1Universidad Politécnica del Estado de Morelos, Boulevard Cuauhnáhuac #566, Col. Lomas del Texcal, Jiutepec, Morelos. CP 62550. Tel: (044) 777 207 23 53, Correo electrónico: [email protected] 2Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria, INIFAP, Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla No. 8534, Col. Progreso C.P. 62550 Jiutepec, Morelos. 3Sitio Experimental “Las Margaritas”, INIFAP, km. 9.5, Carretera Hueytamalco–Tenampulco, C.P. 73580 Hueytamalco, Puebla, México.
Autor corresponsal: Reyes G.D.E. Tel.: (01) 777 319 28 60, Correo electrónico: [email protected] ANÁLISIS DE EXPRESIÓN RELATIVA DE CITOCINAS, FCER1A Y FACTORES DEL ESTRÉS A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA DE OVINOS PELIBUEY NATURALMENTE INFECTADOS POR
Haemonchus contortus
Maza L.J.*1, Reyes G.D.E.2, López A.M.E.2, Ramírez V.G.2, Pacheco A. M. J.1, Olazarán J.S.3, Aguilar M.L.2, Mendoza de G.P.2
RESUMEN
El uso constante de drogas genera problemas de resistencia antihelmíntica por los nematodos gastrointestinales (NGI), por esta razón se buscan nuevas alternativas de control basadas en el estudio de genes asociados a la respuesta inmunológica. En la presente investigación, 15 corderos Pelibuey descendientes de padres con fenotipo de resistencia a NGI, fueron expuestos a H. contortus en condiciones de pastoreo durante 13 semanas en trópico y tres animales controles libres de NGI se mantuvieron en corrales de piso de cemento. Se determinó el número de huevos por gramo (HPG) de heces y el porcentaje de volumen celular aglomerado (%VCA). Se obtuvieron muestras de RNA total a partir de sangre periférica a la semana ocho post-infección de los ovinos. El análisis de la expresión de los genes IL4, IL5, IL6, IL8, IL13, TGFB1, FCER1A, SOD1 y PRDX6 se realizó mediante retro-transcripción acoplada a PCR en tiempo real (RT-qPCR) con respecto a los genes constitutivos gapdh y β-actina y grupo control. Los corderos mostraron fenotipo de resistencia con una media de HPG de 269±433.1 y %VCA de 28±3.14. Por otro lado, se observó sobre-regulación del gen FCER1A (p<0.05); comportamiento endógeno de los genes IL5, IL13, SOD1, TGFB1 y PRDX6 (p>0.05) y los genes IL4, IL6 e IL8 muestran sub-expresión (p<0.05). En conclusión, los resultados indican la regulación de la hemoncosis, sobresaliendo la expresión del gen FCER1A, asociada a la disminución de HPG y a la conservación de los valores normales del %VCA.
INTRODUCCIÓN
Los rumiantes en pastoreo están constantemente expuestos a las infecciones por NGI, destacando entre ellos al nematodo parásito de mayor prevalencia en clima tropical,
Haemonchus contortus, que genera fuertes pérdidas económicas en el sector ganadero
[1]. Las principales acciones patógenas de H contortus son debido a su hábito hematófago en el tejido abomasal de ovinos, provocando anemia, falta de apetito, debilidad muscular, diarrea e incluso la muerte de los animales [2]. Sin embargo, actualmente el único y principal método de control comercial contra los NGI es el uso periódico de antihelmínticos; no obstante, la generación de resistencia antihelmíntica y la preocupación por la permanencia de estos químicos en el ambiente genera la búsqueda de nuevas alternativas de control integral que permitan un uso más estratégico de los antihelmínticos y cuidado de la salud. La vacunación y las estrategias de mejoramiento genético podrían surgir como nuevas herramientas, considerando los aspectos
relacionados a la respuesta inmunológica para contrarrestar el daño causado por este tipo de infecciones [3]. Durante la patogenia por NGI como primera línea de defensa, se ha observado la regulación de genes de enzimas antioxidantes asociada a la respuesta por estrés oxidativo y por la presencia de especies reactivas de oxígeno (ERO), producidas por células del sistema inmune [4]. Asimismo, se ha observado la regulación de diversos componentes de la respuesta inmune humoral y celular, como citocinas tipo Th1 (IL2 e
IL8) y Th2 (IL4, IL5, IL6, IL10 e IL13) por la proliferación de eosinófilos, linfocitos,
neutrófilos, mastocitos y la producción de anticuerpos que permiten el reconocimiento de antígenos derivados de los NGI [5]. Por lo que, en el presente trabajo se evaluó la expresión relativa de genes de la respuesta inmune periférica por H. contortus en corderos Pelibuey bajo condiciones de pastoreo en una región tropical.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron corderos Pelibuey de tres a cinco meses de edad, tres corderos fueron aislados en un corral de piso y con alimento comercial para mantenerlos libres de la infección a H contortus en el CENID-PAVET, INIFAP como grupo control, y 15 corderos fueron seleccionados de padres con características de tolerancia a NGI [6]. Los corderos fueron expuestos a la infección natural con H contortus en pastoreo durante 13 semanas en la región tropical de Hueytamalco, Puebla, en el Sitio Experimental “Las Margaritas”. El %VCA por la técnica de microhematocrito [7] y HPG por la técnica de McMaster [8], fueron determinados cada semana durante la infección para la discriminación de ovinos resistentes y susceptibles a la hemoncosis con base a los parámetros fenotípicos citados por González et al., 2008 [6].
Muestras individuales de RNA total fueron extraídas de sangre en la semana 8 post-infección de los ovinos utilizando un kit comercial (Qiagen/BD Company, Germany). La concentración fue estimada basándose en la medición espectrofotométrica a 260 nm y la pureza se evaluó en una relación de 260/280 nm en un NanoDrop-1000 (Thermo Scientific). Posteriormente, se realizó la descontaminación de trazas de DNA genómico utilizando el kit comercial RQ1 RNase-Free DNase® (Promega, Madison, USA), la síntesis de cDNA se preparó mediante el kit RT2 First Strand Kit® (Qiagen Sciences, USA). Se llevaron a cabo ensayos de qPCR con SYBER® Green qPCR Mastermix® (Qiagen, Sciences, Maryland), utilizando un arreglo de genes diseñado por una casa comercial (SABiosciences Corporation®, Qiagen, Germany) con cebadores sintetizados basados en secuencias nucleotídicas reportadas en el GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/). La evaluación
de los genes de seis citocinas (IL4, IL5, IL6, IL8, IL13 y TGFB1), dos factores de estrés (SOD1 y PRDX6) y un receptor de IgE (FCER1A) con respecto a los genes de referencia
gapdh y β-actina, se realizó mediante el qPCR con las condiciones siguientes:
desnaturalización inicial a 95°C durante 10 min, seguido de un ciclado de 45 repeticiones que consta de una desnaturalización a 95°C durante 15 seg, y un alineamiento-extensión a 60°C por 45 segundos, finalizando con una rampa de disociación (melting) de 65 a 95°C.
El análisis de características fenotípicas %VCA y HPG se realizó mediante el método de Duncan, con un nivel de significancia de p0.05, utilizando el software estadístico SAS 8. El análisis de la expresión relativa a través de qPCR fue realizado con el software bioinformático RT2 Profiler PCR Array Data Analysis v3 SABiosciences®
(http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php) usando los valores resultantes de Threshold cycle (CT) de los genes en estudio de cada anillo con respecto a los animales control y a los genes constitutivos, y mediante la normalización llevada a cabo por el mismo software utilizando el método de la ΔΔCT.
RESULTADOS
La presencia e identificación de huevos y larvas de H. contortus se realizó a partir del 5 de mayo al 28 de agosto de 2014, en donde, no se observaron diferencias estadísticas entre las semanas (p>0.05) para él %VCA y el HPG. Tomando en cuenta el criterio de selección antes mencionado, los corderos en experimentación se eligieron con fenotipo resistente donde su promedio de HPG es de 269±433.1 de H. contortus y el %VCA de 28±3.14.
La extracción de RNA se llevó a cabo a partir de muestras de sangre de los corderos en estudio y de los animales controles, estimando una concentración promedio de 90 ng/μL y una pureza de RNA dentro del rango establecido de 1.8 a 2.0. Los resultados del presente estudio, indican que los corderos Pelibuey con fenotipo de resistencia mostraron una sub-expresión en los genes IL4, IL6 y IL8; en donde la IL4 se sub-reguló 0.37 veces,
IL6 0.34 veces, y la IL8 0.059 (p<0.05) veces menos con respecto a los genes
constitutivos y el grupo control. Asimismo, se puede observar el comportamiento de una regulación normal de expresión de los genes IL5, IL13, SOD1, TGFB1 y PRDX6; en donde el IL5 se reguló 0.904 veces, IL13 1.036 veces, SOD1 1.497, TGFB1 0.780, y PRDX6 1 (p>0.05) veces más que los genes de referencia y el grupo control. En contraste, se observó una sobrexpresión del gen de FCER1A con 3.38 (p<0.05) veces más en comparación con el grupo control y con los genes constitutivos gapdh y β-actina.
DISCUSIÓN
En el presente estudio, se observó una variante expresión de diferentes genes asociados a las infecciones por NGI. Sin embargo, es necesario realizar estudios que proporcionen información acerca de la interacción parásito-hospedero en infecciones de NGI en un sistema de pastoreo. En este trabajo, se mostró la subregulación de la expresión de los genes de la IL8 y la IL6, lo que podría indicar una regulación de la inflamación, además de que son citocinas principalmente expresadas en células endoteliales activadas en el sitio de la infección, durante el daño tisular provocado por NGI [9]. Similares resultados han observado la sub-regulación de estas interleucinas debido a infecciones por NGI [10]. La expresión de los genes IL4 e IL13 ha sido estudiada ampliamente debido a su consistente sobre-expresión asociada a la resistencia de ovinos contra NGI [11]. En contraste, en este estudio se observó sub-expresión del gen IL4, una expresión normalizada de la IL13 y de las enzimas antioxidantes PRDX6 y SOD1. En un estudio previo, el incremento de la expresión de estos genes se observó durante los primeros días de infección de NGI [12], diferente a los resultados observados en el presente trabajo, dónde la subexpresión fue a las 8 semanas post-infección. Posiblemente esta sub-regulación es resultado de la tolerancia de los individuos en estudio infectados con H.
contortus, Por otro lado, la expresión de la IL5 está directamente asociada a expresión de
la IgE durante la infección con NGI, por lo que en el presente trabajo, se mostró la sobrexpresión de la IgE (FCER1A), coincidiendo con el aumento de la expresión de
debido a que su sobrexpresión está fuertemente relacionada a infecciones por NGI [10]. Sin embargo, para la presente investigación, la expresión de TGFB1 mostró un comportamiento endógeno similar a los genes constitutivos, gapdh y β-actina.
CONCLUSIÓN
Los corderos Pelibuey con fenotipo de resistencia a la infección por H. contortus en campo no mostraron signos de riesgo para la salud de los animales, por lo que se vio reflejada en la variante expresión de los genes, destacando al receptor de la IgE (FCER1A), obteniendo así, resultados que nos podrían ayudar a la implementación de diferentes métodos de control como lo son las vacunas y estrategias en los programas de mejoramiento genético. Sin embargo, es preciso evaluar otros genes asociados a la respuesta inmune dada por NGI para encontrar posibles marcadores de DNA, como lo podría ser el receptor de IgE (FCER1A) debido a su sobre-expresión mostrada en este estudio.
LITERATURA CITADA
1. López, A. M. E. 2012. Diagnóstico: resistencia antihelmíntica en nematodos parásitos de rumiantes, Fomix: Viento en popa, proyectos en marcha Centro Nacional de Investigación en Parasitología Veterinaria, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias INIFAP. Morelos, México .40-42. 2. Kelkele, F. A., Tolossa, Y. H., Kassa, G. M. 2012. Experimental infection of
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