Hada C. Macher Manzano
FEA del Servicio de Bioquímica Clínica del
Hospital Universitario Virgen del Rocío de
Sevilla
El ADN circulante es el que encontramos en plasma o suero, no unido a células, circulando por el
torrente sanguíneo (cantidades muy bajas en individuos sanos)
Se describe la existencia de ADN circulante por primera vez en 1948 (Mandel y Metais).
Tanto el ADN como el ARN circulan libres de células en el torrente sanguíneo y son resistentes a las
ADNasas y ARNasas endógenas.
ADN estable en suero y plasma a 4ºC durante 24 h; más de un año si el plasma o suero es separado y congelado
ARN estable en plasma a 4ºC durante 6 h (más estables los microRNAs circulantes).
• Presente en diversos compartimentos extracelulares
(sangre, saliva, orina, sudor, liquido amniotico y fluido cerebroespinal)
• Secuencias circulantes espejo del genoma del individuo
libre de partículas
• ADN
asociado a partículas
• Posibles fuentes del ADN extracelular
Necrosis célular y de tejidos Liberación mediante apoptosis Liberación celular de exosomas Rotura de células sanguíneas Bacterias y virus
Transposones y retro-transposones Liberación espontánea de virtosomas
Liberación espontanea de un complejo de ADN/RNA lipoproteína sintetizado de novo
La fracción protéica incluye ADN y ARN polimerasas dependientes de ADN
Entra fácilmente en otras células, donde es capaz de modificar biológicamente a las células receptoras (alteraciones inmunológicas y transformación de células normales a células cancerosas).
Tanto ADN como ARN están presentes en este complejo
La liberación no causa perjuicio alguno para la célula
La fracción lipoprotéica es recién
sintetizada por la célula y no deriva de lipoproteínas de membrana
MATERNO POR DENNIS LO
DESCUBRIMIENTO DEL ADN FETAL CIRCULANTE EN EL PLASMA
MATERNO POR DENNIS LO
EN 1997 SE PRODUCE UN HITO EN EL USO DEL ADN CIRCULANTE, ES EL
COMIENZO DE LA UTILIZACIÓN DEL ADN FETAL EN EL DIAGNOSTICO
PRENATAL NO INVASIVO (Dennis Lo y cols, The Lancet, Vol 350, issue
9076; 16 August 1997,pp:485-487)
PLASMA MATERNO
•El ADN fetal que circula en el suero materno mide entre 100 y
300 pb. (En la gestante normalmente hay cadenas mayores de
500 pb y que llegan hasta 24 Kb de longitud).
•El ADN fetal constituye entre el 2,5-14% del ADN circulante
materno según la edad gestacional.
•El ADN fetal se elimina de la sangre materna en su mayoría 1h
tras el parto y como máximo a las 48h.
•Es detectable con técnicas de amplificación del ADN desde la
sexta semana de gestación.
•El ARN fetal también ha demostrado su estabilidad en el
plasma materno.
UTILIDAD DEL ADN CIRCULANTE EN EL DIAGNÓSTICO
PRENATAL
Representación de las posibilidades de herencia fetal de un
gen
heterocigoto
en
el
padre.
Las
cadenas
rojas
representan el ADN de herencia paterna, las cadenas
verdes el de herencia materna y la estrella es la diana de
estudio genético (Lo y cols 2007)
NIPD ANTES DEL 2010
Determinación Secuencia detectada Método de detección
Sexo fetal (determinación y aplicación a desordenes gestacionales)
SRY, DYS14, DYS1, DYZ1, DYZ3, DAZ, ZFY.
PCR (convencional, anidada, a tiempo real)
Grupos sanguíneos RHD, RHC, RHc, RHE, Kell. PCR (convencional, anidada, a tiempo real)
Desordenes de un sólo gen HD, FGFR3, DMPK, CFTR, globina, CYP21, MEN2A.
PCR (convencional, anidada, a tiempo rea, HRM, Cold HRM), Espectrometría de masas tras PCR .
Aneuploidias (trisomías 13, 18, 21)
SNPs, maspin, PLAC4 RNA, Cromosoma 21 locus.
PCR (a tiempo real, sensible a metilaciones y/o espectrometría de masas, PCR Digital)
Marcadores fetales universales
Fetal RNA (PLAC4, GCM1, ZDHHC1, PAPPA, PSG9, PLAC1, TFP12, KISS1) RASSF1A, maspin. STRs, polimorfismos inserción/delección bialélica , SNPs.
RT–PCR; microarray. Conversión con bisulfito o PCR sensible a metilaciones con espectrometría de masas, PCR convencional, anidada)
Marcadores Universales de ADN (Materno junto con fetal)
GAPDH, CCR5, globina, actina, b-gonadotrofina coriónica, albumina, ATL1.
PCR (convencional, anidada)
APLICACIONES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS CIRCULANTES EN
NIPD: EVOLUCION HACIA LA SECUENCIACION MASIVA Y LA PCR
DIGITAL INSTAURANDOSE SU USO DESDE 2011
XXIII Reunión Científica SANAC Almería
NIPD: EVOLUCION HACIA LA SECUENCIACION MASIVA Y LA PCR
DIGITAL INSTAURANDOSE SU USO DESDE 2011
APLICACIONES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS CIRCULANTES EN
NIPD: EVOLUCION HACIA LA SECUENCIACION MASIVA Y LA PCR
DIGITAL INSTAURANDOSE SU USO DESDE 2011
XXIII Reunión Científica SANAC Almería
NIPD: EVOLUCION HACIA LA SECUENCIACION MASIVA Y LA PCR
DIGITAL INSTAURANDOSE SU USO DESDE 2011
En secuenciación masiva se amplifican masivamente fragmentos de
ADN de forma dirigida, o no, y posteriormente el análisis
informático agrupa los amplicones en base a un “Blast” con el ADN
conocido y detecta SNPs diferenciales entre la madre y el feto.
El diagnostico de aneuploidías se considera una prueba de cribado por la existencia de falsos positivos descritos al existir una fracción de ADN fetal menor del 4% en la circulación materna
* Cuando la gestante padece obesidad.
(Ultrasound Obstet Gynecol 2013; 41: 26–32. G. ASHOOR et al)
* Cuando la fertilización ha sido in vitro.
La existencia de mosaicismos en la placenta también puede llevar a confusión Las gestaciones gemelares o múltiples tienen menor sensibilidad de detección de aneuploidías
Se han descrito falsos positivos en los que la madre era la portadora de una anomalía cromosómica que desconocía
•El NIPT ofrece una alta sensibilidad para el estudio de las aneuploidias 21,18 y 13, existiendo no obstante, falsos positivos por lo que recomiendan se oferte amniocentesis en estos casos. No recomiendan aún otras alteraciones ofertadas en NIPT por distintas compañías de NGS.
•La gestante debe ser informada de las posibilidades y limitaciones del test, así como tener derecho a no saber más de lo que concierne a las aneuploidías 21, 18 y 13 aunque el test dilucide otras posibilidades.
•Hay que diferenciar el tipo de información que se debe dar a la gestante que se hace el cribado convencional y a la que se le oferta el NIPT, los profesionales deben estar formados para el consejo genético.
•Reconocen la utilidad de estas técnicas en la práctica clínica pero no creen deba sustituir al cribado clásico, de momento lo enfocan como contingencia de los casos de riesgo intermedio en el clásico.
Hasta el año 2015 se criticaba que los datos de eficiencia de las diferentes plataformas de NGS estaban sesgados porque solo se analizaba población en riesgo, actualmente esto se ha solventado con estudios en población normal
Ya proponen el NIPT como primera línea de cribado de aneuploidias cromosómicas sustituyendo al clásico Se identificarían un 15% más de aneuploidias Reduciría un 88% de técnicas invasivas
Valorando los gastos debidos a la imprecisión del cribado clásico y la mayor precisión del NIPT el resultado es que se ahorra suprimiendo el cribado clásico.
• Diagnostico
del
RHD
fetal
en
plasma
materno desde la semana 10 de gestación
para todas las gestantes RhD negativas
• Diagnóstico del sexo fetal desde la semana
6 de gestación para toda gestante con
síndrome
Adreno-genital
y
posibles
herencias ligadas al cromosoma X.
• Diagnostico de la mutaciones puntuales
heredadas del padre en casos concretos
(MEN2A, HPA1A)
RESULTADOS DETERMINACIÓN RHD FETAL
En el Protocolo de Consenso entre Hematólogos y Ginecólogos para el diagnóstico y prevención de la enfermedad hemolítica del feto , esta prueba figura en primer lugar para valorar lacompatibilidad en la gestante RhD negativa. Siendo una técnica rutinaria de
diagnóstico en numerosos países desde el año 2000 hasta el presente, en el HUVR está en cartera de servicios desde el 2010 para todas las gestantes RhD negativas
PCR
PCR
PCR
PCR Multiplex
Multiplex
Multiplex
Multiplex del
del
del
del gen
gen SRY
gen
gen
SRY
SRY
SRY y
y
y
y de
de
de
de exones
exones 5
exones
exones
5
5
5 y
y
y
y 7
7
7 del
7
del gen
del
del
gen
gen
gen RHD
RHD
RHD
RHD con
con
con
con
ADN
ADN
ADN
ADN del
del
del
del plasma
plasma
plasma o
plasma
o
o suero
o
suero
suero materno
suero
materno desde
materno
materno
desde
desde semana
desde
semana
semana 10
semana
10 de
10
10
de
de gestación
de
gestación
gestación
gestación
Negativo para el RHD y Negativo para el RHD y Negativo para el RHD y Negativo para el RHD y positivo para el SRY positivo para el SRY positivo para el SRY positivo para el SRY
Feto varón RHD Feto varón RHD Feto varón RHD Feto varón
RHD----Todos los genes positivos Todos los genes positivos Todos los genes positivos Todos los genes positivos
Feto varon RHD+ Feto varon RHD+ Feto varon RHD+ Feto varon RHD+
Todos los genes Todos los genes Todos los genes Todos los genes negativos negativos negativos negativos Posible hembra RHD Posible hembra RHD Posible hembra RHD Posible hembra
RHD----Positivo para RHD y negativo Positivo para RHD y negativo Positivo para RHD y negativo Positivo para RHD y negativo para el SRY
para el SRYpara el SRY para el SRY
Hembra RHD+ Hembra RHD+Hembra RHD+ Hembra RHD+
Los duplicados no concuerdan : Los duplicados no concuerdan : Los duplicados no concuerdan : Los duplicados no concuerdan :
no cocluyente no cocluyente no cocluyente no cocluyente
Repetición de estudio del Repetición de estudio del Repetición de estudio del Repetición de estudio del RHD junto a la beta
RHD junto a la betaRHD junto a la beta
RHD junto a la beta----globinaglobinaglobinaglobina
En esta población las gestantes RhD negativas que
portan niño negativo para el antígeno D suponen el
38.7%. Dado que en esta ocasión determinamos doce
falsos positivos, han sido un 38,4% de las gestantes las
que se han ahorrado la inmunoprofilaxis
RESULTADOS DETERMINACIÓN SEXO FETAL
La técnica no alcanza el 100% de sensibilidad y en
el consejo genético se le ofrece a las pacientes la
posibilidad de la amniocentesis antes de tomar
decisiones a razón del sexo fetal
•
Hoy en día el RHD y sexo fetales se pueden realizar en cualquier laboratorio que disponga de PCR a tiempo real, existiendo la posibilidad de automatización del proceso• Las técnicas para la detección de mutaciones puntuales son altamente fiables si se dispone de PCR digital, aunque se
pueden abordar con COLD PCR HRM
• La secuenciación masiva actualmente es una tecnología fiable para la detección de trisomías 21 y 18, así como bastante
sensible para la detección de aneuploidías del cromosoma 13 y los cromosomas sexuales
• No obstante existen falsos positivos en el NIPT, por lo que se recomienda ofertar amniocentesis confirmatoria en casos de resultados positivos de aneuploidias por NIPT
•El NIPT demuestra ser costo-efectivo y sería importante plantearlo desde la sanidad pública
•Se recomienda ofertar el NIPT en el contexto del consejo genético
METODOS UTILIZADOS PARA EL NIPD DE MUTACIÓN PUNTUAL
CON HERENCIA AUTOSOMICA DOMINANTE DEL PADRE (MEN2A)
PARA LA REALIZACIÓN DE LA HRM SE USAN AGENTES INTERCALANTES DE ADN DE TERCERA GENERACIÓN QUE PERMITEN DIFERENCIAR UNA SOLA BASE NITROGENADA CAMBIADA RESPECTO AL CONTROL SANO CON DIFERENTE TEMPERATURA MELTING
Se determina la mutación C634Y por ser la mayoritaria en nuestra población con un amplicón de 135 pb.
La HRM es tan fiable como la secuenciación para esta mutación en heterocigosis (100% de sensibilidad y especificidad para amplicones con menos de 400 pb)
A
B
Analisis de la HRM por el software del LC 480 para 23 pacientes con Sdr. MEN2A frente a 10 controles sanos (rojos) tras ser normalizadas las curvas de fusión de la melting (A) y realizarse la derivada diferencial de la fluorescencia mediante la substracción del perfil control (difference plot) (B). El análisis por HRM muestra la una clara diferencia en la pendiente de la curva meltig de los controles sanos frente a todos los pacientes con la mutación C634Y.
METODOS
LA FAST COLD PCR SEGUIDA DE HRM SE REALIZA AÑADIENDO 20 CICLOS TRAS LOS 45
DE LA PCR PARA LA HRM UTILIZADA EN DIAGNOSTICO SEROLÓGICO, PERO LOS 20 CICLOS ADICIONALES TIENEN COMO TEMPERATURA DE DESNATURALIZACIÓN 91ºC, QUE ES LA TM PARA NUESTRO AMPLICON FAVORECIENDO LA AMPLIFICACIÓN DEL PRODUCTO MUTADO
METODOS UTILIZADOS PARA EL NIPD DE MUTACIÓN PUNTUAL
CON HERENCIA AUTOSOMICA DOMINANTE DEL PADRE (MEN2A)
COLD PCR de fetos con MEN2A es eficiente
Este resultado ofrece la posibilidad de abordar el diagnóstico prenatal no invasivo, para una gestante sana que queda embarazada de un varón portador de la mutación, dado que esta enfermedad es de herencia autosómica dominante, el 50% de los hijos son susceptibles de heredar la enfermedad.
Conventional HRM COLD-PCR 50% 25% 10% 5% 2,5% 50%, 25%, 20%, 10% 5% 2,5% Pregnant Pregnant
Diagnostico prenatal no invasivo por High Resolution Melting (HRM)
COLD PCR de fetos con MEN2A secuenciacion de resultados
Secuenciación de los productos de la COLD PCR de un control positivo con MEN2A para la mutación C634Y (A), un control negativo sano (B), y de la gestante que posee el feto con la mutación C634Y heredada del padre (C).
