Desarrollo larval del manjuarí Atractosteus tristoechus (Bloch y Schneider, 1801) (Pisces: Lepisosteidae) en condiciones de cultivo: Aspectos morfo-fisiológicos.
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas.
Yamilé Comabella Soto
La Habana
2011
Desarrollo larval del manjuarí Atractosteus tristoechus (Bloch y Schneider, 1801) (Pisces: Lepisosteidae) en condiciones de cultivo: Aspectos morfo-fisiológicos.
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas.
Autor: M.C. Yamilé Comabella Soto
Tutora: Dra. Tsai García Galano Asesora: Dra. Olimpia Carrillo Farnés
La Habana
2011
Todo el que de una forma u otra ha estado cerca de mí en estos últimos seis años, puede entender que escribir los agradecimientos de esta tesis no es tarea fácil, pues han sido muchos los que me han brindado su ayuda incondicional para la elaboración y felizmente la culminación de este trabajo.
Quisiera comenzar agradeciendo a mi tutora Tsai García y a mi asesora Olimpia Carrillo, por toda la ayuda, los conocimientos y el ánimo brindado para continuar a pesar de los obstáculos. A ambas muchas gracias.
Al gran grupo del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena de la Ciénaga de Zapata, y en especial a Andrés Hurtado, por abrirme las puertas para la realización de las experimentaciones, por acogernos como familia y por ayudarnos de la forma en que lo hicieron.
A Gabriel Márquez, de la UJAT, por su gran ayuda y por haberme iniciado en el tema de los lepisosteidos.
A Arlette Hernández, también de la UJAT, por su inmensa colaboración en el procesamiento de las muestras de histología y sus conocimientos, sin su participación no hubiese sido posible incluir tan importante información en esta investigación.
A los Doctores Roberto Mendoza y Carlos Aguilera, de la Universidad Autónoma de Nuevo León, México, por permitirme procesar las muestras para el análisis de las enzimas digestivas y por la asistencia brindada por todos los del Grupo de Ecofisiología de dicha universidad.
A la Dra. Allyse Ferrara, de la Universidad Nicholls State, EEUU, por sus sugerencias y comentarios a los artículos relacionados con esta tesis que fueron de gran valía.
Al Dr. Yamaoka, de la Escuela de graduados de la Universidad de Kochi, Japón, por el apoyo logístico para la realización de esta investigación, así como también por sus sugerencias y comentarios.
A la Dra. María Elena Ibarra por haberme abierto las puertas cuando pensé que ya nada era posible, por su ejemplo y por su empeño de llevar a cabo esta utopía.
Al Consejo Científico del CIM y a los oponentes, por todas las sugerencias y señalamientos realizados, lo cual fue de mucha ayuda.
A los trabajadores del CIM y en especial al grupo de Acuicultura Marina que de una forma u otra se vincularon a esta investigación; a Jorge Angulo por facilitarme tanto las cosas cuando estaba en la recta final; a Raúl Cruz, Lalana y Manolo por brindarme su ayuda cada vez que lo necesité; al personal de administración del centro.
A Yuriem por soportarme constantemente, por sus esfuerzos en la búsqueda de bibliografía al igual que Hanaina y por su amistad.
A todos los involucrados en la impresión de este trabajo (Aimée, Vilma, Melvis, Eduardo y Felipe).
Para el final he dejado a lo más preciado que tengo, mi familia.
A mis padres, a los que les dedico esta tesis, porque además del mérito en sí que tienen, han formado parte activa en este trabajo, a tal punto de convertirse en ocasiones imprescindibles, pues sin su intervención esto no hubiese llegado al final.
A mis hermanas Jeannett, Laritza, Yildian y Patricia, por saber que las tengo para las buenas y para las malas, por el apoyo y el ánimo brindado para seguir adelante.
A Javier, porque sin su ayuda en las experimentaciones me hubiese sido imposible llevar a cabo tan intenso trabajo, por darme fuerzas para continuar, por existir y por hacerme feliz.
A mis hijas, ambas engendradas durante la realización de este trabajo e involucrada una, Cynthia, en el arduo trabajo experimental y la otra, Maya, en el intenso proceso intelectual que conlleva la escritura de la tesis. A ambas por ser mi inspiración.
En fin, a todos los que han aportado su poquito, aunque no aparezcan explícitamente aquí, Muchas Gracias
.
A mis padres, por su ejemplo
SÍNTESIS
El estudio de la etapa larval de Atractosteus tristoechus fue realizado a través del análisis morfo-fisiológico bajo condiciones de cultivo a 28oC, desde la eclosión hasta los 18 días después de eclosionadas (DDE) las larvas. Se identificaron y describieron tres etapas de desarrollo: adherida 0-3 DDE, de transición 4-10 DDE y libre nadadora 11-18 DDE. Las tasas de crecimiento fueron de 1,30 mm/d y 10,2 %/d, encontrándose una desaceleración en la segunda etapa que coincide con las mayores alometrías, lo que indica fuertes cambios morfogénicos. En esta etapa crítica es donde ocurre el agotamiento del vitelo y la transición de la alimentación endógena a exógena. A los 4 DDE el tracto digestivo está diferenciado en región bucofaríngea, esófago, estómago con sus tres zonas e intestino anterior y posterior; detectándose tempranamente la actividad de las proteasas ácidas antes que la de las alcalinas. La tercera etapa se caracteriza por un pronunciado incremento del peso debido a la absorción eficiente de los nutrientes externos como consecuencia de la maduración del tracto digestivo. En este momento se inicia la transición hacia juvenil y se evidencia en el crecimiento los efectos de la inanición y de diferentes dietas. Se evaluaron cinco dietas inertes de iniciación, encontrándose los mejores resultados en incremento en peso y supervivencia con la moina congelada. La integración de los resultados morfo-fisiológicos mostró que la ontogenia larval del manjuarí ocurre a través de cambios puntuales y rápidos de la mayoría de los elementos analizados, más que por una gradación continua, identificándose dos puntos críticos en el desarrollo larval de esta especie.
TABLA DE CONTENIDOS
Capítulo Pág.
1. INTRODUCCIÓN --- 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA --- 8
2.1 Sistemática de los lepisosteidos vivientes ………... 9
2.2 Generalidades de los lepisosteidos ………. 10
2.2.1 Hábitat ………. 11
2.2.2 Alimentación ………... 11
2.2.3 Reproducción ………... 12
2.2.4 Relación con el hombre e importancia ……… 13
2.2.5 Situación actual de las poblaciones de lepisosteidos ………... 13
2.3 Especificidades biológicas de Atractosteus tristoechus ……….. 14
2.4 Estudios de la etapa larval de los lepisosteidos ………... 16
2.5 Ontogenia en peces ……….. 18
2.6 Alimentación larval ………. 20
3. MATERIALES Y MÉTODOS --- 22
3.1 Condiciones experimentales ………..……… 23
3.2 Muestreos ………...……… 26
3.3 Procesamiento de las muestras, mediciones y determinaciones……….. 26
3.3.1 Análisis histológico ……….. 28
3.3.2 Actividad enzimática del tracto digestivo ……….………... 28
3.4 Análisis estadísticos ……… 30
4. RESULTADOS --- 32
4.1 Descripción morfológica larval ………... 33
4.2 Morfometría larval ………. 37
4.3 Crecimiento ………..……….. 39
4.4 Desarrollo histológico del tracto digestivo ………. 43
4.5 Ontogenia de las enzimas digestivas …...……… 48
4.6 Alimentación larval ………...………. 50
4.6.1 Dietas de iniciación …..………... 50
4.6.2 Efectos de la inanición en la etapa larval ……….. 52
4.7 Generalización ……… 55
Capítulo Pág.
5. DISCUSIÓN --- 56
5.1 Etapa 1 de desarrollo larval ……….….…………... 57
5.2 Etapa 2 de desarrollo larval ……….…..……….…………. 59
5.3 Etapa 3 de desarrollo larval ………..……..………. 70
5.4 Generalizaciones ……….…………..…….…………. 76
6. CONCLUSIONES --- 80
7. RECOMENDACIONES --- 82
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS --- 84 9. ANEXO
1. INTRODUCCIÓN
Conocido popularmente como manjuarí, Atractosteus tristoechus es una especie endémica de Cuba y el único representante de la Familia Lepisosteidae (Cuvier, 1825) en Las Antillas, cuyos integrantes no han experimentado cambios evidentes respecto a los registros fósiles que datan del Cretácico. De ahí la terminología de “fósiles vivientes” utilizada para hacer referencia a los mismos. Esta especie habita en ríos, esteros, canales y lagunas de agua dulce en la región sur occidental de Cuba, principalmente en la Ciénaga de Zapata, donde se cree existan las mayores poblaciones, y en la Isla de la Juventud (Vergara, 1992;
Alfonso y Gutiérrez, 1995).
Conjuntamente a esta restricción espacial que presentan, existen otros factores como son la pérdida de hábitats y las drásticas alteraciones ecológicas ocurridas en los mismos, que han sometido a la especie a un gran estrés ambiental. Es por ello que se infiere que muchas poblaciones de A. tristoechus han desaparecido o disminuido drásticamente en número (Prats, 2003). Estas alteraciones ecológicas incluyen desde la destrucción y transformación de los hábitats naturales, la contaminación de las aguas como consecuencia del desarrollo socioeconómico, la pesca indiscriminada tanto de la especie como de los peces que le sirven de alimento, hasta la introducción de peces exóticos con fines comerciales (Ej.
Clarias sp.) que compiten por el alimento y por el espacio.
De forma general, en la actualidad existen pocos estudios sobre los lepisosteidos al compararlos con los peces teleósteos, destacándose las investigaciones relacionadas con aspectos morfológicos (Simon y Wallus, 1989), fisiológicos (Luft et al., 1994; Farmer y Jackson, 1998), evolutivos (Dores et al., 1996; Suzuki et al., 1999; Hale et al., 2002;
Kumar et al., 2005) y genéticos (Dores et al., 1997; Raabi et al., 1999; Barrientos- Villalobos y Espinosa, 2008), siendo minoritarios los estudios relacionados con el manjuarí.
La primera obra donde se hace referencia al manjuarí, es la publicada por Parra (1787), en la cual se hace una breve descripción del mismo y aparece un grabado de su aspecto externo, aunque su clasificación fue realizada por Bloch y Schneider (1801) nombrándolo Esox tristoechus. Posteriormente, en estudios realizados por Poey (1854) se describe a la especie, se presentan varios dibujos sobre su anatomía externa e interna y se destaca la función de la vejiga de los gases como alternativa para su respiración. Otros autores como
De la Torre (1889), Suttkus (1963) y Wiley (1976) también aportaron a su descripción morfológica.
No es hasta la década de los 60 del siglo XX, que aparecen nuevos trabajos exclusivamente relacionados con A. tristoechus, a pesar de que los estudios con las especies norteamericanas habían tenido una gran explosión en la primera mitad de ese siglo como los de Potter (1923), Raney (1942), Gunter (1945), entre otros autores. En 1965, Gómez de la Masa publicó un informe sobre las primeras crías de manjuarí logradas en estanques, que constituyó el primer reporte sobre la obtención de larvas de un lepisosteido en cautiverio.
En los años setenta aparecen una serie de investigaciones relacionadas con la fisiología (Siret et al., 1976), la genética (Sánchez et al., 1977) y el cultivo artificial del manjuarí (León et al., 1978). En este último, se reporta por primera vez la obtención de larvas mediante desove inducido, además de brindar los primeros datos sobre el desarrollo embrionario, crecimiento y alimentación de larvas de lepisosteidos en cautiverio.
Posteriormente aparecen las publicaciones de Coy y Hernández (1982) y la de Gajdúšek y Rubcov (1986) quienes analizaron los endoparásitos más frecuentes y la microestructura de las membranas del huevo, respectivamente. Finalmente en el año 2003, se realizó el estudio de la morfometría externa y de la morfología de las gónadas masculinas (Prats, 2003), y esta es la última referencia, de las pocas que existen, sobre las investigaciones realizadas durante más de dos siglos en A. tristoechus.
Este desconocimiento existente de la biología del manjuarí así como de la situación de sus poblaciones naturales, es la causa principal por la cual su estatus no ha sido evaluado por CITES (Convention on International Trade in Endangered Species) ni por la IUCN (International Union for Conservation of Nature) (Ibarra y Cotazo, 2003). Los primeros pasos dados para el manejo de esta especie fueron la creación del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena en la Ciénaga de Zapata en 1990, dedicado a la reproducción ex situ y a la obtención de juveniles que principalmente se comercializan como peces ornamentales; y la prohibición de su captura (Decreto Ley 164 del Ministerio de la Industria Pesquera). Además, se le otorgó el estatus de vulnerable en el taller de Conservación, Análisis y Manejo Planificado realizado en La Habana en 1999, basándose fundamentalmente en los factores de amenaza anteriormente descritos y en la escasa información que sobre el grupo se tenía (Pérez et al., 1999). Sin embargo, se hace necesario
desarrollar planes de manejo y estrategias para proteger la existencia y supervivencia de estos animales en el archipiélago, por lo que es imprescindible ampliar el marco de las investigaciones que respondan a estos propósitos.
Aunque la descripción de la etapa larval y de las tasas de crecimiento de los lepisosteidos como Lepisosteus osseus, L. platostomus, L. oculatus, Atractosteus spatula y A. tropicus aparecen publicadas (Netsch y Witt, 1962; Pearson et al., 1979; Yeager y Bryant, 1983;
Simon y Wallus, 1989; Simon y Tyberghein, 1991; Long y Ballard, 2001; Aguilera et al., 2002); aún la del manjuarí no se ha realizado, cuando esta es la base para cualquier tipo de análisis futuro que se pretenda hacer.
Durante la primera fase de vida de un pez, las larvas sufren procesos muy complejos de morfogénesis y diferenciación, lo que incluye cambios en las relaciones morfométricas, cambios morfo-fisiológicos en la musculatura y en los sistemas de órganos internos, así como cambios óseos y en la conducta (Webb, 1999). Dentro de estas transformaciones, las relacionadas con el sistema digestivo requieren de especial atención para el entendimiento de los procesos de ingestión, absorción y asimilación de los nutrientes, pues es el primer paso para determinar la posibilidad real del mantenimiento en cautiverio de las crías (Divakaran et al., 1999; Fountoulaki et al., 2005). Otros de los elementos que igualmente hay que tener presente por su influencia en el crecimiento, la supervivencia y la eficiencia de alimentación de las larvas de peces tanto de cultivo como del medio natural, son los factores abióticos, como la temperatura de incubación (Teletchea et al., 2009), la salinidad (Mihelakakis y Yoshimatsu, 1998), los niveles de oxígeno (Hanna et al., 2008) entre otros;
así como la disponibilidad de alimento (Shoji et al., 2002; Bolasina et al., 2006; Kling et al., 2007). Todos ellos pueden afectar además el metabolismo, la actividad e incluso la estructura y calidad del desarrollo general de las larvas (Saka et al., 2005).
Una vez entendida la morfo-fisiología digestiva en las larvas y sus requerimientos abióticos y nutricionales, se tienen los cimientos para el cultivo de la etapa más sensible de todo su ciclo de vida. Para perfilar dicho sistema, se hace imprescindible la formulación de dietas y de esquemas de alimentación adecuados que garanticen, en un alto porcentaje, la supervivencia y el crecimiento de las larvas. El alimento se convierte así, en el punto neurálgico de cualquier sistema de cultivo. Además de ser su composición, sus
calidad de las larvas, es el que establece la viabilidad económica del proceso, pues el mayor costo del mismo está representado por los grandes gastos que significa la alimentación, principalmente de las larvas. Es por ello que la búsqueda de dietas adecuadas debe considerar tanto las particularidades nutricionales de la especie en cuestión, como la rentabilidad económica y las posibilidades tecnológicas con las que se pueden contar.
El establecimiento de sistemas de cultivos de peces, estén estos amenazados o no, ha constituido una vía eficaz para la reducción de la presión de pesca sobre los mismos, y en muchas ocasiones se ha convertido en una opción efectiva para la repoblación de áreas naturales (Leitão et al., 2011). Es por ello que se avizora el cultivo del manjuarí como un posible paliativo a la situación actual que presentan sus poblaciones. Tanto la metodología existente desde la década de los 90 en la Ciénaga de Zapata para el desove y cultivo de larvas y juveniles, así como los antecedentes de los cultivos a gran escala que actualmente existen con las otras dos especies del género Atractosteus; sientan las bases para el perfeccionamiento de un sistema que puede ofrecer la posibilidad tanto para la explotación comercial con fines ornamentales, como para el establecimiento de programas de repoblación en áreas naturales.
Dado el valor faunístico del manjuarí, por ser endémico, por su importancia científica, económica y social, la aparente situación actual de vulnerabilidad de sus poblaciones y encontrándose una problemática cuya solución requiere de una base teórica que sirva como punto de partida en la elaboración de medidas eficaces para su conservación y manejo; se proponen la siguiente hipótesis y objetivos de trabajo.
HIPÓTESIS
La caracterización morfo-fisiológica de las larvas de manjuarí (Atractosteus tristoechus) mantenidas en condiciones de cultivo, permite encontrar los puntos críticos del desarrollo de esta etapa.
Objetivo general:
Evaluar morfo-fisiológicamente la etapa larval del manjuarí (Atractosteus tristoechus) en condiciones de cultivo.
Objetivos específicos:
1. Describir los principales cambios morfológicos y morfométricos durante la etapa larval.
2. Describir histológicamente el desarrollo del tracto digestivo de las larvas.
3. Cuantificar la actividad de las enzimas digestivas durante la ontogenia larval.
4. Evaluar cinco dietas inertes de iniciación.
5. Determinar el efecto de la inanición en la supervivencia y crecimiento de las larvas.
La novedad científica de esta investigación se puede resumir de la siguiente manera:
- Por primera vez para los lepisosteidos se aplica el análisis alométrico del crecimiento de las larvas.
- Por primera vez se describe detalladamente la morfología y la morfometría de la etapa larval de A. tristoechus.
- Por primera vez para la especie se describe el desarrollo ontogénico del tracto digestivo desde el punto de vista histológico y fisiológico a través de la actividad de las enzimas digestivas.
- Por primera vez para la especie A. tristoechus se evalúa el efecto de la inanición y de diferentes dietas inertes de iniciación sobre la supervivencia y crecimiento de las larvas.
- Se ofrecen resultados bioquímicos e histológicos como ejemplos novedosos a aportar a la “teoría de la ontogenia por saltos” formulada por Balon (1985), la cual se basa esencialmente en cuestiones morfológicas externas y conductuales.
La importancia teórica fundamental de la tesis consiste en que se caracteriza la etapa larval de A. tristoechus y la influencia que diferentes tipos de alimento puede ejercer sobre el crecimiento y la supervivencia de las mismas; aportándose conocimientos básicos de la anatomía y fisiología de esta especie con el fin de ganar un mayor entendimiento del desarrollo biológico durante esta etapa. Se indica la existencia de dos puntos críticos en el desarrollo larval que constituyen referencias obligadas para la comprensión y el manejo de esta fase del ciclo de vida del manjuarí.
La importancia práctica de la tesis viene dada porque la definición de las etapas de desarrollo y los puntos críticos de la fase larval, así como los resultados obtenidos en la caracterización de los aspectos relacionados con la alimentación durante las primeras etapas y el manejo de las mismas, permitió perfeccionar la metodología del cultivo y así optimizar la cría de las larvas de esta especie en el Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional de la Ciénaga de Zapata. Constituye además, un importante aporte para la concepción y ejecución de planes de manejo y conservación que se pretendan implementar en el país, sirviendo también como referencia para estudios futuros en esta especie.
Parte de los resultados de esta tesis fueron publicados en revistas internacionales arbitradas (Fish Biology and Biochemistry (2006) y Zoological Science (2010)) y presentados en cinco ponencias orales y un cartel, en tres eventos internacionales auspiciados por la Red Internacional para la Investigación y el Manejo de los Lepisosteidos.
El documento está conformado por 83 páginas, distribuidas en Introducción, Revisión Bibliográfica, Materiales y Métodos, Resultados, Discusión, Conclusiones y Recomendaciones. El documento consta además de los acápites Tabla de Contenidos, Síntesis, Referencias Bibliográficas (290) y Anexo.
2. REVISIÓN
BIBLIOGRÁFICA
Los lepisosteidos constituyen un grupo de peces muy particular, pues la prevalencia de varias de sus características primitivas los separa del resto de los teleósteos. Suttkus (1963) señaló varios de sus rasgos distintivos que sin duda contribuyeron a su supervivencia durante millones de años, entre los que se encuentran: su rígida cubierta protectora proporcionada por escamas romboidales articuladas entre sí por sus bordes; la vejiga de los gases altamente vascularizada que los habilita con la capacidad de respirar aire atmosférico;
el cono arterial del corazón con ocho hileras transversales provistas con cuatro a ocho válvulas cada una, lo cual los dota de una capacidad cardiaca particular; la presencia de vértebras completamente osificadas y opistocélicas, una conformación única entre los peces vivientes que les permite realizar movimientos rápidos y precisos indispensables en el momento de atacar a sus presas; así como la existencia de una válvula espiral en el intestino posterior que aumenta su capacidad digestiva, convirtiéndolos en depredadores eficaces.
Este grupo se originó a finales del período Pérmico, hace unos 180 millones de años, e incluía varias líneas evolutivas que se desarrollaron durante el período Triásico y se expandieron notablemente hasta fines del Jurásico junto con los peces cartilaginosos (Young, 1985). Sin embargo, en el Cretácico su representatividad disminuyó marcadamente al aparecer los peces teleósteos, los que incrementaron el número de especies y variedad de formas, hasta sustituir gradualmente a los ganoideos y dejarlos reducidos a las pocas especies de la actualidad (Wiley, 1976).
Se reconocen restos fósiles de nueve especies de lepisosteidos, encontrados en Norteamérica (Cretácico a Reciente), Europa (Cretácico a Oligoceno), África (Cretácico) e India (Cretácico). Los representantes actuales, restringidos a siete especies localizadas en Norteamérica, Centroamérica y Cuba, aparecieron en el período Cretácico tardío (Era Mesozoica) hace unos 130 millones de años y exhibieron su máximo éxito ecológico en el período Paleoceno temprano (Era Cenozoica) hace 75 millones de años (Wiley, 1976;
Smith, 1981; Hedges, 1996).
2.1 Sistemática de los lepisosteidos vivientes
La clasificación sistemática de este grupo ha sufrido numerosos cambios desde la segunda mitad del siglo XVIII hasta la actualidad, marcado por un gran número de sinonimias y de reconocimientos de géneros diferentes. El primer lepisosteido fue descrito por Linnaeus
(1758) como Esox osseus (actual Lepisosteus osseus), convirtiéndose en el precursor en la clasificación sistemática de este grupo. Ya en 1801, Bloch y Schneider describieron al segundo lepisosteido, Esox tristoechus (actual Atractosteus tristoechus), y en 1803 Lacépède estableció el género Lepisosteus (Prats, 2003). Posteriormente Rafinesque (1818, 1820) agregó otros géneros al grupo, Litholepis, Sarchirus, Cylindrosteus y Atractosteus; y Cuvier en 1825 agrupó las especies existentes en una familia, Lepisosteidae. Durante la continuación del siglo XIX y el XX se describieron las especies actuales, destacándose los trabajos de Agassiz (1834, 1850), Girard (1858), Moore (1957), Suttkus (1963) y otros muchos citados en el estudio de Wiley (1976). Es este autor quien propuso la definición de dos géneros bien establecidos, Lepisosteus y Atractosteus, para la familia Lepisosteidae.
En el género Lepisosteus (Lepis =escama, osteus =ósea) se encuentran:
L. osseus (Linnaeus, 1758) - Longnose gar
L. platostomus (Rafinesque, 1820) - Shortnose gar L. oculatus (Winchell, 1864) - Spotted gar
L. platyrhincus (De-Kay, 1870) - Florida gar
Ubicados todos en el Este y centro de Norteamérica.
En el género Atractosteus (Atractos =ahusado, referido a la forma del cuerpo, osteus
=ósea) se encuentran:
A. tristoechus (Bloch y Schneider, 1801) – manjuarí-Cuban gar (Cuba)
A. spatula (Lacépède, 1803) – catán- alligator gar (Estados Unidos y Centroamérica) A. tropicus (Gill, 1863) – pejelagarto - tropical gar (Centroamérica)
2.2 Generalidades de los lepisosteidos
Las características de la familia Lepisosteidae son las siguientes: cuerpo alargado, subcilíndrico, con escamas ganoideas oblicuamente imbricadas que forman una coraza protectora pero que al mismo tiempo permiten curvaturas corporales extremas (Gemballa y Bartsch, 2002); mandíbulas alargadas, la superior proyectándose sobre la inferior, premaxilas formando la mayor parte del margen de la mandíbula superior, maxila
serie exterior de dientes pequeños, seguida por una o dos series de dientes mayores aguzados, dientes presentes también en el vómer, palatinos y faringe; lengua edentada, corta, emarginada, anteriormente libre; ojos pequeños; narinas cerca del final de la mandíbula superior; espiráculos ausentes; pseudobranquias presentes; cuatro arcos branquiales, con la abertura tras el último; branquiespinas cortas; “pulmón” presente, funcional; aleta dorsal corta, alta, posterior, más o menos opuesta a la anal, que es de forma similar; cola heterocerca abreviada y redondeada, con filamento posterior en los juveniles;
ventrales aproximadamente equidistantes de las pectorales y la anal; pectorales y ventrales moderadas, con pocos radios (Villa, 1982).
2.2.1 Hábitat
Los lepisosteidos se encuentran en ríos, esteros, canales y lagunas de aguas dulces, gustan de la vegetación y aguas tranquilas, siendo peces de costumbres poco activas (Poly, 2001).
Algunas especies se han visto en aguas salobres o marinas a lo largo de la costa del Golfo de México (Goodyear, 1966; Bussing, 1987; Robinson y Buchanan, 1988) indicando su tolerancia a determinadas salinidades.
2.2.2 Alimentación
De manera general los lepisosteidos adultos se alimentan principalmente de peces, crustáceos (Potter, 1923; Toole, 1971; Reséndez y Salvadores, 1983) y artrópodos (Goodyear, 1967), aunque también se han encontrado eventualmente restos de aves en sus contenidos estomacales (Raney, 1942). Las preferencias alimentarias dependen de varios factores, entre los que se encuentran la disponibilidad del alimento, la etapa de desarrollo y la especie. Holloway (1954), Netsch (1964) y Echelle y Riggs (1972) reportaron que en la etapa juvenil de L. osseus, L. oculatus, L. platyrhincus y L. platostomus prefieren insectos como las larvas de mosquitos, microcrustáceos y peces, pero que con el desarrollo de los mismos se muestra una mayor preferencia por los peces en la dieta. Los escasos organismos bentónicos encontrados en los contenidos estomacales y la abundancia de pelágicos como Gambusia, suponen que su alimentación se realiza principalmente en la superficie (Echelle y Riggs, 1972). Se ha sugerido que este tipo de alimentación tiene cierta relación con su capacidad para respirar aire atmosférico, un proceso que ocurre frecuentemente durante el
verano en las aguas poco profundas de las lagunas. Por otra parte, Holloway (1954) mencionó que la alimentación de L. platyrhincus se lleva a cabo principalmente a la caída del sol, durante las noches o en los días nublados. Esto coincide con lo observado por Reséndez y Salvadores (1983), quienes en función del grado de digestión de los contenidos estomacales de A. tropicus y de la hora de captura, dedujeron que estos animales eran de hábitos nocturnos. De manera similar, Goodyear (1967) mencionó que L. osseus es un depredador activo en aguas abiertas, alimentándose preferentemente en la noche.
La estrategia de depredación de los lepisosteidos consiste en la ausencia de movimientos innecesarios, permaneciendo inmóviles hasta que la presa se encuentra a su alcance y en ese momento con un movimiento lateral muy rápido de la cabeza atrapa súbitamente de un mordisco a la misma (Suttkus, 1963; Netsch, 1964). A pesar de los numerosos y agudos dientes con que se encuentran dotados estos animales, en los contenidos estomacales prácticamente no se hallan individuos en pedazos o mordidos, lo que sugiere que los dientes son utilizados principalmente para evitar que las presas escapen.
2.2.3 Reproducción
Los lepisosteidos presentan un comportamiento poco gregario, sin embargo, durante la temporada de reproducción, se les puede encontrar formando grupos de hasta más de 20 al mismo tiempo (Holloway, 1954, Alemán y Contreras, 1987). Suttkus (1963) mencionó que cuando las hembras van a desovar encabezan los grupos de reproductores y se aproximan a las orillas, haciéndose acompañar de uno a cuatro machos. Éstos con el hocico presionan la región abdominal de la hembra hasta que se inician los movimientos bruscos típicos de la ovoposición, sincronizado con la expulsión del esperma de los machos. Ocurre así la fecundación de los óvulos y la formación de los huevos que se adhieren a la vegetación sumergida por estar cubiertos de una sustancia pegajosa (Contreras y Alemán, 1987). Estos huevos son relativamente grandes, hasta 4 mm, de color verdoso y son tóxicos, por lo que causan graves daños sin son ingeridos por aves o mamíferos (Netsch y Witt, 1962).
Los desoves ocurren habitualmente en las horas más frescas (Pérez-Sánchez, 1995) y las épocas de desove típicas son durante la primavera y principios del verano (García de León et al., 2001; Love, 2004). Es en este período donde se incrementan las lluvias, por lo que
huevos y aumentan los niveles de zooplancton, lo que asegura el alimento para las futuras larvas (Pérez-Sánchez, 1995).
Los embriones permanecen pocos días en incubación, nace una larva que presenta un órgano adhesivo con el que se fija a los objetos sumergidos hasta que comienza la natación y la búsqueda de alimentos (Mendoza et al., 2004b).
2.2.4 Relación con el hombre e importancia
Este grupo de peces ha sido considerado en muchas regiones como un pez desagradable, depredador y destructivo, que afecta la pesca de interés comercial o deportiva por sus hábitos alimenticios (Holloway, 1954). Esto ha motivado que en muchas ocasiones y áreas se haya exhortado continuamente su erradicación de los hábitats naturales, existiendo asociaciones que reúnen a los interesados en la pesca de los lepisosteidos, sobre todo en los Estados Unidos.
En el caso particular de Centroamérica y el Caribe, los lepisosteidos se consideran de importancia comestible, ocupando un lugar importante en la dieta de varias poblaciones humanas, como ocurre en la región de Tabasco, México (León et al., 1978; Contreras y Alemán, 1987). Por estas razones, es que se ha incrementado el cultivo de la especie existente en esta área geográfica (A. tropicus) con marcados volúmenes productivos (Márquez, 2004). Igualmente han tenido cierta importancia cultural, como en Norte y Centroamérica donde los indios tradicionalmente empleaban las escamas ganoideas y los huesos para confeccionar puntas de flecha, instrumentos para sus rituales y ornamentos (Agogino y Shelley, 1987).
2.2.5 Situación actual de las poblaciones de lepisosteidos
Debido a la sobrepesca en algunas zonas, ya sea para fines comerciales o deportivos, y a la pérdida de las áreas pantanosas donde habitualmente se localizan los lepisosteidos, numerosas poblaciones se han visto afectadas. Durante años las zonas pantanosas han sido a menudo consideradas como indeseables, ya que contienen agua relativamente estancada y porque se consideran como un obstáculo para la navegación y la construcción de caminos (Mendoza et al., 2004a). Por estas razones, muchas de ellas fueron rellenadas para construir caminos, desarrollar zonas de cultivo y asentamientos poblacionales, lo que ha arruinado de
manera crítica las zonas de permanencia y desove de estas especies. Desde hace poco tiempo es que estas áreas han ocupado el lugar ecológico que realmente tienen como reservorio de una riqueza incalculable de la flora y la fauna. Estas zonas, por sus características hidro-geográficas, también se han visto afectadas por la contaminación, la cual está considerada como otro factor negativo que afecta a las poblaciones de lepisosteidos (Hartley et al., 1996).
Desafortunadamente, los estudios poblaciones sobre los aspectos básicos con interés en la conservación de este grupo se desconocen o apenas han sido explorados, lo cual dificulta la determinación con precisión del estatus de cada especie y del tipo de medidas específicas que se requieren para protegerlas. No obstante, se ha empleado el principio precautorio en muchas de ellas, como en los Estados Unidos, donde A. spatula, L. platostomus, L. oculatus y L. osseus han sido declaradas en el estatus de peligro en Kentucky, amenazada en Illinois y necesaria de manejo en Tennessee (Simon y Wallus, 1989). Por su parte, la especie A.
spatula fue considerada potencialmente en riesgo considerable de desaparecer en gran parte del Golfo de México (Mendoza et al., 2004a) y A. tropicus fue incluida en Costa Rica dentro de la lista de especies con poblaciones reducidas (Mora et al., 1997). En el caso de A. tristoechus, éste fue considerado como primariamente amenazado por Buide et al.
(1974) y como vulnerable por Pérez et al. (1999), basándose fundamentalmente en los factores de amenazas y la escasa información que se tenía sobre la especie.
2.3 Especificidades biológicas de Atractosteus tristoechus
Al igual que el resto de las especies vivientes de lepisosteidos, la posición taxonómica del manjuarí ha estado sometida a diferentes sinonimias en la categoría de orden, familia, género y especie (Bloch y Schneider, 1801; Poey, 1854; Suttkus, 1963; Gómez de la Maza 1965; Alayo 1973, Wiley, 1976).
La ubicación taxonómica de la especie según Nelson (2006) es:
Phylum Chordata Subphylum Craniata
Superclase Gnathostomata Clase Actinopterygii
Orden Lepisosteiformes Familia Lepisosteidae Género Atractosteus
Especie Atractosteus tristoechus (Bloch & Schneider, 1801)
La etimología indica: Atractosteus (del griego atractos = ahusado, referido a la forma del cuerpo y del latín osteus = hueso, referido a la escama) y tristoechus (del latín tri = tres y del griego steachos = hileras, filas; referido a las tres hileras de dientes presentes en las mandíbulas, dos en la superior y una en la inferior) (Prats, 2003). El nombre común de manjuarí proviene de los primeros pobladores de Cuba que lo llamaron “manchuari”
debido a sus dientes abundantes (Cosculluela, 1965).
En cuanto a las características morfológicas externas del adulto, son similares a las del resto de los lepisosteidos, con la excepción de que carece de manchas en la región de la cabeza, las aletas y el dorso del cuerpo (Poey, 1854; Wiley, 1976). La coloración general es de parda oscura a gris verdosa, más clara en el vientre. Presentan un cuerpo alargado, cilíndrico, cubierto por las escamas ganoideas y la línea lateral es completa y recta sin que difieran las escamas en esta zona. La cabeza es deprimida dorso-ventralmente y protegida por placas osificadas. La boca es terminal y grande, con mandíbulas armadas con tres hileras de numerosos dientes cónicos y afilados, siendo la mandíbula superior más prolongada que la inferior. Además, aparecen dientes relacionados con el vómer, palatinos y faringe (Parra, 1787; Poey, 1854; Gómez de la Maza 1965, Alayo, 1973). Difiere de los otros representantes del género por las características de los huesos craneales y el número de los rastrillos branquiales (Suttkus, 1963; Wiley, 1976).
Posee fuertes hábitos carnívoros, por lo que se alimenta de animales acuáticos de todo tipo, de preferencia peces, además de pequeños reptiles, crustáceos, anfibios y aves acuáticas (Poey, 1854; Vergara, 1992). Los endoparásitos más frecuentes fueron descritos por Pérez (1936), Barus y Moravec (1967) y Coy y Hernández (1982) e incluyó a especies como:
Proteocephalus manjuariphilus, P. singularis, Posthodiplostomulum sp., entre otros. En vida natural es frecuente la presencia de gran número de ectoparásitos, dentro del que se destaca el género Argulus sp., conocido como piojos acuáticos (Hurtado et al., 1994).
2.4 Estudios de la etapa larval de los lepisosteidos
La mayoría de las investigaciones realizadas en este grupo de peces se ha centrado en las poblaciones naturales de organismos adultos (Johnson y Noltie, 1996, 1997; Ferrara e Irwin, 2001; Love, 2002). Sin embargo, existen pocos estudios de la etapa larval, los cuales se han enfocado esencialmente en la descripción morfológica y morfométrica de algunas estas especies (Netsch y Witt, 1962; Pearson et al., 1979; Simon y Wallus, 1989; Long y Ballard, 2001; Aguilera et al., 2002). Estas descripciones morfológicas se han basado principalmente en las características generales de la pigmentación, de la conducta, en la aparición de determinadas estructuras y en el establecimiento de intervalos de longitud total con la relación de los diferentes caracteres morfométricos medidos dentro de cada uno de ellos. Simon y Wallus (1989) y Simon y Tyberghein (1991) por ejemplo, a través del análisis de larvas coleccionadas en museos, establecieron seis intervalos de talla a través de la medición de 81 ejemplares para Lepisosteus osseus (5,9-10,9; 11,4-15,6; 16,2-19,6; 20,1- 23,9; 24,1-26,9; 27,1-30,2 mm); seis intervalos con 31 individuos para L. oculatus (9,8- 11,2; 13,6-17,6; 20,2-23,9; 24-26,9; 27,2-35,9; 51,8); dos intervalos para L. platostomus por solo contar con dos individuos (26,5; 38,0) y cuatro intervalos para Atractosteus spatula (14,9; 20,4-24,0; 65,8; 94,6-103) basándose en este caso solamente en seis animales. Posteriormente Aguilera et al. (2002) reevalúa esta especie y mediante el empleo del análisis de discriminante, constituyen seis intervalos de talla (6,6-8,8; 9,2-13,5; 14,2- 19,2; 19,5-22,5; 23,0-32,0; 34,8-50,0) a través de la medición de 62 individuos. Este mismo tipo de análisis lo aplicaron en A. tropicus, formando igual número de intervalos de tallas (6,8-9,0; 9,6-12,1; 12,5-13,8; 14,5-21,8; 22,0-36,0; 38,3-60,3) empleando para ello 70 individuos.
Con relación al establecimiento de estadios o etapas dentro de la fase larval, solamente aparecen los trabajos de Yeager y Bryant (1983) con L. osseus, quienes definieron las fases de prolarva (8,8-12,4 mm LT) y postlarva (23,5-27,7 mm LT) y los de Aguilera et al.
(2002), quienes empleando los mismos intervalos de longitud total designaron el término de estadios de desarrollo del I al VI para A. spatula y A. tropicus. Como se evidencia, en ninguno de estos estudios se definieron etapas de desarrollo larval a través de la integración de caracteres morfológicos, morfométricos y conductuales, ni fue aplicado el análisis
La alometría se define como el crecimiento relativo diferencial (Gisbert y Doroshov, 2006), y muchos peces la exhiben durante su período larval (Mello et al., 2006). Estos patrones de crecimiento alométrico reflejan las prioridades morfo-anatómicas de acuerdo con su importancia en las funciones vitales primarias que garantizan una supervivencia adecuada en las larvas (Sala et al., 2005; Choo y Liew, 2006). En la última década, ha existido un incremento en este tipo de análisis debido a su uso en biología pesquera y la acuicultura, apareciendo estudios en espáridos (Kouttouki et al., 2006; Cobán et al., 2009), esturiones (Gisbert y Doroshov, 2006), peces gatos (Geerinckx et al., 2008; Huysentruyt et al., 2009) y loricaridos (Schmidt, 2001).
Motivadas por el vacío de información que se tenía y por el desarrollo del cultivo de algunas de sus especies, como el catán y el pejelagarto, las universidades mexicanas (Universidad Juárez Autónoma de Tabasco y la Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey), junto con otras universidades norteamericanas, iniciaron un grupo importante de investigaciones encaminadas a la caracterización de las diferentes fases del desarrollo embrionario y larvario, la comparación del crecimiento de las larvas de ambas especies, el diseño de dietas adecuadas, así como estudios histológicos, enzimáticos, endocrinológicos, y sobre marcadores bioquímicos (Mendoza y Aguilera, 2001; Mendoza et al., 2002 a,b;
Márquez, 2004; de la Cruz, 2008). Dentro de estos aspectos, se potenciaron aquellas investigaciones relacionadas con la alimentación de las larvas y las condiciones para su cría en cautiverio, pues estos son elementos claves para el éxito de cualquier sistema de cultivo que se pretendiera establecer. Aparecen así estudios relacionados con los efectos de la temperatura y la densidad de siembra en el desarrollo de los embriones y el crecimiento de las larvas (Márquez, 1998; Méndez, 2004); la frecuencia y el horario de alimentación (Zapata, 2003); la determinación de los requerimientos nutricionales (Jesús, 2008) y del punto de no retorno en larvas (Hernández, 1999); la evaluación de diferentes tipos de dietas de iniciación como alimento vivo, artemia congelada, piensos comerciales y formulaciones semipurificadas (Escobar, 2006; Márquez et al., 2006; Mendoza et al., 2007), entre otros.
Este último aspecto ha tomado especial atención, pues para establecer cualquier método de cultivo, es imprescindible encontrar aquellas dietas que satisfagan los requerimientos de la especie, pero que además haga factible tanto práctica como económicamente la producción
de las crías. Es por ello que el empleo de alimento inerte motivó el desarrollo de numerosas investigaciones en el catán y el pejelagarto, lográndose buenos resultados con la utilización de piensos tanto comerciales como formulados, en el crecimiento y la supervivencia de las larvas desde su primera alimentación (Mendoza et al., 2002a; Márquez et al., 2006).
Estos avances han permitido el perfeccionamiento en el diseño y operación de las técnicas de cultivo (González, 2006) con el consiguiente incremento substancial de la producción de crías (Rodríguez, 2008), viéndose como una posibilidad real la utilización de estas especies con fines comerciales y la implementación de programas de repoblación de las áreas naturales afectadas.
2.5 Ontogenia en peces
La ontogenia es un proceso formativo que tiene lugar en todas las especies a una tasa y ritmo específico, provocando cambios anatómicos, fisiológicos, conductuales y ecológicos (Hensel, 1999). En el caso de los peces puede seguir tres modelos: la ontogenia indirecta, en la que aparece el embrión, la larva, el juvenil y el adulto; la ontogenia transitoria, en la que no aparece el estadio de larva, sino de alevín, el cual es considerado una larva vestigial;
y la ontogenia directa en la que directamente el embrión pasa a juvenil (Balon, 1990).
La etapa larval está considerada como la más vulnerable de todas las etapas comprendidas en el ciclo de vida de los peces. La misma está caracterizada por altas mortalidades y por la existencia de numerosas estructuras temporales específicas, que con posterioridad deben ser remodeladas a través de procesos metamórficos. La larva es por tanto, una forma vegetativa transitoria, que a menudo ocupa un nicho completamente diferente al del adulto. Es por eso que el patrón de ontogenia directa, está considerado un tipo de desarrollo más especializado y ventajoso al eliminar la etapa vulnerable, que implica además un costo energético dado por las remodelaciones necesarias para el paso a juvenil (Balon, 1990).
Definir el final de la etapa larval y el inicio del período juvenil en los peces que tienen ontogenia indirecta, resulta complejo. Para eso es necesario combinar los análisis de crecimiento relativo con descripciones externas y funcionales, lo cual permite definir el momento del final de la metamorfosis y el paso a la etapa juvenil (Gozlan et al., 1999).
Existen dos puntos de vista relacionados con el proceso de ontogenia en peces. Algunos autores consideran que éste es gradual y contínuo y otros que es por saltos (Kovac y Copp, 1996). La teoría de la ontogenia por saltos formulada por Balon (1985) ha sido ampliamente reconocida. La misma sugiere que el desarrollo se presenta como una sucesión de estados estabilizados que son más largos (denominados pasos), alternando con intervalos menos estables que son más cortos (denominados umbrales). Kovac (2002) consideró que estos saltos en la ontogenia vienen dados por procesos de sincronía y asincronía. El primero garantiza el desarrollo de estructuras necesarias para que nuevas funciones aparezcan en el momento adecuado, y el segundo, el desarrollo de individuos que alcancen el próximo estado de estabilidad de forma prematura. Fallos en esta sincronía y asincronía puede tener consecuencias fatales en el embrión en desarrollo.
El sincronismo opera a nivel de grupos de estructuras, de forma tal que las mismas estén listas simultáneamente, proveyendo al organismo con nuevas funciones (habilidades) e interacciones asociadas con el próximo estado estabilizado superior (Kovac, 2002). Por ejemplo, las larvas recién eclosionadas poseen una aleta media bien desarrollada, así como pequeñas aletas pectorales inmóviles y horizontales. Sin embargo, tanto la capacidad natatoria como el incremento de la actividad, requieren de un buen desarrollo de los órganos de los sentidos y de un sistema respiratorio cada vez más eficiente. Durante esta etapa, las aletas pectorales aumentan su tamaño y tornan su base verticalmente y es que comienzan a ser móviles. Al incrementar los latidos cardiacos y perfeccionarse el sistema respiratorio, ya pueden nadar horizontalmente y cambiar de dirección cuando sea necesario.
La sincronía armoniza el desarrollo del organismo completo en un corto intervalo de tiempo, pasando el embrión de un estado de estabilidad caracterizado por una conducta pasiva, al próximo estado de estabilidad caracterizado por el nado activo y controlado. Este cambio tiene que ser rápido, para que el organismo siga funcionando durante la transición, el cual representa un estado menos estable (Kovac, 2002).
Otro ejemplo se evidencia cuando el agotamiento del vitelo avanza. El bajo nivel de las fuentes nutritivas y de energía no permiten mantener al embrión en el estado estable de forma segura y lo fuerza a prepararse para la transición hacia el otro estado de estabilización. Para esta transición es necesario haber adquirido un nado activo y
controlado, acompáñado de otras nuevas funciones y habilidades que permitan al embrión explotar fuentes exógenas para sobrevivir (Hunt Von Herbing y Boutilier, 1996).
Cada transición tiene que asegurar que el organismo adquiera nuevas funciones y habilidades y así incremente sus posibilidades de supervivencia (Kovac, 2002). Por lo tanto, el organismo como un sistema auto-organizado, resiste la desestabilización tanto como sea posible, para así asegurarse que el nuevo nivel de estabilización (superior), comience en el momento apropiado (Balon, 1990).
2.6 Alimentación larval
Durante estos procesos ontogénicos en los peces, toma especial importancia aquellos relacionados con el tracto digestivo, pues solamente una adecuada formación del mismo es lo que garantizará el crecimiento y la supervivencia de cada individuo. En el desarrollo de este sistema deben darse procesos tanto morfológicos como fisiológicos, que permitan la asimilación de los nutrientes, vengan estos procedentes de las reservas internas o del alimento externo. Al eclosionar, el canal alimentario es un tubo recto que pasa por encima del saco vitelino y está cerrado hacia la boca y el ano en la mayoría de las especies (Civera et al., 2004). Posteriormente comienza la regionalización del mismo, siendo el desarrollo del estómago y de los ciegos pilóricos el último cambio morfológico en aparecer, indicando el inicio de la etapa juvenil. Este completamiento del sistema digestivo tarda aproximadamente tres semanas en Brama brama y Pagrus major, seis semanas en Chanos chanos, catorce semanas en Plecoglossus altivelis y un mes en Dicentrarchus labrax (Watanabe y Kiron, 1994). Sin embargo, existe un grupo reducido de peces que muestran una anticipación en el desarrollo del estómago y los ciegos pilóricos, incluso previo al inicio de la alimentación exógena, y otros que carecen de estas estructuras durante toda la vida (Dabrowski, 1984).
No solamente estas transformaciones morfológicas se hacen vitales durante la ontogenia, sino que las mismas deben ir acompañada de la funcionalidad del sistema. Esto permitirá que una vez haya ingresado el alimento al tracto, éste sea digerido y absorbido adecuadamente, haciéndose trascendental la participación de las enzimas digestivas, tanto las gástricas como las intestinales (Civera et al., 2004).
Es por ello que una de las primeras aproximaciones para determinar la capacidad digestiva de larvas con potencial para su cultivo, ha sido a través de los estudios de ontogenia y caracterización enzimática. Estos permiten comprender en que momento las larvas presentan un equipo enzimático completo y por consiguiente tienen la habilidad de digerir eficientemente el alimento (Alarcón y Martínez, 1998). La mayor relevancia de estos estudios se alcanza cuando se pretende hacer habitual el empleo de dietas artificiales en el mantenimiento en cautiverio de larvas de peces, lo cual impone nuevos retos.
Hacia el empleo de dietas artificiales va encaminada la acuicultura de peces en la actualidad, por las ventajas que estás ofrecen tanto económicas (por la disminución en los costos de producción), biológicas como de manejo. No obstante, aún persisten serias dificultades para el empleo de estos alimentos en la etapa larval, dado principalmente por las particularidades de cada especie como son: la incapacidad de digerir el alimento inerte, no cubrir éste plenamente los requerimientos nutricionales, la falta de estimulación hacia su consumo, las conductas naturales de captura del alimento, entre otros elementos (Lazo, 2000).
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Condiciones experimentales
Las experimentaciones se realizaron en los meses de Abril, Mayo y Junio de los años 2005 y 2006 en el Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional Ciénaga de Zapata, Provincia de Matanzas, Cuba (Fig. 1).
Figura 1. Mapa de Cuba que muestra la zona donde fueron realizados los experimentos.
Señalizado el Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional Ciénaga de Zapata, Provincia Matanzas.
Los huevos del manjuarí (Atractosteus tristoechus) empleados para los bioensayos, se obtuvieron del desove inducido de reproductores mantenidos en cautiverio en dicho centro.
Se empleó siempre una proporción de una hembra y tres machos. Estos reproductores se colocaron en estanques de concreto de dimensiones 3 x 2.5 m con una altura de agua de 50 cm, fluctuando la temperatura de la misma entre los 24 y los 27oC. Los estanques se acondicionaron previamente con sustratos artificiales con el objetivo de garantizar las condiciones requeridas por los lepisosteidos para el desove (Dean, 1895; León et al., 1978;
Simon y Wallus, 1989). Se aplicó una inyección inicial de la hormona luteinizante (LHRH- A; 25 µg/mL, ARGENT) a los reproductores y una segunda inyección a las 16 horas. El cortejo y el desove ocurrían entre las 8 y las 10 horas a partir de esta segunda inyección.
100 Km
10 Km
Pasados 15 minutos del inicio del desove, los sustratos artificiales con los huevos fertilizados adheridos fueron removidos del estanque y transferidos a tanques circulares de fibra de vidrio de 100 L de capacidad hasta su eclosión (68-100 horas). Estos huevos fueron gradualmente adaptados durante cuatro horas a las temperaturas de mantenimiento (28 ± 1oC).
Todos los experimentos se realizaron hasta que las larvas alcanzaron los 18 días después de eclosionadas (DDE) debido a observaciones in situ de la aparición del fenotipo juvenil así como por referencias de estudios realizados con las otras especies del género (Aguilera et al., 2002). En la evaluación del efecto de la inanición, una vez terminados los 18 días de experimentación, las larvas se mantuvieron hasta su muerte. Se emplearon tres réplicas en cada uno de los bioensayos, excepto en el de la ontogenia de las enzimas digestivas que contó con dos réplicas.
Se mantuvieron las temperaturas del agua constantes, con regímenes de luz desde las 08:00 hasta las 20:00 horas, y con niveles de oxígeno mantenidos por encima de 6 ppm. Cada mañana se recambiaba entre el 50 y el 75% del agua de cada tanque después de la limpieza del fondo de los mismos. Las larvas se alimentaron tres veces al día (09:00, 14:00, y 19:00 h) a partir del cuarto día después de eclosionadas, excepto en el tratamiento de inanición en el experimento correspondiente. Las especificidades de la duración de cada experimento, así como de las dietas, los tanques y las densidades de siembra iniciales empleados aparecen en la Tabla 1.
Los quistes de artemia empleados, provenientes de Salt Creek Select (Great Salt Lake, UTA), fueron hidratados con abundante aireación y luz durante una hora en agua dulce y después por 23 horas en agua salada (28 g/L). Los quistes fueron preparados 24 horas anteriores a cada alimentación. Las moinas provenían del área de alimento vivo del propio Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional Ciénaga de Zapata y eran colectadas previas a cada alimentación. Justo antes de ofrecerlas como alimento, tanto los nauplios de artemias como las moinas eran lavados con agua dulce e igualmente distribuidos en los tanques.
Tabla 1. Características de los experimentos realizados: duración de cada uno (DDE - días después de eclosionadas las larvas) y tamaños de muestras (n=larvas/réplica/día), especificándose los tanques utilizados, las densidades de siembra iniciales y las dietas empleadas en cada uno de ellos.
1 Moina sp.
2 nauplios de Artemia sp.
3 Pienso < 600 µm hasta los 8 DDE, de ahí en adelante 600-850 µm
4 100 % Pienso a partir de los 13 DDE
En el experimento sobre la evaluación de dietas inertes, las artemias y moinas empleadas fueron congeladas a -20oC y posteriormente porcionadas y pesadas para ofrecerlas según el porcentaje de la biomasa correspondiente. Para esto se hicieron ajustes diarios de la ración a ofrecer según los pesos que mostraban las larvas en los muestreos. El pienso empleado fue el alimento balanceado comercial para truchas El Pedregal
MR
(45% de proteína y 16%
grasa), el cual fue previamente tamizado para obtener tamaños de partículas < 600 µm y entre 600-850 µm. Se determinaron la proteína total y el contenido de humedad (AOAC, 1990) de las dietas y de las larvas de 4 DDE y de 18 DDE. En el experimento donde se evaluó el efecto de la inanición, los tanques fueron tapados con mallas para impedir la entrada de ningún tipo de alimento.
Dieta
Experimentos Duración
n Tanques y densidades iniciales
Cantidad Tipo Descripción morfológica
y morfométrica
0-18 DDE N=2-3
Tanques plásticos circulares 15L
(6.7 larvas/L) Moina1 viva
Desarrollo histológico del tracto digestivo
0-18 DDE N=2-3
Tanques plásticos circulares 15L (6.7 larvas/L)
Ontogenia de las enzimas digestivas
5-18 DDE N=100
Tanques fibra vidrio rectangulares 300L (6.7 larvas/L) Efectos de la inanición 5-18 DDE
n=3
Tanques fibra vidrio rectangulares 50L (4 larvas/L)
ad libitum
Artemia2 viva
Moina1 congelada Artemia2 congelada 50 % Moina1 congelada + 50 % Pienso3, 4 50 % Artemia2 congelada + 50 % Pienso3, 4
Dietas de iniciación 5-18 DDE n=7
Tanques fibra vidrio rectangulares 50L (4 larvas/L)
100 % de la Biomasa
Pienso3
3.2 Muestreos
Antes de la limpieza de los tanques y de la alimentación matutina, las larvas fueron muestreadas al azar de forma diaria, excepto en el bioensayo de la evaluación de las dietas de iniciación, donde solamente se analizaron los días 8, 12, 15 y 18 después de eclosionadas. Los tamaños de muestras empleados para cada bioensayo aparecen en la Tabla 1. Una vez colectadas las larvas, estas eran anestesiadas con MS 222, individualmente pesadas con una balanza Ohaus (±0.1 mg) y fijadas en solución de etanol 700 para el posterior análisis. En el experimento para la descripción histológica, las larvas se fijaron primero en Bouin a temperatura ambiente por 24 horas y luego deshidratadas en etanol.
Las especificidades del experimento de la ontogenia de las enzimas digestivas fueron las siguientes. Las larvas removidas fueron mantenidas en dos pequeños tanques sin alimento por al menos una hora para impedir la asimilación de ningún alimento y permitir parte del vaciado intestinal. Todas las larvas se lavaron con agua destilada y el exceso de la misma fue removido empleando papel absorbente. La disección se realizó bajo la observación estereoscópica sobre una placa Petri refrigerada manteniendo una temperatura 0-20C. Entre los 5 y los 12 DDE, fue tomada toda la larva, con excepción de la cabeza y la cola. A partir del 13 DDE en adelante, se realizaba un corte desde el inicio del esófago y se extraía todo el segmento intestinal incluido el hígado y el páncreas. Estas muestras fueron almacenadas en tubos plásticos Eppendorf y mantenidos en hielo. Una vez terminado el muestreo, que no excedía los 15 minutos, las muestras se congelaban en nitrógeno líquido a -700C y posteriormente fueron liofilizadas para el análisis de la actividad enzimática. Fracciones del tracto digestivo de un adulto (estómago, ciegos pilóricos, intestino, válvula espiral) fueron tomadas e idénticamente procesadas como referencia para los análisis.
3.3 Procesamiento de las muestras, mediciones y determinaciones
El establecimiento de los estadios de desarrollo de las larvas fue llevado a cabo mediante la observación (10, 20 y 40 X de amplificación) de la desaparición, la reducción o la aparición de estructuras externas y mediante la observación in situ de la pigmentación y de la conducta larval. Se empleó una cámara Kodak Z 760 montada en un microscopio binocular
Omano y mediante semi-oscuridad o total iluminación se fotografiaron las larvas conservadas.
Los caracteres morfométricos y merísticos fueron medidos o contados, empleando un micrómetro ocular y un vernier digital (±0,01 mm) según los criterios definidos por Simon y Wallus (1989) para las larvas de lepisosteidos. Los caracteres morfométricos aparecen en la Figura 2 y los caracteres merísticos fueron el número de radios de las aletas dorsal, anal y caudal.
Figura 2. Caracteres morfométricos medidos en el manjuarí (modificado de Simon y Wallus, 1989). Largo total (LT), largo estándar (LS), largo del hocico (LH), diámetro ocular (D), largo cefálico (LC), largo predorsal (LPd), largo preanal (LPa), largo del tronco (LTc), largo de la cola (Lc), largo del saco vitelino (Lsv), largos de las aletas pectorales (LAPc) y pélvicas (LAPv), altura cefálica (HC), altura pectoral (HP), altura preanal (Hpa), altura postanal (Hpta), altura del pedúnculo caudal (HPc), altura del saco vitelino (Hsv), ancho inicial del hocico, ancho medio del hocico, ancho posterior del hocico (AH), ancho cefálico (AC), ancho del disco suctorial (Ads).
LT LS LH D
LC
LPd LPa
LTc
Lc Lsv
LAPc
LAPv HC
HP
Hpa Hpta HPc Hsv
AH AC Ads
El porcentaje de mortalidad total fue determinado diariamente para el experimento del efecto de la inanición en las larvas y para el bioensayo de las dietas de iniciación al finalizar el mismo.
La tasa de crecimiento (TC; mm/d) fue calculada a través de: [LT2- LT1] / (t2-t1) donde LT2
y LT1 son los largos totales a los tiempos t2 y t1 (expresados en días) respectivamente. La tasa de crecimiento específica (TCE; %/d) fue calculada como: 100 [ln P2-ln P1] / (t2-t1) donde P2 y P1son los pesos húmedos a los tiempos t2 y t1 respectivamente (Rana, 1990 a,b).
3.3.1 Análisis histológico
Las muestras de las larvas enteras después de fijadas en Bouin por 24 horas fueron conservadas en etanol 700 hasta su procesamiento. Posteriormente estas fueron deshidratadas con inmersiones periódicas en alcohol a diferentes graduaciones (70-1000) e incluidas en parafina. Secciones seriadas sagitales y transversas de 8 µm de espesor fueron cortadas, fijadas en portaobjetos y secadas. Posteriormente fueron teñidas con Hematoxilina-Eosina (HE) y con Ácido periódico-Shiff (PAS) (Drury y Wallington, 1980) para la observación y descripción general. Se utilizó microscopía óptica (Omano) con aumentos de 40X, 50X, 100X y 400X.
3.3.2 Actividad enzimática del tracto digestivo
Las muestras fueron pesadas y homogenizadas a una proporción 1:10 (tejido:agua bi- destilada) durante unos minutos empleando un homogenizador de tejidos Polytron (Brinkman Instruments, Westbury, N.Y) a una temperatura de 4oC. Posteriormente el homogenizado fue centrifugado a 10 600 g por 15 min a la misma temperatura. El sobrenadante fue colectado y dividido en alícuotas de 0,1 mL, las cuales se almacenaron en nitrógeno líquido a -70oC y se emplearon posteriormente para los análisis de la actividad enzimática y del contenido proteico. La concentración de proteína soluble total en los extractos se determinó por el método de Bradford (1976) para lo cual se utilizó la albúmina de suero bovino (BSA) como referencia.
Todas las determinaciones se realizaron por triplicado a temperatura ambiente (25oC) empleando un espectrofotómetro de microplacas Tecan Sunrise excepto para los análisis de
