1. INTRODUCCIÓN
Se define ADN circulante como el ADN que encontramos en plasma o suero, no unido a células, circulando por el torrente sanguíneo. Este puede provenir de la necrosis o apoptosis celular, así como de ADN sintetizado de novo y espontáneamente liberado, pudiendo entrar en otras células, donde podría modificar biológicamente a las células receptoras. De esta forma se está considerando como una vía de transmisión de la información genética de manera horizontal.
El descubrimiento de ácidos nucleicos circulantes libres, no unidos a células, en el plasma o suero (CNAPS) humano fue descrito por primera vez por Mandel y Metais en 1948. Sin embargo, la importancia de estos hallazgos no fue muy reconocida inicialmente y tuvieron que pasar 13 años hasta que de nuevo se describiera la existencia de ácidos nucleicos circulantes en suero. En torno a los años 60, Anker y Stroun realizaron una serie de experimentos con injertos en plantas de distinta variedad dentro de una misma especie de berenjenas (Solanum melangena). De este modo, realizaron un injerto de una planta con frutos alargados de color púrpura, en las ramas de una planta con fruto redondo blanco. Tras tres generaciones de injertos, sin polinización desde el injerto a la planta base, observaron características hereditarias adquiridas en la planta receptora. Es decir, aparecían frutos redondos blancos con manchas púrpura y frutos alargados de color púrpura. Estos resultados sugerían de forma clara que la información genética se había trasmitido desde el injerto a la planta base. Así, Anker y Stroun postulan que el ADN portador de información genética puede circular y entrar en las células somáticas y reproductivas en un momento propicio y permanecer activo (1). En 1975 estos mismos autores demostraron la secreción activa de ácidos nucleicos por células vivas en cultivo, y posteriormente, incluso la existencia de una liberación espontánea de ARN por células vivas (1).
Fue en 1977 cuando se demostró su aplicación potencial en el diagnóstico y pronóstico del cáncer, al encontrarse que existían altos niveles de ADN circulante en el suero de los pacientes diagnosticados
DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO
Macher Manzano, Hada; Rubio Calvo, Amalia; Trujillo Arribas, Elena; Ferro Conde, Marta Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla.
radioterapia (2). Desde entonces hasta la fecha se ha avanzado en el conocimiento de la naturaleza del ADN circulante, así como su utilidad como posible herramienta diagnóstica. En 1989 se demostró que el ADN que circula en los pacientes con cáncer tenía las características específicas del tejido canceroso (2), detectándose en el ADN libre en plasma o suero, las mutaciones oncogénicas características de diversos tipos de cáncer y disparándose por tanto los estudios utilizando ácidos nucleicos circulantes (tanto ADN como ARN), para diagnóstico, pronóstico y monitorización de tratamientos en pacientes con cáncer.
Paralelamente se abre una importante línea de aplicación en el diagnóstico prenatal no invasivo para el feto. Esto fue posible a partir de 1997 tras el éxito obtenido en la detección de secuencias de ADN pertenecientes al cromosoma Y en el plasma y suero de gestantes con feto varón (3).
Desde el año 2000 y hasta la fecha ha existido y persiste una explosión de aplicaciones de los CNAPS como herramienta diagnóstica, pronóstica y de monitorización de pacientes bajo una gran variedad de diferentes situaciones clínicas (pacientes críticos tras traumatismos, sepsis, quemados, accidente vascular, etc) (4). En la tabla 1 se muestran algunos de los hitos más importantes en la investigación de las aplicaciones diagnósticas del ADN circulante. Tanto en estudios cuantitativos como en cualitativos en diferentes situaciones clínicas proporcionan una herramienta no invasiva que permitiría un mejor manejo de los pacientes. El ADN es estable en plasma a 4ºC durante 24 h y más de un año si el plasma o suero es separado y congelado.
Tabla 1 Algunos de los logros más importantes en la utilización de los CNAPS como herramienta de utilidad clínica.
Año Resultados
1948 Descubrimiento de ADN libre en la sangre
1975 Aspectos metodológicos de detección en plasma de controles y secreción de ADN en sobrenadante de cultivos
1977 Detección de altos niveles de ADN circulante en pacientes con cáncer dependiente de estadío tumoral y respuesta al tratamiento
1978 Existencia de una liberación espontánea de ARN por células vivas
1989 Evidencia de la existencia en el ADN circulante de las características del tejido canceroso
1997 Detección de ADN fetal libre en el plasma de la gestante
2000-2010 Aplicaciones de los CNAPS en el diagnóstico y pronóstico de numerosas enfermedades (Cáncer, Trauma, IAM, ACV, Trasplante, etc,…)
2010 Hipótesis de la genometástasis, el ADN como inductor de cáncer
2011 Aplicación de la secuenciación masiva en el diagnostico no invasivo de las aneuploidías cromosómicas fetales
2. CARACTERÍSTICAS DEL ADN CIRCULANTE
El ADN circulante está presente en diversos compartimentos extracelulares como la sangre, la saliva, la orina, el líquido cefalorraquídeo y lo podemos encontrar circulando de forma extracelular tanto libre como asociado a partículas. Así podemos definir el ADN libre no encapsulado en partículas, comúnmente denominado free-DNA, que es aquel que no se encuentra unido a ninguna estructura, siendo este ADN más lábil y en ocasiones transportado por proteínas plasmáticas que se han denominado argonautas. Por otro lado hablamos del ADN o ARN derivado de partículas que es aquel que puede estar asociado a partículas como micropartículas, cuerpos apoptóticos, exosomas y virtosomas (5). En la figura 1 se esquematiza como se encuentran circulando los CNAPS.
Figura 1. Clasificación de los CNAPS según se encuentre unidos o no a partículas
Se han postulado diversas posibles fuentes de los CNAPS incluyendo la rotura de células sanguíneas, necrosis de células y tejidos, la liberación mediante apoptosis, la liberación celular de los exosomas, material genético procedente de bacterias y virus y por último la liberación espontánea de un complejo de ADN/RNA lipoproteína sintetizado de novo por células vivas denominado virtosoma.
2.1. Micropartículas y cuerpos apoptóticos
Durante la apoptosis, antes de la formación de los cuerpos apoptóticos, las células liberan cierto número de micropartículas. Más adelante en el proceso de apoptosis, cuando los contenidos celulares están completamente fragmentados, se dispersan tanto en forma de micropartículas o de cuerpos apoptóticos, siendo estos últimos los que contienen la mayor parte
CNAPS
ADN libre ADN asociado a partículas
MICROPARTÍCULAS CUERPOS
APOPTÓTICOS EXOSOMAS VIRTOSOMAS
del ADN degradado durante el proceso de apoptosis. El ADN y el ARN ribosomal se puede encontrar fragmentado dentro de estas partículas debido a rotura nucleolítica (6)
2.2. Exosomas
Los exosomas provienen de endosomas tardíos que van aumentado de vesículas intraluminales procedentes de la invaginación de la membrana. Cuando los endosomas se llenan de estas vesículas, se les llama endosomas multivesiculares. Los exosomas corresponden a estas vesículas intraluminales, que se transforman en lo que denominamos exosomas que contienen principalmente proteínas, ARNm y miARN. Los exosomas o bien, se funden con lisosomas y son degradados, o son secretados al exterior de la célula siendo capaces de realizar una serie de funciones claramente asociadas con la comunicación intercelular. Los exosomas pueden recorrer largas distancias en la circulación encontrándose también en los fluidos corporales como la orina y líquido cefalorraquídeo (7). Recientemente se ha descrito que estas partículas pueden también contener ADN. La señalización mediada por el exosoma se consigue mediante la fusión con otras células, liberando su contenido en la célula receptora (8). Hay que considerar que la cantidad de ADN existente en circulación formando parte de los exosomas es insignificante en relación con los niveles de ADN debidos a los procesos de apoptosis y necrosis.
2.3. Virtosomas
La liberación espontanea de un complejo formado por ADN, ARN y lipoproteínas que es sintetizado de novo por células vivas ha recibido la nueva denominación de virtosoma. Esta partícula puede liberarse tanto de células en división como de células ya diferenciadas, por lo que no parece que esté asociado a la síntesis mitótica de ADN celular. La fracción protéica de estos virtosomas incluye además polimerasas de ADN y ARN (9).
La liberación de los virtosomas ocurre de una manera controlada. Así parece que se alcanza cierto equilibrio cuando una cierta concentración del complejo está presente en el medio de cultivo y no se produce una mayor liberación a menos que haya una reducción de la concentración externa del complejo. Este complejo puede entrar fácilmente en otras células tanto in vitro como in vivo, donde, en algunos casos, es capaz de modificar biológicamente a las células receptoras, incluyendo alteraciones inmunológicas y la transformación de células normales a células cancerosas. El mecanismo de captación requiere que el complejo puede pasar al interior celular y evitar la digestión por el sistema lisosomal.
Aunque algunas características parecen ser compartidos entre este complejo y ciertos virus o los exosomas, hay otras características que hacen del virtosoma una entidad independiente, como son:
Tanto el ADN como el ARN están presentes a la vez en este complejo, mientras que sólo una de estas moléculas está presente en virus o exosomas;
La liberación de los virtosomas no causa perjuicio alguno para la célula que lo libera, a diferencia de lo que ocurre por ejemplo con la eclosión vírica;
La fracción lipoprotéica es recién sintetizada por la célula y no deriva de lipoproteínas de membrana en contraste con lo que ocurre con los exosomas y algunos virus que utilizan fracciones de membrana plasmática.
3. UTILIDAD DEL ADN CIRCULANTE EN EL DIAGNÓSTICO PRENATAL
El descubrimiento de CNAPS procedentes del feto (fCNAPS) circulando en el plasma materno, ha permitido el desarrollo de técnicas de diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD) teniendo como objetivo en un futuro cada vez más cercano sustituir por completo a las pruebas diagnósticas en líquido amniótico. No obstante, las técnicas de secuenciación masiva para la detección de aneuploidias fetales en el suero materno aun no alcanzan la especificidad suficiente para ser consideradas diagnósticas y los casos considerados positivos deben ser confirmados en líquido amniótico, acunandose en esta situacion el concepto de NIPT (“non invasive prenatal test”) (3).
Se ha demostrado la existencia tanto de ADN como ARN fetal en la circulación materna y se han descrito sus características específicas. Así el ADN y ARN fetal están constituidos por fragmentos cortos, en su mayoría menores de 150 pares de bases, se postula que su origen es apoptótico de células fetales o bien de la placenta, dado que existe una relación directa entre la cantidad de ADN fetal circulante y un mayor recambio celular en la placenta. Esta característica hace que su cuantificación resulte ser de utilidad para clasificar el estado de gravedad en la preeclampsia (10). Paralelamente se ha demostrado que secuencias de ADN y de ARN fetales son exportadas mediante exosomas o virtosomas con capacidad de actuar como mensajeros intercelulares (9).
Los fCNAPS ya son indetectables en el plasma materno a las 48 horas tras el parto, siendo eliminados en su mayoría en las 2 primeras horas postparto (11), por lo que no se podría detectar ADN de un embarazo anterior. Esto hace posible amplificar genes en el plasma de la gestante que si están ausentes en la madre, inequívocamente pertenecen al feto.
3.1. Técnicas aplicadas en el manejo del ADN circulante fetal en el NIPD/NIPT
El ADN circulante de origen fetal representa un porcentaje reducido del ADN total en el plasma materno, que puede ser detectado mediante PCR a partir del día 18 de gestación (3).
Aunque los primeros estudios cuantitativos del ADN fetal mediante PCR sugerían que este representaba un porcentaje del 3.6% respecto al materno, mediante nuevas técnicas de cuantificación más precisas como la secuenciación masiva se ha podido detectar que el ADN procedente del feto puede ser hasta el 10% en etapas tempranas del embarazo (12). El ADN fetal está representado de manera completa en el plasma materno y las concentraciones absolutas del mismo parecen aumentar de manera paralela a la edad gestacional (13). El hecho de que los fCNAPS estén presentes sólo como componentes minoritarios dentro del conjunto de los CNAPS ha supuesto un importante obstáculo técnico en el desarrollo del NIPD (figura 2).
Figura 2. Dilución de los fCNAPS en el conjunto de los CNAPS maternos. Adaptado de Lo YMD and Chiu RWK. Nature Reviews Genetics 2007;8:71
Se han descrito diferentes estudios en los que se ha tratado de enriquecer el componente fetal, basados en la diferencia de tamaño del mismo, las diferentes propiedades de unión a los nucleosomas o el diferente grado de metilación (14, 15), aunque ninguna ha podido instaurarse actualmente en la práctica clínica. Cuando se detecta la presencia de un único gen procedente del feto la realización de una RT-PCR puede ser utilizada siendo este un método claramente costo- efectivo.
Las moléculas de ADN fetal circulan diluidas dentro de las secuencias del ADN circulante materno
Figura 3. Abordajes en el diagnóstico prenatal no invasivo. Adaptado de Bianchi DW, Nature Medicine 2012:18:1041–1051
En la figura 3 se muestran diferentes abordajes en la detección de los fCNAPS dependiendo de si determina enfermedades monogénicas o aneuploidías.
A continuación se revisan brevemente los principales métodos de cuantificación y enriquecimiento del ADN fetal en el plasma materno.
Secuenciación masiva en paralelo shotgun (s-MPS): permite secuenciar simultáneamente millones de fragmentos tanto de ADN fetal como materno. Si existe una aneuploidía fetal, debe encontrarse un exceso o déficit relativo del cromosoma en cuestión. Para poder detectar de forma fiable estas diferencias, la fracción fetal debe ser apreciable y los recuentos deben ser comparados con casos euploides.
Secuenciación masiva en paralelo dirigida (t-MPS): una variante de la anterior es amplificar selectivamente sólo aquellas regiones cromosómicas que son de interés (por ejemplo, los cromosomas 21, 18 y 13) y entonces determinar si hay algún caso fuera de
ADN circulante en la placenta ADN circulante en el plasma materno ADN materno
ADN fetal Eritrocitos
Aneuploidias Enfermedades monogénicas
Detección de productos de PCR específicos del feto
(ejemplo RHD)
RT-PCR amplificando secuencias que se encuentren en el feto pero
no en la madre
Secuenciación masiva del ADN total presente en el plasma
materno
Alineamiento de secuencias leídas respecto a la secuencia consenso y determinación de la representación
relativa de cromosomas
Detección de aneuploidias (ejemplo trisomía 21)
la euploidia, basándose en el número relativo de fragmentos de ADN para este subgrupo de cromosomas.
Técnicas basadas en el ADN metilado: Algunos genes presentes en las células placentarias serán diferentes de las células maternas en cuanto al patrón de metilación. El ADN metilado puede ser químicamente modificado, permitiendo de este modo su caracterización y separación del ADN no metilado. Si además, existen diferencias polimórficas en los alelos fetales, la alteración en la relación 1: 1 puede ser utilizado para identificar la trisomía. También es posible utilizar inmunoprecipitación para enriquecer el ADN metilado.
Técnicas basadas en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP): las técnicas que trabajan con SNPs deben tener ventajas sobre aquellas basadas en el contaje total de secuencias.
Las técnicas que trabajan con SNPs tienen ventajas sobre aquellas basadas en el contaje total de secuencias ya que los SNPs pueden proporcionar información acerca del origen de la aneuploidía, de la recombinación y de la herencia de mutaciones.
PCR digital: Esta tecnología se basa en la dilución del ADN de partida de tal manera que fragmentos de ADN de interés se puedan amplificar por separado y se puedan cuantificar.
Las estimaciones teóricas de la cantidad de producto amplificado de cada una de las regiones de interés han sido cuantificadas y esta técnica podría llegar a ser particularmente atractiva ya que no serían necesarios los métodos de enriquecimiento de fCNAPS a partir de plasma materno.
Pruebas basadas en el ARN: la identificación de los genes que se expresan en los trofoblastos pero no en las células maternas dan lugar a la presencia de los correspondientes RNA fetales en el plasma materno, libre de contaminación de ARN materna. Pero estas técnicas están siendo desplazadas por una mayor eficiencia en la secuenciación masiva del ADN circulante en el suero de la gestante.
3.2. Detección del RhD y el sexo fetal
La incompatibilidad del grupo sanguíneo Rhesus D (RhD) entre la madre y el feto puede resultar en aloinmunización materna, donde los anticuerpos anti-D producidos, cruzan la barrera placentaria y atacan a los glóbulos rojos fetales provocando la enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido, pudiendo ocasionar desde anemia fetal hasta la muerte del feto. Esta inmunización de la madre contra la proteína de membrana hemática RhD del feto, ocurre generalmente después del nacimiento del primer bebé RhD positivo al término del embarazo. Sin embargo, otros eventos relacionados con la gestación, como el aborto electivo o espontáneo, o
un traumatismo que haga contactar la sangre materna con las células de la sangre fetal, pueden resultar en la formación de anticuerpos. Aunque el embarazo en el cual se produjo la aloinmunización puede no afectar al niño, los niños que fueran concebidos más adelante poseerían un riesgo considerable de manifestar la enfermedad. Cuando la madre no expresa el antígeno RhD en sus eritrocitos (RhD-), es esencial evitar una posible enfermedad hemolítica en el recién nacido. Hasta el momento, la prevención de esta patología consistía en la administración, vía intramuscular de gamma-globulina anti-D humana a estas mujeres en la semana 28 de gestación y si el recién nacido es RhD+, se le administraba una segunda dosis posparto. Sin embargo, aproximadamente el 40% de las mujeres gestantes RhD-, portan un feto RhD- y no necesitarían ser expuestas a este tratamiento si el estatus del RHD fetal es diagnosticado antes de la semana 28 de gestación (16).
Aunque el ADN fetal libre comprende solo del 3 al 10% del ADN circulante de la madre, cuando la secuencia fetal de interés no tiene una contrapartida materna (ej: ADN del cromosoma Y para feto varón, o el gen RHD, cuando la madre es RhD negativa), ha sido posible obtener excelentes resultados en la detección y cuantificación de estos genes mediante RT-PCR. El uso del ADN fetal circulante en el plasma materno como una herramienta de diagnóstico hace posible detectar el estatus del RHD fetal a partir de la octava-décima semana de gestación, siendo de especial interés cuando la gestante está sensibilizada (con anticuerpos anti RhD circulantes en su sangre) permitiéndole una gestación normal si el feto es RHD- o, en caso contrario, si el feto es RHD+, tenerla bajo una vigilancia adecuada y constante (10).
El diagnóstico del RHD fetal en el suero materno, constituye un ensayo seguro, con un porcentaje de exactitud descrito que varía entre 94.8% - 100%, con una sensibilidad cercana al 100% (16, 17), estando instaurado en numerosos hospitales europeos y concretamente, en el HUVR de Sevilla donde está en la cartera de servicios desde el año 2009 para todas las gestantes RhD negativas en base al siguiente algoritmo diagnóstico (Fig 4).
Figura 4. Algoritmo diagnóstico protocolarizado en el HUVR de Sevilla
En la mayor parte de los protocolos existentes, simultáneamente a la detección del RHD fetal, se determina la presencia o ausencia de un gen del cromosoma Y para tener una mayor seguridad de la existencia de ADN fetal en la muestra de plasma materno. Así, cuando no amplifica ningún gen (SRY y/o RHD) se realiza una verificación de la existencia de ADN en la muestra amplificando junto con el RHD un gen constitutivo como es la beta globina y clasificar posteriormente al feto como femenino y RHD negativo. Los estudios genómicos del ADN fetal en el plasma materno para detectar la presencia del gen RHD y de un gen del cromosoma Y se hacen procesando como mínimo dos veces la misma muestra, por PCRs multiplex, tanto en la primera prueba diagnóstica como en la comprobación de existencia de ADN .
Recientemente se han realizado estudios de costo-beneficio donde se concluye que la implementación del NIPD del RHD fetal es una estrategia costo-efectiva para el manejo de la incompatibilidad materno-fetal del factor RhD, recomendándose la implantación nacional en Alemania, Suecia y Holanda (18). El NIPD del sexo fetal tiene utilidad clínica en el manejo de las enfermedades ligadas al cromosoma X, como es el caso de las hemofilias, donde una amniocentesis puede ser evitada si se descarta que el feto sea varón.
PLASMA/SUERO GESTANTE (10 semanas o más)
EXTRACCIÓN DEL ADN CIRCULANTE
PCR MULTIPLEX DEL GEN SRY Y DE LOS EXONES 5 & 7 DEL
GEN RHD
RESULTADO NEGATIVO PARA EL GEN RHD Y POSITIVO PARA EL SRY:
FETO VARÓN RHD NEGATIVO
TODOS LOS GENES AMPLIFICAN: FETO
VARÓN RHD POSITIVO
RESULTADO POSITIVO SÓLO PARA EL GEN RHD: FETO FEMENINO RHD POSITIVO
CUANDO NINGÚN GEN AMPLIFICA O LOS DUPLICADOS NO RESULTAN
IGUALES: RESULTADO IMPRECISO
EN ESTOS CASOS SE EXTRAE DE NUEVO ADN Y SE REALIZA PCR MULTIPLEX PARA
LOS DOS EXONES DEL RHD Y LA BETA GLOBINA COMO CONTROL DE LA EXISTENCIA DE ADN. SI LOS EXONES DEL RHD SIGUEN SN AMPLIFICAR EL FETO SE
CONSIDERA RHD NEGATIVO
Los principales métodos para la determinación del sexo se basan en la presencia o ausencia en el plasma materno de secuencias pertenecientes al cromosoma Y, concretamente de los genes DYS14, DAZ y SRY, con los que según un reciente meta análisis de 57 estudios se muestra como una técnica de alta eficiencia a partir de la séptima semana de gestación cuando se realiza mediante RT-PCR (19).
3.3. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen
El hecho de que cualquier secuencia del genoma fetal se encuentra circulando en el plasma materno representando en torno al 10% del ADN circulante de la gestante, abre la posibilidad a la detección de mutaciones autosómicas dominantes heredadas del padre. En esta línea existen numerosas publicaciones (Tabla 2). En un estudio piloto de nuestro grupo, analizamos la presencia de la mutación mayoritaria del gen c-RET mediante NIPD en pacientes MEN2A, (C634Y), en gestantes sanas cuyas parejas padecían la enfermedad. Mediante una técnica de genotipado muy sensible (COLD- PCR), se diagnosticó dentro de las 20 primeras semanas de gestación un feto que portaba la mutación causante de la enfermedad (20).
Cuando las mutaciones a estudiar por NIPD son recesivas, han de existir en el genoma materno y paterno para que el feto herede dicha mutación en homocigosis. Para detectar si el feto porta la mutación, se han realizado aproximaciones calculando la cantidad relativa de los alelos mutados respecto a los sanos acuñándose el término de “Relative Mutation Dosage (RMD)”. De este modo, si el feto posee la mutación en homocigosis se detecta una sobreexpresión del alelo mutado respecto al ADN de un control con la mutación en heterocigosis. Esta aproximación se ha utilizado para el NIPD en la beta-talasemia, la hemofilia y la anemia falciforme (10).
Tabla 2. Mutaciones autosómicas dominantes heredadas del padre detectadas en el ADN circulante materno
ENFERMEDAD MUTACION GENETICA
Acondroplasia Mutación G1138A del gen FGFR3 Fibrosis Quística Mutación paterna Q890X
Hemofilia Gen F8 c.6278A.G, c.826G.A, c.1171C.T, gen F9 c.874delC, c.1144T.C, c.802T.A,c.1069G.A
Enfermedad de Huntington Gen IT-15 trinucleotido expandido (CAG)
Distrofia Miotónica Repetición inestable del trinucleotido CTG en el gen DMPK Síndrome MEN2A Mutación C634Y del gen cRET
Anemia falciforme Alelos mutados (hemoglobina S)del gen HBB
3.4. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal
En la superficie de la membrana plaquetaria, formando parte de 6 glucoproteínas, se encuentran los llamados Antígenos Plaquetarios Humanos (HPA). Durante el embarazo, por herencia paterna, los HPA fetales pueden ser distintos a los de la madre y ocasionar la aloinmunización materna, formándose anticuerpos que atraviesan la barrera placentaria e inducen la destrucción de las plaquetas fetales. Este fenómeno es lo que conocemos como trombocitopenia fetal y neonatal aloinmune (FNAIT), una enfermedad cuya incidencia se estima en 1/1000 nacidos vivos, un 0.9% de prevalencia en población general y que es la causa más frecuente de trombocitopenia aislada en fetos y recién nacidos ( 21)
En caucásicos, el antígeno HPA-1 es el implicado con más frecuencia en FNAIT. De herencia bialélica, el 80% de las incompatibilidades se deben a embarazos de fetos HPA-1a en mujeres HPA-1b homocigotas. Por suerte, solo el 2% de la población es HPA-1a negativa, es decir, homocigota para el HPA-1b, y tan solo el 10% creará finalmente anticuerpos.
Figura 5. Modelo piramidal de la TAIFN. Cada piso de la pirámide muestra el número de mujeres y niños afectos por cada una de las condiciones básicas para la aparición de TAIFN y su manifestación más grave,
la hemorragia intracraneal (HIC) en un total de 10.000 mujeres.
Castellano MEM. Haematologica/edición española | 2011; 96 (Extra 1)
El objetivo fundamental del desarrollo de un NIPD para esta enfermedad es reducir la morbilidad y mortalidad que lleva asociadas, principalmente previniendo la hemorragia intracraneal. Sin tener que recurrir a las actuales técnicas invasivas, como la amniocentesis. Así, en 2011 Scheffer et al plantean una primera metodología a partir del ADN circulante fetal en plasma materno: la única diferencia entre ambos alelos es un SNP (rs5918). Este nucleótido distinto en el HPA-1b da lugar a una secuencia diana para la enzima de restricción MspI. Por tanto, el uso de la misma previamente a una RT-PCR evita las amplificaciones inespecíficas del abundante ADN circulante materno y deja intacto el HPA-1a fetal para su genotipado (22).
Posteriormente, en 2013, Toriellec et al plantean otra metodología independiente de digestión enzimática y del genotipo materno. En este caso mediante high resolution melting (HRM) y/o PCR-alelo específica, en las que un solo cambio nucleotídico sería suficiente para diferenciar homocigotos para el alelo HPA-1a, para el HPA-1b y heterocigotos (21).
Para colaborar en el avance del NIPD y su posible implantación, queda pendiente completar el desarrollo de la “vacuna anti-HPA-1a”. Análoga a la de la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido, está formada por anticuerpos que se unirían a los antígenos fetales para evitar la aloinmunización materna.
3.5. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas
Se considera aneuploidía a la existencia de un cambio en el número de cromosomas dentro de una célula. La causa suele ser una disfunción de la meiosis durante la formación de los gametos.
Se cree que es relativamente frecuente en los embriones en desarrollo, pero la mayoría de las aneuploidías conllevan un aborto espontáneo al principio del embarazo, siendo las más compatibles con la vida, las trisomías del cromosoma 13, el 18 y el 21. La trisomía del cromosoma 21, responsable del síndrome de Down, es la más común de las aneuploidías que afecta 1 de cada 700 nacidos vivos. Actualmente la opción más extendida de NIPD que determina el riesgo de padecer síndrome de Down es el triple “screening” que se realiza entre las semanas 12 y 14 de gestación. Así, se cuantifica en el suero materno la fracción libre de la subunidad beta de la gonadotrofina coriónica humana (free beta-HCG), la PAPP-A (pregnancy-associated plasma protein) y se mide la translucencia del pliegue nucal en ecografía, determinando una probabilidad de padecer síndrome de Down según el grado de alteración de los tres parámetros en base a la edad gestacional (23). El método tiene una sensibilidad de un 90% y tiene un porcentaje de falsos positivos del 3-6%, de modo que es necesario un diagnóstico invasivo para confirmar una anomalía cromosómica.
En los últimos cinco años se han desarrollado varias técnicas que tratan de conseguir un diagnóstico prenatal no invasivo para las trisomías de los cromosomas 13, 18 ó 21, utilizando los ácidos nucleicos fetales que circulan en la madre. Se han realizado aproximaciones buscando diferentes patrones de metilación entre el ADN materno y el placentario de un gen que tenga un SNP paterno distinto al materno y poder cuantificar el ADN hipometilado fetal del cromosoma de interés. Otra aproximación ha sido cuantificar los ARN mensajeros placentarios en base al cromosoma de origen y establecer ratios entre los cromosomas de origen y detectar así trisomías con buenos resultados. Pero la técnica más prometedora que se ha abierto camino en el diagnóstico clínico es la basada en la secuenciación masiva en paralelo, capaz de establecer porcentajes entre miles de secuencias existentes en el ADN circulante, consiguiendo alta sensibilidad y especificidad para diferentes aneuploidías. Así, se ha descrito una sensibilidad entre el 99.1% y el 100% y una especificidad entre el 99.7% y el 100% para la trisomía 21; una sensibilidad entre el 97.2% y el 100% con especificidad entre el 99.7 y el 100% para la trisomía 18,; y aunque con un menor número de trabajos publicados, una sensibilidad entre el 78.6%- 91.7% y una especificidad entre el 99.1 y el 100% para la trisomía 13 (24)
Recientemente se ha realizado un estudio multicéntrico denominado MELISA (MatErnal BLood IS Source to Accurately diagnose fetal aneuploidy) en 532 muestras de gestantes estudiando su genoma por secuenciación masiva en paralelo (25) siendo capaz de diagnosticar en el 100% de los casos existentes la trisomía del 21, mostrando altas sensibilidades para el diagnóstico de trisomías del 18,13 e incluso del 20 y el 16, así como los casos de XXX, XXY y XYY, un caso de monosomía del X y mosaicismos del 21 y el 18.
Las técnicas de secuenciación masiva están cada vez más extendidas, mostrando además la capacidad de detectar no sólo las trisomías cromosómicas sino además un amplio rango de anormalidades extendiendo las posibilidades del NIPD.
Figura 6. Posible futuro diagnóstico y estrategia de tratamiento para el Síndrome de Down.
Adaptado de Bianchi DW, Nature Medicine 2012:18:1041–1051
En la figura anterior se muestran las aproximaciones actuales en el NIPD de la trisomía 21 así como posibles estrategias futuras en el que el análisis del trascriptoma fetal pueda servir para identificar posibles tratamientos si se decide llevar el embarazo a término.
Por otra parte la información del haplotipo fetal es especialmente útil en la detección de algunas enfermedades de las que se conoce el haplotipo asociado, como por ejemplo el lupus eritematoso sistémico. En los últimos años se ha desarrollado una nueva técnica que permite la caracterización más precisa del ADN de origen fetal estudiando en el CNAPS de la gestante tanto del genotipo como del haplotipo fetal. Dado que el genoma fetal es la combinación de los
Cribado sérico y/o ecografía
• Alto riesgo de aneuploidia
• Consejo genético pre-test
Diagnóstico citogenético invasivo
Trisomía 21
Consejo genético
Finalización del embarazo
• Continuación del embarazo
• Preparación para el nacimiento de niño afectado
• Parto en hospital con cuidados especiales
Cribado sérico y/o ecografía
Trisomía 21
Consejo genético
Finalización del embarazo
• Continuación del embarazo
• Preparación para el nacimiento de niño afectado
• Parto en hospital con cuidados especiales
Secuenciación del ADN circulante y/o
TRATAMIENTO DEL FETO Diagnóstico
citogenético invasivo
cromosomas de transmisión parental, se reconstruye el genoma fetal mediante la observación de transición del alelo parental en el plasma materno a diferencia de estudios previos donde únicamente se infiere el genotipo fetal basándose en el haplotipo materno. Primero se construyen los haplotipos de los padres, y luego se observa la transición del alelo paterno en el plasma materno y se optimiza el haplotipo fetal mediante un modelo oculto de Markov (HMM) y el algoritmo de Viterbi. De esta manera se consigue reconstruir el genoma fetal independientemente de la concentración de ADN fetal circulante en plasma materno y logrando una tasa de recuperación de alelos materno y paterno del 100% (26).
Es evidente que este nuevo enfoque facilita un alcance más amplio en el campo de NIPD, incluyendo la caracterización de enfermedades con herencia mendeliana, el cribado de enfermedades complejas y la identificación de cambios en el número de copias tanto en el caso de síndromes microdeleccionales como en el caso de microduplicaciones. Por otra parte, este estudio demuestra un aumento en la precisión, especialmente para la recuperación del alelo paterno, incluso en aquellos casos en los que la cantidad de fCNAPS es limitada (< 6%). Este método no invasivo, preciso y robusto ofrece soluciones a diferentes niveles, tanto a nivel de ADN (microdeleciones, microduplicaciones y mutaciones puntuales), como a nivel de modificaciones epigenéticas (metilación) y a nivel de la traducción (ARNm y micro RNAs).
3.5.1. Limitaciones actuales del NIPT
Las técnicas disponibles actualmente en los laboratorios son específicas para trisomias 21, 18 y 13, ampliando algunas plataformas el estudio de aneuploidias en los cromosomas sexuales. Hay que tener en cuenta que aproximadamente el 50% de las anormalidades identificadas por citogenética son distintas a las estudiadas por NIPT.
Las anormalidades cromosomicas como las translocaciones no balanceadas, las delecciones y las duplicaciones no se detectan actualmente por el NIPT.
El NIPT no puede distinguir las formas específicas de la aneuploidía, por ejemplo, no puede distinguir si un síndrome de Down es debido a un cromosoma extranumerario o una translocación Robertsoniana que implique al cromosoma 21 o si existe un mosaicismo de alto grado.
NIPT no detecta mutaciones de un solo gen.
El NIPT puede verse afectado cuando se reduce la cantidad de ADN fetal circulante en el plasma/ suero materno, como está descrito para un índice de masa corporal elevado en la gestante y para extracciones de muestras antes de la semana 10 de gestación.
El NIPT no informa de la existencia en defectos de la formación del tubo neural, por lo que no excluye la realización del cribado bioquímico del segundo trimestre cuando proceda.
El NIPT tampoco excluye la utilidad de realizar el cribado combinado del primer trimestre donde la ecografía es necesaria para determinar la edad gestacional, la posible existencia de distintas anomalías cromosomicas, la identificación de embarazos gemelares y la detección de embarazos de riesgo por otros valores como la placentación anormal.
El NIPT tiene una menor sensibilidad en el caso de embarazos gemelares.
No tiene capacidad predictiva de las complicaciones en la gestación avanzada (27)
3.5.2. Recomendaciones
Las recomendaciones más recientes de la UnitedHealthcare (Medical Polici number:
2014T0560E) abogando por un uso racional del NIPT aconsejan su realización en las siguientes circustancias:
Mujeres gestantes mayores de 35 años en el momento del parto.
Cuando existen signos en la ecografía que hagan sospechar la existencia de una aneuploidía.
Cuando la embarazada ha tenido una gestación anterior de un feto con trisomía.
Cuando los cribados de primer o segundo trimestre dan un riesgo positivo.
Cuando alguno de los padres padece una translocación Robertsoniana balanceada con un mayor riesgo de trisomía 13 o 21 fetal
Se insiste que al realizar un NIPT sea siempre en el contexto del consejo genético antes y después de la realización de la prueba.
Un test positivo debe de confirmarse mediante una amniocentesis.
4. CONSIDERACIONES ÉTICAS EN EL NIPT
Ya desde el 2011 existe la posibilidad de solicitar a empresas privadas de diagnóstico clínico el NIPT en suero materno para la detección de aneuploidias cromosómocas desde la décima semana de gestación. Al ser considerada una técnica no diagnóstica, aunque altamente fiable, debe realizarse en el contexto del consejo genético que conlleva un consentimiento informado.
En el año 2013 el American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) publicó sus recomendaciones para la realización de estas pruebas y sus limitaciones.
Es importante destacar que el cariotipo actualmente puede detectar con más seguridad patologías cromosómicas como son las translocaciones no balanceadas, delecciones o duplicaciones parciales, translocaciones Robertsonianas, o grados de mosaicismos. En este mismo sentido, tampoco es posible detectar mediante NIPT defectos de la formación del tubo neural. Por otro lado, aunque el futuro de la detección precoz de aneuploidias cromosomicas mediante NIPT parece prometedor, este aun no es suficientemente sensible en los casos de gestaciones gemelares o multiples.
En las recomendaciones de la ACMG, se aconseja aclarar suficientemente las limitaciones diagnósticas en el consejo genético. Se recomienda también que se que solicite a las pacientes la información precisa acerca de lo que quieren que sea estudiado, dado que la secuenciación masiva, cada vez mas perfeccionada, puede encontrar anomalias que no son objeto de estudio o atipias que no posean explicación actualmente y es posible que informar de estas incidencias aún por perfeccionar genere ansiedad e inseguridad innecesariamente.
En esta guía recomiendan también que en los casos que dan positivos, se proporcione de nuevo un consejo clínico donde se oferte la amniocentesis para confirmación del diagnóstico. De igual forma, en el caso que se confirme que el feto tiene una aneuploidía cromosómica, es importante ofrecer a los padres de las posibilidades de actuación o preparación (26).
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6. ENLACES DE INTERÉS
https://www.acmg.net/
http://www.lettercase.org/
http://www.brightertomorrows.org/
http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/IVDRegulatoryAssistance/ucm12 4105.htm
