UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Optimización de un medio de cultivo compuesto de harina de Glycine max “soya”, suero de leche y harina de Ipomoea batatas “camote”
para la producción de la biomasa de Bacillus thuringiensis.
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO- MICROBIÓLOGO
AUTORES:
Br. Esparza Guevara, Melissa Jahaira Br. Amaya Alfaro, Gary Kevin
ASESOR:
Dr. Robles Castillo, Heber Max
TRUJILLO-PERÚ 2021
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Carlos Alberto Vásquez Boyer
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Juan Amaro Villacorta Vásquez VICE - RECTOR ACADÉMICO
Dr. Esteban Alejandro Ilich Zerpa SECRETARIO GENERAL
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Mg. Adalberto Javier Gonzáles Varas
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dra. Fátima de la Cruz
SECRETARIA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dra. Manuela Luján Velásquez
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.
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DEL ASESOR
El que suscribe, Dr. Heber Max Robles Castillo, asesor de la tesis titulada:
“Optimización de un medio de cultivo compuesto de harina de Glycine max
“soya”, suero de leche y harina de Ipomoea batatas “camote” para la producción de la biomasa de Bacillus thuringiensis.
CERTIFICA:
Que la presente investigación ha sido desarrollada de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su correspondiente proyecto y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.
Por lo tanto, autorizo a los bachilleres Melissa Jahaira Esparza Guevara y Gary Kevin Amaya Alfaro, continuar con el trámite del reglamento correspondiente.
Dr. Heber Max Robles Castillo ASESOR
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PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, ponemos a vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis titulado: “Optimización de un medio de cultivo compuesto de harina de Glycine max “soya”, suero de leche y harina de Ipomoea batatas “camote” para la producción de la biomasa de Bacillus thuringiensis, con el propósito de obtener el Título Profesional de Biólogo - Microbiólogo.
Trujillo, Octubre del 2021
Br. Melissa Jahaira Esparza Guevara Br. Gary Kevin Amaya Alfaro
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MIEMBROS DEL JURADO
Ms.C. Anibal Quintana Diaz PRESIDENTE
Dr. Heber Max Robles Castillo
SECRETARIO
Dr. David Zavaleta Verde VOCAL
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Dictaminador, declaran que el presente informe, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.
Ms.C Anibal Quintana Diaz PRESIDENTE
Dr. Heber Max Robles Castillo SECRETARIO
Dr. David Zavaleta Verde VOCAL
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DEDICATORIA
En primer lugar, a DIOS por haberme dado la fuerza necesaria para concluir este trabajo, y darme la sabiduría en situaciones difíciles.
A mis padres Roxana y Marcial, por depositar su confianza y creer en mí, por su sacrificio y esmero para brindarme una carrera universitaria.
A mis hermanos Marco, Dany, Ingrid y Pamela, por alentarme a conseguir mis metas.
A mi esposo Juan Diego García Esquen, por su paciencia y apoyo incondicional durante todo este proceso, por animarme
a cumplir mis objetivos; y ser mi complemento en la vida.
A mi preciosa hija Sofia por ser el principal motivo para ser mejor cada día, por enseñarme lo importante que es el trabajo de una madre.
A mi abuelito Valdemar Guevara Zavaleta por sus consejos y cariños, un abrazo hasta el cielo
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A Dios, por haberme dado la fuerza y sabiduría para continuar en los momentos difíciles
A mis padres María y Domingo, por su constante apoyo, por confiar en mí y por todas sus enseñanzas
A mis hermanos David, Cesar y Piero, por el apoyo brindado cuando lo necesité
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AGRADECIMIENTOS
Nuestro agradecimiento al Dr. Heber Max Robles Castillo por su asesoramiento, habernos brindado su conocimiento, su tiempo y sobretodo la confianza que depositó en nosotros para realizar la presente tesis.
A nuestros profesores de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología, por compartir sus conocimientos y consejos para convertirnos en excelentes profesionales.
Al jurado, por sus críticas constructivas y su apoyo para mejorar el presente trabajo.
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RESUMEN
Se evaluó diferentes formulaciones de medios de cultivo compuestos por harina de Glycine max, harina de Ipomoea batatas, suero de leche, NaCl y sulfato de amonio, con la finalidad de determinar cuál es el medio óptimo para la producción de esporas y biomasa seca de Bacillus thuringiensis. Se formularon 12 medios siguiendo un diseño Plackett-Burman, cada uno fue inoculado con un cultivo de B. thuringiensis y se incubó por 72 h a 25 °C en un agitador orbital (200 RPM). Se cuantificó la producción de biomasa seca y esporas de cada medio. Se realizó un análisis estadístico de los resultados utilizado el software estadístico Minitab y se determinó que la harina de Glycine max, harina de Ipomoea batatas y NaCl presentan efecto significativo sobre la producción de esporas de B. thuringiensis y que la harina de Glycine max, harina de Ipomoea batatas y suero de leche presentan efecto significativo sobre la producción de biomasa seca de B. thuringiensis. Se determinó que un medio óptimo para la producción de biomasa seca y esporas debe estar compuesto por 1.5 % de harina de Glycine max, 1.5 % de harina de Ipomoea batatas, 0.5 % de suero de leche y 0.2 % de NaCl.
Palabras claves: optimización, harina de Glycine max, suero de leche, harina de Ipomoea batatas, Bacillus thuringiensis, Plackett-Burman, biomasa seca, esporas.
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ABSTRACT
Different formulations of culture media composed of Glycine max flour, Ipomoea batatas flour, whey, NaCl and ammonium sulfate were evaluated, in order to determine which is the optimal medium for the production of spores and dry biomass of Bacillus thuringiensis. Twelve media were formulated following a Plackett-Burman design, each one was inoculated with a B. thuringiensis culture and incubated for 72 h at 25 °C in an orbital shaker (200 RPM). The production of dry biomass and spores of each medium was quantified. A statistical analysis of the results was carried out using the statistical software Minitab and it was determined that Glycine max flour, Ipomoea batatas flour and NaCl have a significant effect on the production of B.
thuringiensis spores and that Glycine max flour, Ipomoea batatas flour and Whey showed a significant effect on the dry biomass production of B. thuringiensis. It was determined that an optimal medium for the production of dry biomass and spores should be composed of 1.5% Glycine max flour, 1.5% Ipomoea batatas flour, 0.5%
whey and 0.2% NaCl.
Key words: optimization, Glycine max flour, whey, Ipomoea batatas flour, Bacillus thuringiensis
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, Plackett-Burman, dry biomass, spores.DE CIENCIAS
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INDICE
DEL ASESOR ... iv
PRESENTACIÓN ... v
MIEMBROS DEL JURADO ... vi
APROBACIÓN ... vii
DEDICATORIA ... viii
AGRADECIMIENTOS ... x
RESUMEN ... xi
ABSTRACT ... xii
INDICE ... xiii
INTRODUCCIÓN ... 1
MATERIAL Y MÉTODOS ... 9
1. Material de estudio ... 9
2. Procedimiento ... 9
2.1. Reactivación y verificación de la pureza del cultivo... 9
2.2. Preparación y estandarización del inóculo. ... 9
2.3. Formulación de los medios de cultivo... 10
2.4. Preparación de los medios de cultivo. ... 12
2.5. Inoculación de los sistemas de fermentación. ... 12
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2.6. Recuento de esporas. ... 13
2.7. Cuantificación de biomasa seca. ... 13
2.8. Análisis estadístico de los resultados. ... 13
RESULTADOS ... 14
DISCUSIÓN ... 21
CONCLUSIONES ... 26
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ... 27
ANEXOS ... 36
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INTRODUCCIÓN
Los cultivos comerciales constituyen una fuente importante para la economía del mundo, ya que gran parte de la base alimentaria de la población proviene de la producción agrícola. Uno de los principales factores que se debe controlar para evitar la pérdida de la producción son los insectos-plaga, pues se estima que la producción agrícola mundial se ve afectada aproximadamente en un 18%
por esta causa, situación por la cual se considera que anualmente deja pérdidas de miles de millones de dólares1.
Se estima que existen aproximadamente 2.5 millones de especies de insectos, de las cuales el 10% causan daños al ser humano o generan pérdidas económicas en el sector agrícola o agropecuario2. En el Perú, actualmente, se están desarrollando tecnologías con el fin de reducir el uso excesivo de los pesticidas; para el control de plagas, evitando así, el aumento de la resistencia sobre los fitopatógenos, lo cual genera la resurgencia y aparición de nuevas plagas; por otro lado, también se busca, disminuir el efecto directo e indirecto;
sobre el ambiente y la salud de los seres vivos ocasionado por el uso de estos agroquímicos3.
Dentro del desarrollo de dichas tecnologías tenemos al control biológico. La FAO (Food and Agriculture Organization of the United States) recoge el concepto de la Organización Internacional de Control Biológico – IOBC (2012), que define al control biológico como «una estrategia para el control de plagas
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que utiliza enemigos naturales vivos, antagonistas o competidores y otras entidades biológicas que se autoreproducen»4. De esta forma se ha generado una gran ventaja puesto que representa una alternativa ecológica, respetuosa con el ambiente, no contaminante, y que reduce notablemente el riesgo de resistencia de los patógenos. Además, al ser selectivos en su modo de acción, es poco probable que dañen a otros organismos5.
Uno de los microorganismos que ha sido estudiado con gran esmero debido a su capacidad entomopatógena es la bacteria Bacillus thuringiensis. Esta bacteria Gram positiva, tiene la capacidad de formar esporas y proteínas cristalinas con actividad insecticida, contra una amplia variedad de lepidópteros, coleópteros e insectos dípteros6. Las preparaciones de esporas y cristales del B. thuringiensis se han utilizado durante unos 60 años para el control de plagas y también para el control de insectos vectores de enfermedades.
B. thuringiensis es un bacilo Gram positivo, aerobio facultativo, esporulado, cuyo tamaño oscila entre 1 a 1.2 micrómetros de ancho y de 3 a 5 micrómetros de largo. Pertenece a la familia Bacillaceae y al género Bacillus junto con B.
cereus y B. anthracis, de los cuales se diferencia por la formación de una inclusión parasporal refringente7. La inclusión parasporal, puede ocupar hasta el 30% de la célula y se produce en la fase estacionaria de crecimiento de la bacteria. Esta inclusión está conformada por diversas estructuras proteicas, denominadas Cry y Cyt Las proteínas Cry son el principal factor de virulencia
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de B. thuringiensis y son altamente tóxicas contra insectos. Estas proteínas han sido utilizadas ampliamente como biopesticidas o en el desarrollo de cultivos8.
El aumento de la demanda del bioproducto se debe a que posee muchas ventajas, tales como: la producción a través de bioprocesos, uso de los equipos utilizados para la aplicación de insecticidas químicos, inocuidad a los mamíferos y otros vertebrados; además posee un amplio espectro de acción con alta especificidad9.En este sentido, la producción de biomasa B. thuringiensis es un tema que ha tomado mucha importancia en los últimos años10. Por otro lado, el precio exorbitante de los medios de cultivo comerciales, hace que sea necesario desarrollar un nuevo proceso de fermentación utilizando materias primas autóctonas para reducir los gastos de producción11.
Las fuentes complejas de carbono y nitrógeno, son los medios más comunes para suministrar los nutrientes requeridos en la producción industrial de B.
thuringiensis. Se han realizado estudios sobre el desarrollo de medios más baratos utilizando almidón y melaza como fuentes de carbono y materiales ricos en proteínas como la soja, el licor de maíz y la caseína como fuentes de nitrógeno12. Obeta y Okafor (1984), en su investigación formularon cinco medios, usando como sustrato: semillas de leguminosas, sangre de vaca y sales minerales; evaluaron el crecimiento y la producción de toxinas insecticidas de B. thuringiensis, que fueron efectivas contra Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus y Anopheles gambiae. De manera similar, también se ha informado que otros medios de cultivo que contienen harina de soja y licor de
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maíz se han utilizado para la producción de B. thuringiensis y otras especies del género Bacillus13.
Fernando Hercos Valicente y Colaboradores (2010), probaron cuatro diferentes medios para el crecimiento de B. thuringiensis, el primero estaba compuesto por: Luria Bertani suplementado con sales (FeSO4, ZnSO4, MnSO4, MgSO4) y 0.2% de glucosa; el medio 2 estaba compuesto por: glucosa 1.5%, harina de soya 0.5% y sales; el medio 3: estiércol de porcino líquido al 4% y glucosa 0.2%.
Luego del periodo de incubación a 30 °C durante 96 horas. Los resultados mostraron que en el medio 1 y 2 hubo una mayor cantidad de esporas viables 2.0 x 108 UFC/mL, el medio 2 la cantidad de biomasa fue 1.18 g/L14.
Así mismo, medios que contienen harina de pescado, cereales y licor de maíz, también han sido utilizados con éxito para la producción de B. thuringiensis y B.
sphaericus15.Por otra parte, también formulaciones en base a materias primas como: leguminosas, papa, suero de leche, salvado de trigo y semillas de algodón, concluyendo que un medio formulado con leguminosas, en comparación con el medio NYSM (medio comercial) y otros medios, produjo una mayor cantidad de esporas16.
Existen estudios en los que se han empleado sustancias residuales provenientes de las agroindustrias; tal como lo muestra la investigación realizada por Khanh Dang Vu, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli y J.R. Valéro. Ellos analizaron las preparaciones de B. thuringiensis var. Kurstaki HD-1 producidas
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en seis medios diferentes, empleando componentes de la industria del almidón, realizaron las siguientes combinaciones: agua residual (AR) con una concentración total de sólidos (ST) de 15 g/L, AR con 30 g/L de ST, agua residual (15 g/L ST) suplementado con quitina coloidal 0.2% (w/v), agua residual (16.5 g/L ST), suplementado con almidón de maíz al 1.25% (w/v) y tween 80 al 0.2% (v/v), lodos secundarios de la planta de tratamiento de aguas residuales de Quebec y un medio semisintético17.
En otro trabajo realizado, se optimizó un medio compuesto por lodos de aguas residuales de la industria cervecera; además se empleó caldo proveniente de la hidrólisis de lodos con varios subproductos agrícolas (arroz, harina de soja y harina de maíz) y sales minerales (MgSO4.7H2O; K2HPO4; KH2PO4; MnSO4; CaCl2; NaCl). Se encontró que: el salvado de arroz, MgSO4.7H2O y CaCl2, tuvieron una influencia significativa en la producción de endotoxinas. El medio de cultivo óptimo estuvo compuesto por: lodos de aguas residuales deshidratados (20 g/L, peso seco), CaCl2 (0.3 g/L), MgSO4.7H2O (0.32 g/L) y salvado de arroz (5.8 g/L). Los recuentos de células y esporas viables fueron de 1.25x109 UFC/mL, 1.07x109 UFC/mL, respectivamente18.
También se han evaluado subproductos industriales como: melaza, nejayote, harina de soya y suero de queso, en la formulación de tres medios de cultivo, para producir la cepa GP139 de B. thuringiensis, La evaluación se realizó en matraces de 250 mL con 100 mL de volumen de trabajo y se incubó durante 72 horas a 30 °C en un agitador orbital a 250 rpm. En el medio que contenía: 250
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g/L de melaza suplementado con 50 g/L de harina de soya, se obtuvo 5,9 x 108 esporas/mL y 1,36 mg/mL de proteína total, este resultado fue el mayor en comparación con las otras formulaciones19. De igual manera Bhowmik y colaboradores (2015) desarrollaron diferentes combinaciones empleando productos baratos como: harina de soya, cistina, melaza y agua de mar, para la producción de B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-73 20.
En estudios recientes, se han evaluado sustratos como: salvado de trigo, alimento para conejos, hojas de col, tubérculos de papa y extractos de cactus, como fuentes de carbono y proteínas; también se evaluó el agua de mar como fuente se sales minerales. El medio elaborado con extracto de cactus y agua de mar, mostró ser mejor para el crecimiento de B. thuringiensis 21. Por otra parte, Yulia Pujiastuti, y colaboradores (2018), usaron agua de coco y desechos líquidos de la industria del tofu, enriquecido con harina de caracol dorado
“Golden Snail Meal” (GSM). Los resultados mostraron que, B. thuringiensis cultivado en el medio enriquecido con 13 g de harina de caracol dorada produjo 14.14x107 esporas/mL y tuvo 86.67% de mortalidad larvaria22.
En un trabajo realizado por Zhang y colaboradores en 2013, se utilizó desechos de cocina como sustrato para la producción de B. thuringiensis mediante fermentación en base sólida. Se determinó que la mezcla optima estaba conformada por 55.21% desechos de cocina, 22.08% salvado de trigo, 11.04%
torta de soya, 11.04% cascara de granos, y 0.63% mezcla de iones. En condiciones óptimas, se obtuvieron un recuento de esporas de 5.01×1010 UFC/g
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y una entomotoxicidad de 15200 IU/mg después de 48 h de fermentación, mientras que con el medio convencional se obtuvo un recuento de esporas de 2.51×1010 UFC/g y una entomotoxicidad de 12900 IU/mg.23
Una de las razones para buscar nuevos medios de cultivo para la producción de B. thuringiensis es encontrar medios más económicos. En ese sentido, en 2019, Kumar y colaboradores realizaron un estudio en el cual produjeron B.
thuringiensis utilizando aguas residuales de la industria del almidón como sustrato. Se estimó que el costo de producción de 5 millones de litros de biopesticida formulado fue de $ 2.54/L, lo cual es competitivo con los pesticidas químicos. La evaluación tecnoeconómica reveló que la rentabilidad del proceso de fabricación de bioplaguicidas era sensible a la capacidad de la planta y al precio de venta del bioplaguicida.24
La determinación de las necesidades nutricionales de B. thuringiensis, es fundamental en la producción de un bioinsecticida; además seleccionar apropiadamente los ingredientes del medio es decisivo para obtener una mayor actividad tóxica del producto y podría considerarse como un paso principal en el proceso de escalado para la producción de delta-endotoxinas, formulación e implementación a nivel de campo25. Una fuente de carbono provee de energía necesaria para los procesos anabólicos. La ausencia de fuentes metabolizables puede ocasionar una falta de esporulación y por ende poca formación de toxinas proteicas. Del mismo modo B. thuringiensis necesita una fuente de nitrógeno para su crecimiento y se ha demostrado que la combinación de nitrógeno
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orgánico e inorgánico proporcionan una mayor cantidad de aminoácidos para el crecimiento de la bacteria, así como la formación de toxinas26.
Según Ghibri y colaboradores, existe la represión o inhibición del metabolismo secundario por catabolismo de las fuentes de carbono y nitrógeno al ser utilizadas rápidamente; como es el caso de la glucosa y el amonio27, respectivamente, lo cual podría interferir en la formación de los cristales proteicos. Todos los estudios anteriormente citados estuvieron orientados a la búsqueda de materias primas más baratas, que pueden ser usadas por separado o en combinación, para la producción de biomasa, esporas y toxinas.
Uno de los principales sustratos utilizados para la producción de B. thuringiensis es la harina de Glycine max, la cual contiene hasta 48% de proteínas, asi mismo contiene 1% de grasa y vitaminas como tiamina, riboflavina, niacina, entre otros.
28. Otro sustrato con potencial nutritivo para la producción de B. thuringiensis es la harina de Ipomoea batatas, la cual es una fuente que contiene 84% de carbohidratos, 2% de proteínas y vitaminas como vitamina A, vitamina C, tiamina, rivoflavina, niacina, asi mismo, contiene pequeñas cantidades de calcio, fosforo, zinc y hierro29. Teniendo en cuenta las capacidades nutricionales de estos productos, asi como la necesidad de formular nuevos medios de producción de B. thuringiensis, el presente trabajo tuvo como objetivo optimizar un medio de cultivo a base de: harina de Glycine max, suero de leche y harina de Ipomoea batatas, con la finalidad de obtener una mayor producción de esporas y biomasa de B. thuringiensis.
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MATERIAL Y MÉTODOS
1. Material de estudio
En el presente trabajo se utilizaron los siguientes materiales:
Un cultivo puro de B. thuringiensis (BT3) proporcionado por el laboratorio de Biotecnología e Ingeniería Genética de la escuela de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.
Harina de Glycine max, harina de Ipomoea batatas y suero de leche
2. Procedimiento
2.1. Reactivación y verificación de la pureza del cultivo.
El cultivo Bt3 conservado en refrigeración a -4°C, se inoculó en 50 mL de caldo nutritivo y se incubó durante 24 horas a 25°C con agitación constante (200 RPM) en matraces de 250 mL, luego se sembró en agar nutritivo por agotamiento para verificar las características macromorfológicas (color, borde, aspecto y uniformidad de las colonias), además se realizó una tinción de Gram (Anexo 1) y tinción con azul de comassie a las 72h, para observar el cristal paraesporal.
2.2. Preparación y estandarización del inóculo.
El inóculo se preparó Según D. Ghribi et al.2005, a partir del cultivo en agar nutritivo, se sembró en 3ml de medio LB (Anexo 2) y se incubó
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durante 24h a 30°C, se utilizó 0,5 mL para inocular 50 mL de medio LB en matraces de 250 mL. Después de incubó durante 6h a 30°C en un agitador orbital ajustado a 180 rpm, se determinó la densidad óptica (DO) a 600 nm de 0.15, que corresponde a 2x108 UFC mL-1
2.3. Formulación de los medios de cultivo.
Los medios de cultivo experimentales se prepararon siguiendo un diseño Plackett-Burman, el cual es un diseño factorial fraccionado en el cual se realizan N experimentos en donde se analizan k factores, donde “N” es múltiplo de 4 y “k” es como máximo “N-1”30.
En primer lugar, se seleccionaron los parámetros culturales que pueden afectar la producción de biomasa. Las variables seleccionadas incluyeron fuentes de carbono: harina de Ipomoea batatas; fuentes de nitrógeno: harina de Glycine max, suero de leche y sales minerales:
(NH4) + SO4 (sulfato de amonio), NaCl. Cada variable fue estudiada en dos niveles, un nivel alto (+1) y bajo (-1) (Tabla 1).
Se generó una matriz del diseño Plackett-Burman con 12 ensayos (tabla 2), utilizando el programa estadístico Minitab19. Las filas de la matriz representaron los ensayos y cada columna un factor independiente cuyos niveles fueron variados.
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Tabla 1. Valores asignados a las variables en experimento de selección.
Tabla 2. Matriz del diseño Plackett-Burman de 12 ensayos Variables Factores (g/100 mL)
Nivel de variables
-1 +1
X1
Harina de Glycine max
(g/100 mL) 0.5 1.5
X2
Harina de Ipomoea batatas
(g/100 mL) 1.0 1.5
X3 Suero de leche (ml/100 mL) 0.2 0.5
X4 NaCl (g/100 mL) 0.2 0.6
X5
Sulfato de amonio (g/100
mL) 0.2 0.4
N° de
ensayos X1 X2 X3 X4 X5
1 +1 -1 +1 -1 -1
2 +1 +1 -1 +1 -1
3 -1 +1 +1 -1 +1
4 +1 -1 +1 +1 -1
5 +1 +1 -1 +1 +1
6 +1 +1 +1 -1 +1
7 -1 +1 +1 +1 -1
8 -1 -1 +1 +1 +1
9 -1 -1 -1 +1 +1
10 +1 -1 -1 -1 +1
11 -1 +1 -1 -1 -1
12 -1 -1 -1 -1 -1
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2.4. Preparación de los medios de cultivo.
2.4.1. Medio Luria Bertani.
Se preparó caldo Luria Bertani (10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 5 g/L de NaCl), para ser utilizado como medio control. Se ajustó el pH a 7.0 adicionando NaOH 1,0N, antes de ser esterilizado a 121°C por 15 minutos.
2.4.2. Medios experimentales
Los medios de cultivo experimentales se prepararon en matraces Erlenmeyer de 250 mL, con 100 mL del volumen de trabajo, utilizando las diferentes concentraciones establecidas en la matriz del diseño Plackett- Burman (Anexo 3). Cada uno de los medios se calentó hasta disolver completamente los sustratos, posteriormente se filtró utilizando papel de filtro Whatman N°3. Cada uno de los medios se preparó en tres matraces.
Se ajustó el pH a 7.0 adicionando NaOH 1,0N, antes de ser esterilizados a 121°C por 20 minutos.
2.5. Inoculación de los sistemas de fermentación.
Cada matraz con el medio experimental fue inoculado con 1% (v/v) de cultivo (1 mL) (Anexo 4). Se incubó por 72 h a 25 °C en un agitador orbital (200 rpm). Se mantuvo el pH constante durante todo el tiempo de incubación. Al finalizar el periodo de incubación se realizó el recuento de esporas y cuantificación de biomasa seca.
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2.6. Recuento de esporas.
Transcurridas las 72h de incubación, las muestras de cultivo fueron sometidas a un choque térmico (15 minutos a 80 °C y 5 minutos a 5°C) (Anexo 5 y 6), para eliminar las células vegetativas, luego se realizaron diluciones en serie con agua destilada estéril (Anexo 7) , posteriormente se sembró por incorporación en placas con agar PCA, se incubó durante 24h a 30 ± 1°C y se realizó el recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC/mL), lo cual corresponde a la cantidad de esporas presentes en el medio.
2.7. Cuantificación de biomasa seca.
Después de las 72 h de incubación, se tomaron 50 mL de cada matraz y se centrifugaron a 2000 RPM por 10 minutos, eliminando el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 100 mL de agua destilada estéril y se centrifugó nuevamente. Este procedimiento se realizó 2 veces. La deshidratación del sedimento se realizó según el método seguido por Blas y colaboradores (2011)31, en un horno a 60°C durante 24 horas (Anexo 8), de este modo se obtuvo la biomasa seca expresada en gramos por litro.
2.8. Análisis estadístico de los resultados.
El análisis de los datos obtenidos (producción de esporas y biomasa seca) se realizó utilizando el software estadístico Minitab19. Se usó un
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análisis de varianza (ANOVA), para determinar si los sustratos utilizados tienen efecto significativo en la producción de esporas y biomasa.
RESULTADOS
En la figura 1, se observa que el medio número 5 presentó una mayor producción de esporas con respecto a los otros medios evaluados. Así mismo, se observó que todos los medios evaluados presentaron mayor producción con respecto al medio control (Luria Bertani) (Anexo 9)
En la figura 2, se muestra que, todos los medios a excepción del medio 12, presentaron una mayor producción de biomasa seca en comparación con el medio control (Anexo 10). El medio número 6 presentó mayor producción de dicho parámetro.
En la tabla 3 se muestra el Valor F y p de cada variable, como resultado del análisis de varianza para la producción de esporas (Anexo 11), muestra que la harina de Glycine max, la harina de Ipomoea batatas y el NaCl presentaron efecto con diferencia significativa (p < 0.05), esto se puede apreciar en el gráfico de Pareto generado por el software estadístico (Figura 3). El análisis de regresión (Anexo 12), mostró que la harina de Ipomoea batatas es el que tuvo mayor efecto sobre la producción de esporas (Tabla 4), así mismo, hay un alto grado de relación entre los resultados predichos y los obtenidos, esto también se puede observar en el gráfico de probabilidad normal (Figura 4).
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El análisis de varianza de la producción de biomasa (Anexo 13) determinó que existe diferencia significativa entre el efecto producido por los tres sustratos utilizados (Tabla 5), mientras que las sales (NaCl y Sulfato de Sodio) no presentaron efecto con diferencia significativa, esto también se aprecia en el gráfico de Pareto (Figura 5). El análisis de regresión de la producción de biomasa (anexo 14), mostró que la harina de Ipomoea batatas presentó el mayor efecto, seguido de la harina de Glycine max (Tabla 6), de igual forma, se observó un alto grado de relación entre los resultados predichos y los obtenidos, esto también se pudo observar en el gráfico de probabilidad normal (Figura 6)
Figura 1. Producción promedio de esporas de B. thuringiensis, en los medios evaluados, luego de 72 horas de incubación.
0 1E+12 2E+12 3E+12 4E+12 5E+12 6E+12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
UFC/mL
medio
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Figura 2. Producción promedio de biomasa seca de B. thuringiensis, en los medios evaluados, luego de 72 horas de incubación.
Tabla 3. Análisis de varianza del efecto de los sustratos sobre la producción de esporas de B. thuringiensis. Se muestra los valores F y p
Sustrato Valor F Valor p
harina de Glycine max 17.38 0.000
harina de Ipomoea batatas 119.55 0.000
suero de leche 2.54 0.123
NaCl 10.26 0.003
sulfato de amonio 2.58 0.120
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
g/L
medio
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Figura 3. Diagrama de Pareto de efectos estandarizados de los sustratos sobre la producción de esporas de B. thuringiensis. A: harina de Glycine max, B: harina de Ipomoea batatas, C: suero de leche, D: NaCl, E: sulfato de sodio.
Figura 4. Gráfico de probabilidad normal para la producción de esporas de B. thuringiensis utilizando el diseño de Plackett – Burman
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Tabla 4. Análisis de regresión del efecto de los sustratos sobre la producción de esporas de B. thuringiensis. Se muestra el efecto y el valor T.
Sustrato Efecto Valor T
harina de Glycine max 1.36940E+12 4.17
harina de Ipomoea batatas 3.59138E+12 10.93
suero de leche 5.23063E+11 1.59
NaCl 1.05229E+12 3.20
sulfato de amonio 5.27407E+11 1.61
Tabla 5. Análisis de varianza del efecto de los sustratos sobre la producción de biomasa seca de B. thuringiensis. Se muestra los valores F y p
Sustrato Valor F Valor P
harina de Glycine max 57.69 0.000
harina de Ipomoea batatas 118.19 0.000
suero de leche 13.58 0.001
NaCl 0.96 0.335
sulfato de amonio 0.70 0.409
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Figura 5. Diagrama de Pareto de efectos estandarizados de los sustratos sobre la producción de biomasa seca de B. thuringiensis. A: harina de Glycine max, B: harina de Ipomoea batatas, C: suero de leche, D: NaCl, E:
sulfato de sodio
Tabla 6. Análisis de regresión del efecto de los sustratos sobre la producción de biomasa seca de B. thuringiensis. Se muestra el efecto y el valor T.
Sustrato Efecto Valor T
harina de Glycine max 2.008 7.60
harina de Ipomoea batatas 2.874 10.87
suero de leche 0.974 3.68
NaCl 0.260 0.98
sulfato de amonio 0.222 0.84
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Figura 6. Gráfico de probabilidad normal para la producción de biomasa seca de B. thuringiensis utilizando el diseño de Plackett – Burman.
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DISCUSIÓN
En la tabla N°3 se muestra que la harina de Ipomoea batatas, harina de Glycine max y NaCl, tienen un valor p menor a 0.05, lo cual indica que estas variables tienen un efecto significativo sobre la producción de esporas; los valores de p más significativos fueron la harina de Glycine max y harina de Ipomoea batatas, seguido por el NaCl. Por el contrario, el suero de leche y el sulfato de amonio tiene un valor p, de 0.123 y 0.120, respectivamente, por lo cual fueron considerados no significativos.
El análisis de regresión muestra que los 5 sustratos estudiados, presentaron un efecto >0, lo cual indica un efecto positivo en la producción de esporas. Así mismo, el coeficiente de correlación obtenido fue R= 0.919, lo cual señala una buena correlación entre los sustratos y la producción de esporas, tal y como se visualiza en la figura 4. El modelo lineal que relaciona las 5 variables con la cantidad de esporas producidas puede presentarse mediante la siguiente ecuación: Y2 (UFC⁄mL) = +10445172407407 X1 + 7182754444444 X2 + 1743542592593 X3 + 2630712500000 X4 + 637036111111 X5.
Es necesario comprobar que las variables significativas no son producto de azar, esto aplica para aquellos valores F mayores al valor F obtenido en la tabla de distribución F, para una significancia α=0.05. El valor F interpolado de las tablas es: 3.29; en la tabla N° 3 muestra que la harina de Glycine max, harina
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de Ipomoea batatas y NaCl, tienen un valor F> 3.29, por lo tanto, se considera que tienen un efecto significativo; resultando las variables no significativas (suero de leche y sulfato de amonio), con un valor F<3.29.
En la tabla N° 5 se observa que la harina de Ipomoea batatas, harina de Glycine max y el suero de leche tienen un valor p menor a 0.05, esto indica que estas variables presentan un efecto significativo sobre la producción de biomasa seca, por el contrario, el NaCl y el sulfato de sodio presentaron valores p mayores a 0.05 lo que significa que no presentan efecto significativo sobre la producción de biomasa seca.
El análisis de regresión de la producción de biomasa seca muestra que, al igual que con la producción de esporas, los 5 sustratos estudiados presentaron un efecto >0, esto indica un efecto positivo en la producción de biomasa seca. Así mismo, el análisis de regresión determina que existe alto grado de correlación entre los sustratos y la producción de biomasa seca, el coeficiente de correlación obtenido fue R= 0.934, esta correlación puede apreciarse también en la figura 6. La producción de biomasa seca puede determinarse mediante la siguiente ecuación: Biomasa seca (g/L) = -6.738 + 2.008 X1 + 5.749 X2 + 3.247 X3 + 0.649 X4 + 1.11 X5
Los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran que en el medio 5 se obtuvo mayor producción de esporas, así mismo, los medios 2, 6 y 7 también muestran una elevada producción, estos medios contienen concentraciones
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altas de harina de Glycine max y harina de Ipomoea batatas (Anexo 15). Otros medios evaluados contienen alta concentración de un solo sustrato y se obtuvo baja producción de esporas, esto muestra que la mayor concentración de carbono y nitrógeno no necesariamente genera una mayor producción de esporas. En un trabajo realizado por Elsayed se determinó que, la mayor producción de esporas y biomasa, se ve influenciada por la proporción de carbono-nitrógeno y no por la cantidad de estos nutrientes presentes en el medio.32
Un medio de cultivo debe contener una fuente de carbono, que suministra energía para procesos anabólicos33, una fuente de nitrógeno inorgánico y otra de nitrógeno orgánico para el crecimiento y esporulación de la bacteria34. El carbono asimilable cumple un rol significativo en el crecimiento y esporulación de B. thuringiensis. Para lograr un alto crecimiento bacteriano y esporulación se necesitan azucares simples y proteínas desde el inicio de la fermentación35.
La mayoría de variedades de B. thuringiensis son incapaces de utilizar nitrógeno inorgánico como única fuente de nitrógeno, necesitan por lo menos un aminoácido, particularmente glutamato, aspartato, valina, leucina, serina o treonina36. Según Özkan, el uso de nitrógeno inorgánico causa una disminución de crecimiento y esporulación37. Por esta razón en el presente trabajo se utilizó una fuente de nitrógeno orgánico (harina de Glycine max) y una fuente de nitrógeno inorgánico (sulfato de amonio)
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Las fuentes de carbono y nitrógeno deben encontrarse en una concentración equilibrada, puesto que según estudios anteriores los excesos de estos componentes generan una inhibición en el crecimiento y formación de esporas.
En los estudios realizados por Yamashita se evidencio que un exceso de la fuente de carbono genera una represión del catabolismo asimismo se reprimió la expresión del gen SpoOA que desencadena la producción de esporas38.
Se ha señalado anteriormente que el contenido de carbono, en el medio, debe ser mayor al contenido de nitrógeno para obtener alta producción de biomasa y esporas, en un estudio anterior se determinó que un medio que contiene 20 g/L de glucosa y 15 g/L de Glycine max es un medio óptimo para la producción de B. thuringiensis39.
Con respecto a la producción de esporas, los resultados demuestran que no se ve afectada por el sulfato de amonio, esto coincide con un trabajo realizado anteriormente por Sarrafzadeh en año 2012, en el cual se determinó que el sulfato de amonio no tiene efecto significativo sobre la esporulación40, sin embargo, en otro trabajo llevado a cabo por Wan M, Wan Y, Mohd y Chan-Choy el 2003, se reportó que tiene efecto incrementando la producción de esporas41.
La harina de Glycine max presentó efecto significativo sobre la producción de esporas de B. thuringiensis, esto puede deberse a que es un sustrato rico en nitrógeno y aminoácidos, según Prabakaran y Hoti los niveles altos de amino nitrógeno aumentan la producción de biomasa y esporas, en un trabajo
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realizado en 2008 obtuvieron 4.78 g/L de biomasa y 3.24x1011 UFC/mL de esporas en un medio con 0.66 mg/mL de amino nitrógeno42. Otro factor que influye en la producción de esporas es la concentración de NaCl, se ha reportado que Bacillus produce esporas en respuesta a condiciones ambientales desfavorables, tales como alta concentración de sal en el medio43.
En el presente trabajo se determinó que el suero de leche tiene efecto significativo sobre la producción de biomasa seca pero no sobre la producción de esporas, esta diferencia de efecto se ha mencionado en trabajos realizados anteriormente, los cuales revelan que la mejor fuente de carbono para crecimiento vegetativo muchas veces no corresponde a la mejor fuente para esporulación44.
En un trabajo realizado anteriormente, se obtuvo una producción de esporas de Bacillus thuringiensis de 21.6 x 108 esporas/mL en un medio compuesto por suero de leche, soya y melaza (WSM), esto representó cuatro veces la producción de esporas obtenida en un medio compuesto solo de proteína de soya (5.5 x 108 esporas/mL), así mismo, la producción obtenida en un medio estándar fue solo del 7.3 % del obtenido en el medio WSM45. Este resultado es inferior al obtenido en la presente investigación, en la cual se obtuvo una producción máxima de esporas de 5.52 x1012 esporas/mL
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el presente trabajo, tanto la cuantificación de esporas y biomasa seca, como los resultados obtenidos en el
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análisis estadístico, nos permite determinar que el mejor medio óptimo para la producción de B. thuringiensis es el medio número 6, ya que presentó alta producción de biomasa seca y de esporas.
CONCLUSIONES
El presente trabajo nos permitió concluir que un medio óptimo para la producción de biomasa seca y esporas debe estar compuesto por: 1.5 % de harina de Glycine max, 1.5 % de harina de Ipomoea batatas, 0.5 % de suero de leche y 0.2 % de NaCl
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ANEXOS
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Anexo 1. Observación microscópica aumento 100x, Bacilos Gram positivos
Anexo 2. Preparación del inóculo en medio Luria Bertani.
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Anexo 3. Medios experimentales preparados en matraces de
250 mL
Anexo 4. Inoculación de los medios de cultivo experimentales.
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Anexo 5. Tratamiento térmico de las muestras a 80°C por 15 minutos.
Anexo 6. Tratamiento térmico a 5°C por 5 minutos.
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Anexo 7. Diluciones seriadas de las muestras en agua destilada estéril.
Anexo 8. Secado de muestras en un horno a 60°C durante 24 horas.
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Anexo 9. Recuento de esporas (UFC/mL), de los tres ensayos, en medio PCA
Medio UFC/mL
Promedio 1er ensayo 2do ensayo 3er ensayo
1 9.45 x1011 9.20 x1011 9.66 x1011 9.44 x1011 2 5.05 x1012 5.64 x1012 5.50 x1012 5.40 x1012 3 3.69 x1012 3.20 x1012 3.65 x1012 3.51 x1012 4 6.56 x1011 6.20 x1011 6.54 x1011 6.43 x1011 5 5.50 x1012 5.54 x1012 5.53 x1012 5.52 x1012 6 5.50 x1012 5.01 x1012 5.21 x1012 5.24 x1012 7 5.03 x1012 4.48 x1012 4.85 x1012 4.79 x1012 8 5.59 x1011 5.80 x1011 6.00 x1011 5.80 x1011 9 7.92 x1011 1.02 x1011 2.00 x1011 3.65 x1011 10 5.15 x1011 4.96 x1011 4.86 x1011 4.99 x1011 11 4.45 x1011 4.50 x1011 4.60 x1011 4.52 x1011 12 4.99 x1011 4.52 x1011 4.89 x1010 3.33 x1011 Control (LB) 3.04 x1010 1.09 x1011 5.70 x1010 6.55 x1010
Anexo 10. Biomasa seca de cada uno de los medios, obtenidos en cada ensayo
Medio Biomasa Seca (g/L)
Promedio 1er ensayo 2do ensayo 3er ensayo
1 4.22 4.12 4.18 4.17
2 6.52 6.42 6.92 6.62
3 4.03 4.07 4.12 4.07
4 3.56 3.45 3.42 3.48
5 5.64 5.12 5.73 5.49
6 8.56 8.13 8.63 8.44
7 5.34 5.27 5.77 5.46
8 2.40 2.43 2.38 2.40
9 2.34 2.63 2.32 2.43
10 2.72 3.18 2.89 2.93
11 3.68 3.60 3.64 3.64
12 1.10 1.04 1.08 1.07
Control (LB) 2.08 1.12 0.35 1.19
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Anexo 11. Análisis de varianza del efecto de los sustratos sobre la producción de esporas, obtenido usando el programa estadístico Minitab19
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Modelo 7 1.48012E+26 2.11445E+25 21.78 0.000
Bloques 2 1.21066E+23 6.05332E+22 0.06 0.940
Lineal 5 1.47891E+26 2.95781E+25 30.46 0.000
harina de soya 1 1.68772E+25 1.68772E+25 17.38 0.000 harina de camote 1 1.16082E+26 1.16082E+26 119.55 0.000 suero de leche 1 2.46235E+24 2.46235E+24 2.54 0.123
NaCl 1 9.96573E+24 9.96573E+24 10.26 0.003
sulfato de amonio 1 2.50343E+24 2.50343E+24 2.58 0.120
Error 28 2.71872E+25 9.70971E+23
Total 35 1.75199E+26
Anexo 12. Análisis de regresión del efecto de los sustratos sobre la producción de esporas, obtenido usando el programa estadístico Minitab19
Término Efecto Coef EE del coef. Valor T Valor p FIV
Constante 2.35630E+12 1.64230E+11 14.35 0.000
Bloques
1 75509722222 2.32256E+11 0.33 0.748 1.33
2 -6.54703E+10 2.32256E+11 -0.28 0.748 1.33
harina de soya 1.36940E+12 6.84699E+11 1.64230E+11 4.17 0.000 1.00 harina de camote 3.59138E+12 1.79569E+12 1.64230E+11 10.93 0.000 1.00 suero de leche 5.23063E+11 2.61531E+11 1.64230E+11 1.59 0.123 1.00 NaCl 1.05229E+12 5.26143E+11 1.64230E+11 3.20 0.003 1.00 sulfato de amonio 5.27407E+11 2.63704E+11 1.64230E+11 1.61 0.120 1.00
S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred)
9.85378 x1011 84.48% 80.60% 74.35%
BIBLIOTECA
DE CIENCIAS
BIOLOGICAS
Anexo 13. Análisis de varianza del efecto de los sustratos sobre la producción de biomasa, obtenido usando el programa estadístico Minitab19
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Modelo 7 120.360 17.1943 27.33 0.000
Bloques 2 0.111 0.0557 0.09 0.915
Lineal 5 120.249 24.0497 38.22 0.000
harina de soya 1 36.297 36.2966 57.69 0.000
harina de camote 1 74.362 74.3619 118.19 0.000
suero de leche 1 8.542 8.5420 13.58 0.001
NaCl 1 0.606 0.6063 0.96 0.335
sulfato de amonio 1 0.442 0.4418 0.70 0.409
Error 28 17.617 0.6292
Total 35 137.997
Anexo 14. Análisis de regresión del efecto de los sustratos sobre la producción de biomasa, obtenido usando el programa estadístico Minitab19
Término Efecto Coef EE del coef. Valor T Valor p FIV
Constante 4.185 0.132 31.65 0.000
Bloques
1 -0.008 0.187 -0.05 0.964 1.33
2 -0.064 0.187 -0.34 0.737 1.33
harina de soya 2.008 1.004 0.132 7.60 0.000 1.00
harina de camote 2.874 1.437 0.132 10.87 0.000 1.00
suero de leche 0.974 0.487 0.132 3.68 0.001 1.00
NaCl 0.260 0.130 0.132 0.98 0.335 1.00
sulfato de amonio 0.222 0.111 0.132 0.84 0.409 1.00
S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred)
0.793209 87.23% 84.04% 78.89%
BIBLIOTECA
DE CIENCIAS
BIOLOGICAS
Anexo 15: composición de los medios experimentales
Medio
Concentración (g/100 mL) Harina de
Glycine max
Harina de Ipomoea
batatas
Suero de
leche NaCl Sulfato de amonio
1 1.5 1.0 0.5 0.2 0.2
2 1.5 1.5 0.2 0.6 0.2
3 0.5 1.5 0.5 0.2 0.4
4 1.5 1.0 0.5 0.6 0.2
5 1.5 1.5 0.2 0.6 0.4
6 1.5 1.5 0.5 0.2 0.4
7 0.5 1.5 0.5 0.6 0.2
8 0.5 1.0 0.5 0.6 0.4
9 0.5 1.0 0.2 0.6 0.4
10 1.5 1.0 0.2 0.2 0.4
11 0.5 1.5 0.2 0.2 0.2
12 0.5 1.0 0.2 0.2 0.2
