INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICASSECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
Expresión de genes de virulencia de la isla de
patogenicidad cagPAI y vacA de Helicobacter pylori en
pacientes infectados.
T E S I S QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR P R E S E N T A
Q.B.P. E R I K N I E T O P A T L Á N
Directores de Tesis: Dra. Rosa María Ribas Jaimes
Dr. Francisco Avilés Jiménez
México, D.F., 2010
Ribas Jaimes del Laboratorio de Producción y Control de Biológicos, Departamento de Microbiología, de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional y del Dr. Francisco Avilés Jiménez de la Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Infecciosas y Parasitarias, Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social.
El sustentante agradece el apoyo económico del Programa de Formación de Investigadores del I.P.N. a través del Proyecto SIP 20091190 a cargo de la Dra. Rosa María Ribas Jaimes y la beca otorgada por el CONACyT.
ÍNDICE
Índice de Figuras. ... vii
Índice de tablas. ... viii
1.- INTRODUCCIÓN. ... 1
1.1. Antecedentes históricos de Helicobacter pylori. ... 1
1.2. Morfología de H. pylori. ... 2
1.3. Características bioquímicas de H. pylori. ... 2
1.4. Epidemiología. ... 3
1.5. Patologías relacionadas a la infección de H. pylori. ... 5
1.5.1. Gastritis.. ... 5
1.5.2. Enfermedad ulcero-péptica ... 5
1.5.3. Cáncer gástrico. ... 6
1.6. Mecanismos de patogenicidad y factores de virulencia. ... 8
1.7. Gen rocF y Arginasa de H. pylori. ... 9
1.8. Proteína activadora de neutrófilos (NapA). ... 10
1.9. Adhesinas BabA (de unión a grupo sanguíneo) y SabA (de unión a ácido sialico). ... 10
1.10. Citotoxina vacuolizante VacA de H. pylori. ... 11
1.10.1. Estructura de la proteína VacA. ... 12
1.10.2. Actividad biológica de VacA. ... 13
1.11. Isla de patogenicidad (cagPAI). ... 15
1.11.1 Actividad biológica de CagA. ... 18
2. JUSTIFICACIÓN ... 22 3. HIPÓTESIS. ... 23 4. OBJETIVO. ... 24 4.1. OBJETIVOS PARTICULARES. ... 24 5. MATERIAL Y MÉTODOS. ... 25 5.1. Población de estudio. ... 25
6. Aislamiento e identificación. ... 26
6.1. Extracción del DNA bacteriano. ... 26
6.2. Extracción y purificación de RNA Total. ... 27
6.3. Purificación de RNA. ... 27
6.4. Determinación de la presencia de cagPAI mediante PCR. ... 28
6.5. Determinación de la expresión relativa de genes de virulencia mediante RT-PCR en tiempo real. ... 29 7. RESULTADOS. ... 32 8. DISCUSIÓN. ... 41 9. CONCLUSIONES. ... 45 10. PERSPECTIVAS. ... 46 11. BIBLIOGRAFÍA. ... 47
Índice de Figuras.
Número Figura Pág 1 Micrografía de H. pylori en microscopio electrónico. 2
2 Desarrollo hipotético de cáncer en la mucosa gástrica. 8 3 Microfotografía electrónica y modelo computacional. 13 4 Esquema de la isla de patogenicidad cagPAI. 15 5 Cambio en la morfología celular ocasionado por H. pylori. 19 6 Expresión relativa promedio de cagPAI de H. pylori en pacientes con
gastritis.
32 7 Expresión relativa promedio de cagPAI de H. pylori en pacientes con
ulcera duodenal.
33
8 Expresión relativa promedio de cagPAI de H. pylori en pacientes con
cáncer gástrico. 34
9 Comparación de los niveles de expresión relativa promedio de cagPAI
en las tres patologías. 35
10 Expresión relativa promedio de los genes asociados a virulencia que
están fuera de cagPAI en gastritis. 36
11 Comparación de los niveles de expresión de genes fuera de la isla con trabajos previos.
37 12 Expresión relativa promedio de los genes asociados a virulencia que
están fuera de cagPAI en ulcera duodenal.
37
13 Expresión relativa promedio de los genes asociados a virulencia que están fuera de cagPAI en cáncer gástrico. 38 14 Comparación de los niveles de expresión relativa de los genes
Índice de tablas.
Numero Tabla Pág. 1 Homología entre los genes presentes en cagPAI de H. pylori y A.
tumefaciens.
15
2 Función de los genes que forman el SST4 de H. pylori. 16 3 Genes esenciales para la translocación de CagA 17 4 Mezcla de reacción para la purificación de RNA. 27 5 Condiciones de amplificación utilizadas en la PCR para determinar
presencia o ausencia de cagPAI.
28
6 Tamaño de los productos obtenidos mediante PCR. 28 7 Mezcla de reacción utilizada en el RT-PCR. 30 8 Condiciones de amplificación utilizadas en la RT-PCR para
determinar la expresión relativa de genes en H. pylori.
31
9 Muestras analizadas correspondientes a tres diferentes patologías. 32 10 Muestras utilizadas para el análisis de expresión relativa de genes de
H. pylori asociados a virulencia.
RESUMEN.
Helicobacter pylori infecta cerca de la mitad de la población mundial, es la principal
causa del desarrollo de gastritis, ulcera duodenal o gástrica y cáncer gástrico. H.
pylori cuenta con varios de factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad,
como son: arginasa, la toxina VacA, la proteína NapA, las adhesinas BabA y SabA, la enzima catalasa, y una isla de patogenicidad (cagPAI).
Nuestro objetivo fue estudiar la expresión relativa de genes asociados a virulencia mediante RT-PCR, en pacientes infectados con diferentes cuadros clínicos: gastritis, úlcera duodenal y cáncer gástrico, en condiciones in vivo.
De un total de 274 muestras procesadas (biopsias gástricas humanas), se obtuvo elcultivo en91 casos, de las cuales solo 58 (63%) fueron cagPAI+, mientras que la expresión relativa se evaluó en 30 muestras (10 de cada grupo).
Los resultados obtenidos muestran que la expresión relativa entre las diferentes patologías es similar, solo se encontraron diferencias significativas (P<0.05) en los genes cagH y cagG cuando se compara gastritis contra úlcera duodenal, ambos genes codifican para proteínas necesarias para la translocación de CagA.
En cáncer gástrico 9 de 10 muestras analizadas no se encontró expresión de los genes cagI y cagD, esto nos sugiere que bajo las condiciones in vivo estos genes aparentemente no son necesarios en esta patología, sobre estos genes se sabe que cagD codifica para la proteína CagD; necesaria para translocar CagA a través del Sistema de secreción tipo IV de H. pylori.
ABSTRACT.
Helicobacter pylori infects nearly half the world population is the main cause of
development of gastritis, duodenal or gastric ulcer and gastric cancer. H. pylori has several virulence factors and pathogenicity mechanisms, such as: arginase, VacA toxin, protein Napa, the adhesins BabA and SabA, catalase, and a pathogenicity island (cagPAI).
Our objective was to study the relative expression of virulence-associated genes by RT-PCR, in patients infected with different clinical conditions: gastritis, duodenal ulcer and gastric cancer in vivo.
Of a total of 274 samples processed (human gastric biopsy), culture was obtained in 91 cases, of which only 58 (63%) were cagPAI+, while the relative expression was evaluated in 30 samples (10 from each group).
The results show that the relative expression between the different diseases is similar, only significant differences (P<0.05) in genes cagH and cagG when compared against duodenal ulcer whit gastritis, both genes encode proteins required for translocation of CagA.
In gastric cancer 9 of 10 samples analyzed did not find gene expression cagI and
cagD, this suggests that under in vivo conditions these genes are apparently not
required on these genes in cancer, are known to cagD code for the protein CagD; necessary to CagA translocated through the type IV secretion system of H. pylori.
1.- INTRODUCCIÓN.
1.1. Antecedentes históricos de Helicobacter pylori.
La relación entre los microorganismos y los seres humanos ha existido prácticamente desde el comienzo de la humanidad. Estas interacciones han sido objeto de múltiples estudios e investigaciones, principalmente en los microorganismos cuyo desarrollo tiene como consecuencia enfermedades en los humanos. Una de ellas es Helicobacter pylori, la cual ha sido objeto de investigaciones en los últimos años. En el año 1893 el italiano Giulio Bizzozero describió por primera vez una bacteria en forma de espiral presente en la mucosa gástrica de perros y gatos, posteriormente en 1899, el polaco Walery Jaworski, aisló a partir de sedimentos de lavados gástricos una bacteria de forma espiral a la que nombró Vibrio rugula, al realizar esto fue también el primero en proponer una posible relación entre la presencia de esta bacteria y el desarrollo de patologías en el estómago (Konturek et al., 2003).
Pero no fue hasta 1983 en que dos investigadores australianos, Robin Warren y Barry Marshall aislaron a H. pylori a partir de biopsias gástricas de pacientes con úlcera gástrica y gastritis, aplicando tinciones de plata lograron observar la bacteria que comenzó un estudio a fondo de la relación entre esta bacteria y el desarrollo de patologías (Lancet et al., 1983).
En un principio Warren y Marshall dieron a esta bacteria el nombre de
Campylobacter like organism, por su gran parecido microscópico y bioquímico (ya
que las bacterias de este género son oxidasa y catalasa positivas) con las bacterias del género Campylobacter, posteriormente Goodwin y colaboradores en 1989, demostraron que esta bacteria no pertenece al género Campylobacter, ya que solo presenta un flagelo polar y la bacteria recientemente descubierta tenía de cuatro a seis flagelos, otra razón de peso fueron las secuencias del RNA
ribosomal, las cuales fueron suficiente evidencia para demostrar que se trataban de géneros diferentes y de esta forma se le dio el nombre con el que actualmente conocemos a esta bacteria: H. pylori (Goodwin et al., 1989).
1.2. Morfología de H. pylori.
H. pylori es una bacteria Gram negativa, de forma espiral o curva, posee de 5 a 7
flagelos polares, mide de 2.5-3.5μm de largo y de 0.5-1μm de diámetro (Figura 1) (Fochesatto et al., 2004).
Figura 1. Micrografía de H. pylori en microscopio electrónico. En la imagen se pueden apreciar los flagelos polares, así como la forma en espiral de H. pylori (Tomada de Mobley et al., 2001), barra = 0.5 µm.
H. pylori se puede aislar a partir de biopsias gástricas, en medio de gelosa sangre
incubándolo de 3 a 10 días bajo condiciones microaerofílicas (5% oxigeno, 10% dióxido de carbono y 85% nitrógeno). Se incuban a una temperatura de 37°C, donde crece como colonias pequeñas que van de 1-2 mm de diámetro, redondas y translúcidas con aspecto húmedo de color blanquecino o crema (Mobley et al., 2001).
1.3. Características bioquímicas de H. pylori.
H. pylori es microaerofílica y tiene un metabolismo de tipo oxidativo y fermentativo,
para su identificación bioquímica, ya que H. pylori es positiva a estas pruebas (Harris et al., 1998).
La ureasa se sintetiza constitutivamente y con ella H. pylori degrada la urea del
medio ambiente en amonio y CO2. Con este proceso H. pylori crea un
microambiente adecuado a su alrededor al neutralizar la acidez presente en el estómago (Bauerfeind et al., 1997; Nam-Chul et al., 2001).
La catalasa es una enzima codificada por el gen katA, este gen tiene una longitud de 1518 pb y H. pylori solo cuenta con una copia. La proteína tiene una longitud de 505 aminoácidos. Esta enzima es expresada en el citoplasma y en el espacio periplásmico (Odenbreit et al., 1996).
El sustrato de la catalasa es el peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual es degradado
con la consecuente formación de oxígeno y agua; el H2O2 es producido por los
macrófagos y neutrófilos presentes en el proceso de inflamación, implementado por el sistema inmune del huésped y al ser degradado por la catalasa de H. pylori disminuye el estrés oxidativo (Bauerfeind et al., 1997; Harris et al., 2002).
La oxidasa es una enzima presente en las bacterias que utilizan el oxígeno como último aceptor de electrones, y permite la identificación de H. pylori, que es oxidasa positiva, a diferencia de enterobacterias como Shigella, Salmonella o E.
coli que son negativas a esta prueba. Esta enzima se pone de manifiesto
utilizando el reactivo de Kovacs (diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina) que al paso de unos segundos se puede observar un cambio en la coloración a un morado-púrpura, debido a la oxidación del reactivo de Kovacs que lleva acabo la oxidasa, esto pone en evidencia el uso del O2 atmosférico como aceptor final de
electrones (Harris et al., 2002).
1.4. Epidemiología.
Se estima que alrededor del 50% de la población mundial se encuentra infectada por H. pylori, en países en vías de desarrollo la prevalencia de la infección es de hasta un 80%, en cambio en los países desarrollados se observa que la incidencia
es relativamente menor (Dunn et al., 1997). Se ha visto que en los países en vía de desarrollo la infección se da en los primeros años de vida, estimándose que el 50% de los niños menores de dos años ya están infectados, mientras que en países desarrollados la prevalencia en los niños de diez años es del 5 al 10% (Torres et al., 2000; Madrazo-de la Garza et al., 2001).
Existen varios factores que propician la infección con esta bacteria, algunos de ellos son: el hacinamiento, la falta de medidas sanitarias adecuadas, el bajo nivel socioeconómico y la infección de algún miembro de la familia o personas del entorno, que pudieran facilitar una transmisión directa. El mecanismo de transmisión propuesto es la vía fecal-oral (Feldman et al., 1993), ésta se basa en el aislamiento de la bacteria a partir de muestras de heces, que en algunos casos aunado a la falta de higiene de las personas y a la mala infraestructura en los sistemas de saneamiento favorecen la colonización por parte de H. pylori.
Lo anterior sugieren que el contacto directo entre personas es la principal forma de adquirir a la bacteria, además no se ha encontrado ningún reservorio animal, lo que hace pensar que el humano es el único huésped, donde la bacteria puede estar de forma crónica sin ocasionar ninguna molestia seria, esta infección puede persistir en el estómago de la persona, incluso después del tratamiento con antibiótico, si este último no resultó ser el adecuado.
Otro mecanismo de transmisión propuesto es el oral-oral, debido a que H. pylori se ha logrado aislar ocasionalmente en la placa dental y saliva, de personas infectadas (Krajden et al., 1989), esto se ha comprobado mediante PCR (Nguyen
et al., 1993; Ferguson et al., 1993). La presencia de H. pylori en sitios diferentes al
estómago (cavidad bucal) se cree que es producto del reflujo gastroesofágico, que pudiera presentarse de forma poco frecuente y sin estar relacionado con alguna patología, además del número bajo de infecciones que se pudieran dar por malos procedimientos endoscópicos y dentales.
1.5. Patologías relacionadas a la infección de H. pylori.
1.5.1. Gastritis. Aunque la mayoría de las personas que están infectadas por H.
pylori no presentan ningún síntoma, existe un número de personas (alrededor de
10%) que durante su vida logran desarrollar patologías severas. La gran mayoría desarrolla una gastritis tipo B o también conocida como gastritis asociada a H.
pylori, esta gastritis es de tipo crónica y no es predominante en algún sexo. Este
tipo de gastritis no tiene una sintomatología bien definida, incluso puede ser asintomática y solo se puede dar un diagnóstico definitivo mediante histología.
La principal característica que se presenta en el desarrollo de gastritis es el proceso inflamatorio que se da en la mucosa gástrica que es un aumento en la atracción de células inflamatorias, especialmente de linfocitos, polimorfonucleares y macrófagos, además de que al estar H. pylori presente las células epiteliales liberan quimiocinas, principalmente las interleucinas 2 y 8 (IL-2 y IL-8), que con factores citotóxicos propios de las bacterias van a favorecer la liberación de proteasas y reactivos intermediarios del oxígeno con efecto bactericida, estos últimos con capacidad química para reaccionar con el amonio que es producido por la degradación de la urea por parte de la bacteria, esta situación podría ocasionar el estallido oxidativo.
1.5.2. Enfermedad ulcero-péptica. Otra patología con la que se relaciona H. pylori es el desarrollo de úlcera gástrica o duodenal. Cuando la infección persiste y las condiciones entre el huésped y la bacteria lo favorecen, la patología evoluciona a una gastritis atrófica y ulceraciones. La formación de ulceras está asociada a la presencia de diferentes factores de virulencia, entre ellos están las proteínas CagA, VacA y BabA (Torres et al., 2009). En esta fase de la infección las condiciones de pH del estomago comienzan a cambiar. Este efecto se debe a una respuesta hormonal. La infección por H. pylori esta asociada con una baja producción de somatostatina por parte de las células D del páncreas, esta disminución hormonal está ligada a la presencia de mediadores inflamatorios entre
ellos el oxido nítrico (Moss et al., 1992; Odum et al., 1994). Una disminución en la secreción de la somatostatina tiene como resultado un incremento en la gastrina; hormona encargada de estimular la producción de ácido clorhídrico en el estomago; de igual forma si aumenta la secreción de somatostatina, disminuye la concentración de gastrina en circulación y por ende la secreción de ácido clorhídrico, estos cambios en la secreción de gastrina invariablemente tienen repercusiones en la acidez estomacal, la cual será determinante en la patología que se desarrollará (Ernst et al., 2006; O'Connor et al., 1996).
Una baja producción de ácido en el estomago aumenta el riesgo de la formación de una úlcera gástrica, mientras que un incremento en la producción de ácido, favorece la formación de una ulcera duodenal. La evolución de la gastritis hacia uno u otra patología está marcada por el área del estomago predominantemente infectada por H. pylori. Si la infección se encuentra principalmente en el cuerpo del estomago se desarrollará una ulcera gástrica. Por otro lado si la infección se encuentra en la zona del antro, el riesgo hacia la formación de una ulcera duodenal será mayor, debido a que los pacientes que tienen una infección en el antro inducen una hipergastrinemia, la cual ocasiona una mayor secreción de ácido gástrico y una proliferación de las célula parietales, estos dos eventos conducen finalmente a la formación de la ulcera duodenal (Gillen et al., 1998).
La sintomatología de estas patologías consiste en ardor abdominal intenso que puede variar con la ingesta de alimentos o medicamentos.
1.5.3. Cáncer gástrico. La presencia de cáncer gástrico, al igual que en otros tipos de cáncer, es un proceso multifactorial, donde además de H. pylori intervienen diversos factores (como son ambientales y del propio huésped), además de tratarse de un proceso de tipo crónico, el cual requiere de una infección de varios años (Backert et al., 2004).
En 1994 la Organización Mundial de la Salud (OMS) clasificó a H. pylori como un agente carcinógeno de tipo I (O'Connor et al., 1996), el cual podría dañar el DNA de las células del huésped, generando mutaciones, que al paso de varios años pudieran derivar en un cáncer gástrico (Echarri et al., 1998).
La aparición de cáncer en el epitelio gástrico tiene como predecesor los acontecimientos anteriormente descritos, todos ellos propiciados por la infección de H. pylori, aunados al déficit de nutrientes y vitaminas. La infección de H. pylori en el cuerpo o pangastritis, están relacionadas al desarrollo de adenocarcinoma. Se piensa que el mecanismo por el cual se llega a esta patología tan severa es parecido al que se presenta en la gastritis de tipo A (auntoinmune), donde se existe una respuesta frente a la bomba de protones de la ATPasa del epitelio gástrico por parte de células T (CD4+), esto se fundamenta en el cruce antigénico entre proteínas de H. pylori y la ATPasa, lo que propicia atrofia en la mucosa gástrica, que trae como consecuencia daño al epitelio y mucosas gástricas. (El Omar et al., 1997; Amedei et al., 2003). Este daño puede dar lugar a una metaplasia gástrica, que es el cambio de epitelio gástrico por intestinal, con la consecuente pérdida de funciones y displasia que se caracteriza por la pérdida de estructura celular. Otro mecanismo de carcinogénesis propuesto es la formación de mutaciones en el DNA del epitelio gástrico. Estas mutaciones pueden ser propiciadas debido al estallido oxidativo formado por la respuesta inflamatoria (Touati et al., 2003).
El desarrollo de cáncer es un proceso que requiere de varios factores, ambientales, microbiológicos y del mismo huésped, por lo que el tiempo en que se desarrolle esta patología va a variar entre los diferentes pacientes (Figura 2) (Correa, 2008).
Figura 2: Desarrollo hipotético de cáncer en la mucosa gástrica. Se muestran las fases por las que teóricamente pasa el epitelio gástrico durante el desarrollo de cáncer, a partir de un epitelio sano (Modificado de Correa, 2008).
1.6. Mecanismos de patogenicidad y factores de virulencia.
H. pylori cuenta con diferentes mecanismos de patogenicidad que le permiten
colonizar y mantenerse en el estómago del humano, a pesar de las condiciones adversas que este presenta. Uno de ellos es la forma de espiral que tiene, esta forma de sacacorchos le permite a la bacteria moverse y atravesar el moco
gástrico y llegar al epitelio. Además cuenta con flagelos polares que le facilitan esta movilidad (Worku et al., 1999).
H. pylori también cuenta con enzimas como la oxidasa, la catalasa y la ureasa, las
cuales le permiten disminuir el estrés oxidativo montado por el hospedero y de esta forma perpetuar la infección. Otro mecanismo de patogenicidad en H. pylori son las adhesinas como son SabA y BabA, que le sirven para poder reconocer y fijarse al epitelio gástrico. La arginasa, es una proteína producida por H. pylori la cual le permite combatir el estrés oxidativo y así evadir en parte la respuesta inmune del huésped.
Entre los factores de virulencia tenemos a la isla de patogenicidad cagPAI y la citotoxina vacuolizante VacA en H. pylori, los cuales le permiten a la bacteria colonizar e infectar al humano; a continuación se enumeran las principales características de estos componentes.
1.7. Gen rocF y Arginasa de H. pylori.
La enzima arginasa es codificada por el gen rocF, esta enzima participa en el ciclo de la urea y degrada la L-Arginina, en ornitina y urea. La arginasa compite por la L-arginina con la óxido nítrico sintasa presente en los macrófagos los cuales utilizan este sustrato para producir agentes reactivos del nitrógeno, de esta forma la arginasa de H. pylori disminuye el estrés oxidativo nocivo para ella (Gobert et
al., 2001; Chaturvedi et al., 2007).
Por otro lado la producción de urea tiene un efecto sobre el microambiente que rodea a H. pylori en el estomago, ya que la bacteria, dentro de su repertorio enzimático también cuenta con la ureasa, la cual degrada la urea en amonio y dióxido de carbono, el amonio producido ayuda a neutralizar las condiciones ácidas del estómago (Ha et al., 2001).
1.8. Proteína activadora de neutrófilos (NapA).
Otro mecanismo de patogenicidad con el que cuenta H. pylori es la proteína activadora de neutrófilos NapA (del ingles Neutrophil-activating protein), esta proteína tiene un peso molecular de 17kDa y es codificada por el gen napA. NapA guarda homología con las proteínas de Protección a DNA (DPS), las cuales han sido ampliamente estudiadas en E. coli. NapA es capaz de secuestrar hierro, el cual es un cofactor importante en el funcionamiento de varias enzimas del huésped que forman agentes reactivos del nitrógeno y del oxígeno, por lo que, al no tener disponible todo el hierro necesario, disminuyen considerablemente su actividad y la protección contra H. pylori (Evans et al., 1995; Pulliainen et al., 2005; Cooksley et al., 2003; Wang et al., 2006).
NapA tiene la capacidad de activar neutrófilos induciendo la expresión de las moléculas de superficie CD11 y CD18 (estas integrinas son las principales responsables de la transmigración de leucocitos y de la inflamación) por lo que pareciera tener funciones antagonistas, por un lado activando neutrófilos y por otro combatiendo el estrés oxidativo (Lelies et al., 2000).
1.9. Adhesinas BabA (de unión a grupo sanguíneo) y SabA (de unión a ácido sialico).
Las Adhesinas BabA y SabA son proteínas de membrana externa que le permiten a H. pylori reconocer y fijarse específicamente al epitelio gástrico del huésped. La proteína de adhesión al antígeno de grupo sanguíneo BabA (del inglés Blood
group Antigen Binding Adhesin), es utilizada por H. pylori para reconocer
específicamente el antígeno Lewis b, el cual está presente en el epitelio gástrico. Se conocen dos genotipos de esta adhesina, babA1 y babA2, de las cuales la primera no es funcional, debido a un cambio en la secuencia genética, este genotipo presenta 14 residuos de adenina, mientras que babA2 tiene solamente 10, este cambio altera la transcripción del gen, eliminando el codón de inicio de transcripción dando como resultado que solo se exprese el genotipo babA2
(Mahdavi et al., 2002; Yamaoka et al., 2008). Existen estudios que relacionan los alelos babA+, vacA+ y cagA+ con el desarrollo de ulcera duodenal y cáncer gástrico (Oliveira et al., 2003; Gatti et al., 2005).
La adhesina SabA (del inglés Sialic Acid-Binding Adhesin) o adhesina de unión a ácido siálico, al igual que BabA participa en el proceso de reconocimiento del epitelio gástrico, con la diferencia de que SabA reconoce el ácido siálico presente en los antígenos de Lewis tipo X ó de tipo A presentes en la superficie epitelial. Ambas proteínas favorecen la unión de H. pylori al epitelio gástrico del huésped, de esta forma propician una infección de tipo crónica. Aunado a estas adhesinas,
H. pylori desarrolla un mimetismo antigénico, ya que estas proteínas son
estructuralmente parecidas a las presentes de forma normal en la membrana de los eritrocitos, con el cual disminuye la actividad inmunológica que el huésped pudiera montar en su contra, favoreciendo de esta forma la infección crónica (Mahdavi et al., 2002).
El control en la expresión de estas adhesinas puede jugar un papel importante a lo largo de la infección ya que al ser una unión de tipo especifico, al regular la expresión de estas proteínas puede unirse o separarse dependiendo de las condiciones y necesidades de la bacteria (Mahdavi et al., 2002).
1.10. Citotoxina vacuolizante VacA de H. pylori.
Uno de los factores de virulencia más importante con los que cuenta H. pylori es la citotoxina vacuolizante VacA (del inglés Vacuolating Activity Citotoxin), esta proteína es codificada por el gen vacA, el cual cuenta con una longitud aproximada de 3864pb y en donde se pueden distinguir regiones conservadas y regiones variables por lo que se tienen diferentes alelos. En la secuencia señal (s) se han descrito dos grupos principales, s1 y s2. En la región media (m) se tienen dos grupos principales, m1 y m2. La combinación de estas secuencias da como resultado los diferentes alelos, los cuales pueden ser: s1/m1, s1/m2, s2/m1 y s2/m2. Estas diferentes combinaciones determinarán la actividad vacuolítica de la
proteína madura VacA en condiciones in vitro (Atherton et al., 1995; van Doorn et
al., 1998; Wang et al., 2003).
Cepas de H. pylori que presentan el genotipo s1/m1 tienen una alta toxicidad, mientras las s2/m2 dan como resultado una proteína que no induce vacuolización, esto se debe a que las cepas con alelos s2 codifican para una proteína con un segmento hidrofílico de 12 aminoácidos en la región amino-terminal, este segmento interfiere en la actividad vacuolítica de la toxina.
1.10.1. Estructura de la proteína VacA.
La proteína VacA madura está formada por dos subunidades, p33 y p55. La región p33 junto con la primera porción de p55 tienen la capacidad de vacuolizar, mientras que la segunda parte de p55 es la encargada de que la proteína se una a la célula blanco. Existen diferencias entre la pro-toxina y ya la toxina madura, debido a los cortes y pérdidas de secciones que ésta sufre durante su procesamiento, una de ellas es el peso molecular, la protoxina pesa 140kDa, mientras que la proteína madura pesa 88kDa (un solo monómero).
VacA puede ser translocada al exterior de la bacteria, el péptido señal guía a la proteína del citoplasma al espacio periplásmico, donde la región P40 se une a la membrana externa, para que funcione como transportador de las regiones P33 y P55; posteriormente enzimas con actividad proteolítica cortan la región P40 y es secretada la proteína madura.
Una vez en el exterior se unen de 6 a 7 monómeros de la toxina para formar hexámeros y heptámeros de la proteína (Figura 3) y finalmente se unen dos oligómeros para formar estructuras dodecaméricas estables (Papini et al., 2001; Ivie et al., 2008).
Figura 3: Microfotografía electrónica y modelo computacional de la citotoxina VacA. Imagen obtenida mediante microscopia electrónica de la citotoxina vacuolizante VacA purificada in vitro (izquierda) y modelo de la unión de las dos subunidades (derecha). (Modificado de Reyrat et al., 1999).
1.10.2. Actividad biológica de VacA.
Vacuolización. Una de las primeras características biológicas que se observó en VacA fue la actividad vacuolizante. Cuando se coloca VacA en cultivos celulares epiteliales in vitro (HeLa, AGS, RK-13), bajo condiciones ácidas, es capaz de formar abundantes vacuolas citoplásmicas (Tombola et al., 1999). En esta actividad las subunidades que conforman VacA (P55 y P33) juegan un papel específico .La región P55 es la quereconoce y se une a la célula blanco, mientras que la subunidad P33 junto con la porción amino de la subunidad p55 tiene la actividad vacuolítica. Despues de la unión de la toxina a la superficie celular, esta es internalizada en endosomas en las cuales se forman canales anionicos. Através de estos canales se introducen iones Cl- y hay un incremento en la actividad de las ATPasas con reducción del pH interno. Posteriormente hay una movilización al interior de bases débiles que son protonadas (NH4+) e incremento
en la osmosis lo que lleva al hinchamiento de las vacuolas (Willhite et al., 2004; Ye et al., 1999 & 2000).
Formación de canales iónicos. VacA in vitro es capaz de formar canales de iones, los cuales son dependientes de voltaje y son anión-selectivos in vitro. En la infección in vivo, ésta podría ser una fuente de nutrientes para H. pylori. Por este
canal iónico pueden pasar los iones Cl-, HCO3-, piruvato y D-glucanato, I- y Br
-(Iwamoto et al., 1999; Tombola et al., 1999).
La función de VacA como mediador iónico en la membrana celular tiene la capacidad de regular el flujo de tal forma que el cambio osmótico que sufre la célula no sea lo suficientemente fuerte como para perder su integridad y de esta forma poder formar estos canales por periodos prolongados de tiempo (Czajkowsky et al., 2005).
Apoptosis celular. VacA es capaz de inducir apoptosis en cultivos celulares (Willhite et al., 2004; Cover et al., 2003). El mecanismo propuesto, es la formación de un canal selectivo de iones, cuyo resultado final es la liberación de citocromo C que conlleva a incrementos en la apoptosis, estos estudios se realizaron en cultivos de células de epitelio gástrico humano (AGS) (Galmiche et al., 2000; Willhite et al., 2004). H. pylori también es capaz de inducir apoptosis en macrófagos, este mecanismo le sirve a la bacteria para evadir la respuesta inmune, H. pylori logra esto mediante alteraciones a nivel mitocondrial en los macrófagos(Menaker et al., 2004; (Galgani et al., 2004).
Inhibición del procesamiento de antígeno y activación de linfocitos. Otro mecanismo por el cual VacA evade la respuesta inmune del huésped es impidiendo el procesamiento del antígeno (Linfocitos B) y la activación de linfocitos T. Estudios in vitro demuestran que VacA disminuye la actividad para presentar antígenos en los linfocitos B, actuando sobre las moléculas de histocompatibilidad tipo II (MHC II) (Molinari et al., 1998). VacA actúa también inhibiendo la activación de linfocitos T, esta citotoxina interfiere con el receptor entre linfocito-interleucina II (2), dando como resultado que se tengan niveles bajos en la transcripción de IL-II. Esta citocina es necesaria para la viabilidad y proliferación de los linfocitos T (Gebert et al., 2003).
1.11. Isla de patogenicidad (cagPAI).
La isla de patogenicidad cagPAI (cagPAI) es un conjunto de 27 genes, cuya longitud es de aproximadamente 40Kb (Figura 4). Estos genes fueron adquiridos mediante transferencia horizontal y hasta el momento se ha descrito homología de diez genes de esta isla con algunos de los que conforman el sistema de secreción tipo IV (SST4) de Agrobacterium, Bordetella, Legionella y Bartonella (Kutter et al., 2008). La presencia de cagPAI se ha asociado epidemiológicamente al desarrollo de ulcera duodenal y cáncer gástrico (Parsonnet et al., 1997; Oliveira et al., 2003; Gatti et al., 2005; Backert et al., 2004).
Figura 4. Esquema de la isla de patogenicidad cagPAI. En esta imagen se muestran los 27 genes que conforman la isla de patogenicidad de H. pylori (modificada de Fischer
et al., 2001).
La isla cagPAI de H. pylori es capaz de formar un sistema de secreción tipo IV, algunos de los genes que forman esta isla guardan homología con genes de otros patógenos como Agrobaceterium tumefaciens, que al igual que H. pylori forma un SST4, la comparación del SST4 de H. pylori con otros los presentes en otros patógenos (Tabla 2) ha sido de gran utilidad para poder entender mejor el funcionamiento del sistema de secreción en H. pylori.
Tabla 1: Homología entre los genes presentes en cagPAI de H. pylori y A.
tumefaciens.
cagPAI de H. pylori SST4 A. tumefaciens
orf9 virB1
cagC virB2
Continuación tabla 1:
cagPAI de H. pylori SST4 A. tumefaciens
orf16 virB6 cagT virB7 orf17 virB8 orf15 virB9 orf13/14 virB10 orf11 virB11 orf10 virD4
Las funciones específicas de los componentes del SST4, se han clasificado en tres grupos. Dependiendo de la función que realizan se encuentran los genes que participan en la formación estructural del core del SST4, las proteínas asociadas al pili y las involucradas en la aportación de energía, en la tabla 3 se muestran cuales es la función descrita hasta el momento para los genes que forman el SST4.
Tabla 2: Función de los genes que forman el SST4 de H. pylori.
Formación del Pili en el SST4 de H. pylori.
Formación del core del SST4 de H. pylori.
Aporte energético para la función de SST4.
cagC y cagL cagT, cagE, orf16, orf17,
orf15 y orf 13/14
cagE, orf11 y orf10
H. pylori utiliza principalmente este sistema de secreción para inyectar hacia la
célula huésped la proteína CagA. Esta proteína es codificada por el gen cagA y tiene diferentes actividades dentro de la célula huésped, esto va a depender si la proteína CagA es fosforilada o no.
Es necesaria la participación de 20 de los 27 genes que conforman cagPAI para la translocación de cagA, dentro de los cuales 15 tienen la capacidad de inducir la expresión de IL-8 y 2 genes son parcialmente esenciales (Tabla 1).
Tabla3. Genes esenciales para la translocacion de CagA.Genes esenciales para la translocación de CagA. Esto se determinó eliminando a cada uno de los genes y evaluando si la mutante era capaz de inyectar CagA. También se muestra que genes que codifican proteínas que inducen la expresión de IL-8 (Fisher et al., 2001).
Esencial para la translocación de CagA
Inducción de IL-8 No esencial para la translocación
Parcialmente esenciales
orf11, orf16, orf18, cagE, cagL, orf17, cagG, orf15, orf9, cagH, cagT, cagM, orf13/14, cagI, orf10,
cagF, cagD, cagC, orf8 y
cagA
orf8, orf9, orf13/14, orf15, orf16, orf17, orf18, cagT, cagM, cagL, cagH, cagE,
cagC, orf11 y cagD. cagP, cagQ, cagS, orf6 y orf7 cagN y orf12
Dentro de la translocación de CagA, particularmente se piensa que CagF juega un papel esencial, ya que funge como chaperona de CagA, además de iniciar el proceso de translocación. CagF comparte varias características con otras proteínas chaperonas o parecidas a chaperonas presentes en otros grupos de bacterias, algunas de ellas es el punto isoeléctrico (pI 4.5), un alto contenido de dominios α-hélice y un peso molecular de 35 kDa, esta última característica contrasta con otras proteínas de similar función, ya que las más pesadas tienen una masa de 20kDa, esta diferencia puede estar relacionada con las propiedades de asociación a membrana de CagF. (Fisher et al., 2001)
El dominio de unión entre CagF y CagA se da en la región C-terminal de CagA, que contiene la región con la secuencia señal de secreción. El resto de las proteínas involucradas en la translocación de CagA son necesarias para
estabilizar la translocación de CagA, aunque estudios sugieren que CagF es el primer contacto con CagA pues en ausencia de esta proteína la translocacion no se puede dar (Pattis et al., 2007; Couturier et al., 2006)
1.11.1 Actividad biológica de CagA.
Se han encontrado asociaciones entre el desarrollo de algunas enfermedades como úlcera péptica o cáncer gástrico y la presencia de cagPAI y cagA, este comportamiento se ha visto en diferentes grupos poblacionales.
Antes de que CagA sea translocada hacia la célula epitelial, es necesaria una interacción entre el SST4 y el epitelio celular, esta interacción se piensa que tiene lugar en las integrinas presentes en la célula del huésped. Las integrinas son moléculas transmembranales de adhesión celular, presentes en el epitelio gástrico, cuya interacción está mediada por unión de motivos Arg-Gly-Asp (RGD). Estos motivos se encuentran en CagL (proteína codificada por cagPAI) y que se encuentra presente en el pili que forma el SST4. La familia de las integrinas a las que se une H. pylori es del tipo α5β1. La unión entre las integrinas α5β1 y CagL da
lugar a un efecto conocido como “ruffling” que es un leve ondulamiento en la superficie de la membrana celular, este es el primer efecto que sufre la célula del huésped, la localización de las integrinas es en la superficie basolateral donde el acceso es más difícil para la bacteria.
Una vez que CagA se encuentra dentro de la célula, puede o no ser fosforilada. La fosforilación se da por las mismas cinasas del hospedero y ocurre en las tirosinas de los motivos EPIYA (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala). CagA cuenta con 5 motivos EPIYA en la región C-terminal, pero CagA solo puede ser fosforilada en dos sitios EPIYA distintos, aunque también se puede presentar fosforilación en los dos sitios. La fosforilación es llevada a cabo por dos tipos de cinasas, las de la familia Src y por las Abl, Las Src participan en el control de los procesos del citoesqueleto celular,
la diferenciación de células normales y en procesos carcinogénicos. (Tammer et
al., 2007; Selbach et al., 2002).
CagA fosforilada (CagAPY) es capaz de unirse a tres proteínas presentes en el citoplasma celular, estas son: tirosina fosfatasa Shp-2, tirosina cinasa Csk y adaptadora de la proteína Crk. Las tres están involucradas de forman directa en los rearreglos del citoesqueleto, ya que intervienen entre las cascadas de señalización de la polimerización y despolimerización de la actina. La suma de estos eventos da como principal resultado una deformación y alargamiento estructural de la célula epitelial, efecto conocido como “hummingbird” (Figura 5) (Higashi et al., 2002; Susuki et al., 2003; Tsutsumi et al., 2003).
Figura 5: Cambio en la morfología celular ocasionado por H. pylori. Efecto “hummingbird” ocasionado por H. pylori. Imagen del efecto “hummingbird” en cultivo celular, consecuencia de cambios en el citoesqueleto de la célula, donde se observa el cambio en la morfología. (Tomado de Segal et al., 1999).
También cuando CagA no es fosforilada, actúa junto con la peptidoglicana presente en la célula, sobre factores de transcripción celular que a su vez intervienen en los procesos mitogénicos, anti-apoptóticos y proinflamatorios.
Cuando CagA no esta fosforilada, es capaz de desestabilizar la membrana celular afectando los sitios de comunicación intercelular conocidos como AJ y TJ (del inglés Adherence Junctions y Tight Junctions). La forma en la que CagA sin fosforilar interviene es actuando entre la unión de proteínas OZ-1 y JAM, las cuales a su vez están unidas a la proteína transmembranal TJ, dando como
resultado inestabilidad celular; mismo mecanismo que ocurre con la proteína transmembranal E-caderina presente en el sitio AJ, donde CagA interviene entre unión de E-caderina y β-caderina, incrementando la cantidad de β-caderina libre en el citoplasma celular y desestabilizando la membrana. Otra forma se da cuando CagA se une específicamente a Par1 inhibiendo la actividad de esta cinasa, reguladora central de la polaridad, promoviendo la pérdida de polaridad celular. Todas estas intervenciones dan como resultado que la célula pierda estabilidad en su membrana (Amieva et al., 2003; Murata-Kamiya et al., 2007).
También existe evidencia de que CagA cuando no está fosforilada actúa sobre ciertas vías de transcripción y activación, una de ellas es potencializando la activación del factor transcripcional proinflamatorio NF-κB, vía la ruta Ras>Raf>Mek>Erk, esto se da cuando CagA interfiere en una GTPasa que actúa sobre H-Ras, primer punto de esta vía y desencadenante de toda la reacción (Brand et al., 2005).
Otro factor transcripcional que es sobreactivado es la β-catenina/LEF, esto podría deberse a la presencia en exceso de β-catenina, proteína que conduce la sobreregulacion transcripcional de genes mitógenicos involucrados en carcinogénesis (Murata-Kamiya et al., 2007).
Finalmente, CagA sin fosforilar es capaz de inhibir la apoptosis celular, esto es al activar la secreción de una metaloproteinasa y una proteína anti-apoptótica (MCL-1 del inglés Myeloid Cell Leukemia sequence (MCL-1), la activación de estas proteínas es mediante la vía Erk, misma que interviene en el señalamiento proinflamatorio. La reducción de apoptosis interfiere en la renovación del tejido epitelial el cual podría permitir una mayor colonización de H. pylori in vivo (Mimuro et al., 2007).
La presencia de los factores de virulencia por si solos no pueden explicar el por que algunas personas llegan a desarrollar patologías tan graves como las úlceras o incluso un cáncer gástrico, mientras que otras no presentan síntomas. Una posible respuesta a esta interrogante podría encontrarse en los diferentes niveles
de expresión que presentan los factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad.
2. JUSTIFICACIÓN
Helicobacter pylori es un patógeno que infecta alrededor del 50% de la población a
nivel mundial, donde el 1% desarrolla cáncer gástrico. Las características genéticas de la bacteria es un factor importante que determina en parte el desarrollo de la enfermedad. Actualmente se conoce poco sobre los niveles de expresión de genes relacionados con la patogenicidad y la virulencia in vivo.
En la infección en humanos los niveles de expresión de estos gene podrían estar relacionados con el desarrollo de gastritis, úlcera duodenal y cáncer gástrico, por lo que un estudio de este tipo ayudaría a comprender mejor los procesos patológicos de H. pylori en humanos.
3. HIPÓTESIS.
No solo las diferencias cualitativas de genes asociados a virulencia, sino también diferencias cuantitativas en estos genes, pueden estar asociados con el desarrollo de las patologías (gastritis, ulcera duodenal y cáncer gástrico). Por lo que, en este estudio se cuantificó la expresión relativa de genes de cagPAI y genes asociados a patogenicidad que están fuera de la isla in vivo.
Hipotéticamente esperamos encontrar una mayor expresión de cagPAI y los genes fuera de ésta, en úlcera duodenal y en cáncer gástrico, comparados con gastritis donde esperamos que la expresión sea menor.
4. OBJETIVO.
Determinar los niveles de expresión in vivo en genes asociados a factores de virulencia de H. pylori en diferentes patologías.
4.1. OBJETIVOS PARTICULARES.
• Cuantificar la expresión in vivo de los genes de la isla de patogenicidad
cagPAI, vacA, sabA, babA, rocF, napA y katA de H. pylori en biopsias
gástricas de pacientes con gastritis, úlcera duodenal y cáncer gástrico. • Determinar si existe relación entre los niveles de expresión y el cuadro
5. MATERIAL Y MÉTODOS.
5.1. Población de estudio.
Sujetos que cumplan con los criterios de inclusión, que sean positivos a la infección por H. pylori y que presenten cuadro clínico de gastritis, úlcera duodenal o cáncer gástrico en los hospitales de Oncología, Especialidades y Gabriel Mancera del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y que hayan dado su consentimiento informado de toma de biopsia y participación en el estudio por escrito.
5.2. Criterios de inclusión.
Para este estudio se consideraron pacientes mayores de 21 años, de ambos sexos y con diagnóstico de gastritis, úlcera o cáncer gástrico, cuyas biopsias gástricas hayan sido positivas para el aislamiento de H. pylori.
5.3. Criterios de exclusión.
Pacientes que hayan recibido tratamiento con antibióticos al menos 30 días antes de la toma de muestra o que hayan consumido dosis terapéuticas de medicamentos anti-inflamatorios durante los 7 días previos a la toma de muestra o pacientes diagnosticados con gastritis tipo A (autoinmune).
6. Aislamiento e identificación.
H. pylori se aisló a partir de biopsias gástricas, las cuales se inocularon en gelosa
sangre con y sin antibiótico, se incubaron a 37°C bajo una tensión de CO2 (15%)
de 3 a 10 días. Después de este periodo las colonias sospechosas se identificaron por medio de la morfología colonial y microscópica (tinción de Gram), además de pruebas bioquímicas (ureasa, catalasa y oxidasa).
Las colonias seleccionadas se cosecharon en solución salina fisiológica para la extracción de DNA.
6.1. Extracción del DNA bacteriano.
A partir de una suspensión de H. pylori en solución salina, se centrifugaron los microtubos a 15,000g por 2min y se eliminó el sobrenadante. Se adicionaron 600µl de solución de lisis (Promega) y se mezclaron ligeramente, se incubó por 5min a 80°C, transcurrido este tiempo dejar enfriar a temperatura ambiente y adicionar 1.2µl de RNasa (10mg/ml) (Promega), mezclar ligeramente. Incubar la mezcla de 15-60min a 37°C, y adicionar 200µl de solución de precipitación de proteínas (Promega), mezclar vigorosamente en el vortex e incubar en hielo por 5min. Centrifugar a 15,000g durante 6min, decantar el sobrenadante, adicionar 600µl de etanol al 70% y mezclar ligeramente. Centrifugar a 15,000g durante 3min y descartar nuevamente el sobrenadante, dejar secar al aire y adicionar 100µl de agua estéril e incubar a 65°C por 1h. Cuantificar por espectrofotometría (260nm) y conservar el DNA a -20°C.
6.2. Extracción y purificación de RNA Total.
Para cada extracción de RNA se maceraron dos biopsias gástricas en 250µl de trizol (Invitrogen), posteriormente se completó un volumen de 1ml con trizol, se dejó reposar por 5min a temperatura ambiente y se agregaron 200µl de cloroformo, se agitó el microtubo por inversión durante 15s y se centrifugó a 13,000g por 15min a 4°C. Se transfirio la capa acuosa a otro tubo que este libre de RNasas y se adiciono 500µl de isopropanol e incubo a temperatura ambiente por 10min. Posteriormente se centrifugo a 13,000g por 10min a 4°C, se desecho el sobrenadante y lavó con 1ml de etanol al 75%, Agitar en vortex y centrifugar a 10000g por 5min a 4°C y descartar todo el sobrenadante. Secar la pastilla al aire y resuspender en 80µl de agua libre de RNasas por 10min a 55-60°C.
6.3. Purificación de RNA.
Preparar la siguiente mezcla al momento de usarla.
Reactivo Concentración final
DNase I (Roche) 0.1U/µl
Inhibidor de RNasas (Promega)
0.4U/µl
Tris pH 8.30 0.01 M
MgCl2 0.01 M
Adicionar 20µl de la mezcla a 80µl de RNA, e incubar a 37°C por 30min. Adicionar 6µl más de DNasa y continuar incubando durante 30min más. Transcurrido este periodo purificar el RNA utilizando el kit RNAeasy (Qiagen).
Realizar el tratamiento con DNAsa y purificación por duplicado y eluir finalmente con 100µl de agua libre de RNasas. Conservar el ARN a -70°C.
6.4. Determinación de la presencia de cagPAI mediante PCR.
Preparar una mezcla de reacción conteniendo en un volumen total de 50 μl, 5μl de buffer para PCR 10X (Roche Diagnostics), 50 μM de cada nucleótido (Roche Diagnostics), 20pM de cada iniciador, 2 unidades Taq DNA polymerasa (Roche) y 1 μl de MgCl2. La reacción de PCR se realiza bajo las siguientes condiciones:
Ciclos Temperatura Tiempo
1 94°C 1:30 min 35 94°C 1:00 min 57°C 1:00 min 72°C 1:00 min 1 72°C 5:00 min 4°C ∞
Tamaño de los productos obtenidos.
Tamaño (pb)
cagPAI positivo No
amplificación
Secuencia de los juegos de iniciadores.
Gen Secuencia (5’>3’) Referencia
cag2 y
cag25
ACA TTT TGG CTA AAT AAA CGC TG TCA TGC GAG CGG CGA TGT G
Akopyants N. et al 1998
6.5. Determinación de la expresión relativa de genes de virulencia mediante RT-PCR en tiempo real.
6.5.1. Diseño y síntesis de iniciadores.
Previamente fueron diseñados pares de iniciadores (Solnick J. y col.) para amplificar los genes de virulencia y cada gen de cagPAI de H. pylori, usando el software Oligo6.0 y las secuencias conocidas de H pylori J99 y 26695. Todos los pares de iniciadores tienen una temperatura de fusión calculada de 68 a 70ºC y amplifican productos de aproximadamente 250 pb. Estos iniciadores fueron probados con DNA extraído de cada aislado de H. pylori de cada paciente, para asegurar que la amplificación fuera eficiente. Solo los pares de iniciadores con una eficiencia mayor a 85% fueron utilizados.
Juegos de iniciadores adicionales fueron sintetizados conforme se necesitaron (esto fue cuando algún gen obtuvo constantemente una eficiencia baja en diferentes muestras).
Mezcla de reacción en un volumen total de 10 μl conteniendo:
Reactivo Concentración final
Buffer de Tricina 0.25 M Desoxiribonucleotidos trifosfato (dNTP) 0.3 mM uracil-DNA-glicosilasa 0.4 U Dimetilsulfóxido (DMSO) 1 %
SyBR GREEN en DMSO 4%
Retrotranscriptasa (rTth) 2 U
MnCl2 2.4 mM
RNA o DNA 0.001875 ng/µl (DNA) o 20 ng/µl (RNA)
Iniciadores 1 µMol
La acumulación del producto del RT-PCR es medida en cada ciclo por medio de detección de fluorescencia a 490nm. Todas las reacciones se llevaron a cabo usando el termociclador Light Cycler 2.0 (Roche Diagnostics). El tamaño correcto de cada producto de PCR fue confirmado por cada par de iniciadores por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2%. Se examino la ausencia de DNA contaminante en cada muestra corriendo reacciones RT-PCR en tiempo real y reemplazando Mn con 2.4 mM MgCl2, en estas condiciones la rTth tiene actividad
de DNA polimerasa, pero no actividad de transcriptasa reversa. Por lo que en ausencia de DNA no tendrá que amplificar ningún producto. Todas las pruebas se realizaron por duplicado.
La reacción se realizo bajo las siguientes condiciones: Paso Temperatura (°C) Tiempo Inicio 50 3min Retro-transcripción 60 30min Amplificación (40 ciclos) 95 20seg 59 1min Melting o temperatura de fusión. 95 0seg 65 15seg 95 0seg
Melting point o Temperatura de fusión (Tm): Temperatura a la cual el producto de RT-PCR se disocia, es específica para cada producto.
6.5.2. Cálculo de la expresión relativa del gen.
El Ct observado obtenido con el DNA de cada aislado clínico fue corregido
utilizando el Ct observado con el DNA de la cepa control ATCC 26695 para determinar la eficiencia del juego de iniciadores. Dado que el número de bacterias en cada muestra fue desconocido, el Ct observado para cada RNA mensajero fue
normalizado con el Ct del RNAm del gen 16S ribosomal, el cual es siempre encontrado en concentraciones más altas que los RNAm más abundantes. Los números de transcritos normalizados fueron entonces expresados como 2^( Ct 16S
rRNA-Ct del gen blanco). (Boonjakuakul et al, 2004).
Numero de muestras analizadas: Para este estudio se considero tomar 10 muestras de cada patología (gastritis, úlcera duodenal y cáncer gástrico).
7. RESULTADOS.
a) Cultivo de H. pylori y prevalencia de cagPAI.
Tabla 4. Total de muestras analizadas correspondientes a tres diferentes patologías, se encontró que el mayor porcentaje de aislados clínicos cagPAI+ se encontraron en ulcera duodenal y cáncer gástrico.
Patología Total Cultivo + cagPAI +
Gastritis 142 51 (35%) 29 (56%)
Úlcera duodenal 38 13 (34%) 10 (76%)
Cáncer gástrico 94 27 (30%) 19 (76%)
Total 274 91 (28%) 58 (63%)
Se han trabajado un total de 274 biopsias de pacientes con tres diferentes patologías, gastritis, ulcera duodenal y cáncer gástrico. De las cuales solamente 91 biopsias (28%) han resultado positivas al cultivo. La baja proporción de muestras positivas al cultivo se debió a que la biopsia contiene una gran carga de contaminantes microbianos (flora normal) y en la serie de resiembras que se realizan no es posible aislar a H. pylori o que el paciente haya consumido antibióticos y no la declaro (Tabla 1).
De las 91 biopsias positivas al cultivo, solo 58 (63%) presentan la isla de patogenicidad. La asociación que existe entre la presencia de cagPAI al desarrollo de ulceras y cáncer gástrico, podemos observarla en la tabla 1, donde el mayor porcentaje (76%) de cagPAI+ esta en ulcera duodenal y cáncer gástrico.
Tabla 5. Pacientes analizados en los niveles de expresión de genes relacionados a virulencia. Patología Casos Gastritis 10 Úlcera duodenal 10 Cáncer gástrico 10
b) Expresión relativa de cagPAI en H. pylori de pacientes con gastritis.
Figura 6. Expresión relativa promedio de cagPAI de H. pylori en pacientes con gastritis (n=10)
En la fig. 6 se muestran los resultados de los niveles de expresión de H. pylori en pacientes con gastritis, cuantificando el RNAm de los diferentes genes.
Los genes dentro de la isla con mayor expresión relativa fueron: orf6, orf18, cagC y cagA. Donde a orf6 no se conoce alguna función específica, orf8 es necesario para la traslocacion de CagA e induce IL-8, cagC forma parte estructural del pili además de inducir IL-8 y cagA es el gen que codifica para la proteína efectora y que es translocada. Expr esión r ela tiva
Los genes orf13/14, orf15, orf16, orf17 y cagT que forman lo que se conoce como el core del T4SS, tienen niveles de expresión parecidos entre si.
El gen cuya expresión fue más baja fue cagI dentro de cagPAI , del que se sabe que no participa en la translocación de CagA.
Los genes orf10, cagE y orf11, cuyos transcritos participan en la aportación de energía, presentan niveles de expresión parecidos.
c) Expresión relativa de cagPAI en H. pylori de pacientes con úlcera duodenal.
Figura 7. Grafica de la expresión relativa promedio de cagPAI en pacientes con ulcera duodenal (n=10).
En la figura 7 se muestran los niveles de expresión de cagPAI en pacientes con ulcera duodenal. Los genes con mayor expresión fueron: cagA, cagC y cagD, cuya función es: cagA, codifica para la proteína efectora, cagC forma parte estructural del pili e induce la expresión de IL-8 y cagD es necesario para la translocación de CagA y también es capaz de inducir la expresión de IL-8 (Fischer W. et al. 2001; Cendron et al 2009).
Al igual que en gastritis los genes que forman el core (orf13/14, orf15, orf16, orf17 y cagT) tienen niveles de expresión similares entre si.
Los genes orf10, cagE y orf11 también presentan niveles de expresión parecidos y todos participan en el aporte energético.
Genes presentes en cagPAI de H. pylori
Expre
sión
r
ela
d) Expresión relativa de cagPAI en H. pylori de pacientes con cáncer gástrico.
Figura 8. Grafica de la expresión relativa promedio de cagPAI en pacientes con cáncer gástrico (n=10).
En la figura 8 observamos que este grupo de genes los que presentaron la mayor expresión relativa fueron: cagA, cagF, cagC, cagP, orf15 y orf18; cuyas funciones son en cagA, codificar para la proteína efectora, cagF reconoce las integrinas presentes en la célula del huésped y forma parte estructural del pili, cagC codifica para la proteína CagC, que forma parte estructural del pili, orf15 forma parte del core e induce la secreción de IL-8, orf18 solo se sabe que también favorece la secreción de IL-8 y cagP no se le conoce alguna función específica.
Llama la atención que en cáncer gástrico no se expresen los genes cagI y cagD para 9 de los 10 casos estudiados, mostrando solo expresión en uno de los casos, cuya expresión se muestra en la figura 8, mientras que en gastritis y en ulcera duodenal si se expresan, cagD y cagI que son esenciales para la translocación.
Expr
esión
r
ela
tiva
e) Comparación de la expresión relativa de cagPAI en H. pylori de pacientes con gastritis, úlcera duodenal y cáncer gástrico.
Figura 9. Comparación de los niveles de expresión relativa promedio de cagPAI en las tres patologías.
Se compararon las medias de cada grupo por medio de la prueba estadística t de
student, no se encontró diferencia significativa entre los valores de cada grupo, en
la mayoría de los genes. Los únicos casos donde la diferencia si fue estadísticamente significativa son: cagH (P= 0.025) y cagG (P= 0.029) cuando se comparo gastritis contra úlcera dúodenal.
El gen cagH participa en la formación del core se une a la membrana citoplasmática de H. pylori, además de ser necesario para translocar CagA e inducir IL-8. Mientras que a cagG no se le ha descrito alguna función específica, pero es también necesario para inyectar CagA (Fischer W et al, 2001; Kutter S et
al, 2008). Expre sión r ela tiva
f) Expresión de genes fuera de cagPAI en pacientes con gastritis.
Figura 10. Expresión relativa promedio de los genes asociados a virulencia que están fuera de la isla de patogenicidad (cagPAI) en gastritis (n=10).
En la figura 10 se muestran los niveles de expresión relativa de los genes fuera de
cagPAI, el gen que menos se expresa es rocF (codifica para la arginasa), el que
tuvo mayor expresión es napA el cual codifica para una proteína que es capaz de secuestrar hierro y que ayuda a combatir el estrés oxidativo.
El orden de la expresión relativa de los genes estudiados es:
napA>katA>babA>vacA>sabA>rocF. Estas diferencias no fueron estadísticamente
significativas.
Nuestros resultados concuerdan con lo reportado por Boonjakuakul y cols. en el 2004 para la expresión relativa de vacA, babA, napA y katA en cepas aisladas de pacientes con gastritis (Fig. 10).
Expr esión r ela tiv a
Figura 11: Comparación entre los niveles de expresión de genes fuera de cagPAI obtenidos por Boonjakuakul (barras en negro) y los obtenidos en el presente trabajo (barras en verde), (modificado de Boonjakuakul J. et al 2004).
f) Expresión de genes fuera de cagPAI en pacientes con úlcera duodenal.
Figura 12. Expresión relativa promedio de los genes asociados a virulencia que están fuera de la isla de patogenicidad (cagPAI) en pacientes con ulcera duodenal (n=10). Exp resió n re lativa E xpres ión rel ativ a
Genes fuera de cagPAI asociados a virulencia
En la figura 12, el patrón que presentan los niveles de expresión es:
napA>katA>vacA>sabA>babA>rocF, donde al igual que gastritis el gen que mayor
expresión tiene es napA, el que presenta menor expresión es rocF. f) Expresión de genes fuera de cagPAI en pacientes con cáncer gástrico.
Figura 13. Expresión relativa promedio de los genes de virulencia que están fuera de la isla de patogenicidad (cagPAI) en pacientes con cáncer gástrico (n=10). En la figura 13, encontramos un comportamiento en los niveles de expresión diferente, al que presentaron gastritis y ulcera duodenal. Aquí los niveles de expresión más altos corresponden a vacA y babA. El gen que tuvo menor expresión es rocF pero su expresión es muy parecida al resto de los genes, donde la diferencia no es estadísticamente significativa.
En general observamos que todos los genes fuera de cagPAI presentan niveles de expresión más altos que las otras dos patologías, aunque estas diferencias no son estadísticamente significativas con una P>0.05 (Fig. 13).
Expr
esión
r
ela
tiva
g) Expresión de genes de virulencia de H. pylori de genes que están fuera de
cagPAI en pacientes con gastritis, úlcera duodenal y cáncer gástrico.
Figura 14. Comparación de los niveles de expresión relativa de genes asociados virulencia que están fuera de la cagPAI en las tres patologías.
La comparación estadística de las medias para cada gen entre los tres grupos estudiados, muestra que no existe diferencia significativa entre patologías. Sin embargo la tendencia es que vacA, babA, sabA y rocF se expresen mas en el grupo de cáncer comparado con el de gastritis y ulcera duodenal.
Al comparar las medias de cada grupo mediante la t de student para determinar si las diferencias que se observan en las graficas de los niveles de expresión son significativas en los genes que están fuera de cagPAI, se encontró que ningún caso se tiene diferencia significativa entre patologías. Sin embargo la tendencia es que vacA, babA, sabA y rocF se expresen mas en el grupo de cáncer comparado con el de gastritis y ulcera duodenal.
Expre
sión
r
ela
tiva
8. DISCUSIÓN.
El resultado más evidente en la expresión de los genes, es el que presenta cagA, este gen codifica para la proteína efectora que es inyectada en la célula del hospedero. Aunque la diferencia que se observa en los niveles de expresión entre las tres patologías, no es significativa, podemos ver claramente como a medida que la gravedad de la patología aumenta, también aumenta la expresión de cagA (Figura 9).
Cuando realizamos un análisis estadístico de las medias obtenidas, encontramos que solo dos genes; cagH (P= 0.04) y cagG (P=0.029) presentan diferencias significativas en los niveles de expresión cuando se comparó gastritis contra úlcera duodenal (Fig. 9). Se sabe que estos genes son necesarios para que se lleve a cabo la translocación de CagA, además el gen cagG es capaz de inducir secreción de IL-8. El resto de los genes (pertenecientes a cagPAI y fuera de ella) no presentan diferencias significativas cuando se compara la expresión relativa de entre las diferentes patologías.
Si se realiza una comparación de la expresión relativa entre las diferentes patologías, en base a la función teórica (formación estructural del SST4, aporte energético o formación de pili) encontramos que: los genes involucrados en la formación del core (orf13/14, orf15, orf16, orf17 y cagT) presentan niveles de expresión similares entre las tres patologías, aunque en la fig. 9 pueden observase algunas diferencias (principalmente en orf15 y cagT) estas no llegan a ser significativas. La expresión constante de estos genes entre las diferentes patologías, puede ser un indicativo del importante papel que tienen estos genes, dentro del fucionamiento del SST4 (Fischer W et al, 2001).
Los genes que forman parte estructural del pili (cagC, cagE y cagL) presentan diferentes niveles de expresión entre sí, dependiendo de la patología (Fig 9). El gen cagC, que es el principal componente del pili del SST4 de H. pylori, tiene niveles de expresión muy similares entre las tres patologías. Esto nos sugiere que
el comportamiento estructural del pili en el SST4 no se ve afectado, independientemente de la patología.
Por otro lado el gen cagE, tiene un ligero aumento en la expresión en cáncer (no es estadísticamente significativa), aunque este comportamiento podría estar relacionado con otra de las funciones que tiene este gen, que es el aporte energético.
Finalmente el gen cagL, cuyo transcrito (la proteína CagL) se une a las integrinas presentes en el epitelio gástrico, presenta una expresión mayor en gastritis. La función de CagL es la de reconocer y unirse a las integrinas presentes en las células del epitelio gástrico; esta mayor expresión en gastritis podría explicarse por la integridad del epitelio y el tiempo que tiene la infección. En esta etapa, dentro del proceso patológico que lleva a cabo H. pylori, es cuando teóricamente la infección comienza y H. pylori requiere de unirse al epitelio gástrico y por lo tanto necesitaría una mayor expresión de esta proteína (CagL) en gastritis, que en ulcera o cáncer (Cho S. et al 2006).
A los genes orf10, orf11 y cagE se les ha descrito funciones relacionadas al aporte energético del SST4. En la fig. 9 podemos ver que la expresión de estos tres genes es mayor en cáncer gástrico que en las otras patologías, aunque la diferencia no es estadísticamente significativa, este comportamiento es constante en los tres genes, lo cual nos puede sugerir que la necesidad energética del SST4 es constante independientemente de la patología.
Con respecto al resto de los genes (que no participan en ninguno de los tres procesos descritos anteriormente). Tenemos que cagI y cagD no se expresan en las cepas provenientes del grupo de cáncer gástrico (solo se encontró expresión en uno de los diez casos), a pesar de estar presentes en el genoma. Estos genes son necesarios para que se lleve a cabo la translocación de CagA, además de que son capaces de inducir la secreción de IL-8; la ausencia en la expresión de estos genes podrían ser un indicador bacteriano de posible factor para el desarrollo de esta patología, aunque debemos tener presente que el desarrollo de estas
