métodos de extracción más importantes:
Maceración. - Se entiende por maceración al contacto prolongado durante cierto tiempo de la droga con el menstruo constituyendo un conjunto homogéneamente mezclado en el cual el menstruo actúa simultáneamente sobre todas las proporciones de la droga, circulando a través en todas las direcciones y sentidos y disolviendo sus principios activos hasta producirse una concentración en equilibrio con la del contenido celular. (Selles, 1992)
Percolación o lixiviación. -consiste en que el menstruo (generalmente alcohólico o mezcla hidroalcohólica) atraviesa la masa de droga pulverizada siempre en un solo sentido, alcanzando concentraciones crecientes de tal modo que el equilibrio entre el solvente dentro y fuera del marco nunca se alcanza, por lo que la droga bañada siempre por nuevas proporciones de menstruo acaba por ceder todos sus componentes solubles de manera progresiva. (Selles, 1992)
Decocción. - Consiste en llevar a la mezcla de droga más menstruo a la temperatura de ebullición del agua, manteniendo esta temperatura durante un período variable que suele oscilar de 15 a 30 minutos. (Selles, 1992)
Infusión. - Es el proceso en cual se somete a la droga previamente humedecida al contacto con el solvente a una temperatura igual a la de ebullición del agua por cinco minutos, se deja enfriar hasta temperatura ambiente y se prepara al 5%.
1.4.4 Extractos
Son preparados concentrados de consistencia sólida, líquida o intermedia, derivados generalmente de material vegetal desecado, se obtienen al evaporar parcial o totalmente el disolvente en los líquidos extractivos de origen vegetal. Los extractos pueden clasificarse en (56):
Extractos fluidos o líquidos: Son preparados líquidos de drogas vegetales que contienen alcohol como disolvente y/o conservador, de modo que cada mL Contiene los constituyentes terapéuticos de 1g de la droga estándar que representa. Los extractos fluidos farmacopéicos se preparan mediante percolación.
Extractos semisólidos o blandos: Son aquellos que tienen una consistencia seca y son fácilmente pulverizables, se obtienen por evaporación del disolvente y desecación del residuo. Los extractos secos no deben presentar un contenido de humedad mayor del 5%. (Voigt, 1982)
Extractos secos: Son aquellos que poseen una concentración de principio activo superior a la de la droga* original y tienen consistencia semisólida. El disolvente suele ser agua o mezclas hidroalcohólicas. Los extractos blandos son poco estables y resultan difíciles de manipular; por lo que no se utilizan (56).
1.5 Tamizaje Fitoquímico de extractos vegetales
Son pruebas preliminares sencillas y rápidas que permiten detectar cualitativamente la presencia de determinados grupos de compuestos. Se ayudan de la micro química para evidenciar estos grupos de constituyentes mediante formación de precipitados, coloraciones, etc (57).
1.5.1 Técnicas para el tamizaje fotoquímica
película coloreada de rojo en el seno del líquido o en las paredes del tubo de ensayos, respectivamente.
Ensayo de Mayer y el de Wagner. - Permiten identificar alcaloides, se debe añadir 2 o 3 gotas de la solución reactiva de Mayer o Wagner respectivamente, se observa opalescencia, turbidez definida, precipitado coposo, entonces se considera positiva la presencia de este tipo de metabolito. En el caso de alcaloides cuaternarios y/o aminoácidos libres, estos sólo se encontrarán en el extracto acuoso y para considerar su presencia debe observarse la aparición de turbidez definida o precipitado coposo en todos los casos, ya que la aparición de opalescencia puede dar un resultado falso, pues puede provenir de una extracción incompleta de bases primarias, secundarias o terciarias. Ensayo de Shinoda. - Permite reconocer la presencia de flavonoides en
un extracto vegetal. El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo, intensos en todos los casos.
Ensayo de antocianidinas. - Permite identificar en los extractos la existencia en estas estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. La aparición de un color rojo a marrón en la fase amílica es indicativa de un ensayo positivo.
La presencia de estructuras tipo polisacárido, que forma un coloide hidrófilo de alto índice de masa, que aumenta la densidad del agua donde se extrae, denota la presencia de mucílagos.
Ensayo de resina. - Permite identificársete tipo de compuestos y se considera positivo cuando aparece un precipitado.
Ensayo de espuma. - Permite reconocer la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénicas.
Ensayo de Fehling. - Permite reconocer la presencia de azucares reductores. Este se considera positivo si la solución se colorea de rojo o aparece un precipitado rojo.
Ensayo de Baljet. - Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, en particular coumarinas, aunque otros compuestos láctonicos pueden dar también positivo este ensayo. En estas condiciones se considera la presencia de esta familia de compuestos por la aparición de una coloración y un precipitado. Ensayo de Borntrager. -Permite identificar quinonas. Si la fase acuosa
alcalina se colorea de rosado a rojo, el ensayo se considera positivo. Ensayo Liebermann - Burchard. - Permite determinar la presencia de
triterpenos y/o esteroides debido a que ambos tipos de productos poseen un núcleo de androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.
Ensayo de Ninhidrina. - Permite determinar la presencia de aminoácidos libres o de aminas en general. Este ensayo se considera positivo cuando se desarrolla un color violáceo
1.6 Actividad antimicrobiana
En el siglo XX el descubrimiento de los antibióticos se convirtió en la solución a las múltiples enfermedades producidas por agentes infecciosos. Las bacterias como todos los seres vivos exhiben mecanismos biológicos, que las facultan para adecuarse a diversas presiones ambientales (58).
Aunque la resistencia a los antibióticos es una expresión natural de la evolución y genética bacteriana, ciertos factores también contribuyen al aumento de la expresión y diseminación de esta característica inherente (58).
El ataque a los microorganismos, por parte de los antimicrobianos, se pueden dar de diferente manera (59):
Inhibición a la síntesis de la pared celular. Funciones de la membrana celular.
Los antibióticos son productos metabólicos de un organismo que es perjudicial o inhibitorio para otros microorganismos en muy pequeñas cantidades, estas sustancias pueden actuar de dos maneras (59):
Microbiocidas: Matan las formas vegetativas de los gérmenes, específicamente se denominan bactericidas, refiriéndose a bacterias y fungicidas refiriéndose a hongos.
Microbiostatico: inhibe el crecimiento de microorganismos y se denominará, bacteriostático o fungistático, según se refiera a bacterias u hongos.
1.6.1 Resistencia antimicrobiana
La aparición de los antibióticos en la terapéutica médica se hizo patente el problema de resistencia bacteriana, un hecho oculto hasta ese momento a los seres humanos, pero existente en el mundo microbiológico. Los antibióticos que utilizamos para el tratamiento de pacientes afectos de infecciones, usualmente son copia o modificación de sustancias elaboradas por microorganismos (60).
Algunos microorganismos lo utilizan a la resistencia bacteriana como mecanismo de defensa, esto es un fenómeno que existía antes del descubrimiento de los antibióticos y de su uso, pero que con su introducción en el tratamiento de enfermedades infecciosas se ha intensificado debido al fenómeno denominado “presión selectiva” contra las bacterias, considerado como uno de los factores más importantes para la aparición y diseminación de la resistencia a los antibióticos (61).
1.6.2 Tipos de resistencia
Las bacterias por su capacidad de adaptación, pueden desarrollar mecanismos de resistencia frente a los antibióticos. La resistencia antibiótica puede ser (62): Natural (intrínseca). -La resistencia natural es propia de cada familia,
especie o grupo bacteriano.
Adquirida. -Es la que puede llevar a un fracaso terapéutico cuando se
utiliza un antibiótico supuestamente activo sobre el germen que produce la infección.
Resistencia transmisible. - Es la más importante, estando mediada por plásmidos, transposones o integrones, que pueden pasar de una bacteria a otra.
Las bacterias se hacen resistentes a los antibióticos desarrollando mecanismos de resistencia que impiden al antibiótico ejercer su mecanismo de acción.
Los mecanismos de resistencia de las bacterias son fundamentalmente tres (62):
Inactivación por enzimas. - La bacteria produce enzimas que inactivan al antibiótico; las más importantes son las betalactamasas y muchas bacterias son capaces de producirlas.
Modificaciones bacterianas que impiden la llegada del antibiótico al punto diana: Las bacterias producen mutaciones en las porinas de la pared que impiden la entrada de ciertos antibióticos (betalactámicos) o alteran los sistemas de transporte (aminoglucósidos en los anaerobios). Alteración por parte de la bacteria de su punto diana. - Impidiendo o
1.6.3 Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana
Son usados para determinar In vitro la susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos, pero estos no son igualmente sensibles o no se basan en los mismos principios, permitiendo que los resultados sean influenciados por el método seleccionado, los microorganismos usados y el grado de solubilidad de cada compuesto evaluado (63).
Los métodos se clasifican en:
Métodos de difusión: Son ampliamente usadas para evaluar extractos de plantas con actividad antimicrobiana. Estudia los compuestos polares y sus resultados son altamente reproducibles.
Métodos de dilución: Es utilizado para determinar la concentración mínima bactericida y la concentración mínima inhibitoria. Estudia las sustancias polares y no polares.
Método bioautografía: Es útil para la purificación de sustancias antibacterianas, o como una técnica de tamizaje fitoquimico preliminar, o un fraccionamiento bioguiado, realizando el ensayo a través de cromatogramas, que permitan la localización de los compuestos activos, incluso en matrices complejas como los derivados de productos naturales.
Método conductimetrico: Detecta el crecimiento microbiano como un cambio en la conductividad eléctrica o impedancia del medio de cultivo.
Factores que influencian en la actividad antimicrobiana
1.6.3.1 Factores que influyen en las pruebas antimicrobianas
La correlación exacta entre los resultados in vitro y la respuesta clínica es muchas veces difícil de predecir, ya que existen numerosos factores que influencian la interacción de los agentes antimicrobianos y los microorganismos en un determinado paciente. Entre los factores podemos resaltar (65):
Factores del agente antimicrobiano Farmacocinética
Unión a proteínas del plasma Vías de administración
Acción bacteriostática o bactericida Concentración en el sitio de la infección
Factores del huésped Enfermedad
Estado inmunológico Formación de absceso Presencia de cuerpo extraño Función renal y hepática Cumplimiento del tratamiento
Factores del microorganismo Virulencia
Alta concentración de microorganismos Infección mixta
Desarrollo de resistencia durante el tratamiento
1.6.3.2 Antibiograma
El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población bacteriana (65).
La realización de un antibiograma se basa en el patrón de resistencia de cada bacteria. Así, los antibióticos a los que esa bacteria es intrínsecamente resistente o cuya sensibilidad puede inferirse por otros, no suelen informarse en el antibiograma (66).
Así también, el antibiograma mide la sensibilidad de una bacteria frente a diferentes antimicrobianos in vitro y a partir de estos resultados predice la eficacia in vivo. Con un antibiograma se pueden obtener resultados cualitativos que indican si la bacteria es sensible o resistente a un antibiótico, o cuantitativos que determinan la concentración mínima (CMI) de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano (en µg/ ml o en mg/l) (66).
CAPITULO II
MARCO METODOLÓGICO
Se realizó un estudio que por sus características y desarrollo es considerada como etnofarmacologicas.
Por cuanto la Etnofarmacología es la exploración científica interdisciplinaria de los agentes biológicamente activos y tradicionalmente empleados o conocidos por el hombre. Por eso para su mejor ejecución y descripción se divide en 4 etapas (67).
2.1 Estudio etnobotánica.
En la primera etapa se realizó un estudio etnobotánico para identificar las plantas con propiedades antimicrobianas reportadas por los informantes clave (ancianos, vendedores de plantas medicinales y curanderos) mayores de 35 años de la parroquia Pacuyacu del canton Lago Agrio de la provincia de Sucumbíos y determinar cuál de ellas tenía mayor valor de uso para utilizarla en la investigación.
Por lo tanto, el estudio se ha realizado bajo el siguiente esquema:
2.1.1 Descripción del Área de Estudio
La presente investigación se realizó en la provincia de Sucumbíos en el cantón Lago Agrio de la Parroquia Pacuyacu (Gráfico N.1); está ubicada en el extremo oeste del cantón Lago Agrio. Limitada al Norte con el Río San Miguel y la
parroquia de Santa Elena, al Sur con la parroquia Shushufindi y Tarapoa, al
este con la parroquia Palma Roja, al oeste con las parroquias General Farfán y
Dureno. Según el censo del (INEC 2011), la población de Pacuyacu es de 6600
Segmentando a la población de acuerdo a grupos de edad, el 60% de la
población se encuentra en edad de trabajar, en el rango de 15 a 64 años de
GRÁFICO No 2. cantón Lago Agrio de la parroquia Pacuyacu Fuente: Ministerio del ambiente, Ecuador
2.1.2 Aplicación de cuestionario etnofarmacológico
Para la encuesta se consideró el 42.7% de la población que es a partir de 35 años y el 57.3% se descarta debido a que este grupo se encuentran los niños y jóvenes. Por lo cual el número de habitantes considerados para la encuesta es de 2800.
La muestra se determinó a través de la fórmula:
Dónde: n es la muestra, N es la población, y Ne2 es el margen error de 5%, teniendo una confianza del 95%.
Se procedió a visitar a los mercados, casa de curanderos y lugares de alta concurrencia.
2.1.3 Análisis de datos etnobotánicos
Posteriormente se procedió a tabular el cuestionario aplicado: se
identificó las especies referidas con fines medicinales, indicaciones o usos, modo de uso, forma de preparación, partes usadas de la planta, ubicación de la planta, tiempo de uso, resultados de su uso, precauciones, vía de información y edad de las personas en las que se usaron los vegetales.
La información etnobotánica proporcionada fue recopilada y organizada en una base de datos empleando la hoja de cálculo de Excell.
Se empleó la fórmula para determinar el índice de valor de uso de las plantas mencionadas.
Se estimó el nivel de uso significativo para cada especie y para verificar su aceptación cultural.
2.2 Obtención del extracto hidroetonólico de Vernonanthura patens.
Una vez identificado el vegetal con mayor nivel de uso significativo y la parte de la especie a estudiar se procedió a la obtención de extracto hidroetanólico a partir de las hojas frescas de la Vernonanthura patens mediante el método común denominado Maceración
2.2.1 Lavado y Desinfección de la planta
Se seleccionó las hojas que se encuentran en buen estado y se eliminó las raíces.
Se realizó el lavado del vegetal, por inmersión con agua potable y con la solución desinfectante de hipoclorito de sodio al 2%.
Se lavó el vegetal en agua corriente y se sumergió en agua potable varias veces y luego en la solución desinfectante por 5 minutos.
2.2.2 Maceración de la muestra
Se procedió a añadir al vegetal un litro de etanol al 96% por un tiempo
de 15 días.
2.2.3 Filtración
Para filtrar se procedió a utilizar una bomba de vacío y un embudo Buchner.
2.3 Análisis de calidad del Extracto hidroetanólico de la planta.
2.3.1 Determinación de cenizas totales.
Se pesó 2g de la porción de ensayo pulverizado y tamizado en un crisol de porcelana previamente tarado.
Calentamos suavemente la porción de ensayo aumentando la temperatura hasta. carbonizar.
Incineramos en un horno mufla a una temperatura de 700 a 750 °C durante 2 horas.
Enfriamos el crisol en una desecadora.
Pesamos repitiéndose el proceso hasta que dos pesadas sucesivas no
difieran en más de 0,5 mg por g (masa constante). Obtenemos la masa constante en intervalos de 30 min.
Se procedió a determinar las cenias totales mediante la siguiente formula: 𝐶𝑇 = (𝑀2 – 𝑀/ 𝑀1 − 𝑀) 𝑥100
CT: porcentaje de cenizas totales en base hidratada. M: masa del crisol vacío (g).
2.3.2 Determinación de cenizas solubles en agua.
Se añadió de 15 a 20 ml de agua a las cenizas totales obtenidas.
Tapamos el crisol con un vidrio reloj y hervimos suavemente en la plancha térmica durante 5 minutos.
Filtramos la solución a través del papel de filtro libre de cenizas.
Transferimos el filtro con el residuo al crisol inicial, carbonizamos en mechero y luego incineramos en un horno mufla a 700 a 750 °C durante 2 horas.
Colocamos en una desecadora y pesamos cuando alcance la temperatura ambiente.
Repetimos el procedimiento hasta alcanzar el peso constante.
Se procedió a determinar las cenias totales mediante la siguiente formula: 𝐶𝑎 = (𝑀2 − 𝑀 /𝑀1 − 𝑀) 𝑥100
Ca: porcentaje de cenizas solubles en agua en base hidratada. M2: masa del crisol con las cenizas totales (g).
Ma: masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g). M1: Masa del crisol con muestra de ensayo (g).
M: Masa del crisol vacío.
2.3.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10% Se determinó a partir de las cenizas totales.
Se trató las mismas con ácido clorhídrico al 10% y se empleó una mufla a 700 a 5000°C durante 2 horas.
Los resultados se obtuvieron por la expresión siguiente: 𝐵 = (𝑀2 – 𝑀/ 𝑀1 – 𝑀) 𝑥100
M1: masa del crisol con la porción de ensayo (g). M2: masa del crisol con la ceniza (g).
2.3.4 Determinación de agua (humedad residual) Pesamos 2 g con desviación permisible de 0,5 mg.
Transferimos a una cápsula de porcelana previamente tarada y desecada a 105 °C hasta masa constante.
Desecamos a 105 °C durante 3h.
Colocamos la cápsula en la desecadora donde se dejó enfriar a
temperatura ambiente y se pesó.
Colocamos nuevamente en la estufa durante 1h, volviéndolo a pesar, hasta obtener una masa constante.
Expresión de los resultados: 𝐻𝑔 = (𝑀2 − 𝑀1/ 𝑀2 – 𝑀) 𝑥100
Hg: perdida en peso por desecación (%).
M2: masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g).
M1: masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g). M: masa de la cápsula vacía.
2.4. Análisis fitoquímico
Con el extracto hidroetanólico obtenido a partir de hojas de Vernonanthura patens se procedió a realizar el tamizaje fitoquímico en base a pruebas preliminares sencillas y rápidas que permitieron detectar cualitativamente la presencia de determinados grupos de compuestos mediante la formación de precipitados, coloraciones, etc.
24.1 Ensayo de Espuma (saponinas)
Se colocó 1 ml de extracto hidroetanólico en un tubo de ensayo y se
agitó la muestra fuertemente. Posterior a esto no se observó la formación de espuma en la superficie del líquido.
La presencia de saponinas no se encuentra en el extracto vegetal prueba (-)
2.4.2 Ensayo de Benedic (Fenoles)
En un tubo de ensayo se colocó 1 ml del extracto y se adicionó de 1 gota de FeCl3.
Se desarrolló una coloración rojo-vino, lo cual determinó la presencia de fenoles.
2.4.3 Ensayo de Shinoda (Flavonoides)
En un tubo de ensayo se colocó 1 ml del extracto, con la ayuda de una paleta se agregó una pequeña cantidad de limaduras de Mg y 3 gotas de HCl concentrado.
Se observó la aparición de coloración carmelita, dando positivo para la
presencia de flavonoides. (+)
2.4.4 Ensayo de Borntrager (Quinonas)
Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo y se colocó unas gotas de hidróxido de sodio al 5%.
Se agitó mezclando las fases y se dejó en reposo para posteriormente observa la reacción.
No se observó ninguna reacción de coloración, dando negativo para
2.4.5 Ensayo de Chalconas
En un tubo de ensayo se colocó 1ml de extracto y luego se añadió 1 ml
ácido sulfúrico.
Se observó la presencia de un color amarillo, dando la prueba (+) para Auronas.
2.4.6 Ensayo de Rosentaler (Terpenos)
En un tubo de ensayo se colocó 1ml de extracto y luego se añadió 1 gota de reactivo de Rosentaler y se calentó.
Se observó una colororación parda dando a la prueba (+) para terpenos.
2.4.7 Ensayo de Dragendorff (Alcaloides)
A la alícuota del extracto se añadió 1 gota de HCl concentrado; se calentó suavemente y se dejó enfriar hasta la acidez.
Luego a la solución ácida se añadió el reactivo de Dragendorff y se observa la reacción.
No se observó la presencia de precipitado dando un resultado negativo
para alcaloides (-).
2.5. Análisis microbiológico mediante método de difusión en disco (Kirby-Bauer)
Se procedió a preparar los medios de cultivo con agar Mueller Hinton para lo cual se pesó 7.6 g del medio con la finalidad de hacer varias repeticiones.
También se preparó medios con agar cerebro corazón para reactivar las cepas de Escherichia coli
Se reactivó las cepas de Escherichia coli en caldo cerebro corazón por 24 horas a 37°C para lo cual se procedió a sembrar la cepa en el medio mencionado a una concentración de 0.5 McFarland.
Una vez que se preparó los medios y se esterilizó los materiales a usar se procedió a plaquear los medios.
En la cámara de flujo laminar y con la ayuda de un hisopo estéril se
procede a sembrar la cepa de Escherichia coli sobre la superficie de agar Müller-Hinton: medio de cultivo microbiológico utilizado comúnmente para realizar la prueba de susceptibilidad a antibióticos. Una vez que el medio está seco se procedió a colocar con una pinza los
discos esterilizados del estándar, antibiótico y extractos. Luego con una micropipeta se impregnó 20 ul del extracto de Vernonanthura patens a diferentes concentraciones (25, 50, 75 y 100%) y se incubó a 37 °C por 24 horas.