1 3
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TESIS
PRESENTADA POR LA BACHILLER:
BELTRÁN CHÁVEZ, Marleni Carmen
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
HUANCAYO – PERÚ 2010
“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN TRES ESTADÍOS DE MADUREZ DEL SAUCO (Sambucus
peruviana L.) DE NOR YAUYOS-LIMA”
2
ASESOR:
ING. LUIS ARTICA MALLQUI
3
ÍNDICE
Página RESUMEN
I. INTRODUCCIÓN
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. EL SAUCO (Sambucus peruviana L.) 2.1.1. Origen y Distribución Geográfica 2.1.2. Taxonomía y Denominaciones 2.1.3. Condiciones de Cultivo
2.1.4. Producción 2.1.5. El Fruto
2.1.6. Características Fisicoquímicas Según el Estadío de Madurez
2.1.7. Composición Químico Proximal 2.1.8. Usos
2.2. COMPONENTES FITOQUÍMICOS DE FRUTOS NATIVOS 2.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
2.1.1. Métodos de Evaluación
2.4. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE FRUTOS Y OTROS VEGETALES
2.5. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL SAUCO III. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN 3.2. MATERIALES
3.2.1. Materia prima
3.2.2. Equipos, materiales y reactivos 3.3. MÉTODOS DE ANÁLISIS
3.3.1. Análisis fisicoquímico 3.3.2. Análisis químico proximal 3.3.3. Determinación de polifenoles
3.3.4. Determinación de la actividad antioxidante
3.4. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL,DIAGRAMA DE FLUJO 3.5. ESQUEMA EXPERIMENTAL
3.5.1. Variables intervinientes 3.5.2. Variables independientes 3.5.3. Variables dependientes
1 2 2 2 2 4 4 5
6 6 7 8 11 13 16 20 23 23 23 23 23 25 25 25 25 25 25 27 28 28 28 28
4 3.6. DISEÑO ESTADÍSTICO
3.7. MODELO MATEMÁTICO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. ANÁLISIS FISICOQUÍMICO
4.2. ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL 4.3. EVALUACIÓN DE POLIFENOLES
4.4. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE V. CONCLUSIONES
VI. RECOMENDACIONES VII. BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
29 29 30 30 34
36 41 46 47 48 54
5
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla N°
Página
01
02
03
04 05 06
07 08 09
10
11 12
Superficie, producción y rendimiento del fruto de sauco a nivel nacional (2005 a 2009)
Composición químico proximal del fruto de sauco (g/100g muestra)
Contenido de polifenoles en frutas nativas peruanas y recursos vegetales promisorios
Valor IC50 (µg/mL) de frutos tropicales
Actividad antioxidante de frutos según su estadío de madurez Porcentaje de inhibición de radicales libres de alimentos nativos del Perú
Actividad antioxidante de siete plantas medicinales peruanas Actividad antioxidante de cáscaras de frutos cítricos
Características fisicoquímicas del sauco según el estadío de madurez
Análisis químico proximal del sauco (g/100g muestra) en tres estadíos de madurez
Contenido de polifenoles del sauco en tres estadíos de madurez Actividad antioxidante del sauco en tres estadíos de madurez
4
7
11 17 18
19 19 20
30
35 37 41
6
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura N°
Página
01 02 03
04 05 06 07 08
09
10
11
12
13
14
Vista de un árbol de sauco
Estructura física del fruto de sauco
Estructura química del ácido cafeico, ácido ferúlico y ácido clorogénico
Estructura química general de las flavonas
Estructura química del ácido gálico, la catequina y el ácido elágico Método del 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)
Estructura química general de las antocianinas
Diagrama de flujo para la obtención de los extractos del sauco en estadío verde, pintón y maduro
Comportamiento de los sólidos solubles (°Brix) con respecto al estadío de madurez del sauco
Comportamiento del pH con respecto al estadío de madurez del sauco
Comportamiento de la acidez total con respecto al estadío de madurez del sauco
Acidez total (expresado en ácido cítrico) según los estadíos de madurez del sauco
Comparación del contenido de polifenoles entre los estadíos de madurez del sauco
Comparación de la actividad antioxidante entre los estadíos de madurez del sauco
3 5
9 10 10 14 21
27
31
32
32
34
37
41
7
RESUMEN
En la investigación se evaluó la actividad antioxidante en tres estadíos de madurez del sauco (Sambucus peruviana L.). Se utilizó materia prima procedente del Distrito de Laraos, ubicado en la zona norte de la Provincia de Yauyos - Región Lima, a una altitud de 3564 m.s.n.m. Para obtener los extractos del sauco en estudio, los frutos recolectados fueron sometidos a selección y clasificación, lavado, pesado, secado en estufa a 50 °C por 96 horas, envasado y almacenado a temperatura ambiente. Los resultados indicaron que el mayor contenido de polifenoles del sauco se determinó en el estadío maduro 744,5mg ácido gálico/100g muestra, seguido del estadío verde 668,52 mg ácido gálico/100g muestra y por último el estadío pintón 633,72mg ácido gálico/100g muestra; mientras que la mayor actividad antioxidante, expresada en porcentaje de inhibición de radicales libres, fue para el estadío verde (58,6%), seguido del estadío maduro (54,6%) y por último el estadío pintón (45,6%). El diseño estadístico utilizado fue el Diseño Completamente al Azar (DCA) con 3 repeticiones.
Para la comparación de medias se empleó la prueba de Duncan al 5% de nivel de significación. Asimismo, el sauco presentó características fisicoquímicas de acuerdo a los diferentes estadíos de madurez. En el estadío verde se obtuvo para sólidos solubles 3,2 °Brix, pH 3,42 y acidez total 3,7%(ácido cítrico). En el caso del estadío pintón se determinó para sólidos solubles 4,9 °Brix, pH 3,51 y acidez total 1,645%
(ácido cítrico). Finalmente, en el estadío maduro se registró para sólidos solubles 5,9
°Brix, pH 3,64 y acidez total 1,065% (ácido cítrico).
1 5
6
I. INTRODUCCIÓN
El Distrito de Laraos de la Provincia de Yauyos - Región Lima, ubicada a 3564 m.s.n.m., presenta microclima variado y producción de diversos frutos, entre los que destaca el sauco (Sambucus peruviana L.). Una característica del lugar es la existencia de éste frutal en la mayoría de las casas, en las cuales podemos encontrar personas longevas que dicen consumir los jugos y dulces derivados de estos frutos.
Razón por la cual, se toma como muestra de estudio para evaluar sus principales características fisicoquímicas, composición químico proximal, polifenoles y actividad antioxidante, considerando que es un fruto andino de múltiples usos.
El sauco, rico en vitamina C y de un color morado intenso, se consume fresco o es empleado en la elaboración de mermeladas, néctares, licores y yogures, entres otros.
Además, las frutas con un alto nivel de polifenoles, tales como las bayas de sauco, poseen típicamente gran actividad antioxidante.
Sin embargo, durante su desarrollo, maduración y almacenamiento, las frutas sufren cambios en sus fitonutrientes. También cuando éstas son procesadas y no son bien manejadas, presentan problemas sobre la degradación de sus compuestos antioxidantes, ocasionando cambios o daños en su actividad antioxidante y, por ende, en el poder benéfico sobre la salud humana. Asimismo, las controversias sobre el momento de cosecha del sauco donde se aprovecha mejor sus propiedades nutricionales y funcionales, nos motiva a evaluar la actividad antioxidante en tres estadíos de madurez: verde, pintón y maduro.
Bajo este contexto, el trabajo de investigación planteó los siguientes objetivos:
Evaluar las características fisicoquímicas (°Brix, pH y acidez).
Evaluar la composición químico proximal.
Evaluar polifenoles.
Evaluar la actividad antioxidante en tres estadíos de madurez.
1 2 3 4
2 6
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. EL SAUCO (Sambucus peruviana L.) 2.1.1. Origen y Distribución Geográfica
El sauco es una planta originaria del Perú y regiones adyacentes. Se distribuye desde Argentina hasta Costa Rica [1]. Crece espontáneamente, en climas templados y fríos, en terrenos húmedos a orilla de los ríos [2].
En el Perú, el sauco tiene un amplio rango altitudinal, desde los 2 800 hasta los 3 900 msnm, según la zona del país, pero el óptimo está entre 3 200 y los 3 800 msnm, encontrándose en los valles de las regiones de Ancash, Lima, Huánuco, Junín, Cusco y Apurímac [1].
El Sambucus peruviana L. crece y se desarrolla en la parte alta de la micro cuenca del Tulumayo en el Distrito de Comas, Provincia de Concepción. En las localidades del Valle del Mantaro, los árboles de sauco se encuentran como cerco de terrenos de cultivo y en jardines de algunas casas [3].
2.1.2. Taxonomía y Denominaciones Familia : Caprifoliaceae Género : Sambucus Especie : peruviana L.
Fuente: Palacios (2007)
Los nombres varían de acuerdo a las zonas donde se distribuye esta especie como son: “sauco” (Andahuaylas, Bolivia y Colombia), “rayan”
(Cuzco), “uvas de la sierra”, “uvilla del diablo” (Ancash), “layan”, “pintura de novia” (San Jerónimo), “ccola ccola, “kjola” (Aymara), “sauco blanco”,
“tilo” (Ecuador) [48]; entre otros nombres populares están: sabuco, caniller, ramrash, guinda, koola y láyame[2].
3 Figura 01. Vista de un árbol de sauco
El sauco es un arbusto o árbol, normalmente de 3-6m de altura. En buenas condiciones llega a alcanzar hasta 12m de altura. Sus tallos tiernos son poco resistentes, debido a su médula esponjosa; pero los fustes añosos se endurecen tanto que constituyen una de las maderas más fuertes y apreciadas para construcciones rurales. Tronco cilíndrico, a veces torcido, con copa irregular y de color verde claro característico. Las hojas son compuestas, de 7-9 foliolos imparipinnadas, oblongos y puntiagudos en el ápice, de bordes aserrados [1]. Las flores son hermafroditas, de color blanco cremoso, ligeramente fragantes e irritantes, agrupadas en cima voluminosa y con brácteas en la base. La corola posee cinco pétalos obtusos [2].
Los frutos son bayas esféricas de 5-6mm de diámetro, inicialmente de color verde y rojinegro al madurar, agrupadas en manojos colgantes, cada uno con pesos que oscilan entre los 180 a 415g [1], y contienen de cinco a seis semillas en el interior de su pulpa jugosa[2].
4 2.1.3. Condiciones de Cultivo
Es una especie poco exigente en suelos, aunque desarrolla mejor en suelos profundos, francos y limosos, con pH neutro a ligeramente alcalino. Requiere buena humedad (riego), por lo que normalmente se le encuentra plantado al borde de acequias, en cercos de chacra y en huertos mezclados, por ejemplo, con manzanos y membrillos. Por su exigencia en humedad, especialmente en etapa de prendimiento, ésta debe mantenerse a buen nivel [3].
2.1.4. Producción
La producción de sauco comienza a partir del tercer año y dura aproximadamente hasta los 50 años. Las plantas jóvenes pueden producir entre 5-10kg/año y las plantas antiguas hasta 50kg/año. Las principales regiones productoras son: Tumbes, Junín, Apurímac y Andahuaylas [5].
La planta produce sus primeros frutos a mediados del mes de noviembre hasta finales de marzo. Su producción es anual [3].
A nivel nacional la producción ha venido aumentando considerablemente en la última década, debido a la comercialización del fruto en diferentes productos. En 2009, la producción del fruto de sauco se estima que fue alrededor de 223TM [6].
Tabla 01. Superficie, producción y rendimiento del fruto de sauco a nivel nacional (2005 a 2009)
Año Superficie (Ha)
Producción (TM)
Rendimiento (Kg/Ha) 2002
2003 2004 2005
32 34 36 41
132 151 181 156
4281 4448 4232 4567
2006 41 207 5034
2007 41 210 5163
2008 41 205 5081
2009 41 223 5527
Fuente: MINAG (2009)
5 2.1.5. El Fruto
El fruto del sauco posee una estructura similar a los frutos de uva. Se compone de piel u hollejo, pulpa y semillas [3].
Figura 02.Estructura física del fruto de sauco Fuente: Cahuana (1991)
a) Piel u Hollejo
Es una membrana fina que rodea al fruto. Se encuentra recubierta por una capa cérea que protege a las células de la piel contra la acción de la humedad atmosférica e impide la penetración de gérmenes patógenos en el interior de los frutos. En el hollejo se encuentran sustancias aromáticas, y el color del fruto se debe a la presencia de la cianidina, los cuales son pigmentos naturales que
6 están presentes en las células de la piel, cuya cantidad e intensidad de color desempeñan un papel importante [3].
b) Pulpa
Constituye la mayor parte del fruto. Es de color verde transparente brillante, muy jugoso y agridulce. En ella se encuentran alojadas las semillas y es la parte del fruto que contiene la mayor cantidad de agua, ácidos, compuestos nitrogenados, azúcares y sales minerales [3].
c) Semillas
En los frutos de sauco normalmente desarrollados existen pepitas o semillas cuyo número oscila de 4 a 6. Son de color crema, forma alargada y ligeramente arqueadas. Tiene sabor amargo y astringente. Las semillas se encuentran comúnmente cubiertas por una gruesa capa incolora y transparente de naturaleza coloidal [3].
2.1.6. Características Fisicoquímicas Según el Estadío de Madurez
En un inicio los frutos son de coloración verdosa, luego cambian de tonalidad a marrón verdoso y en su madurez presentan una tonalidad de morado intenso, pulpa color guinda, semillas pequeñas e infértiles en su mayoría. En los meses de febrero y marzo, se desarrolla habitualmente este periodo, alcanzando las bayas el contenido máximo de azúcar y menor contenido de ácidos. El progreso de la maduración de las bayas es conocido exteriormente por su coloración y por la facilidad en el desprendimiento de los frutos del escobajo [5].
Los frutos de sauco tienen valores de °Brix entre 2,3 y 3,2 (estado verde), 4,7 y 5,4 (estado pintón), 6,5 y 7,2 (estado maduro). En cuanto a la acidez, los frutos presentan rangos de acuerdo al estado de madurez:
verde (1,93-1,75), pintón (1,64-1,42) y maduro (1,37-0,92). El pH de las bayas de sauco se encuentra de 1,6 a 2,2 (estado verde), de 2,4 a 3,0 (estado pintón) y de 3,2 a 3,8 (estado maduro) [7].
2.1.7. Composición Químico Proximal
En la tabla 02 se reporta la composición químico proximal del sauco que corresponde a los frutos en pleno estadío de madurez.
7 Tabla 02. Composición químico proximal del fruto de sauco (g/100g
muestra)
Componente (a) (b) (c) (d)
Humedad Grasa Proteína Fibra Ceniza
Carbohidratos
91,49 0,26 1,51 1,72 0,84 7,81
89,67 0,67 1,58 1,94 0,89 7,24
84,22 0,88 1,00 --- 1,02 7,81
91,20 0,16 1,57 1,94 0,70 4,43
Fuente: (a) Arana (1984), (b) Cahuana (1991), (c) Honda (1986) y (d) García (2003)
2.1.8. Usos
El sauco del Perú produce un fruto comestible de agradable sabor que se puede consumir fresco. Esta es una planta muy usada en la industria para la obtención de una esencia adecuada para perfumar los productos alimentarios y enológicos [8].
Sus frutos se pueden conservar deshidratados sin que varíen sus propiedades originales [3]. También sirven para la pequeña industria campesina en la elaboración de mermeladas, jaleas, lácteos y licores [1].
La mermelada de sauco es un producto de consistencia gelatinosa de color vino tinto y con sabor agridulce, utilizada para los desayunos, postres, helados y en la preparación de platillos exóticos [9].
El sauco, rico en vitamina C y de un color morado intenso, que se consume en yogurt o mermelada, también puede ser el ingrediente principal de una salsa para carnes o ensaladas. Esta fruta puede y debe ser parte de nuestra dieta, por ejemplo, en una bebida batida de leche con sauco, que puede ser útil en la temporada escolar cuando los niños no quieren tomar la leche. Estos frutos andinos fáciles de cultivar y con un inmenso potencial de agro industrialización, se exportan como mermeladas, harinas y dulces naturales a mercados internacionales, especialmente el europeo [10].
Los frutos del sauco deben presentar una madurez industrial en la elaboración de licores, mermeladas, yogures y néctares, que se evalúa a través del pH y los grados Brix, cuyos valores para el procesamiento se encuentran entre 2,5-3,4 y 6,5-7,0 respectivamente [11]. En el Valle del
8 Mantaro los frutos se utilizan para elaborar chicha, mazamorra, jalea y mermelada, siendo éstos dos últimos los más comunes [3].
2.2. COMPONENTES FITOQUÍMICOS DE FRUTOS NATIVOS
Los fitoquímicos son una serie de compuestos que intervienen en el metabolismo secundario de los vegetales, tales como pigmentos, sustancias aromáticas, reguladores del crecimiento, protectores naturales frente a parásitos y otros, que no tienen una función nutricional clásicamente definida, o no son considerados esenciales para la salud humana, pero que pueden tener un impacto significativo en el curso de alguna enfermedad. Se encuentran abundantemente en frutas y verduras. En la actualidad estas sustancias están siendo investigadas por la industria farmacéutica y alimentaria. En la literatura científica, este campo de investigación se denomina alimentos funcionales o functional foods [14].
Los frutos contienen numerosos y diferentes compuestos químicos con diferentes capacidades y propiedades biológicas y farmacológicas. Entre los fitoquímicos antioxidantes más comunes se incluyen el ácido ascórbico (vitamina C), tocoferoles y tocotrienoles (vitamina E), carotenoides (provitamina A) y los compuestos fenólicos [13].
Los compuestos fenólicos o polifenoles son metabolitos secundarios que juegan un importante rol en la planta, ya que actúan como mecanismos de defensa contra varios factores ambientales tales como: la luz, temperatura, humedad y factores internos. Estos compuestos poseen al menos un grupo hidroxilo con un anillo aromático, los cuales son químicamente heterogéneos de aproximadamente 10000 compuestos individuales; algunos son solubles solamente en solventes orgánicos [14].
Estas sustancias han reportado beneficio para la salud humana especialmente en la prevención de enfermedades degenerativas, potenciado en la dieta el consumo de frutas que impiden la acumulación de radicales libres que causan daño oxidativo a lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, asociados a enfermedades cancerígenas, cardiovasculares y neurodegenerativas [13].
Los tres grupos más importantes de fenólicos dietéticos son los ácidos fenólicos, flavonoides y los polifenoles [14].
Los ácidos fenólicos forman un grupo diverso que incluyen los derivados del ácido hidroxibenzoico y del ácido hidroxicinámico. Ejemplos de los derivados del ácido hidroxicinámico son los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico.
9 Generalmente están presentes en diversas formas conjugadas, siendo más frecuentes como ésteres que como glucósidos. El miembro más importante de este grupo, en los alimentos, es el ácido clorogénico, un éster del ácido cafeico con el ácido quínico [14]
Figura 03. Estructura química del ácido cafeico, ácido ferúlico y ácido clorogénico
Fuente: Muñoz (2007)
Los flavonoides son el grupo fenólico más grande en los alimentos vegetales;
son compuestos de bajo peso molecular que generalmente existen enlazados a moléculas de azúcares. Los flavonoides están agrupados en antocianinas y antoxantinas. Las antocianinas son moléculas de pigmentos rojos, azules y púrpuras. Las antoxantinas, que incluyen flavonoles, flavonas, flavanoles, e isoflavonas, son moléculas incoloras o de colores que oscilan desde el blanco hasta el amarillo [14].
10 Figura 04. Estructura química general de las flavonas
Fuente: Leighton y Urquiaga (2000)
Entre los polifenoles existen: los difenoles, con dos grupos -OH en el anillo aromático de benceno, como la hidroquinona el fenol simple más ampliamente distribuido; y los trifenoles, con tres grupos -OH en el anillo aromático, siendo el ácido gálico un ejemplo de estos, está presente en forma esterificada en las catequinas del té, en forma soluble como ésteres del ácido quínico, o condensado en taninos hidrolizables (ácidos tánicos), o derivados del ácido elágico [14].
Figura 05. Estructura química del ácido gálico, la catequina y el ácido elágico
Fuente: Castañeda (2008)
Los polifenoles tienen acción antioxidante, pueden reducir la peroxidación de los lípidos. Estos compuestos se hallan preferentemente en las capas más superficiales de verduras y frutas, para proteger de la oxidación los tejidos de las capas inferiores. Posee también efectos anticoagulantes, antimicrobianos, inmunoestimulantes y reguladores de la presión arterial y de la glucemia [12].
O
OH O
H
OH R
O
R'
11 Por las razones anteriores hay un interés creciente que ha desencadenado una intensa investigación en el campo de las ciencias agronómicas y alimenticias.
Estudios están orientados a determinar el contenido total de polifenoles y otros fitoquímicos de muchos frutos, y de que forma éstos pueden ser mejorados a través del desarrollo de cultivares, prácticas de producción, almacenaje post cosecha y procesamiento [13].
Tabla 03. Contenido de polifenoles en frutas nativas peruanas y recursos vegetales promisorios
Nombre común Polifenoles
(mg ácido gálico/100g)
Aguaymanto(a) 154
Papaya de monte(a) 167
Tomate de árbol(a) Tuna roja(a) Carambola(b) Yacón(b)
Tumbo costeño(b) Tumbo serrano(b) Camu camu(b) Noni(b)
Guinda(b)
130 52 75,97 67,64 2,16 1478,26 2393,72 164,77 24,05
Fuente: (a) Repo y Encina (2008), (b) Muñoz et al. (2007)
2.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
Los productos vegetales poseen una variedad de compuestos químicos que actúan como agentes antioxidantes, inhibiendo la formación y el daño producido por radicales libres, que no sólo producen rancidez y pérdida de alimentos en su almacenamiento, sino que están asociados con enfermedades crónicas como el cáncer, Alzheimer, enfermedades cardiovasculares y están ligados al proceso de envejecimiento. Antioxidante es cualquier sustancia que a bajas concentraciones reduce significativamente o previene la oxidación de un sustrato [19]. Los antioxidantes más comunes en vegetales son las vitaminas C y E, carotenoides, flavonoides y compuestos fenólicos [18].
12 La actividad antioxidante es la capacidad acumulativa de los componentes de un alimento de atrapar radicales libres [20].
Los radicales libres tienen un electrón desapareado o libre por lo que son muy reactivos ya que tienden a captar un electrón de moléculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad electroquímica. La molécula que se lo cede se convierte a su vez en un radical libre por quedar con un electrón desapareado, iniciándose así una reacción en cadena que destruye nuestras células. El consumo de aceites vegetales hidrogenados, como los de la margarina, y ácidos grasos trans, como los de la carne y leche, también contribuyen al aumento de radicales libres [21].
El resveratrol del vino o las isoflavonas de la soya son sólo algunos ejemplos de la reciente tendencia a buscar compuestos bioactivos en los alimentos. Lo cierto es que estos compuestos de nuestra dieta han demostrado actividad antioxidante al ser probadas en estudios en animales y humanos, teniendo un efecto protector frente al cáncer, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas [22].
Por otra parte, la actividad antioxidante de un alimento también depende del microambiente en que se encuentra el compuesto. Los compuestos interactúan entre sí pudiendo producirse efectos sinérgicos o inhibitorios [23]. El efecto sinérgico que puede existir entre diferentes antioxidantes indica que el efecto antioxidante total puede ser más grande que la suma del efecto antioxidante individual y en el aislamiento de un componente no se verá exactamente reflejado toda su acción [24].
La gran diversidad de métodos empleados proporciona resultados numéricos difíciles de comparar. Para solventar este problema, en la mayoría de estudios científicos en los que se valora la actividad antioxidante, bien de compuestos puros o extractos vegetales, se utiliza el Trolox (ácido-6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico) como patrón, que se caracteriza por ser un análogo hidrosoluble de la vitamina E. El ensayo para medir la actividad antioxidante expresada en equivalentes Trolox constituye uno de los métodos que aparece referenciado con gran frecuencia en la bibliografía científica [25].
Es necesario considerar que las determinaciones de la actividad antioxidante realizadas in vitro nos dan sólo una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo. Sin embargo, la extrapolación de resultados in vitro a lo que ocurre en un organismo in vivo, sólo es posible cuando se conoce
13 la biodisponibilidad del compuesto activo, vale decir, cuando es estable en el tubo digestivo, se absorbe y alcanza niveles circulantes significativos [16].
2.3.1. Métodos de Evaluación
Muchos métodos han sido descritos para medir la efectividad de los antioxidantes naturales o sintéticos. De hecho, muchas técnicas se basan en determinar la actividad antioxidante ya sea expresada como una medida de la estabilidad de aceites y materiales lipídicos frente a la oxidación, como una medida antirradical explícita frente a radicales oxidantes específicos o como la actividad frente a metales catalizadores de la producción de radicales libres [26].
Los métodos de evaluación de la actividad antioxidante se basan en comprobar cómo un agente oxidante induce daño oxidativo a un sustrato oxidable, daño que es inhibido o reducido en presencia de un antioxidante. Esta inhibición es proporcional a la actividad antioxidante del compuesto o la muestra [27].
La actividad antioxidante de los frutos y bebidas puede evaluarse in vitro e in vivo por medio de experimentos sencillos. Con base a las reacciones químicas involucradas, pueden dividirse en dos categorías: ensayos basados en la transferencia de un átomo de hidrógeno y ensayos basados en la transferencia de electrones. En la primera categoría los métodos están basados en reacciones donde el antioxidante y el sustrato compiten por el radical libre, una molécula oxidable y un antioxidante;
mientras que en la segunda categoría, los métodos involucran una reacción de oxidación con el antioxidante que es un indicador del punto final de la misma [28].
Dentro de los métodos propuestos para medir la actividad antirradical de materiales biológicos frente a radicales oxidantes, los más comunes por su facilidad de uso, rapidez y sensibilidad, son aquellos que involucran compuestos cromógenos de naturaleza radical. La presencia de antioxidantes conduce a la separación de estos radicales cromógenos por medio de la captura de los mismos, con la consecuente decoloración de la solución que los contiene, la cual puede ser medida por métodos espectrofotométricos [29].
14 La captación de radicales libres es el principal mecanismo de acción de los antioxidantes en los alimentos. Se han desarrollado muchos métodos en los que se mide la actividad antioxidante a través de la captación de radicales libres sintéticos en solventes orgánicos polares, por ejemplo metanol, a temperatura ambiente. Los radicales usados son del tipo 2,2- difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS). Estos métodos pueden ser útiles para la búsqueda de nuevos antioxidantes [30].
a) Método DPPH
Este método nos permite evaluar la actividad antioxidante de sustancias frente al radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) en una solución metanólica que tiene un color violeta intenso, el cual se pierde progresivamente cuando se añade la muestra que contiene antioxidantes [28].
En la figura 06, se muestra la reacción entre el DPPH y un antioxidante (AH).
F
igura 06. Método del 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) Fuente: Molyneux (2004)
La reducción del DPPH es seguida por monitoreo de la disminución de la absorbancia en la longitud de onda característica durante la reacción. El radical en forma de DPPH absorbe a 515nm y por reducción de un antioxidante (AH) disminuye la absorbancia [32].
15 El electrón desapareado en el radical libre DPPH da una máxima absorción a 515nm y es de color violeta. El color cambia de violeta hacia naranja pálido, a medida que va reaccionando, cuando el electrón desapareado del radical DPPH consigue aparearse con un hidrógeno de un antioxidante para dar la forma reducida DPPH-H [23].
La capacidad para secuestrar los radicales DPPH está en función al contenido del principio activo presente en cada una de las muestras en estudio. La reducción de la concentración del DPPH está indicada como el decremento de la absorbancia en el tiempo [33].
El DPPH muestra la misma estequiometria de reacción con los antioxidantes convencionales como el ácido L-ascórbico o el Trolox, lo cual permite expresar sus resultados como equivalentes de dichos estándares [26].
b) Otros métodos
Los distintos métodos difieren en el agente oxidante, en el sustrato empleado, en la medida del punto final, en la técnica instrumental utilizada y en posibles interacciones de la muestra con el medio de reacción. Además, los objetivos de los diferentes métodos de medida son diversos. Entre ellos, la medida de la resistencia de un alimento a la oxidación, la evaluación cuantitativa del aporte en sustancias antioxidantes o la evaluación de la actividad antioxidante del plasma una vez ingerido el alimento [27].
Entre otros métodos conocidos por sus siglas, tenemos: capacidad de absorbancia del radical oxígeno (ORAC por sus siglas en inglés), parámetro antioxidante de tratamiento total de radicales (TRAP) (De Pablo y Gotteland, 2007), ácido 2,2´azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6- sulfónico (ABTS, test del status antioxidante total), reacción con el óxido nitroso (test NO), diclorhidrato de N,N-Dimetil-p-fenilendiamina (DMPD), poder antioxidante reductor férrico (Ferric Reducing/Antioxidant Power: FRAP), generación de radicales superóxido: sistema NADH FENAZINA METOSULFATO-O2-AZUL DE NITROTETRAZOLIO, generación de radical hidroxilo: sistema H2O2/Fe+3-EDTA ASCORBATO, sistema ácido ascórbico-hierro
16 EDTA, generación del radical peróxido de hidrógeno: sistema NADH, sistema ABAP y generación del ácido hipocloroso (HOCl): sistema Na OCL/H2SO4O [17].
Las condiciones para el empleo de los métodos de transferencia de electrón como el ABTS y DPPH, pueden variar de alguna forma (por ejemplo, el pH, los solventes y la longitud de onda a la que se mide), dando diferentes resultados. Sin embargo, son muy útiles para evaluar la actividad antioxidante de sustancias y alimentos que los contienen. Estos métodos pueden servir para evaluar si el proceso de elaboración de un alimento influye sobre la actividad antioxidante, además de ser un indicativo del potencial antioxidante para su consumo [16].
La mayoría de los métodos de medida de la actividad antioxidante no emplean especies radicales de significado biológico. Son radicales ajenos al organismo el DPPH o el ABTS. Estos métodos in vitro son útiles para comparar la actividad antioxidante de diferentes muestras de alimentos, pero los resultados son limitados desde un punto de vista nutricional ya que no reproducen la situación fisiológica del organismo. Para alcanzar una mayor aproximación algunos ensayos incluyen radicales relevantes en los sistemas biológicos, como O2, H2O2, ROO y OH [27].
2.4. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE FRUTOS Y OTROS VEGETALES
En frutas, legumbres y algunos vegetales se encuentran sustancias capaces de atrapar radicales libres, mejorando nuestra defensa antioxidante, reportándose que son capaces de detener o prevenir el desarrollo de tumores y los efectos bioquímicos asociados con la progresión de los mismos; este potencial se atribuye, principalmente, a sus propiedades antioxidantes. Se reporta que la capacidad antioxidante de una copa de vino es igual al jugo de 7 naranjas ó de 20 manzanas [17].
Existe interés en organizaciones internacionales de salud por conocer y difundir las propiedades antioxidantes que tienen los alimentos de consumo habitual, especialmente por su aporte de sustancias protectoras contenidas en frutas y hortalizas, que son el resultado del metabolismo secundario que poseen todas las plantas. Por tales razones resulta de particular interés investigar el poder antioxidante de los productos vegetales de nuestro medio [33].
17 Los frutos, además de los nutrientes esenciales y a una serie de micronutrientes, aportan diversos componentes secundarios de naturaleza fenólica, para los cuales demostrado su efecto benéfico sobre la salud; debido a su capacidad para captar radicales libres causantes del estrés oxidativo, por lo que se les atribuye un efecto favorable en la prevención de enfermedades crónicas como algunos tipos de cáncer y ciertas patologías cardiovasculares. El potencial antioxidante de las frutas puede perturbarse por factores de índole fisiológico y tecnológico, como por ejemplo, las condiciones de conservación y procesado [34].
Se ha acumulado información sobre la capacidad de algunos componentes de los alimentos para disminuir o prevenir los procesos de oxidación celular (guanábana, uva, chirimoya, guayaba, semilla del marañón, carambola, plátano verde, moni, ciruela, granadilla, mango, papaya, mamey, naranja, limón, maracuyá, zapote, níspero, jagua, entre otros.) [35].
Uno de los trabajos de investigación presentados en el IX Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYTA), el cual se realizó en la ciudad de Tingo María, (tabla04) reportó que la mayor actividad antioxidante de los frutos tropicales correspondió al lima dulce cuyo valor de IC50 (µg/mL) fue 279,43 [19].
Tabla 04. Valor IC50 (µg/mL) de frutos tropicales
Nombre común IC50
(µg/mL) Lima dulce
Guayaba Guanábana Taperiba Arazá Carambola Maracuyá Papaya
279,43 441,93 749,68 1008,13 1218,35 2767,38 3225,83 4389,96 Fuente: Carrión et al. (2009)
El coeficiente de inhibición al 50% (IC50) del radical libre DPPH, es expresado en µg/mL o mg/mL [60]. El valor IC50 representa la cantidad de bebida que reduce la absorbancia de la solución de DPPH en un 50%. Así, un menor valor de IC50
indica mayor actividad antioxidante porque se requiere menos cantidad de la
18 bebida para disminuir en un 50% la absorbancia de la solución de DPPH. Los frutos que tienen el valor de IC50 menor tienen mayor actividad antioxidante [35].
El Centro de Investigación de Productos Naturales de la Amazonía (CIPNA), en su evaluación de la actividad antioxidante en pulpa concentrada de camu camu en dos estados de madurez, concluyó que la más alta habilidad para inhibir radicales libres como el DPPH corresponde al estado maduro en el día 60 de almacenamiento, superando al estado pintón en todas las evaluaciones [36].
Asimismo, la Revista del Encuentro Científico Internacional (ECIPERU) difundió un trabajo de investigación donde evaluaron la actividad antioxidante del nonio en tres estados de madurez, cuyos resultados indican (tabla05) que la mejor actividad antioxidante mediante el método DPPH fue en el estado maduro 149,475 [37].
Tabla 05. Actividad antioxidante de frutos según su estadío de madurez
Fruto Estadío de
madurez
IC50 (µg/mL) Camu camu(a)
Noni(b)
Pintón Maduro Pintón Maduro Sobre maduro
19,12 5,85 154,819 149,475 200,321 Fuente: (a) Calvay et al. (2009) y (b) Sullón et al. (2009)
En la investigación sobre la capacidad antioxidante y determinación de ácidos fenólicos y flavonoides en ocho alimentos nativos del Perú, el más potente fue el huacatay, que produjo el máximo porcentaje de inhibición de radicales libres (84,70%) [33]. En la Revista de la Sociedad Química del Perú, cuyo artículo sobre la determinación de la capacidad antioxidante y compuestos bioactivos de frutas nativas peruanas, destacó (tabla 06) que la tuna roja presentó una capacidad de inhibición del radical DPPH (77,65%) mucho mayor que las otras tunas estudiadas; concluyendo que la capacidad antioxidante está directamente relacionada con el contenido de pigmentos de la fruta [18].
19 Tabla 06. Porcentaje de inhibición de radicales libres de
alimentos nativos del Perú
Alimento Porcentaje de inhibición de radicales libres (%) Huacatay(a)
Aguaymanto(a)
Sachapapa morada(a) Pituca(a)
Tumbo(a) Sachatomate(a) Olluco(a)
Sachaculantro(a) Tuna roja(b)
Tuna anaranjada(b) Tuna verde(b)
84,70 60,00 39,05 38,10 34,29 29,56 27,62 23,81 77,65 41,65 34,20
Fuente: (a) Zavaleta (2005), (b) Repo y Encina (2008)
La Revista Horizonte Médico publicó un estudio de los diferentes extractos de siente plantas medicinales peruanas, los cuales presentaron una buena actividad antioxidante, (tabla07) demostrando la mayor capacidad de captación de radicales libres el extracto de corteza de canela 70,34% [17].
Tabla 07. Actividad antioxidante de siete plantas medicinales peruanas
Muestra Porcentaje de inhibición de radicales libres (%) Corteza de canela
Harina de maca Koken Hojas de muña
Hojas de lagarto caspi Fruto de camu camu Hojas de hiporuro Hojas de yacón
Harina de maca Amazon
70,34 60,32 59,85 57,15 53,76 44,18 42,86 40,71 Fuente: Castañeda (2008)
20 En el VI Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, realizado en la ciudad de Acapulco (México), se presentó una investigación en la cual fue analizada la actividad antioxidante de cáscaras de frutos cítricos (tabla08). La naranja valencia tuvo un valor de 87,75%, cercano al correspondiente para el BHT de 95,18%, que es un antioxidante sintético, siendo el extracto que obtuvo el valor más alto de todos los cítricos estudiados [38].
Tabla 08. Actividad antioxidante de cáscaras de frutos cítricos
Nombre común Actividad antioxidante (%)
Naranja valencia Limón mexicano Naranja agria
87,75 52,48 43,75 Fuente: Escobar et al. (2010)
La actividad antioxidante es un parámetro que determina qué tanto el compuesto antioxidante evita que su sustrato se oxide. Si el valor es cercano a cien, la actividad antioxidante del compuesto en cuestión es alta. Además, se plantea que la actividad antioxidante es un parámetro para valorar la calidad dietética del producto en distintas condiciones de almacenamiento y procesos industriales [38].
Las frutas tienen propiedades antioxidantes debido a la presencia de diversos compuestos como vitaminas C, E, β-caroteno y flavonoides. Cada uno de éstos compuestos tienen actividad in vivo, pero es difícil evaluar su contribución porque no se consumen en forma aislada sino combinados [35].
También es cierto que la actividad antioxidante de las diversas frutas y verduras está influenciada por diferentes factores como la variedad de cultivo, zona geográfica e incluso horas de luz, tipo de suelo, temperatura y fertilizantes utilizados, por lo que es indispensable disponer de datos de los alimentos cultivados en el país [39].
2.5. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL SAUCO
Los antioxidantes de las bayas de sauco son actualmente investigados por sus actividades antiviral, inmune, y en estudios antiangiogénicos (anti cancerígenos);
también apoyan a la salud cardiovascular y contra el envejecimiento. El fruto del sauco contiene 60-80 antioxidantes y un alto valor de ORAC [40].
21 En el Hospital II-Chocope de Trujillo, se evaluó la eficacia del infuso de Sambucus peruviana L. (3g en 250mL de agua por día durante 6 meses) en 30 pacientes atendidos con diagnóstico de hiperplasia benigna de próstata, concluyéndose que hasta en un 95% de los pacientes disminuyeron significativamente la sintomatología producida por dicha enfermedad. En el grupo control (pacientes que no recibieron el infuso) no se observó mejoría [8].
Además, estudios individuales han probado que las antocianinas provenientes de las bayas de sauco tienen actividad antioxidante y pueden reducir el estrés oxidatico debido a la edad, también ayudan a desarrollar las funciones cerebrales. Los antioxidantes del sauco también mejoran la estabilidad del colesterol LDL protegiéndolo frente a la oxidación producida por los radicales libres, y así contribuyen a reducir la incidencia de arterioesclerosis propiciada por el depósito de colesterol malo en las arterias [41].
Las antocianinas pertenecen a un grupo muy distribuido de metabolitos secundarios, que se conocen colectivamente como flavonoides. Las antocianinas naturales más comunes son las 3-O-glicósidos y las 3,5 di-O- glucósidos. Estos pigmentos son los componentes que otorgan a las plantas colores rojos, azules, morados, particularmente en partes como frutos, flores y hojas. El interés por las antocianinas se ha incrementado debido a su potencial uso como colorantes naturales y por sus potenciales beneficios en la salud como antioxidantes [42].
En la figura 07, se observa la estructura química general de las antocianinas.
Fuente: Leighton y Urquiaga (2000)
Figura 07. Estructura química general de las antocianinas
La baya de sauco es de un color púrpura intenso y está cargada de antocianinas, las cuales le dan al fruto su color y proporcionan muchos efectos positivos para la salud ya documentados [43]. El contenido en antocianinas del
O
OH O
H
OH
OH R
R' +
O
OH O
H
OH
OH R
R' +
O
OH O
H
OH
OH R
R'
+
22 sauco (450mg/100g de fruto fresco) es bastante alto comparado con algunas otras fuentes ricas en antocianinas como los arándanos (Vaccinum myrtillus) que son una fuente muy conocida y con un alto contenido en antocianinas (300- 320mg/100g de fruto fresco), concluyéndose que las bayas de sauco constituyen una fuente bastante rica de antocianinas [44].
Un artículo científico publicado por la Revista Oficial de la Universidad Privada Antenor Orrego, Pueblo Continente, en el cual se determinó las antocianinas totales, fenoles totales y actividad antioxidante en pulpas de frutas procedentes de la región La Libertad y Cajamarca, ha reportado que el color intenso del sauco se relaciona con los altos contenidos de antocianinas totales (120,2mg cianidina 3-glucósido/100g muestra) y fenoles totales (196,5mg ácido gálico/100g muestra), encontrándose además valores de 112,1mg/100g muestra y 22,5μM TE/g muestra, para el VCEAC (actividad antioxidante equivalente en vitamina C) y TEAC (actividad antioxidante equivalente al Trolox), respectivamente [45].
La variación en el contenido de antocianinas totales en las frutas es explicable en el sentido de que la maduración está típicamente acompañada por cambios sustanciales en el perfil de compuestos antioxidantes. Por ejemplo, los cambios en el color del sauco durante la maduración incrementan el contenido de antocianinas. La relación entre la madurez de la fruta y la actividad antioxidante difiere entre los cultivares de frutas [46].
1 2
23 3
4 5 6
III. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN
El trabajo de investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Análisis Instrumental de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú.
3.2. MATERIALES
3.2.1. Materia Prima
La materia prima. bayas de sauco (Sambucus peruviana L.) procedente del Distrito de Laraos, ubicado en la zona norte de la Provincia de Yauyos - Región Lima, a una altitud de 3564 m.s.n.m.
3.2.2. Equipos, materiales y reactivos a) Equipos
Espectrofotómetro UV-1601-VIS
Balanza analítica electrónica, precisión 0,0001g
Centrífuga
Agitador magnético
Baño maría
Vortex MIXER
Estufa, 0-350 ºC
Mufla, máx. 1200 ºC
Digestor de proteínas
Equipo de destilación semi-micro Kjeldahl
Equipo de titulación
Extractor Soxhlet
Peachímetro HANNA, rango 0-14
Refractómetro manual HANNA, 0-32 °Brix
Balanza, capacidad 0-10kg
24 b) Materiales
Vaso de precipitación de 50, 100 y 250mL
Bureta de 25mL
Fiolas de 50, 100 y 500mL
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10mL
Pipetas volumétricas de 5mL
Micropipetas de 100-1000µL
Balones de 50mL
Matraz Erlenmeyer de 100 y 250mL
Probeta de 250mL
Tubos de ensayo con tapa
Desecador
Varillas
Placas petri
Crisoles de porcelana
Mortero con pilón
Embudos
Pinzas de metal
Gradillas
Papel filtro Whatman N° 1 y 2
c) Reactivos
Ácido sulfúrico al 1,25%
Ácido clorhídrico 0,05N
Hidróxido de sodio 0,1N y al 1,25%
Hexano absoluto
Fenolftaleína al 1%
Solución Buffer pH 4,0 y 7,0
Etanol al 80%
Folin-Ciocalteau
Carbonato de sodio
Ácido gálico
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo)
Agua destilada
25 3.3. MÉTODOS DE ANÁLISIS
3.3.1. Análisis fisicoquímico
a) Sólidos solubles (°Brix): AOAC, 1994 b) pH: AOAC, 1994
c) Acidez titulable: AOAC, 1994
3.3.2. Análisis químico proximal
a) Humedad: NTP 205.037: 1975 b) Grasa: Ref. NTP 205.006: 1980 c) Proteína: AOAC, 1994
d) Ceniza: NTP 205.038: 1975 e) Fibra: Ref. NTP 205.003: 1980 f) Carbohidratos: Por diferencia
3.3.3. Determinación de polifenoles: Se realiza la medida del índice de Folin.
El estándar utilizado fue el ácido gálico. Los resultados se expresaron en mg ácido gálico/100g muestra. La lectura de absorbancia se registro a una longitud de onda de 765nm.
3.3.4. Determinación de la actividad antioxidante: Método de Von Gadow y Col (1997), basado en una reacción con el 2,2 difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Los resultados se expresaron en porcentaje de inhibición de radicales libres. La lectura de absorbancia se registro a una longitud de onda de 515nm.
3.4. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
El diagrama de flujo para obtener los extractos del sauco en estadío verde, pintón y maduro, se muestra en la figura 07. Las descripciones se indican a continuación:
a) Recolección.- Se recolectaron manualmente frutos de sauco en tres estadíos de madurez (verde, pintón y maduro).Se utilizo mayas, palos de carrizo de 3MT con punta tijerada para el corte, jabas de plástico por 6Kg.
b) Selección y clasificación.- Los frutos recolectados fueron seleccionados separando aquellos que estaban golpeados o picados, y según el tamaño homogéneo. Se clasificaron según el estadío de madurez.
26 c) Lavado.- Esta operación se realizó por inmersión en agua clorada a temperatura ambiente, con la finalidad de eliminar partículas extrañas adheridas a la superficie de los frutos.
d) Pesado.- Se pesaron 5kg de bayas de sauco por cada estadío de madurez en estudio.
e) Secado.- Se realizó en una estufa a 50 °C por 96 horas.
f) Envasado.- Bolsas de polietileno.
g) Almacenado.- Se almacenó en lugar oscuro a temperatura ambiente hasta que se realizaron las evaluaciones.
h) Molienda.- Las muestras fueron molidas finamente según los requerimientos, empleado un mortero de porcelana con pilón.
27
Manual
Frutos dañados
Impurezas
5kg por estadío de madurez EN LA METODOLOGÍA EXPERIMENTAL SE REALIZO EL SIGUIENTE DIAGRAMA DE FLUJO:
Sauco
(Sambucus peruviana L.)
Figura 08. Diagrama de flujo para la obtención de los extractos del sauco para análisis en estadío verde, pintón y maduro.
RECOLECCIÓN
LAVADO
PESADO
ENVASADO SELECCIÓN Y CLASIFICACIÓN
ALMACENADO
SECADO T°: 50 ºC
Θ: 96h
Bolsas de polietileno
Tº ambiente
MOLIENDA
28 3.5. ESQUEMA EXPERIMENTAL
Leyenda:
EV = Estadío verde EP = Estadío pintón EM = Estadío maduro AA = Actividad antioxidante P = Polifenoles
CF = Características fisicoquímicas
3.5.1. Variables intervinientes
Condiciones climáticas de cultivo
Altitud del lugar
Tipo de suelo
Transporte de muestras
3.5.2. Variables independientes
Estadío verde
Estadío pintón
Estadío maduro
Sauco
EV EP EM
AA
CF P CF P AA CF P AA
29 3.5.3. Variables dependientes
Características fisicoquímicas
Polifenoles
Actividad antioxidante
3.6. DISEÑO ESTADÍSTICO
Se aplicó el Diseño Completamente al Azar (DCA) con 3 repeticiones, evaluando las características fisicoquímicas (°Brix, pH y acidez), los polifenoles y la actividad antioxidante del sauco en tres estadíos de madurez (verde, pintón y maduro). Para la comparación de medias se empleó la prueba de Duncan al 5%
de nivel de significación.
Los datos obtenidos fueron analizados mediante los programas Statgraphics Centurion y Microsoft Office Excel 2007.
3.7. MODELO MATEMÁTICO Modelo aditivo lineal:
Yij = µ + Ai +
ε
ijDonde:
Yij = Cualquier observación de la actividad antioxidante y características fisicoquímicas
µ = Media poblacional
Ai = Efecto del i-ésimo estadío de madurez
ε
ij = Error aleatorio del experimento30 2
3
6
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. ANÁLISIS FISICOQUÍMICO
En la tabla 09, se puede apreciar las características fisicoquímicas (°Brix, pH y acidez) de las bayas de sauco en tres estadíos de madurez.
Tabla 09. Características fisicoquímicas del sauco según el estadío de madurez
Estadío de madurez
Sólidos solubles (°Brix) a 20 °C
pH a 20 °C
% Acidez total (expresado en ácido cítrico)
Verde 3,2 3,42 3,7
Pintón 4,9 3,51 1,645
Maduro 5,9 3,64 1,065
Como puede observarse, los valores de sólidos solubles en los diferentes estados de madurez se encuentran dentro de lo indicado por [7] quien reporta que los frutos de sauco tienen grados Brix entre 2,3 y 3,2 (estado verde), 4,7 y 5,4 (estado pintón), 6,5 y 7,2 (estado maduro). Además, las bayas maduras poseen un valor ligeramente mayor a 5,8 °Brix, determinado por [5] en frutos desarrollados en el rango altitudinal de 3300-3600 m.s.n.m.
Diferentes estudios han demostrado que la principal causa de la concentración de sólidos solubles en los frutos es el transporte de azúcar desde las hojas y sitios de reserva. Por tal motivo, la pulpa presenta monosacáridos como glucosa y fructuosa [47]. La cantidad de sólidos solubles de la pulpa de una fruta es también índice del grado de madurez de la misma [48].
31 El porcentaje de acidez total en el estadío verde es más elevado que los valores de 1,93-1,75 encontrados por [7], pero en el caso de las bayas pintonas y maduras, los datos de acidez están entre los rangos de 1,64-1,42 y 1,37-0,92, respectivamente. La acidez depende del estado de madurez; [49] menciona que a medida que se acerca el punto de maduración disminuye la acidez, esto sucede en la mayoría de los frutos.
Según [48], los niveles de ácidos orgánicos disminuyen estacionalmente cuando la fruta madura. También, señala que el contenido de ácidos es un requisito importante de calidad y en frutas cítricas dulces, durante su época normal de cosecha, varían desde 1% al inicio de la temporada hasta 2,5% al final de la misma. La cantidad de ácidos a través del proceso de maduración disminuye.
Sin embargo, la tasa de ácidos en el fruto maduro sigue siendo alta [50].
Los resultados de pH son superiores a los rangos obtenidos por [10] para los estadíos verde (1,6 a 2,2) y pintón (2,4 a 3,0). El pH del sauco maduro es menor que 4,0 reportado por [51] pero más alto que 3,4 citado por [53], por lo tanto se considera una fruta muy ácida de acuerdo a las Tablas de Clasificación de Alimentos según [52].
La determinación del pH en las frutas es muy importante, ya que mediante éste se puede conocer el estado de madurez y el grado de deterioro de las bayas de sauco [7]. El pH se estabiliza durante la madurez de la pulpa, disminuyendo en los estadíos más avanzados de sobre madurez [47].
Figura 09. Comportamiento de los sólidos solubles (°Brix) con respecto al estadío de madurez del sauco
32 Figura 10. Comportamiento del pH con respecto al estadío de
madurez del sauco
Figura 11.Comportamiento de la acidez total con respecto al estadío de madurez del sauco
33 En las figuras 09, 10 y 11, se observa que existe un incremento en el contenido de sólidos solubles durante la maduración. Además, conforme la fruta madura se reduce el contenido de ácidos, lo que se traduce en un incremento de pH, esto sucede porque según [49] durante la maduración los ácidos orgánicos son respirados o convertidos en azúcares, declinando en el periodo de la actividad metabólica máxima durante el curso de la maduración.
El progreso de la maduración de las bayas de sauco es conocido exteriormente por su coloración y por la facilidad en el desprendimiento de los frutos del escobajo. El estado de plena madurez se presenta habitualmente en los meses de febrero y marzo, alcanzando las bayas el contenido máximo de azúcar y menor contenido de ácidos [5].
Los resultados del análisis de varianza (Anexo 03) de los sólidos solubles (°Brix) y pH, respectivamente, indican que entre estadíos de madurez no existe diferencia estadística. En el análisis de varianza de la acidez, se observa que existe diferencia estadística altamente significativa, lo cual indica que al menos un estadío de madurez muestra diferente efecto sobre la acidez de los frutos de sauco.
Figura 12. Acidez total (expresado en ácido cítrico) según los estadíos de madurez del sauco
34
Figura 12. Acidez total (expresado en ácido cítrico) según los estadíos de madurez del sauco.
Según la figura 12, que representa gráficamente la prueba de Duncan (Anexo 03), los estadíos de madurez tienen efectos estadísticamente diferentes sobre la acidez de las bayas de sauco, siendo el estadío verde significativamente mayor y ocupa el primer lugar según el orden de mérito, seguido del estadío pintón. El estadío maduro es estadísticamente menor, esto se debe a que en los primeros estadíos de desarrollo del fruto la acumulación de ácidos aumenta, disminuyendo con el avance del crecimiento [5]. Al iniciarse el proceso de maduración, los frutos se tornan rojizos (jaspeados) ya que en las células de la piel se sintetiza un pigmento rojo azulado predominante en el sauco, la cianidina.
A partir de entonces, el contenido de azúcares aumenta a la vez que desciende cada vez más la cantidad de ácidos [53].
4.2. ANÁLISIS QUÍMICO PROXIMAL
La tabla 10 muestra los resultados del análisis químico proximal que se realizó a los frutos de sauco en tres estadíos de madurez.
35 Tabla 10. Análisis químico proximal del sauco (g/100g
muestra) en tres estadíos de madurez
Componente
Estadíos de madurez
Verde
bh bs
Pintón
bh bs
Maduro
bh bs
Humedad
Grasa Proteína
Fibra Ceniza
Carbohidratos
88,22 0,58 0,05 1,83 0,97 8,35
--- 4,52 0.42 15.53
8.23 70.88
88,72 0,72 0,03 2,42 1,08 7,03
---- 6,38 0,27 21,45 9,54 62,32
92,35 0,36 0,02 2,29 0,72 4,26
---- 4,57
0,26 29,93 9,65 55,69
El mayor porcentaje de grasa, fibra y ceniza, se encontró en el estadío pintón.
Los frutos verdes presentaron una cantidad relativamente alta de proteína y carbohidratos, comparado con los otros estadíos, mientras que el más elevado contenido de humedad se presentó en las bayas maduras.
De los resultados obtenidos, los valores de humedad son muy superiores a 71,60 señalado por [54] pero cercanos a 91,35 reportado por [5], en bayas procedentes de un rango altitudinal de 3300-3600 m.s.n.m., quien además indica que el contenido de humedad depende tanto de la zona (manejo agronómico y condiciones ecológicas), procedencia y mes de realización de la cosecha.
Asimismo, [55] manifiestan que el contenido de humedad en diferentes frutos tiene una estrecha relación con la humedad ambiental.
Los porcentajes de grasa determinados son más elevados que 0,16 obtenido por [3], pero están entre los datos 0,26 y 0,88, mencionados por [51] y [53], respectivamente. Según [41], la mayor cantidad de grasas se concentra en las semillas y en menor cantidad en las otras partes del fruto.
En cuanto a las proteínas, los resultados determinados son menores a 1,00 referido por [53] pero muy inferiores en comparación al valor 1,58 citado por [7].
Los frutos, en especial aquellos con características cítricas, tienen un bajo contenido de proteína [56], dentro de los cuales se puede considerar al sauco.
36 Las cantidades de fibra cruda son superiores a 1,72 indicado por [51] y se aproximan al valor 1,94 determinado por [7]. En el caso de los porcentajes de ceniza, los datos obtenidos son inferiores a 2,10 mencionado por [54], pero cercanos a 0,70 determinado por [3]. En ese sentido, [55] encontraron diferencias significativas en la comparación de frutos muy maduros con respecto a los pintones y maduros, observándose la disminución del contenido de cenizas a medida que avanza la madurez de éstos. Además, [5] resalta que el desarrollo de los frutos no está condicionado solamente a las disponibilidades de agua en el suelo, sino al suministro de elementos minerales del terreno.
Los valores de carbohidratos se consideran cercanos a 7,24 y 7,81, datos señalados por [7] y Honda [53], respectivamente. Los glúcidos en frutos con características cítricas, están conformados por monosacáridos (glucosa y fructuosa), oligosacáricos (sacarosa) y polisacáridos (almidón y pectinas). Estos últimos se encuentran en pequeñas cantidades [56].
La composición química de las frutas fluctúa dentro de amplios límites, dependiendo en buena medida de la variedad, características del año, abonado, origen, edad, momento de recolección y almacenado [50]. Esto explica algunas diferencias existentes entre los resultados obtenidos y aquellos reportados por los autores mencionados anteriormente.
4.3. EVALUACIÓN DE POLIFENOLES
La determinación de polifenoles fue incluida en el estudio debido a que en trabajos anteriores se encontró una alta correlación entre polifenoles totales y actividad antioxidante en varias clases de frutas, según lo indica [57]. Los resultados del contenido de polifenoles fueron expresados en mg de ácido gálico/100g muestra, para los diferentes estadíos de madurez. Tal como se muestra en la tabla 11, la mayor cantidad de polifenoles se reportó en el estadío maduro, seguido del estadío verde y finalmente el estadío pintón.
37 Tabla 11. Contenido de polifenoles del sauco
en tres estadíos de madurez Estadíos de
madurez
Polifenoles (mg ácido gálico/100g)
Verde 668,52
Pintón 633,72
Maduro 744,55
Los contenidos totales de flavonoides, antocianinas y compuestos fenólicos no flavonoides se obtuvieron al determinar polifenoles totales. Éstos últimos en las frutas suelen determinarse en ácido gálico, pero también pueden ser expresados en otros compuestos fenólicos como es el caso del catecol [45].
Los datos de polifenoles obtenidos son muy superiores a lo señalado por [46]
quienes reportaron un valor de 196,5mg ácido gálico/100g de pulpa de sauco, procedente de la Región Cajamarca. Esta diferencia se debe a que en dicha investigación sólo se analizó la pulpa del fruto y no se tomó en cuenta lo mencionado por [58] quien refiere que, en efecto, los componentes polifenólicos se localizan principalmente en el hollejo mientras que en la pulpa se sitúan los ácidos y azúcares. Del mismo modo, el tamaño final de la baya es un factor importante que determina la concentración de polifenoles a partir de la relación superficie del hollejo/volumen de pulpa.
Además, [59] señalan que la composición de los frutos depende de algunos factores como las condiciones climáticas (lluvias, disponibilidad de nutrientes del suelo, variación de la temperatura), tratamiento del cultivo, localización geográfica, aplicación de pesticidas y almacenamiento. Según [17], dichos factores podrían intervenir en la presencia o ausencia de diversos metabolitos y/o sustancias activas. Por su parte, [23] afirman que la madurez influye directamente en los compuestos bioactivos, dado que se dan durante procesos de biosíntesis, generando mayor contenido de compuestos fenólicos.
Comparando el contenido de polifenoles del sauco en los tres estadíos de madurez, con otros frutos nativos y recursos vegetales promisorios como el aguaymanto 154mg ác. gálico/100g, papaya de monte 167mg ác. gálico/100g,
38 tomate de árbol 130mg ác. gálico/100g y tuna roja 52mg ác. gálico/100g [18], así como aquellos reportados por [15] en carambola 75,97mg ác. gálico/100g, yacón 67,64mg ác. gálico/100g, tumbo costeño 2,16mg ác. gálico/100g, noni 164,77mg ác. gálico/100g y guinda 24,05mg ác. gálico/100g, se evidencia que las bayas de sauco destacan por su elevado contenido de estos compuestos bioactivos.
Por lo tanto, los datos registrados permiten recomendar al sauco como fruta promisoria para una producción dirigida a contar con volúmenes comerciales para la industria, debido a su elevado contenido de compuestos benéficos para la salud, lo cual mejoraría la calidad de vida [58].
Los resultados del análisis de varianza (Anexo 04) de los polifenoles, muestran que entre estadíos de madurez existe diferencia estadística altamente significativa, lo cual indica que al menos un estadío de madurez tiene diferente efecto sobre los polifenoles de las bayas del sauco.
Figura 13. Comparación del contenido de polifenoles entre los estadíos de madurez del sauco
